Summary
Vi presenterar ett protokoll för att isolera nervceller, makrofager och mikroglia från larval zebrafiskar hjärnor under fysiologiska och patologiska förhållanden. Vid isolering utvinns RNA från dessa celler att analysera deras gen uttryck profil. Detta protokoll möjliggör insamling av hög kvalitet RNA för att utföra efterföljande analys som qPCR och transkriptomik.
Abstract
För att få en detaljerad förståelse av olika CNS celler under utveckling eller de skapande roll och progression av hjärnan patologier, är det viktigt att isolera dessa celler utan att ändra deras gen uttryck profil. Zebrafisk modellen ger ett stort antal transgen fisk linjer där specifika celltyper är märkta; till exempel nervceller i NBT:DsRed linjen eller makrofager/mikroglia i raden mpeg1:eGFP. Dessutom antikroppar har utvecklats för att färga specifika celler, såsom mikroglia med 4 c 4 antikropp.
Här beskriver vi isolering av nervceller, makrofager och mikroglia från larval zebrafiskar hjärnor. Centralt för detta protokoll är undvikandet av en enzymatisk vävnad matsmältningen vid 37 ° C, som kunde ändra cellulära profiler. I stället används ett mekaniskt system av vävnad homogenisering vid 4 ° C. Detta protokoll innebär homogenisering av hjärnor till cellsuspension, deras immuno-färgning och isoleringen av nervceller, makrofager och mikroglia av FACS. Efteråt kan vi extraherade RNA från dessa celler och utvärderade deras kvalitet/kvantitet. Vi lyckades få RNA av hög kvalitet (RNA integritet nummer (RIN) > 7) att utföra qPCR på makrofager/mikroglia och nervceller, och transcriptomic analys av mikroglia. Detta tillvägagångssätt möjliggör en bättre karakterisering av dessa celler, samt en tydligare förståelse om deras roll i utveckling och sjukdomar.
Introduction
Kunskapen om hjärnans utveckling och sjukdomar i hjärnan har förbättrats avsevärt under det senaste decenniet sedan första kvantifiering av mus hjärnan transcriptomes1. Faktiskt, genomanalys brett gen uttryck ger oss tillgång till genetisk information om hjärnans vävnader och celler som kan komplettera och förbättra iakttagelser med andra tekniker och verktyg.
Zebrafiskar är en potent biologiska modell, lätt att odla och ändra genetiskt; dess optisk transparens larval skeden tillåter levande avbildning observationer2. Tyvärr, jämfört till mänskliga och mus, antalet tillgängliga antikroppar att utföra immuno-färgning är ganska låg. För att åtgärda detta, görs transgena zebrafiskar fisk linjerna enkelt genom att genetiskt modifiera fisk att uttrycka fluorescerande proteiner under cell typ specifika initiativtagare. Transgena zebrafiskar linjer har använts i förflutnan för att studera makrofager och mikroglia roll under centrala nervsystemet (CNS) utveckling och sjukdom3,4,5,6. Men för att få detaljerad förståelse av dessa processer måste vi förstå förändringar i genuttryck i de respektiva celltyper. I detta syfte utvecklade vi en experimentell metod för att specifikt isolera cellerna som nervceller, makrofager och mikroglia från 3 till 8 dagar efter befruktning (dpf) larval zebrafiskar hjärnor. För etableringen av protokollet arbetade vi med transgen fisk rader som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i makrofager/mikroglia under makrofag-uttryckta gen arrangören (mpeg1:eGFP) och DsRed i nervceller under det neurala ß-tubulinet arrangören (NBT:DsRed)7,8,9. Dessutom har vi utfört immuno-färgning av mikroglia använder 4 c 4, en mus monoklonal antikropp som specifikt fläckar zebrafiskar mikroglia10,11. Efteråt, ribonukleinsyra (RNA) utvinns ur dessa celler för ytterligare kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) eller transkriptom analyser. Detta protokoll har utformats för att effektivt homogenisera hjärnvävnad från zebrafisk larver; samla nervceller, makrofager/mikroglia och mikroglia utan ändring av deras plasmamembranet integritet och slutligen extrahera RNA från dessa celler i hög kvalitet (RIN > 7) och kvantitet att utföra genomisk analys. Till skillnad från tidigare publicerade studier som använder trypsin behandling vid 37 ° C för att smälta hjärnans vävnad12,13, främjar detta protokoll arbete vid 4 ° C tills det RNA extraktion steget att minska modifieringar av gen uttryck profilen. Detta steg är avgörande som mikroglia och makrofager är mycket känsliga celler som reagera på förändringar i sin mikromiljö omedelbart genom att ändra deras gen uttryck profil och polarisering14,15, 16.
