Summary
在这里, 我们提出了一种合成和表征氧化铈纳米粒子 (nanoceria) 的协议, 用于在体内清除活性氧, nanoceria 在植物组织中进行共焦显微成像, 并在体内用共焦显微镜监测 nanoceria ROS 的清除。
Abstract
活性氧 (ROS) 的积累是植物非生物胁迫反应的标志。ROS 在植物中起着双重作用, 在低水平上充当信号分子, 在高水平上破坏分子。在被胁迫的植物中, ROS 的积聚会破坏代谢物、酶、脂类和 DNA, 从而减少植物生长和产量。氧化铈纳米粒子 (nanoceria) 在体内催化清除活性氧的能力为理解和生物工程植物非生物胁迫耐受提供了独特的工具。在这里, 我们提出了一个合成和表征聚 (丙烯酸) 酸涂层 nanoceria (民警) 的协议, 通过叶片渗透与植物界面的纳米微粒, 并监测其分布和 ROS 清除在体内使用共焦显微镜。目前用于操作植物中 ROS 积累的分子工具仅限于模型物种, 需要费力的转化方法。本协议的体内ROS 清除有可能适用于野生类型的植物, 宽叶和叶结构, 如拟南芥。
Introduction
氧化铈纳米粒子 (nanoceria) 广泛应用于生物, 从基础研究到生物工程, 由于其独特的催化活性氧 (ROS) 清除能力1,2,3。Nanoceria 有 ROS 清除能力由于大量表面氧气空缺交替在二氧化状态 (ce3 +和 Ce4 +) 4,5,6。Ce3 +悬垂键有效地清除 ROS, 而纳米晶格菌株通过氧化还原循环反应7促进这些缺陷部位的再生。Nanoceria 最近也被用于研究和工程植物功能8,9。非生物胁迫下的植物积累了 ROS, 对脂质、蛋白质和 DNA 造成氧化损伤10。在 nanoceria 植物中, 在体内活性氧的催化清除能在高光、高温和冷应力下改善植物光合作用8。nanoceria 对土壤的施用也增加了小麦的生物质量和籽粒产量11;nanoceria 处理的油菜 (甘蓝) 植株在盐胁迫下具有较高的植物生物量12。
Nanoceria 提供生物工程师和植物生物学家一个基于纳米技术的工具, 以了解非生物胁迫反应和提高植物非生物胁迫耐受性。Nanoceria 的体内活性氧清除能力是独立于植物物种, 并在植物组织的简便交付有潜力, 使广泛应用外的模型有机体。不像其他基于基因的方法, nanoceria 不需要产生植物线与抗氧化酶的过度表达, 以提高 ROS 清除能力13。nanoceria 对植物的叶片浸润是实验室研究的一种实用方法。
本议定书的总目标是描述 1) 带负电荷的聚 (丙烯酸) 酸 nanoceria (民警) 的合成和表征, 2) 在整个叶细胞内提供和跟踪全国民警, 3) 监测在体内。本协议合成了带负电荷的聚丙烯酸 (nanoceria) 酸 (民警), 并以其吸收谱、流体力学直径和泽塔电位为特征。我们描述了一种简单的叶片入渗方法, 以提供民警到植物叶组织。在体外显像的纳米颗粒在叶肉细胞中的分布, 用荧光染料 (DiI) 标记民警 (DiI), 并通过共焦荧光显微镜观察纳米粒子。最后, 我们解释如何通过共聚焦显微镜监测体内的ROS 清除。
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Protocol
1. 种植芥的植物
- 在5厘米 x 5 厘米的一次性花盆中播种一个.把32这些花盆放入一个装满水的塑料托盘 (0.5 厘米深), 把塑料托盘和植物转移到植物生长室。
- 设置生长室设置如下: 200 µmol/ms 光合活性辐射 (PAR), 24 1 °c 日和 21 @ 1 °c 夜, 60% 湿度, 14/10 h 天/夜光政权分别。
- 在一周的发芽之后, 每壶都要细细地留下一株。注意保持每个花盆中大小相同的幼苗。
- 每两天将自来水直接浇在塑料托盘上, 浇壶水。种植植物四周。南芥植物已准备好进一步使用。
2. 民警的综合和特性
- 在50毫升圆锥管中, 将硝酸铈 (III.) 重1.08 克, 并将其溶解在2.5 毫升的分子生物学级水中。
- 在50毫升圆锥管中, 将4.5 克的聚 (丙烯酸) 酸和溶解在5毫升分子生物级水中。
- 使用数字涡旋混合器, 将这两个解决方案彻底地混合在 2000 rpm 15 分钟。
