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Neuroscience

L'analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Published: October 23, 2014 doi: 10.3791/52023
Automatic Translation
1, 2, 1
1Anatomical Institute, Department of Biomedicine Basel, University of Basel, 2Department of Neonatology, University Children's Hospital (UKBB), University of Basel

Summary

Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

Abstract

Lésion cérébrale ischémique est parmi les affections les plus courantes et les plus dévastatrices de compromettre le bon fonctionnement du cerveau et conduit à la persistance des déficits fonctionnels chez les patients atteints souvent. Malgré les efforts de recherche intensifs, il n'y a toujours pas de traitement efficace disponible qui réduit une lésion neuronale et protège les neurones dans les zones ischémiques du secondaire mort retardée. La recherche dans ce domaine implique généralement l'utilisation de modèles animaux élaborés et problématiques. Cultures organotypique Entorhino-hippocampique contestées par manque d'oxygène et de glucose (OGD) sont établis dans des modèles in vitro qui imitent l'ischémie cérébrale. Le nouvel aspect de cette étude est que les modifications des vaisseaux sanguins du cerveau sont étudiés, en plus de modifications neuronales et la réaction à la fois le compartiment et le compartiment neuronal vasculaire peut être comparée et corrélée. Les méthodes présentées dans ce protocole d'élargir considérablement les applications potentielles de la ouganotypic approche de la culture de la tranche. L'induction de l'hypoxie ou OGD seul peut être appliquée par des moyens relativement simples dans des cultures de tranches organotypiques et entraîne des dommages fiable et reproductible dans le tissu neural. Ceci est en contraste frappant avec les expériences sur les animaux complexes et problématiques induisant accident vasculaire cérébral et ischémie in vivo. En élargissant l'analyse pour inclure l'étude de la réaction du système vasculaire pourrait fournir de nouveaux moyens sur la façon de préserver et de restaurer les fonctions cérébrales. L'approche de la culture de la tranche présentée ici pourrait se développer en un outil intéressant et important pour l'étude des lésions cérébrales ischémiques et pourrait être utile pour tester des mesures thérapeutiques potentielles visant à la neuroprotection.

Introduction

Le système nerveux central est particulièrement sensible à une perte ou une réduction de l'oxygène et de glucose alimentation par le système vasculaire. Même une assez courte interruption de l'approvisionnement en sang au cerveau peut provoquer une perte permanente de la fonction des zones du cerveau concernées mènent aux syndromes de temps typiques. En plus de la perte neuronale dans les zones touchées primaires, il existe généralement une perte neuronale retardée supplémentaire à travers des dommages secondaires. Malheureusement, jusqu'à présent, aucun traitement neuroprotecteur pour la réduction de la mort neuronale secondaire était disponible 1. Les efforts de recherche pour étudier les mécanismes de dommages secondaires reposent sur ​​l'utilisation de modèles animaux d'ischémie cérébrale comme l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et diverses techniques d'occlusion thrombotique (pour une revue récente, voir 2). En parallèle, également en raison de limitations d'ordre éthique avec l'utilisation de modèles animaux, la culture organotypique de divers tissus du système nerveux central ont été utilisés qui permettent à l'étudy de réactions neuronales à différents types de blessures 3-5.

Pour l'étude de la réaction neuronale dans des conditions qui imitent les lésions cérébrales ischémiques, le système de modèle de privation d'oxygène et de glucose (OGD) a été développé. Dans ce modèle, les cultures de tranches sont temporairement exposées à un milieu dépourvu de glucose et a été équilibrée avec de l'azote gazeux en l'absence d'oxygène. Avec un tel traitement, il est possible d'induire une lésion neuronale et la perte qui est assez similaire à celui observé après une lésion ischémique in vivo 6, 7. Dans l'hippocampe, ce traitement induit une perte neuronale dans CA1 spécifiquement, mais pas dans l' région CA3 ou le gyrus denté de l'hippocampe. En revanche, l'étude des réactions vasculaires dans des cultures de tranches jusqu'à présent n'a pas été largement engagé. Une raison évidente est l'absence de circulation et de perfusion vaisseau sanguin dans le modèle de culture de la tranche. Cependant, nous avons montré précédemment qu'il est possible de maintenir bvaisseaux Lood du SNC tranche cultures pendant plusieurs jours 8, 9.