Protokollet beskrivs här i detalj, visar isolering av nervceller, makrofager och mikroglia från zebrafisk larval hjärnor, men nästan, det kan anpassas till alla andra celler presentera inom hjärnan - antingen med hjälp av transgen fisk rader eller märkta med specifika antikroppar. Denna metod kommer att möjliggöra en bättre karakterisering av CNS celler via deras genome bred gen uttryck analyser och hjälper till att förstå sin roll under utveckling och sjukdomar i hjärnan.
Protocol
1. prov och Media förberedelse
- Förbereda embryo medium (E3) genom upplösning 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O i H2O.
- Samla zebrafiskar embryon omedelbart efter befruktningen (0 dpf).
- Splittrades zebrafiskar embryon till 50 per 90 mm petriskål. Höja embryon på 28,5 ° C i 50 mL av embryo medium (E3) behandlades med 200 µM 1-fenyl 2-tiourea (PTU), från slutet av den första dagen av utveckling (0 dpf) under hela försöket att hämma pigmentering.
- Förändring på E3 + PTU medium dagligen under hela försöket.
- Skärmen mpeg1:eGFP och NBT:DsRed larver på 2 dpf med ett fluorescerande stereomikroskop för positiva transgenens uttryck, GFP+ makrofager/mikroglia och DsRed+ nervceller.
- Förbereda alla medier dagen innan experimentet under en vävnadskultur huva att undvika kontaminering och sedan lagra dem vid 4 ° C.
- Förbereda media A genom upplösning 15 mM Hepes och 25 mM D-glukos i HBSS 1 x.
- Förbered täthet lutning medium (100%) genom att blanda 9 volymer av täthet lutning medium i 1 volymdel HBSS 10 x.
- Förbereda täthet lutning medium (22%) genom att späda ut 22 mL täthet lutning medium (100%) i 88 mL DPBS 1 x.
- Förbereda DPBS 1 x.
- Förbereda E3 medium + Tricaine genom att blanda E3 medium med 450 μM Tricaine.
2. homogenisering
Obs: Alla steg är genomförda 4 ° C.
- Tillsätt 1,5 mL Tricaine (15 mM) till 90 mm petriskålar som innehåller 50 larver i 50 mL E3 embryo medium behandlades med 200 µM PTU till obotligt söva dem.
- Suga upp 10 sövda larver från Petriskålarna med en 3 mL Pasteur plast bulk pipett.
- Överföring sövda larver 10 av 10 i en 55 mm petriskål fylld med iskall E3 embryo medium + Tricaine.
- Under ett stereomikroskop, justera 10 larver i mitten av petriskål. Sedan transekt larval huvuden ovan gulesäcken med kirurgisk mikro-sax (utesluta simblåsa för att undvika flytande huvuden).
- Suga upp huvuden från Petriskålarna med en 3 mL Pasteur plast bulk pipett. Vänta tills alla huvuden samla inom pipettspetsen och sedan överföra dem till en glas Homogenisatorer som innehåller 1 mL iskallt Media A (transfer i en minimal volym minska Media en utspädning av E3 + Tricaine). Hålla glas homogenisatorn på is. Använd en Homogenisatorer per experimentella villkor.
- Byt ut varje liten petriskål som innehåller ice cold E3 + Tricaine med en ny varje 30 min att försäkra att transection utförs i kalla E3 + Tricaine medium.
- Ersätta den iskalla Media A i glas homogenisatorn när färgen börjar blekna.
Obs: Media A utspädning kan förändra den huvud vävnaden på grund av temperaturförändringar. - När alla huvuden har samlats (600 huvuden/villkor), ta bort maxvolymen Media a från glas Homogenisatorer och ersätta det med 1 mL färsk iskall Media A.
- Störa hjärnvävnad med en tight glas Homogenisatorer på is. Utföra 40 rundor av krossning och vänder för 3-5 dpf larver och 50 för 7 och 8 dpf larver.
- Tillsätt 2 mL av Media A till cellsuspension (1 mL Media A / 200 huvuden), som kommer att späda ut celler och minska deras tätort med myelin att underlätta deras separation under centrifugering i täthet lutning medium.