- 将15毫升的氢氧化铵溶液 (7.2 米) 转移到50毫升玻璃烧杯中。
- 搅拌在 500 rpm, 加入混合物从步骤2.3 滴到氢氧化铵溶液和搅拌在 500 rpm 在室温下24小时的通风罩。
- 用一张纸盖上烧杯, 以避免夜间反应中的大量溶液损失。
- 24小时后, 将产生的溶液转移到50毫升圆锥管, 并将其离心在 3900 x g 处, 以去除任何可能的碎片和大团聚体。
- 将这22.5 毫升的上清液转化为三15毫升 10 kDa 过滤器, 用分子级水填充过滤器的其余部分, 使总稀释45毫升。
- 用台式离心机在15毫升 10 kDa 过滤器中加入上清液, 用 3900 x g 的离心机在15分钟内, 从游离聚合物和其他试剂中纯化上清溶液. 重复此步骤至少六次。
- 用 220-700 nm 的紫外-可见光分光光度计测量每个周期中淋洗的吸光度, 以确保最终的民警溶液中没有游离聚合物和其他试剂。
- 将收集的民警解决方案放入5毫升注射器中, 并用20纳米孔径注射器过滤器进行过滤。在50毫升锥形管中收集经过过滤的民警解决方案。
- 在塑料试管中采用稀释后的最终民警解决方案, 用 220-700 nm 的紫外可见光分光光度计测量其吸光度。刚果国民吸光度峰值为 271 nm。
- 用啤酒-兰伯特定律计算其浓度: A = εCL。a 是给定样本峰值的吸光度, ɛ是国民 (cm-1米-1) 的摩尔吸收系数, L 是光路长度 (试管宽度, 1 厘米), C 是被测纳米粒子的摩尔浓度。
- 使用粒子大小和泽塔电位分析仪测量合成的民警的水动力直径和泽塔电位 (图 1)。
- 将最终的民警解决方案存储在冰箱 (4 摄氏度), 直到进一步使用。
注: 请参阅吴等。8有关民警特性的更多协议详细信息。
3. 用 DiI 荧光染料标记民警
- 混合0.4 毫升5毫米 (58 毫克/升) 民警与3.6 毫升分子生物学级水在20毫升玻璃瓶和搅拌在 500 rpm。
- 添加24µL 11 '-dioctadecyl 33, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine 高氯酸染料溶液 (DiI, 2.5 毫克/毫升, 稀释在亚砜) 到176µL 的亚砜 (二甲基亚砜), 使 DiI 染料溶液。
- 将 DiI 染料滴入到民警溶液中, 在室温下搅动 1000 rpm 1 分钟。
- 将由此产生的混合物转化为15毫升 10 kDa 过滤器, 并用分子生物学级水填充管顶, 使总稀释15毫升。
- 从亚砜和任何可能的游离 DiI 染料中纯化 DiI 标记的民警 (DiI) 溶液, 其台式离心与15毫升 10 kDa 过滤器在 3900 x g 处5分钟。
- 重复步骤3.5 至少五次。
- 通过20纳米孔径注射器过滤器过滤最终的 DiI-民警解决方案。
- 用紫外-可见光分光光度法测量最终 DiI 的吸光度, 并根据啤酒-兰伯特定律计算其浓度 (图 2)。有关详细信息, 请参阅步骤2.13。
- 将其存储在4摄氏度的冰箱中以供进一步使用。
4. 植物叶片与民警的渗透
- 添加0.1 毫升的渗透缓冲 (100 毫米的附加费, 100 毫米氯化镁2, pH 值 7.5, 由 HCl 调整) 成0.9 毫升的0.5 毫米民警或 DiI-民警解决方案和涡旋。使用10毫米的污水附加入渗缓冲液作为负控制。
- 将0.2 毫升的民警或 DiI 渗透液转移到1毫升无菌无针注射器。点击删除任何可能的气泡。
- 在渗透纳米微粒之前, 从生长室中提取植株, 以避免在室温条件下可能的气孔闭合。
- 在入渗前, 用叶绿素计测定拟南芥叶片的叶绿素含量。测量每片叶子的三个复制 (每个复制包括至少三测量)14。选择具有相似叶绿素含量的拟南芥叶, 进行浸润试验。
- 用最近准备好的民警或 DiI--民警解决方案缓慢地将无针注射器的尖端向下渗透到叶子叶片的底部 (背面) 并压低柱塞 (图 3A)。
- 用一个微妙的任务雨刷 (图 3C) 轻轻地擦掉残留在叶片表面上的多余溶液 (图 3B), 并给植物贴上标签。为每组叶子使用新的微妙的任务湿巾。
- 在3小时内, 将 DiI 的植物放在长凳上进行叶适应和孵化.