L'objectif global de cette méthode est de surveiller non seulement le sort des neurones après les autres ministères mais étendre l'étude sur le sort et le remodelage du système vasculaire qui est une partie importante de la réponse de blessure. Jusqu'à présent, de telles études ont nécessité l'utilisation de l'expérimentation animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Dans le protocole présenté ici, nous allons détailler la façon dont ces études peut être fait dans les cultures organotypique entorhino-hippocampique attaqué ni à l'hypoxie ou par des lésions excitotoxiques suivie d'une analyse des deux réactions de survie et des vaisseaux sanguins neuronales. Ce protocole est basé sur une étude publiée précédemment sur ​​ce sujet 10 et peut être utile pour tout laboratoire s'intéresse aux interactions neurovasculaires dans le SNC.

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Protocol

Les expérimentations animales ont été effectuées conformément à la directive du Conseil Communautés européennes du 22 Septembre 2010 (2010/63 / UE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses.

1 Mise en place de cultures organotypique Entorhino-hippocampiques

  1. Préparer organotypiques cultures tranche de entorhino-hippocampique (de EHOSCs) de chiots jour 4 (P4) de souris postnatales utilisant la méthode statique d'incubation 4,11. Ici, utiliser des souris C57BL6 et CB6F1.
    1. Prenez environ 30 minutes par chiot de la souris pour la préparation des cultures de tranche, soit 3 h pour une portée de 6 chiots de souris. Effectuer toutes les mesures dans des conditions stériles dans un plan de travail à flux laminaire avec des instruments chirurgicaux stérilisés.
    2. Afin d'éviter une interférence possible de la position de la tranche le long de l'axe septo-temporelle, en utilisant uniquement de l'hippocampe des tranches de la moitié du septum. Sauf indication contraire, effectuer toutes les étapes à la température ambiante.
  2. Coupez til la tête d'un chiot P4 de la souris avec des ciseaux chirurgicaux. Aucune anesthésie n'est nécessaire pour cette étape.
    1. Retirez le crâne autour du cerveau et identifier la fissure entre l'extrémité caudale des hémisphères cérébraux et le mésencéphale. Retirez délicatement la partie de la rostrale du cerveau pour le mésencéphale du crâne et de le placer dans le milieu de la préparation glacée composé de MEM complété avec une forme stabilisée de L-glutamine.
  3. Poursuivre la dissection sous un stéréomicroscope avec le cerveau étant immergé dans le milieu de préparation à froid de glace. Retirer méninges restantes des hémisphères corticaux. Identifier l'hippocampe à la surface caudale interne de l'hémisphère et le séparer avec le cortex entorhinal adjacent du reste du cerveau.
    1. Transférer le tissu à un broyeur de tissus et de coupe de 400 pm d'épaisseur des tranches dans des conditions aseptiques transversal à l'axe septo-temporal de l'hippocampe.
  4. Placer les tranches sur CEinserts de culture ll (environ 6 tranches par plaquette) et les incuber dans des plaques 6 puits avec 1 ml par puits de milieu d'incubation (47 ml de MEM, 25 ml de milieu Eagle, 25 ml de sérum de cheval, 1 ml glutamax I, 1 ml d'une solution stérile à 10% de glucose, pH 7,3) dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 à 37 ° C. Changer le support le lendemain, puis tous les deux jours jusqu'à 1 semaine.

