Summary
Мы описываем новый метод выделения геномной ДНК из цельной крови, собранной для плазменных / серологический. После сбора плазмы крови уплотненного обычно выбрасывают. Наш новый метод представляет собой значительное улучшение по сравнению с существующими методами и делает ДНК и плазменными из одной коллекции, не требуя дополнительного крови.
Protocol
1. Сбора проб
- Соберите образцы крови у лиц с надлежащей информированного согласия. Для каждого человека, привлечь от 4 до 5 мл крови в трубке P100 (BD Diagnostics, Франклин озеро, Нью-Йорк, США). Для целей сравнения одновременно собирать крови в пробирку ЭДТА.
- BD P100 трубы содержат 15,8 мл высушенного распылением K2EDTA и лиофилизированных собственной широкий спектр коктейлем ингибиторов протеаз для предотвращения коагуляции и стабилизации белков плазмы. Они также содержат механические сепаратора. После сбора цельной крови, держать обе трубки при комнатной температуре в течение 60 минут на ночь, пока обработка не выполняется.
- Центрифуга BD P100 пробирки при 2500 г в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. Передача плазмы, собранной выше механический сепаратор на микро пробирки.
- Храните P100 трубы, содержащие кровь уплотняется ниже сепаратора, при -80 ° С, пока вы не будете готовы начать ДНК добraction.
2,1 из крови P100 трубку (P100_DNA)
- P100 трубы хранили при -80 ° C после экстракции плазмы. В течение 3 до 4 месяцев, извлекать P100 пробирку, содержащую уплотненный крови из морозильной камеры и оттаивания при 37 ° на водяной бане в течение 5 мин (рис. 1А). Удаления остаточной плазмой, которая сидит над сепаратором. Добавить 2 мл 17% раствора сахарозы (градиент решения испытано в доме - неопубликованные данные) в P100 трубы над сепаратором (рис. 1В). Центрифуга труб при комнатной температуре в течение 20 мин при 2500 г; этот процесс толкает механического сепаратора в верхней части трубки и дает три слоя раствора, включающего лейкомассы (рис. 1в). Вручную извлечь сепаратор использованием steriled крючковатым скрепки металла (рис. 1D).
- После получения механический сепаратор из каждой пробирки (рис. 1D), удалять и discarг верхний слой сахарозы. Передача средний слой, представляющий лейкомассы (BC) слой, в стерильные 15 мл коническую трубку. Добавить фосфатом солевой буфер (PBS), чтобы увеличить громкость лейкомассы до 3 мл. Извлечение ДНК из лейкоцитарной пленки с использованием реагентов из крови Kit Qiagen Puregene в соответствии с рекомендацией изготовителя; кроме центрифугирования скоростью 2500 г (вместо 2000 г).
- Для лизиса и удалить красных кровяных телец (эритроцитов), добавить 9 мл лизис РБК к 3 мл лейкоцитарной пленки. Инверсия каждой трубки несколько раз, и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин с периодическим обращением во время инкубации. Спин каждой смеси вниз на 2500 г в течение 5 мин и отбросить супернатант. Лечение оставшихся гранул в каждую пробирку с 3 мл клеточной лизирующего раствора и вихрь на 15 сек. Лечить лизата с 1 мл раствора белка и вихревые осадков на 15 сек.
- Центрифуга при 2500 г в течение 5 мин и надосадочную жидкость передавать в свежем 15 мл коническую пробирку, содержащую3 мл 100% изопропанола. Инверсия новой трубы 10 раз и центрифуге при 2500 г в течение 3 мин. Удалите супернатант и добавляют 1 мл 70% этанола. Переверните конические пробирки несколько раз, чтобы выбить и мыть осадок ДНК. Центрифуга при 2500 г в течение 1 мин. Разрешить гранулы сушат в течение 3 мин (поместить трубку вверх дном) при комнатной температуре, а затем приостановить ДНК с 250 мл регидратации раствор при 37 ° С в течение 10 минут и переносят в предварительно меченных 1,7 мл микропробирки. Хранить трубы при -80 ° С до использования.