注: 渗透到南芥植物, 然后准备进一步使用 (图 3D)。
5. 共焦显微镜用叶样的制备
- 将豌豆大小的观察凝胶卷到大约1厘米半径 (图 4a), 然后将其摊开, 直到它在玻璃滑块上1毫米薄 (图 4B)。
- 使用软木塞 (直径0.3 厘米) 在玻璃滑动的观察凝胶的中心切出圆形截面 (图 4C)。
- 完全用 perfluorodecalin (PFD) 填充切口, 以便在叶组织中更深入和更好地共聚焦成像分辨率。
- 使用软木塞 (直径0.2 厘米) 从适应的 DiI 收集叶盘--民警渗入了南芥植物 (图 4D)。
- 在 PFD 填充井中安装叶盘;面对渗透 (背面) 的叶子的一侧。
- 将方形盖玻片放在叶盘的顶部, 轻轻按下滑动盖玻片, 将其与观察凝胶的井封住, 确保没有气泡滞留 (图 4E)。
6. 用共焦显微镜成像 DiI 叶组织中的民警
- 在反向激光扫描共聚焦显微镜中使用40X 物镜。
- 在40X 物镜的顶部放置两到三滴 ddH2O。
- 将准备好的 DiI 在倒置的40X 物镜上, 将已制备的叶片样品滑动放在上面。
- 确保盖玻片一侧, 但不是玻璃滑动接触直接与 ddH2O 的镜头。
- 在显微镜下, 用激光光或明亮的磁场找到一个感兴趣的区域。
- 启动显微镜软件, 打开氩激光 (设定在 20%)。
- 设置针孔, 以收集小于2µm 的光学切片, 线平均为4。
- 图像的共聚焦显微镜设置的样品: 514 nm 激光激发 (30%);Z 堆叠截面厚度: 2 µm;PMT1: 550-615 nm (用于 DiI-民警成像);PMT2: 700-800 nm (用于叶绿体成像)。
- 采取代表性的共焦图像的叶子样本从不同的人, 至少三生物复制。
7. 用共焦显微镜对活体活性氧清除成像的实验观察
- 准备25µM 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein 双乙酸 (H2DCFDA, 一染料为表示一般 ROS) 和10µM dihydroethidium (DHE, 一种指示超氧化物阴离子) 染料的染料在工商业污水附加剂渗透缓冲 (pH 7.5) 在1.5 毫升离心管,分别。
- 使用软木钻 (直径0.2 厘米) 从适应的民警中收集叶盘渗透到南芥植物中.