2 In Vitro L'hypoxie et l'oxygène-glucose privation de reperfusion

  1. Voir le tableau 1 pour un échéancier précis de la procédure. EHOSCs de culture pendant 5 jours (DIV5) avant l'exposition à l'hypoxie ou d'autres ministères. A ce point de temps de changer de support de milieu d'incubation contenant du sérum de cheval à 25% de milieu sans sérum avec la composition suivante: milieu Neurobasal avec supplément de 2% de B27, 1% de glutamax supplémentaire et 0,1% de glucose.
  2. Préparer le milieu d'autres ministères comme indiqué dans la référence 7 .Les concentrations finales des composants sera la suivante: 0,3mM CaCl 2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4, et 10 mM de saccharose à pH 6,8. Ajouter 1 ml de milieu AM à chaque puits de deux plaques de culture tissulaire à 6 puits.
    1. Perfuser le milieu AMG avec N 2 pendant 1 heure dans une chambre d'hypoxie et puis sceller et garder O / N dans un incubateur à 37 ° C.
    2. Utiliser des bandes anaérobies comme indicateurs hypoxiques. Pensez aux médias d'être l'oxygène libre lorsque la couleur des bandes a changé du rose au blanc.
    3. Pour l'induction de l'hypoxie, utiliser un milieu sans sérum de glucose au lieu de milieu des autres ministères. Avant utilisation, le milieu de perfuser N 2 dans une chambre à l'hypoxie tel que décrit ci-dessus pour le milieu OGD.
  3. Avant que les tranches sont exposées à la OGD, perfuser le milieu OGD nouveau avec N2 pendant 30 min. Ajouter 2 ul de 1 mg / ml d'iodure de propidium (PI) solution par puits (pour une concentration finale de 2 pg / ml) pour les tranches pendant 30 minutes et sélectionnerseulement tranches saines pour l'expérimentation comme indiqué par un faible nombre de cellules positives PI.
  4. Utilisez le calendrier de l'exposition des autres ministères et la reperfusion indiqué à la figure 1. Priver tranches de soit que l'oxygène (hypoxie) ou de l'oxygène et du glucose (OGD) pendant 15 min.
    1. Pour l'induction de l'hypoxie ou d'autres ministères, transférer tranches dans le milieu des autres ministères et garder pendant 15 min dans la chambre de l'hypoxie. Assurez-vous que tous les fluides qui restent sur les côtés de l'insert sont aspirés loin lorsque les cultures sont passés du milieu régulier à moyen OGD et le dos.
    2. Après l'hypoxie ou d'autres ministères, remplacer le milieu AMG avec un milieu exempt de sérum oxygéné et cultures sont autorisés à récupérer pour 3, 24 ou 48 heures dans un milieu sans sérum dans l'incubateur régulière à 37 ° C avec 5% de CO 2. Ajouter PI nouveau avant la fixation de la détermination de la mort cellulaire.

3. traitements pharmacologiques de Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

  1. CulturEHOSCs e pendant 5 jours (DIV5) dans du milieu d'incubation avant l'exposition à des traitements pharmacologiques. Lancer traitements pharmacologiques, soit pendant ou immédiatement après l'OGD OGD quand les tranches sont transférées dans un milieu sans sérum.
  2. Les traitements pour la protection des autres ministères.
    1. Ajouter 100 uM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) ou 1 uM de tétrodotoxine (TTX) au milieu de culture au cours de l'induction OGD (pendant 15 min) ou immédiatement après l'induction AM pendant 30 min. Ensuite, incuber dans normoxique milieu sans sérum pendant 48 heures avant fixation.
  3. Traitements pour l'induction de la mort excitotoxique.
    1. Après 5 jours d'incubation de cultures de commutation de milieu de milieu sans sérum contenant 100 uM (RS) -α-amino-3-5-méthyl-4-hydroxy-isoxazolepropionique (AMPA) pendant 30 min.
    2. Retirez le milieu de culture contenant AMPA par aspiration (prendre soin d'enlever tout moyen résiduel sur inserts), puis transférer les tranches de nouvelles plaques avec un milieu exempt de sérum normal etles garder pendant 48 heures jusqu'à ce que la fixation.

4. fixation et Immunocoloration Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