2,2 из крови ЭДТА Ttube (EDTA_DNA)
- Цельной крови для обычного тестирования иммуногематологии собирают в пластиковые пробирки vaccutainer распыления покрытый 10,8 мг К 2 EDTA и хранили при -80 ° С. Поскольку трубы не содержат механические сепаратора экстракции ДНК не включать в себя этапы, связанные с механическим сепаратором (2.1.1 и 2.1.2).
- В течение 3-х до 4 месяцев хранения крови, DNИзвлекали с помощью KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Это экстракции ДНК автоматизации системы, основанной на технологии магнитной частицей и состоит из лизиса клеток / ДНК-связывающий несколько стадий промывки и элюции ДНК.
- Набор, используемый в экстракции ДНК является KingFisher Flex 24 ДНК крови (Qiagen, Германия).
3. Количество ДНК и оценка качества
Количество, качество и целостность геномной ДНК оценивали комбинацию метода, который включает в себя PicoGreen, спектроскопии и электрофореза.
- Концентрация геномной ДНК определяется Nanodrop и PicoGreen количественной оценки.
- Чистота определяется из 260/280 Измерение коэффициента на Nanodrop спектрофотометра.
- Образец (500 нг) также загружаются на 1% агарозный гель для оценки целостности (деградация) ДНК.
4. Genotypinг анализы и контроль качества
- Пять P100_DNA и соответствующие образцы EDTA_DNA случайно отобраны для дальнейшего анализа с использованием пользовательских иммуночипа (Иммуно Анализ ДНК BeadChip). Иммуночипа это микросхема Infinium генотипирования полиморфизмов содержащий 196524 и предназначен для исследования иммуногенетическими 5.
- Для каждого образца 200 нг ДНК амплифицируют, разобщены, осаждали и ресуспендировали в соответствующем буфере гибридизации.
- Денатурированные образцы гибридизуют на Immunochips при 48 ° C в течение минимум 16 часов.
- После гибридизации Immunochips обрабатываются для одной базы расширения реакций и запятнанным.
- Immunochips затем отображаемого использованием Illumina Hiscan бисера читатель решетки и нормированного шарик данные интенсивность загружается в программное обеспечение Illumina GenomeStudio и преобразуется в генотипами. Генотипы вызываются с помощью алгоритма autocalling GenomeStudio. Контроля качества вvolves исключение одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) с призывом скорости <95%.
- Скорость SNP вызова используется как мера эффективности анализа иммуночипа. Он рассчитывается как процент от общего количества анализов на чипе (196524 SNP, закодированных на каждом чипе), которые обеспечивают достижение достаточной интенсивности и качества сигнала для получения автоматизированной назначение генотипа. Высокое качество ДНК (260/280 Отношение 1,8 или выше, и отсутствие деградации) как ожидается, достигнет по крайней мере, с той же скоростью звонок, так как ДНК HapMap управления включены в анализ иммуночипа. Контроль качества включает в себя исключение ОНП с призывом скорости <95% в каждом наборе данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ДНК оценки качества и измерение концентрации
Выходы P100_DNAs были значительно ниже, чем у EDTA_DNAs (табл. 1 и 2). ДНК чистота лице 260/280 Значение коэффициента одинакова для обоих P100_DNA и EDTA_DNA выборочной совокупности (табл. 1 и 2). Качество ДНК достаточно равномерным в пределах каждого набора образцов хотя некоторое ухудшение видно в образцах EDTA_DNA, как указано световых пятен (рис. 2). EDTA_DNAs который показал больше признаков деградации также показали снижение концентрации ДНК.
Генотипирование
Скорость генотипирования вызов для обеих EDTA_DNAs и P100_DNAs были сопоставлены. Они получены аналогичные тарифы, и оба были сопоставимы с внутреннего контроля HapMap ДНК (табл. 3).
Рисунок 1. Лейкомассы изоляции.