- 使用钳尖尖, 使叶片上三到四孔, 加速染料加载过程。
- 将叶盘转移到离心管, 分别用 H2DCFDA 和 DHE, 在黑暗下孵化30分钟。
- 孵化后, 用 ddH2O 三次冲洗叶盘, 用观察凝胶将其装入玻璃滑梯 (见协议部分 5)。
- 将幻灯片放在共焦显微镜上, 并手动聚焦到叶肉细胞的区域。有关详细信息, 请参阅协议6节。
- 将叶盘暴露在紫外-A (405 nm) 激光器上, 3 分钟产生 ros, 并记录每叶圆盘的时间序列 ("xyt") 的 ros 信号强度变化。
- 用共聚焦显微镜对叶盘进行图像设置: 40X 水目标;496 nm 激光激发;PMT1: 500-600 nm (用于 DHE 和 DCFDA 染料检测);PMT2: 700-800 nm (用于叶绿体检测)。使用仅渗透缓冲液渗透的植物作为阴性控制。
8.从体外清除 H2O2
- 按照以前出版物3、8、15中的方法, 在体外进行合成民警的猫 (过氧化氢酶) 模拟活动
- 添加45.4 µL 的1x 附加费渗透缓冲 (10 毫米的附加费, 10 毫米氯化镁2, pH 7.5, 由 HCl 调整), 民警 (60 毫微米, 3 µL) 和 H2O2 (2 µM, 1 µL) 入井 (白色圆的底部96井板), 并且轻轻地混合它由吹打。
- 加入 10-乙酰基 37-dihydroxyphenoxazine (工作浓度100µM, 0.5 µL) 和辣根过氧化物酶 (HRP; 工作浓度 0.2 U/毫升, 0.1 µL) 入井, 轻轻地混合它由吹打, 孵化它为30分钟 10-乙酰基 37-dihydroxyphenoxazine反应与 H2O2和被转换成试卤灵在存在的 HRP。
- 在孵化过程中, 用铝箔包装盘子以避免光线。
- 用反应缓冲器或水代替 H2O2, 准备一个负控制。
- 除了库存解决方案, 在室温下准备所有其他解决方案。
- 孵化后, 与一个板块阅读器, 监测吸光度在 560 nm 使用试卤灵, 以表明水平的 H2O2。设置时间制度在0、2、5、10、20和30分钟。
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Representative Results
民警的合成和表征.
民警的合成、纯化和特点遵循了议定书第2节所述方法。图 1A显示了硝酸铈、临机局、硝酸铈和临机局的混合物和民警的溶液的着色。在合成了民警后, 从白色到浅黄色的颜色变化是可见的。用 10 kDa 过滤器纯化后, 民警的特征是紫外-可见光分光光度计。在 271 nm (图 1B) 观察到了刚果民警的吸光度峰值。最后的淋洗也被测量与紫外-对确认未反应的化学制品在净化期间被洗涤了。用粒子粒和泽塔电位分析仪 (图 1C) 测量了合成民警的水动力直径和泽塔电位。
DiI 染料标记.
为了确定纳米粒子在体内的分布情况, 在3号议定书中描述的方法中, 民警用荧光 DiI 染料进行了标记。DiI 染料自发嵌入在刚果国民涂料中, 因为它可以封装到 nanoceria16聚合物涂层内的疏水性领域。在向民警溶液中添加 DiI 染料后, 观察到粉红色的快速变色 (图 2a)。然后用 10 kDa 过滤器纯化 DiI, 并以紫外-可见光分光光度法进行表征。观察了三个标记为民警的 DiI 的吸光度明显峰值 (图 2B)。最后淋洗用紫外-可见光分光光度法测定, 以确认在提纯过程中未反应的化学物质被冲出。
叶片浸润。
民警或 DiI 通过叶片入渗方法被送进了南芥叶, 如协议第4节所述。叶被渗透在四不同的斑点, 以确保充分的叶面积灌注与民警解决方案 (图 3A)。任何剩余的解决方案都从叶表面删除 (图 3B和3C)。在从绿色到深绿色的渗透过程中, 叶色发生了变化 (图 3D)。注射器被轻轻地压在叶子上以避免任何物理伤害。
荧光显微镜的叶样制备。
叶片样品安装在玻璃幻灯片内的观察凝胶, 使充满了 PFD。在滚动的豌豆大小观察凝胶在幻灯片 (图 4A和4B), 井在平的凝胶中间被做了 (图 4C)。然后, 新鲜准备的叶子圆盘被转移到以前充满了 PFD 解决方案 (图 4D) 的井。盖玻片被用来固定幻灯片上的叶子样本 (图 4E)。
DiI 在体内的共焦成像.