  1. L'iodure de propidium (PI) coloration.
    1. Ajouter PI pendant 30 minutes dans le milieu de culture de tranches vivant à une concentration de 2 ug / ml. Voir cultures vivantes avec un microscope inversé équipé d'une optique de fluorescence et sélectionnez tranches pour d'autres traitements. Pour la coloration PI en combinaison avec l'immunohistochimie, ajouter une solution de PI 30 min avant la fixation des cultures.
  2. Fixation des tranches.
    1. Retirer le milieu de culture à partir de la plaque à 6 puits et ajouter 3 ml fraîchement préparée de 4% de paraformaldehyde (PFA) à chaque puits. Ensuite, placez la plaque de 6 puits dans un réfrigérateur et fixer O / N à 4 ° C.
    2. Retirer la solution de PFA le jour suivant et se laver les tranches 3-4 fois avec du tampon phosphate salin (PBS).
  3. L'élimination des tranches à partir de la culture de la cellule insert et procédure de blocage pour l'immunohistochimie de sections flottantes.
    1. Détacher délicatement et retirez les tranches des inserts de culture en utilisant une peinture art pinceau de la taille 0 ou moins. Transférer chaque tranche individuelle dans un puits d'une plaque de 96 puits rempli de tampon de blocage (PBS avec 3% de sérum normal de chèvre (NGS) et 2% de Triton-X100). Conserver les tranches dans le tampon de blocage pendant 2 h à température ambiante sous agitation constante par un agitateur orbital.
  4. Immunocoloration des cultures tranche
    1. Pour le marquage des vaisseaux sanguins utilisent anti-laminine polyclonaux à une dilution de 1: 200 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100.
    2. Pour les neurones d'étiquetage utilisent anti-protéine 2 associée aux microtubules (MAP 2) à une dilution de 1: 500 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100.
    3. Incuber les tranches avec des anticorps primaires pendant 48 heures à 4 ° C avec agitation constante. Après la période d'incubation, les laver dans du PBS avec 0,5% de Triton-X100 à 4.3 fois. Anticorps secondaires Diluer 1: 500 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100. Incuber les tranches pendant 2 heures à la température ambiante dans l'obscurité avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa fluorophores. Utilisez le chèvre anti-lapin approprié ou anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à Alexa 350 ou 488.
    4. Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver les tranches à trois reprises avec une solution saline tamponnée au Tris (TBS); monter sur des lames de verre et lamelle les diapositives avec Mowiol.
  5. Microscopie des coupes colorées
  6. Voir les coupes colorées soit sur un microscope standard avec un équipement à épifluorescence ou avec un microscope confocal. Prenez des photos avec un appareil photo approprié. Pour certaines images, inverser le contraste de fluorescence afin de produire des navires sombre colorées sur un fond lumineux (figures 5 et 6).

5 Détermination de la densité du navire régional dans les cultures

  1. Quantifier la vessel densité basé sur les passages de navires comme décrit dans la référence 8.
  2. Utilisez coupes colorées pour la laminine pour ces mesures. Superposer les images enregistrées de grossissement de 10X avec une grille 6 x 6, où chaque grille est égale à 100 x 100 um par mètre carré, champ total de 0,25 mm 2.
  3. Superposer trois de ces réseaux dans la région CA1, CA3, DG, et CE (figure 2). Comptez le nombre de navires traversant les lignes de la grille.
  4. Pour obtenir des résultats avec un bon niveau de pertinence statistique, effectuer des mesures dans au moins trois expériences indépendantes, chacune comprenant des données à partir de 3 souriceaux avec 3 tranches par chiot de la souris.
  5. Déterminer la valeur moyenne de passages de navires dans les grilles de chaque région et d'effectuer une analyse statistique par ANOVA avec correction de Bonferroni comme test post hoc (p <0,05 défini comme significatif) en utilisant un logiciel de statistique appropriée.

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Representative Results

Privation d'oxygène et de glucose hypoxie induisent la mort neuronale et de la réduction d'un vaisseau sanguin en particulier dans la région CA1 de l'hippocampe.
OGD ou la privation de l'oxygène seul pendant 15 min ont induit une forte induction de la mort cellulaire comme on le voit par l'iodure de propidium en particulier dans la zone CA1 de l'hippocampe (figure 3) similaire à celle décrite précédemment 7. Avec les marqueurs de visualiser le réseau de vaisseaux sanguins, on a constaté que la densité des vaisseaux sanguins et sont apparus organisation similaire au contrôle après une provocation OGD dans la plupart des parties de la culture à l'exception de la région CA1. Il la densité des vaisseaux sanguins a été diminué et le réseau de vaisseaux sanguins a été partiellement perturbé (figure 3, E et F). Ces changements ont été observés seulement dans la zone où la coloration à l'iodure de propidium a été augmentée.