Таблица 1. Образец ДНК выходом (PicoGreen) и коэффициент (NanoDrop).
| Выход ДНК | Чистоты ДНК | |||
| Образцы | P100 | ЭДТА | P100 | ЭДТА |
| 1 | 135 | 340 | 1,79 | 1,9 |
| 2 | 119 | 344 | 1,85 | 1,89 |
| 3 | 57 | 129 | 1,88 | 1,88 |
| 4 | 159 | 640 | 1,86 | 1,88 |
| 5 | 140 | 430 | 1,86 | 1,88 |
| 6 | 150 | 673 | 1,86 | 1,9 |
| 7 | 139 | 425 | 1,74 | 1,88 |
| 8 | 118 | 240 | 1,87 | 1,86 |
| 9 | 51 | 86 | 1,87 | 1,83 |
| Значение р | р = 0,00221 | р = 0,09836 | ||
Таблица 2. Сравнение выхода и чистоты (двусторонний, Paired образец Т-тест).
| Генотипирование Cell Rate | ||
| Образцы | P100 | ЭДТА |
| 1 | 97,9 | 97,5 |
| 2 | 97,9 | 97,8 |
| 4 | 97,4 | 97,5 |
| 7 | 97,5 | 98,2 |
| 8 | 97,9 | 98 |
| Значение Р | р = 0,67970 | |
Таблица 3. Генотипирование Скорость соединения (двусторонний, Paired образец Т-тест).
| Образцы | Слои | Доходность (мкг) | Соотношение (260/280) |
| Лейкомассы | 150 | 1,86 | |
| РБК | 4,13 | 1,73 | |
| P100_07 | Лейкомассы | 139 | 1,74 |
| РБК | 1,00 | 1,70 | |
| P100_08 | Лейкомассы | 118 | 1,87 |
| РБК | 3,72 | 1,78 | |
| P100_09 | Лейкомассы | 51 | 1,87 |
| РБК | 0,23 | 0,98 |
Приложение. Оценка количества ДНК содержится в красных кровяных клеток (эритроцитов) слоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многие человеческие болезни имеют генетические причины и изучения генетической основы заболевания человека требует увеличения высокое качество ДНК. Наиболее распространенным источником ДНК используется в генетических исследованиях антикоагулированной цельной крови. Поскольку большинство клинических лабораторий выполняют биохимические, серологические и вирусных тестирования в качестве первого шага в расследовании фенотипических результат, кровь часто собираются в плазме трубки. После сбора плазмы крови уплотненного часто отбрасывается. Поэтому, когда ДНК, необходимые для проведения генетических исследований или испытаний, дополнительных ничьей крови требуется от того же пациента. Отбрасывается уплотненного крови представляет собой потенциальный источник ДНК, поскольку она содержит лейкоцитов. Поэтому, используя уплотненной плазмы крови из труб дает возможность использовать собранные пробы крови более эффективно, без необходимости использования излишков крови или вспомнить пациента на дополнительное крови.
Различные методы, чтобы бывшиетракта ДНК из лейкоцитов уплотненного или свернувшейся крови поступало 6-10. Большинство проблем этих методов были связаны с конструкцией пробирку для сбора плазмы. Ранее трубы для сбора плазмы содержал сепаратор из геля (гель-сепаратор), которые при центрифугировали, сформированный барьер для разделения клеток крови (в ловушке ниже сепаратора) из плазмы (расположенный выше сепаратор). Для предотвращения загрязнения клеток крови с гелем материал, сепаратор сначала должны быть тщательно удалены из трубки 11. Это сопровождается фрагментацией тромба, чтобы гарантировать эффективное извлечение ДНК. Фрагментации процесс часто приводит к значительной потере крови и снижение выхода ДНК. Чтобы свести к минимуму потери образцов и улучшения процесса, малые поры сетки была использована для механически разогнав тромба на мелкие кусочки 12, но еще страдающих фрагментации ДНК выход и качество и электроннойVEN составляли опасность для здоровья 13 техник.