- För att eliminera cell gytter, kör cellsuspensionen genom en 40 µm cell SIL placeras ovanpå en kall 50 mL falconrör underhålls på is. Upprepa detta 3 gånger.
- Överför 1 mL cellsuspension i kalla 1,5 mL rör och snurra dem på 300 g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten med en 10 mL spruta + nål 23G x 1''.
- Återsuspendering cellpelleten med 1 mL iskallt 22% täthet lutning medium försiktigt överlagras av 0,5 mL iskallt DPBS 1 x (gör inte blanda dem, en interfasen mellan båda lösningarna kommer att ses).
- Snurra rören på 950 g utan broms och långsam acceleration under 30 minuter vid 4 ° C.
Obs: Det här steget separerar myelin från andra celler genom att binda det i interphasen av DPBS 1 x och 22% täthet lutning medium, medan celler kommer pellets på botten av röret. Myelin borttagning är effektivare när cellkoncentrationen inte är alltför hög. - Använda en 10 mL spruta + nål 23G x 1'' kassera högst DPBS, täthet lutning medium och myelin instängd på deras interphase.
- Tvätta cellerna med 0,5 mL av Media A + 2% av normal get serum (NGS) och sedan snurra rören på 300 g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten maximalt, då pool alla cell pellets från samma experimentella skick tillsammans i 1 mL av Media A + 2% NGS.
- Snurra rören på 950 g utan broms och långsam acceleration under 30 minuter vid 4 ° C.
- Om cellerna i intresse uttrycker en fluorescerande proteiner som makrofager/mikroglia från mpeg1:eGFP eller nervceller från NBT:DsRed transgen fisk (screening av transgen fisk Se 1.1.3), kör cellsuspensionen genom en sil med 35 µm i cell cap och överföra dem till en kall 5 mL FACS rören på is, skyddas från ljus.
Obs: Alternativt, immuno-färgning av mikroglia kan utföras.
3. mikroglia Immuno-färgning
Obs: Alla steg utförs vid 4 ° C.
- Återsuspendering cellpelleten med 0,3 mL av Media A + 2% NGS. Dela upp dem i 3 x 1,5 mL rör: en för ofärgade celler att mäta auto-fluorescens från celler av intresse, andra för den sekundära antikroppen (1/200) att mäta icke-specifik bindning av sekundär antikropp till mikroglia och tredje som ett test (4 c 4 mus monoklonal antikropp (mikroglia specifika) (1/20) + sekundär antikropp (1/200)).
- Lägg till låg Endotoxin, natriumazid-fri (blad) på 1% till celler (alla rör) att blockera CD16/CD32 interaktioner med Fc domänen av immunglobuliner. Inkubera cellerna i 10 min med mild agitation var 5 minut.
- Lägg till de 4 c 4 antikropp (1/20) till celler (3 rör) och inkubera i 30 min med försiktig skakning varje 10 min.
- Rör vid 300 g i 10 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten.
- Tvätta en gång med 0,5 mL av Media A + 2% NGS, sedan snurra rören på 300 g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendering cellpelleten med 0,5 ml av Media A + 2% NGS och inkubera cellerna med blad på 1% för 10 min med mild agitation var 5 minut.
- Lägga till sekundära antikroppar (1/200) i celler (tub 2 och 3). Inkubera cellerna för 30 min med försiktig skakning varje 10 min och lätt skydd.
- Rör vid 300 g i 10 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten.
- Tvätta två gånger med 0,5 mL av Media A + 2% NGS, sedan återsuspendering cellpelleten med 1 mL av Media A + 2% NGS.
- Kör cellsuspension genom ett 35 µm cell SIL lock och överföra dem till kalla 5 mL FACS rör på is, skyddas från ljus.
4. cell sortering (FACS)
Obs: Utföra alla steg vid 4 ° C.
- Sortera nervceller, makrofager/mikroglia och mikroglia använder en FACS.
Obs: Detta steg utförs vanligtvis av en anställd i anläggningen FACS och inställningar beror på vilken typ av utrustning som används.- Lägg till DAPI vid en koncentration på 1 µg/mL i varje FACS tube att märka döda celler.