L'évolution dans le temps des changements vasculaires parallèle à celle de neurdégénérescence onal.
Nous avons étudié l'évolution dans le temps des deux dégénérescence neuronale et le sang perte de navire dans CA1 utilisant des points de temps à 3 h, 24 h et 48 h après la privation d'oxygène (hypoxie). A 3 heures après l'hypoxie, il n'y avait pas l'iodure de propidium visible et aucun changement n'a été présents dans l'architecture des vaisseaux sanguins indiquant qu'à cette époque aucun changement n'est encore visible (Figure 4, A et B). À 24 h après l'hypoxie était apparition de l'iodure de propidium indique la progression de la mort cellulaire dans CA1. A ce point de temps, le réseau de vaisseaux sanguins a été déjà perturbée et les vaisseaux sanguins ont été perdus dans la région CA1 (Figure 4, C et D). Les deux, l'iodure de propidium et la perte de sang des vaisseaux est devenu plus prononcé à 48 heures après l'hypoxie (Figure 4, E et F).

Tant la mort neuronale etla perte de sang des vaisseaux sont empêchés par le blocage excitation après les autres ministères ou hypoxie.
Lorsque nous avons combiné les autres ministères avec des traitements pharmacologiques qui ont empêché la libération de glutamate en excès, il était possible de sauver les neurones de la mort cellulaire induite par les autres ministères. Le traitement par la TTX (qui inhibe l'action génération de potentiel résultant de la mise sous silence de terminaisons afférentes) ou traitement avec CNQX (qui inhibe les récepteurs de glutamate de type AMPA) des cellules pyramidales CA1 sauvées de la mort neuronale (figure 5, D et F). Ces résultats indiquent que la mort neuronale après les autres ministères est médiée par l'action du glutamate excitotoxique. Après ces traitements, non seulement la mort neuronale a été empêchée, mais aussi l'intégrité de la cuve a été préservée et la perte de vaisseaux sanguins a été empêchée dans CA1 (Figure 5, C et E).

Traitement AMPA induit la mort neuronale excitotoxique répandue dans les bu de l'hippocampet la perte du navire est limitée à CA1.
D'autres ministères que celui utilisé dans cette étude induit la mort des neurones spécifiquement dans CA1. En revanche, le traitement avec 100 uM pendant 30 min AMPA induit une perte neuronale répandu dans l'ensemble de corne d'Ammon de l'hippocampe (CA1 et CA3) et le subiculum, mais pas dans le corps godronné (Figure 6C). Fait intéressant, la perte de vaisseaux sanguins a été confinée à la région CA1, en ​​dépit d'une perte neuronale dans la même CA3 n'y avait pas de perte de sang du vaisseau dans cette région (Figure 6D). Dans le corps godronné il n'y avait ni mort ni vaisseau sanguin perte neuronale. La quantification de la densité des vaisseaux confirme que les vaisseaux sanguins sont perdus dans CA1, mais pas dans les autres régions de la culture figure 6E.

Figure 1
Figure 1: Calendrier de l'exposition des autres ministères et reperfusion. Après 5 jours dans des cultures in vitro sont soumises à une OGD, de l'hypoxie ou le traitement de l'AMPA. Les cultures sont fixées après une durée de survie de 3 h, 24 h et 48 h.

Figure 2
Figure 2: La quantification de la densité de vaisseaux sanguins dans les différentes régions des cultures de tranches hippocampiques-entorhino. Trois grilles 6 x 6 (ici représentées par des carrés), sont superposées dans la région CA1, CA3, DG, et CE. Les vaisseaux sanguins qui traversent les lignes intérieures de la grille ont été comptées pour chaque carré.