DiI 通过共聚焦成像 (图 5A和5B) 在叶肉细胞中 DiI 的分布.为了使 DiI 和叶绿体之间的定位可视化, DiI-刚果-民警浸润的叶片样本被514纳米激光激发。DiI 的发射量为 550-615 nm, 以避免叶绿体色素信号在 650 nm17后可能受到的干扰。从 700-800 nm 中检测到叶绿体的叶绿素自动荧光。共焦成像设置 (激光功率和增益), 以确保没有 DiI 染料信号检测在控制叶样本 (渗透只有缓冲区) (图 5C)。在叶叶肉细胞中, DiI 与叶绿体的定位可以通过检测 DiI 和叶绿体色素自发荧光的叠加图像来观察 (图 5D)。
刚果民警 ROS 清除的共焦成像体内.
在10毫米的污水附加费缓冲液中, 刚果民警通过叶膜浸润方法, 如7号议定书第节所述, 被送到了南芥叶中.DHE (dihydroethidium) 和 H2DCFDA (-2′-、7′-dichlorodihydrofluorescein 双乙酸) 荧光染料用于在植物组织8,18中显示 ROS。已知2DCFDA 被转化为荧光 DCF (-2′-, 7′-dichlorofluorescein, 是一般氧化应激程度的指标), 原因是由 ROS19对醋酸盐基团进行裂解。DHE 是一种更具体的染料为超氧化物负离子具有其荧光产品 (2-hydroxyethidium) 增加后, 与超氧化物阴离子20的反应。体内在测量 DHE 和 DCF 染料荧光强度变化 (图6A 和 6B) 的叶盘中监测了由民警启用的 ROS 清除。496纳米激光激发了刚果民警的浸润叶样。DHE 和 DCF 染料的排放量设置在 500-600 nm, 以避免可能干扰叶绿体的自动荧光信号。从 700-800 nm 中检测到叶绿体色素的自动荧光。在紫外线胁迫3分钟后, 分别监测了刚果民警和缓冲渗透叶片样品中的 ROS 染料信号。与无纳米微粒缓冲控制 (NNP) 相比, 刚果民警渗透叶片明显减少了 ROS 活化荧光 DCF 染料信号 (图 6A)。同样的结果也发现与超氧化物阴离子活化 DHE 染料, 其中民警渗透叶片比缓冲渗透控制叶明显少 DHE 染料强度 (图 6B)。
猫模拟活动试验.2O2的民警清除情况的分析在8号议定书第节中作了说明。观察了含有民警的反应混合物中的 H2O2水平的试卤灵减少 (图 7), 证实了合成的民警的猫模拟活动。
图 1: 民警的综合和表征.a. 硝酸铈、聚丙烯酸 (临机)、硝酸铈混合物和临机局的着色, 以及合成的民警 (临时包覆的氧化铈纳米颗粒, 浅黄色)。b. 用紫外-可见光分光光度法测定的国民吸收光谱。c. 综合民警的水力直径和泽塔电位。平均标准误差 (n = 4)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用 DiI 荧光染料标记的刚果国民标识.A. 民警 (淡黄色) 和 DiI 染料标记为民警解决方案 (DiI, 粉红色)。b. DiI-民警溶液的吸光度谱。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: DiI 和刚果民警的叶膜浸润。在浸润前的芥叶。注射器内的溶液是 DiI-民警。b. DiI 的叶渗入。c. 用精致的任务湿巾清洁叶子表面的剩余溶液。用 DiI -刚果人的。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 制备叶样切片.a. 显微镜玻璃幻灯片与豌豆大小观察凝胶。b. 用扁平观察凝胶滑动。c. 用扁平观察凝胶滑动, 中间有一个井。d. 用 perfluorodecalin (PFD) 溶液填充的观察凝胶中的叶盘滑动。e. 用盖子滑动固定的圆盘片。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 在叶肉细胞中通过共聚焦显微成像 DiI.叶样品安装在具有40X 水浸泡透镜的倒置共焦显微镜上。B. 共焦显微镜用于成像 DiI-民警和叶绿体。在无纳米粒子 (NNP) 的缓冲渗透叶片样品中, 叶绿体自动荧光记录。