BD P100 труб из BD биологических наук являются последним поколением сбор плазмы труб оценивается в многоцентровых исследований иммунологического исследования 14. Как и в предыдущем трубы плазма, они содержат антикоагулянтов для предотвращения коагуляции и ингибиторы протеазы для стабилизации белков плазмы. Главное нововведение трубки BD P100 находится в механический сепаратор (не гель сепаратор) внутри каждой трубки. Механический сепаратор также обеспечивает физический барьер между плазмой и клеточный осадок после центрифугирования, но в отличие от геля сепаратор, не дает риск загрязнения образца на гель. Протокол применяется в данном исследовании, не включает в себя дробление, поэтому нет риска опасности для здоровья.
ДНК экстрагировали из лейкоцитарной пленки, используя коммерческий протокол комплекта (см. выделение ДНК). Уплотненного крови в BD труб P100 были cryopсохранены в течение от 3 до 4 месяцев до выделения ДНК. ДНК, выделенной из ЭДТА труб (EDTA_DNA) были использованы в качестве контроля при оценке урожайности и качества соответствующих P100_DNA. В предыдущих исследованиях 12,13,15, выходы EDTA_DNA образцы были значительно выше, чем у ДНК из крови предыдущий трубы плазмы. В данном исследовании на ту же сумму цельной крови, собранной у каждого пациента, лейкоцитарную пленку из уплотненного крови были менее ДНК (табл. 2, р = 0,00221). Во время экстракции ДНК из крови в новом P100 труб плазмой, некоторые белые клетки крови от Баффи побережья уходят в слое эритроцитов (ниже его), но представляет незначительное количество ДНК по сравнению с теми из лейкоцитарной пленки (см. приложение таблицу). Изменение доходности видели с EDTA_DNAs также имитировали с P100_DNA предполагая, что она является образцом зависимыми. Пробы с большими объемом, как правило, дают больше ДНК и образцыс меньшим объемом и / или незначительной степени ДНК даст меньше ДНК.
Анализы на агарозном геле (рис. 2) показал, что EDTA_DNAs показывают признаки деградации (мазок) не видели в соответствующих P100_DNAs. В частности, два EDTA_DNA образцов (EDTA_01053 и EDTA_06030) с наименьшей доходностью показать больше мазка, чем другие. В своем исследовании, Вонг и соавт. Сообщили 11 ДНК снизилась доходность с увеличением времени хранения. Поскольку все образцы крови в нашем хранилище были подвергнуты такой же условиях хранения и образец подмножество используемые в этом исследовании было случайно выбранным, длина хранения и состояние вряд ли учитывают эти различия видны на агарозном геле между P100_DNAs и EDTA_DNAs. Тот факт, что только показывают EDTA_DNAs деградации может быть связано с отсутствием ингибиторов протеазы в трубах ЭДТА.
Чистоту и P100_DNAs EDTA_DNAs существенно не отличались ( Используемые образцы были набраны на генетических исследований воспалительное заболевание кишечника. Поэтому, чтобы сравнить производительность извлеченные образцы ДНК, иммуночипа 5 была выбрана в качестве платформы тестирования генотипирования. Иммуночипа был использован в качестве прекрасной площадкой для генотипирования отображение иммуногенетике 16,17. Генома характер SNP генотипирования анализов использовали в качестве строгие меры ДНК производительности. Средняя генотипирования Цены на звонки для всех тестов ДНК и образцы HapMap управления, во всех чипов, были 97,76% и 97,4% соответственно, показывая отличную производительность сопоставима ДНК из обоих труб для сбора крови ( Заключение ДНК может быть выделена из уплотненного крови BD P100 трубы, что облегчает геномного тестирования из того же образца крови, взятой в плазме протеомики исследований. Наши результаты обобщают исследования полезности P100 трубки. Тот факт, что ДНК в клеточном содержании крови, собранной в P100 может использоваться для геномного анализа может помочь упростить приобретение образцов для проведения исследований, в которых оба протеомные и геномных анализов будет выполнена. Таким образом, меньше крови необходимо от каждого человеческого субъекта и связанных затрат и усилий экономии для изучения спонсоров и сотрудников улучшается. Есть несколько преимуществ продемонстрировали:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A.
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C.
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