Figure 3
Figure traitement 3. hypoxie induit la mort neuronale et la perte de sang des vaisseaux dans CA1. (A,C, E) des cultures témoins, (B, D, F), les cultures soumises au traitement de l'hypoxie suivie de 48 heures de normoxie. Laminine immunomarquage à faible grossissement en vert (A, B), coloration PI à plus fort grossissement en rouge (C D), a fusionné images pour la laminine et coloration PI (E) et (F). Les barres d'échelle dans (B pour A, B) et (F C, ​​D, E, F) = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Évolution dans le temps des changements vasculaires et neuronalesdégénérescence après la privation d'oxygène (hypoxie). PI de coloration en rouge illustré en (A, C, E), a fusionné les images pour coloration PI et la laminine (vert) représentés dans (B, D, F). Au traitement post hypoxie de 3 heures, il n'y a pas PI coloration visible et aucun changement vasculaires sont évidents (A, B). Après 24 h PI coloration ressort et la perte de vaisseau sanguin est également évident (C, D). Les colorations de PI et la perte de sang des vaisseaux deviennent plus évidents après 48 h (E, F). La barre d'échelle dans (F) = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5.; Mort neuronale et des vaisseaux sanguins perte sont empêchés par des inhibiteurs de l'excitation neuronale application soit TTX (C, D) ou CNQX (E, F) a empêché à la fois la perte neuronale comme on le voit avec coloration PI (B, D, F) et des vaisseaux sanguins. perte en évidence par la coloration de la laminine (A, C, E). OGD seul induit à la fois la perte neuronale et à la perte de vaisseaux sanguins dans CA1 (A, B). La barre d'échelle dans (F) = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6 Mort neuronale et la perte de sang du navire après le traitement AMPA. Traitement avec 100 uM AMPA pendant 30 min induite généraliséela perte neuronale dans la plupart des régions de l'hippocampe (C), mais la perte de vaisseaux sanguins sont restés restreint à la zone CA1 (D). La barre d'échelle dans (D) = 100 um. La quantification des vaisseaux sanguins confirme la perte sélective de la zone CA1 (E). Colonnes indiquent le nombre moyen de passages de navires, les barres d'erreur indiquant la SEM. Les différences significatives sont indiquées par ** P <0,01. Les résultats ont été tirés à partir de trois expériences indépendantes avec trois cultures analysées chaque (n = 9) pour chaque région. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Temps Action
DIV 4 Préparer autres ministères ou du milieu de l'hypoxie
DIV 4 Perfuser l'OGD oumoyen de l'hypoxie avec N 2 pendant 1 heure dans une chambre d'hypoxie et puis sceller et garder O / N dans un incubateur à 37 ° C
DIV 4 Mettez les cultures à un milieu sans sérum Neurobasal + glucose à partir du milieu d'incubation, de leur permettre de se reposer O / N ou un jour
DIV 5 Perfuser à nouveau le support d'autres ministères avec N 2 pendant 30 min
DIV 5 Ajouter 2 ul de 1 mg / ml d'iodure de propidium (PI) solution par puits (pour une concentration finale de 2 pg / ml) pour les tranches pendant 30 minutes et sélectionner uniquement les tranches sains pour l'expérimentation, comme indiqué par un faible nombre de cellules positives PI
DIV 5 Sucer le milieu ordinaire et ajouter du milieu des autres ministères dans les puits. Assurez-vous que tous les fluides qui restent sur les côtés de l'insert sont aspirés loin lorsque les cultures sont passés du milieu régulier à moyen AM / de l'hypoxie et à l'arrière. Transférer la plaque de la chambre de l'hypoxie
DIV 5 Perfuser avec N2 pendant 15 min dans la chambre de l'hypoxie
DIV 5 Retirer la plaque de la chambre. Revenez à moyen Neurobasal et replacer dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2
DIV 5 Ajouter PI et fixer 3 heures après AM / hypoxie pour l'intervalle de 3 heures
DIV 6 Ajouter PI et fixer 24 heures après AM / hypoxie pour l'intervalle de 24 heures
DIV 7 Ajouter PI et fixer 48 heures après AM / hypoxie pour l'intervalle de 48 heures

Tableau 1 séquence temporelle détaillée des étapes de traitement AMG / hypoxie.