DiI 和叶绿体自动荧光在 DiI-刚果人浸润的叶片样品中成像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 通过共焦显微镜监测planta 中的ROS 清除.(用于监测一般 ROS 信号) 的 DCF 荧光染料比缓冲控制 (无纳米颗粒、NNP) 明显降低。b. 减少的 DHE 荧光染料 (用于监测超氧化物阴离子) 与缓冲控制 (NNP) 相比, 在刚果民警渗透植物的叶肉细胞中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 过氧化氢酶 (CAT) 模拟活动的民警.在辣根过氧化物酶的存在下, 荧光探针与过氧化氢反应, 转化为试卤灵 (吸收 560 nm)。试卤灵的吸光度, 这表明过氧化氢水平, 监测了 560 nm。民警显示了猫的模仿活动。平均值 (标准误差) (n = 4)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本协议中, 我们描述了在植物叶肉细胞内的纳米粒子的合成、表征、荧光染料标记和共焦成像, 以展示其体内活性氧清除活性。从硝酸铈的混合物和氢氧化铵中的临机溶液中合成了民警。民警的特点是吸收 spectrophotomery 和浓度确定使用啤酒 Lamberts 法。泽塔电位测量证实了民警的负电荷表面, 以增强对叶绿体8的传递。用荧光 DiI 染料对民警进行标记,在叶片叶肉细胞内进行共聚焦显微成像, 使纳米粒子在叶绿体中表现出高水平的定位。使用 DHE 和 DCF 荧光染料, 我们确认, 民警作为一个强有力的清除超氧化物阴离子和 ROS在体内。
合成民警的方法是一个简单的步骤明智的过程, 产生的氧化铈纳米粒子的控制大小, 负电荷和 ROS 清除能力16。其他方法, 如热水解, 需要高温和昂贵的化学设备21,22。民警的合成和表征是一种用普通实验室设备进行的低成本方法。它不需要一个陡峭的学习曲线相比, 在植物的分子方法的基础上过度表达的抗氧化剂酶,例如, SOD, APX和猫, 清除 ROS 物种在模型系统23。刚果民警是一种健壮的水溶性 ROS 催化清除剂, 不需要费力的克隆和转化方法, 这依赖于植物的遗传驯良和可用的分子工具箱。
该协议的关键步骤是以注射器为基础的叶肉细胞与民警的渗透。应轻轻地将纳米粒子渗入活植物中, 以避免对叶片24的物理损伤。因此, 就像在协议步骤4的方法, 用注射器轻轻地推到叶子表面, 以避免撕裂或刺穿背面的叶子表面。因为它的气孔密度比正面的表面高25,26, 所以最好从其背面浸润.此外, 在叶片渗透过程中, 应使用在生理 ph 值范围内的 DiI (~ pH 值为 7.5) 的缓冲溶液。该议定书的另一个关键步骤是将适当的民警浓度应用于所研究的植物组织。在本议定书中, 50 毫克/升的民警对一个............目前纳米微粒输送方法的一些局限性是 1) 不适用于具有厚和蜡状角质层或低气孔密度的植物物种, 2) 在外地的应用不可伸缩, 3) 共焦显微系统的高成本监测体内纳米颗粒的分布和活性氧的清除。
该协议通过一种简便的叶片渗滤方法, 说明了 ROS 清除民警在植物中研究和改善非生物胁迫耐受性的应用。ROS 的积累伴随着植物中的非生物胁迫, 从而减少了植物的光合作用, 生长, 产量8,27,28。植物基因修饰方法为 ROS 操作在体内经常被限制到植物模型种类, 而民警的 ros 清除有潜力适用于不同的野生类型植物种类。叶片渗滤是提高叶片组织中 ROS 清除量、了解和工程植物非生物胁迫耐受性的一种实用研究方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加利福尼亚大学、河畔分校和美国农业部食品与农业研究所的支持, 孵化项目 1009710 J.P.G.。该材料的基础是国家科学基金会根据1817363号赠款资助的 J.P.G. 的工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
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