- Ställa in FACS och sortera nervceller, makrofager/mikroglia eller mikroglia från alla hjärnceller. Separera celler från skräp i funktion av deras storlek och granularitet, sedan gate singel-celler av framåt scatter och side scatter. Utesluta döda celler av DAPI märkning från levande celler. Identifiera nervceller, makrofager/mikroglia eller mikroglia av deras respektive positiv färgning.
- Samla in celler i 1,5 mL tuber innehållande 1 mL iskallt Media A + 2% NGS på is. Använd olika rör för varje celltyp.
- Snurra rören vid 300 g i 10 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten.
- Tvätta en gång med 0,5 mL av Media A sedan Kassera supernatanten maximalt.
5. RNA-extraktion
- Extrahera RNA från de olika celltyper som avgränsade med FACS. För RNA-extraktion använda en specifik kit och följ tillverkarens riktlinjer. Se till att arbeta i en RNase gratis miljö genom rengöring arbetsyta och pipetter med en RNase sanering produkt och använda filter tips.
- Nymalen förbereda 1 mL lyseringsbuffert kompletteras med 50 µM β-merkaptoetanol.
Obs: Β-merkaptoetanol läggs här, för att minska RNA nedbrytning. - Bered 70% och 80% etanol använder RNase gratis vatten.
- Lysera celler med 75 µL lyseringsbuffert kompletteras med 50 µM β-merkaptoetanol. Använd sedan en dokumentförstörare för att förbättra cell störningar.
- Fortsätt RNA-extraktion enligt tillverkarens bruksanvisning.
- I slutet av protokollet, eluera RNA med 14 µL RNase gratis vatten för att få en tillräcklig RNA-koncentrationen.
- Nymalen förbereda 1 mL lyseringsbuffert kompletteras med 50 µM β-merkaptoetanol.
Representative Results
Protokollet beskrivs är en okomplicerad metod att isolera nervceller, makrofager och mikroglia från zebrafisk larval hjärnor. Från dessa isolerade celler, betydande mängder av hög kvalitet (RIN > 7) RNA extraherades. Syftet med detta protokoll är att isolera olika typer av celler från CNS, med minimal modifiering av deras gen uttryck profil att analysera och karakterisera Cellegenskaper och funktioner. Därför utförs hela protokollet vid 4 ° C med en mekanisk hjärnans vävnad homogenisering. Denna metod har använts framgångsrikt i två studier som utförts i laboratorium. I den första studien var nervceller och makrofager/mikroglia isolerade från 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larver (figur 1). FACS tillåtet cellseparation från skräp i funktionen av deras storlek (FSC-A) och kornighet (SSC-A) (figur 1A). Enstaka celler skildes sedan från midjekort jacka eller cell agglomeratbildning (figur 1B). Från befolkningens enda cell drogs en grind för att eliminera döda celler (DAPI+). Motsvarande dot tomten avslöjade att detta experimentellt protokoll bevarar cellernas plasmamembran integritet, som döda celler är endast 26,7% (figur 1C). Slutligen, nervceller (DsRed+) och makrofager/mikroglia (GFP+) var lätt åtskilda från levande cell befolkningen grindarna. Neuron befolkningen (23,1%) verkade vara mer framträdande än befolkningen i makrofager/mikroglia (1,56%) i hjärnan (figur 1D). Detta protokoll har tillåtit för att isolera RNA från dessa celler för att utföra efterföljande qPCR analyser för att jämföra uttrycket av specifika gener mellan nervceller och makrofager/mikroglia. Figur 2 visar neuronala och makrofager/mikroglia gen uttryck nivåer av prolifererande celler nukleär antigen (pcna)mot β-aktin städning genen som ett exempel.