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Discussion

Avec les méthodes présentées ici, les cultures organotypiques d'hippocampe de tranche peuvent être utilisés comme un outil polyvalent pour étudier les changements en matière plastique dans le tissu neuronal après une blessure. Bien que les cultures de tranches organotypiques ont été utilisés dans le passé pour l'étude de réactions neuronales après une ischémie de 6, 7, du nouvel aspect de l'étude simultanée de changements vasculaires améliore considérablement les applications possibles de ce procédé. L'induction de l'hypoxie ou OGD seul peut être appliquée par des moyens relativement simples dans des cultures de tranches organotypiques et entraîne des dommages fiable et reproductible dans le tissu neural. En outre, l'approche de la culture de la tranche permet non seulement d'étudier les conséquences de défi ischémique mais permet également des tests de mesures thérapeutiques potentielles visant à la neuroprotection. Cultures tranche sont donc un outil intéressant et important pour l'étude des lésions cérébrales ischémiques.

La méthode présentée ici est facile à mettre en œuvre pour tous les laboratoires haVing une certaine expérience avec les cultures tranche du SNC. Application de l'hypoxie ou OGD nécessite un équilibre soigneux du milieu de culture avec du N 2 pour obtenir des résultats reproductibles. Il est également important de cultures seulement l'utilisation de tranches avec un faible nombre de cellules PI-positif avant l'application de l'OGD. Les conditions d'hypoxie (c'est à dire, le temps pendant lequel l'hypoxie ou d'autres ministères sont appliqués) peuvent être variées et optimisé en fonction du type de culture de tranche utilisé.

Bien que les réactions neuronales à l'ischémie ont été largement étudiés, il ya peu d'informations disponibles sur les changements vasculaires après une lésion cérébrale hypoxique-ischémique. La constatation que les vaisseaux sanguins et même les marqueurs de la barrière hémato-encéphalique sont maintenus dans des cultures organotypique pour une semaine 8, 9 a ouvert la possibilité d'étudier les changements de la vascularisation après l'épreuve de l'hypoxie dans le cadre des cultures organotypique d'hippocampe 10. Bien sûr, il doitêtre réalisé que les navires qui sont maintenues cultures tranche ne sont pas perfusées. En outre, nous avons observé des différences dans la perte de vaisseaux sanguins préexistants, plutôt que la formation complète de nouveaux vaisseaux sanguins. Ce système modèle est donc probablement pas optimal pour l'étude de formation de nouveaux vaisseaux après une lésion ischémique.

La possibilité d'utiliser les cultures tranche de l'hippocampe organotypiques pour la poursuite de l'élucidation de l'interaction complexe entre les neurones et les vaisseaux ouvre un nouveau champ d'étude et promet de contribuer à la réalisation d'une meilleure compréhension et le développement de nouvelles options de traitement pour les troubles neurovasculaires, en particulier l'ischémie cérébrale après accident vasculaire cérébral.

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Disclosures

Les expérimentations animales ont été effectuées conformément à la directive du Conseil Communautés européennes du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses. Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l'Université de Bâle, Département de la biomédecine, et le Fonds national suisse (31003A_141007). Markus Saxer a fourni un appui technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium MEM Gibco 11012-044
Glutamax Gibco 35050-061 stabilized form of L-glutamine
Millicell cell culture inserts Millipore PICM03050
Basal medium Eagle  Gibco 41010-026
Horse serum Gibco 26050-088
Neurobasal medium Gibco 21103-049
B27 supplement Gibco 17504-044
Anaerobic strips Sigma-Aldrich 59886
Propidium iodide solution Sigma-Aldrich P4864
AMPA R&D systems 0169-10
CNQX R&D systems 0190/10
TTX R&D systems 1078/1
polyclonal anti-laminin Sigma-Aldrich L9393 
anti-MAP2 Abcam ab11267
Alexa anti-mouse 350 Molecular Probes A11045
Alexa anti-mouse 488 Molecular Probes A11001
Alexa anti-rabbit 350 Molecular Probes A11046
Alexa anti-rabbit 488 Molecular Probes A11008
Statistics software GraphPad Software GraphPad Prism
McIlwain tissue chopper Ted Pella 10180
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101

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References

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Neurobiologie Numéro 92 le sang-cerveau-barrière le remodelage neurovasculaire l'hippocampe les cellules pyramidales excitotoxic ischémie
L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche
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Chip, S., Zhu, X., Kapfhammer, J. P. The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (92), e52023, doi:10.3791/52023 (2014).

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