För den andra studien fokuserade denna metod på mikroglia isolering från 3, 5 och 7 dpf larval hjärnor. I motsats till de experiment som beskrivs ovan, isolerades celler av immuno-färgning med 4 c 4, en antikropp som specifikt etiketter mikroglia (figur 3 A-D). Som tidigare beskrivits, mikroglia (4 c 4+) valdes från levande celler och samlas in (figur 3D). Mikroglia nummer inom zebrafiskar larval hjärnor är varierande (tabell 1), och mycket låg på 3 dpf (∼ 25 per fisk). Kvalitet och kvantitet av extraherade RNA från dessa celler mättes med hjälp av en mikro-kapillär elektrofores baserat system. Resultaten av extraherade RNA från mikroglia av 5 dpf larval zebrafiskar hjärnor har lämnats till illustrera hur RNA analys (tabell 1 (5 dpf; experiment 4)). Figur 4 visar elektrofores tracen och dess grafiska återgivning som erhållits för detta prov med en tydlig visualisering av ribosomalt RNA (28s och 18s). Dessa data är nödvändigt att beräkna prov RIN och bestämma RNA-koncentrationen. Tabell 1 sammanfattar antalet isolerade mikroglia per fisk, mängden RNA per mikroglia och RIN poäng erhålls för varje olika experiment på 3, 5 och 7 dpf. Beloppet och kvaliteten på extraherade RNA från isolerade mikroglia här metoden tillät oss att förstärka RNA till cDNA med ett kit. Kvalitet och kvantitet tester som tillhandahålls av Edinburgh genforskning bekräftar att den förstärkta cDNA är av tillräcklig kvalitet för bibliotek förberedelser och efterföljande sekvensering. Figur 5 visar storlek distribution av cDNA fragment och deras belopp mätt med ett elektroforetiska system. I det här exemplet cDNA hade en genomsnittlig storlek på 299bp med en koncentration på 36100 pmol/l. tabell 2 illustrerar respektive kvalitet och kvantitet tester görs på förstärkta cDNA från RNA prover (tabell 1 (5 dpf; experiment 4)). Den förstärkta cDNA har använts framgångsrikt för sekvensering.
Flera studier genomförda i laboratoriet bekräftade att kvalitet och kvantitet av extraherade RNA från nervceller, makrofager och mikroglia kan användas för efterföljande qPCR och genome bred gen uttryck analyser. Detta experimentellt protokoll kan därför användas för att tillförlitligt isolera olika typer av CNS celler utan att ändra deras membran integritet och begränsa ändring av deras gen uttryck profil.
Figur 1 : FACS sortering för nervceller och makrofager/mikroglia från mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf zebrafiskar larver. (A-C) Successiva gating visar sekventiellt urval av alla hjärnans celler (A), enstaka celler av framåt scatter och side scatter (B). (C) döda celler har undantagits av DAPI märkning. (D) nervceller och makrofager/mikroglia identifierades respektive av DsRed och god Jordbrukarsed positiv färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Gen uttryck analys för pcna och β-aktin i nervceller och makrofager/mikroglia. RNA från isolerade nervceller och makrofager/mikroglia kan transkriberas till cDNA för användning i kvantitativa PCR-analys. mRNA-uttrycksnivåerna för pcna mot β-aktin städning gen i isolerad nervceller och makrofager/mikroglia bestäms av qPCR (N = 3). Fold change mättes med hjälp av metoden jämförande (ΔΔCT). Fel bar representerar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : FACS sortering för mikroglia från 3 dpf zebrafiskar larver. (A-C) Successiva Usenets Visa sekventiella urval av alla hjärnan cells (A), enstaka celler av framåt scatter och side scatter (B). (C) döda celler har undantagits av DAPI märkning. (D) mikroglia identifierades av 4 c 4 positiv färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Micro-kapillär elektrofores resultaten av extraherade RNA från 5 dpf zebrafiskar mikroglia. De två höga topparna är 18S och 28S ribosomal RNA. RNA integritet nummer (RIN) beräknas automatiskt av bioanalyzer programvara använder genererade förhållandet mellan 18S och 28S ribosomal subenheter och analys av hela elektroforetiska spårningen. Mikroglia RNA har en RIN 8,6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kvalitet och kvantitet tester av förstärkta cDNA från RNA-prov av 5 dpf zebrafiskar mikroglia. Bilden visar cDNA fragment storlek distribution av det analyserade provet med en genomsnittlig storlek på 299 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Villkor | Experiment | Fisk nummer | Antalet celler | Antalet celler per fisk | RNA-koncentrationen (pg/ul) | Total-RNA (pg) | RNA belopp per cell (pg) | RIN Poäng |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0,13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0,13 | 7,9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31,15 | 255 | 3060 | 0,16 | 7,7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18,54 | 189 | 2268 | 0,20 | 7,8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0,10 | 8,4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0,26 | 8,2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97,72 | 362 | 4344 | 0,07 | 7,4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0,13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0,09 | 8,3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0,07 | 8,6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74,95 | 134 | 1608 | 0,04 | 7,6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0,04 | 7,9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0,04 | 7,6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0,04 | 7,8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0,07 | 8,4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99,87 | 245 | 2940 | 0,08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7,8 |
Tabell 1: Sammanfattning av mikroglia isolering och RNA extraktion data från 3, 5 och 7 dpf zebrafiskar larver.
| Inre prov-ID | Externa prov-ID | Qubit (ng/ul) | Qubit(ng/UL) | Genomsnittlig koncentration (ng/ul) | Volym (ul) | UG fick | Godkänt/underkänt för lägsta koncentration | Godkänt/underkänt för reducera kvantitet | Godkänt/underkänt för rekommenderade kvantitet |
| 10907SD0010 | 5 dpf (experiment 4) | 58,8 | 58,4 | 58,6 | 30 | 1,76 | Passera | Passera | Passera |
| Prov krav för bibliotek Prep: | |||||||||
| Bibliotek Prep | Minsta kvantitet (ng) | Rekommenderade kvantiteten (ng) | Lägsta koncentration ng/uL | ||||||
| TruSeq Nano gel gratis 350 bp infoga bibliotek från cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Tabell 2: Antal tester av förstärkta cDNA från RNA-prov av 5 dpf zebrafiskar mikroglia.
Discussion
Det experimentella protokollet som beskrivs här representerar en robust och effektiv metod att isolera hjärnceller från zebrafisk larver från 3 till 8 dpf. Allt är detta det första protokollet som tillåter specifika isolering av mikroglia från larval zebrafiskar hjärnor. Protokollet syftar till att bevara cellmembranet integritet och att minimera potentiella ändringar av genuttryck som inträffar under behandlingen. Denna sista punkt är avgörande för betydelsen av resultat baserat på en analys av dessa isolerade cellulära genetiska profiler. Mikroglia och makrofag polarisering är faktiskt starkt influerad av sin mikromiljö. Vid 37 ° C, skulle dessa celler ha ändrat sin gen uttryck profil i svar på experimentella förhållanden (skada (transection) svar). Därför var det avgörande att utföra detta experiment vid 4 ° C före RNA-extraktion, att bromsa cellulära processer och metaboliska aktiviteter. Dessutom valdes mekaniska hjärnans vävnad homogenisering vid 4 ° C istället för enzymatisk vävnad matsmältningen vid 37 ° C för att undvika inverkan på gen uttryck profiler.
Det är viktigt att betona att denna metod är mycket snabb; inom en dag kan flera hjärnan cellpopulationer isoleras från minst två olika experimentella förhållanden och deras RNA extraherade. Den totala längden av protokollet beror på antalet larver används för varje villkor som transection av larval huvuden är det begränsande steget (∼ 350 huvuden/h). I allmänhet, för att arbeta med mikroglia från 3, 5 och 7 dpf rekommenderas att transekt ∼ 600 huvuden per test för att få tillräckligt RNA att extrahera (tabell 1). Som mikroglia representerar celltypen med den lägsta avkastning (ca 112 celler per capita på 7 dpf), antalet huvuden kan minskas för andra celltyper inklusive makrofager (ca 170 celler per capita på 7 dpf).
En annan fördel med detta protokoll är att när inställningarna på FACS Sorteraren har fastställts, samma inställningar kan användas för olika experiment. Det har observerats att cellpopulationer passar perfekt från ett experiment till en annan med grindar som tidigare designat, visar reproducerbarheten för experiment med denna metod.
En liten nackdel med denna metod är den relativt låga mängden RNA som skördas. Denna begränsning är dock mer en biologisk fråga än ett tekniskt problem, eftersom antalet mikroglia är mycket låg i tidiga skeden av hjärnans utveckling (tabell 1). På grund av detta låg mängd RNA samlas in, behöver förstärkning steg övervägas att utföra genomanalys brett gen uttryck. Lyckligtvis producerar stegen förstärkning tillräckliga mängder av hög kvalitet cDNA. Således, globala förändringar i genen uttryck profilerna isolerade celler kan studeras.
Avslutningsvis ger detta protokoll en robust metod för att isolera och studera olika CNS celltyper från larval zebrafiskar hjärnor. Detta kan användas för att få en djupare förståelse av dessa celler under utveckling samt att studera deras roll i sjukdomen.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Claire Davis och Dr Veronique Miron (drottningens Medical Research Institute, Edinburgh, United Kingdome) för första hjälp och diskussioner om den experimentella metoden och QMRI Flow flödescytometri och cellen sortera Facility. Detta arbete stöds av en Cancer Research UK karriär etablering Award till Dr. Dirk Sieger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
