Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) de ROS (espécies reativas de oxigênio) eliminação na vivo, nanoceria de imagens em tecidos vegetais por microscopia confocal e na vivo monitoramento de nanoceria ROS eliminação pela microscopia confocal.
Abstract
Acumulação de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio é uma marca registrada da resposta ao estresse abiótico planta. ROS desempenham um papel duplo em plantas actuando como sinalização moléculas em níveis baixos e danificando moléculas em níveis elevados. Acumulação de ROS em plantas estressadas pode danificar metabolitos, enzimas, lipídeos e DNA, causando uma redução do crescimento das plantas e o rendimento. A capacidade de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) para eliminar cataliticamente ROS na vivo fornece uma única ferramenta para compreender e tolerância de estresse abiótico bioengineer planta. Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar e caracterizar nanoceria revestido poli (acrílico), ácido (PNC), interface as nanopartículas com plantas através de infiltração de lâmina de folha e monitorar sua distribuição e eliminação na vivo usando confocal de ROS microscopia. Atuais ferramentas moleculares para manipular a acumulação de ROS em plantas são limitadas a espécie de modelo e exigem métodos de transformação laborioso. Este protocolo para na vivo ROS eliminação tem potencial para ser aplicado ao tipo selvagem plantas com folhas largas e estrutura da folha como Arabidopsis thaliana.
Introduction
Nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) são amplamente utilizadas em organismos vivos, de pesquisa básica de bioengenharia, devido a suas espécies distintas catalítico reativas de oxigênio (ROS) eliminação de capacidade1,2,3. Nanoceria ter ROS eliminação habilidades devido a um grande número de vagas de superfície oxigênio que alternam entre dois oxidação Estados (Ce3 + e4 +Ce) 4,5,6. Os Ce3 + oscilação títulos efetivamente eliminar ROS enquanto as cepas de treliça em nanoescala promovem a regeneração destes sites de defeito através de redox reações7de ciclismo. Nanoceria também têm sido usados recentemente para estudar e engenharia planta função8,9. Plantas sob estresse abiótico experimentam acúmulo de ROS, causando danos oxidativos de lipídios, proteínas e DNA10. Em plantas da . thaliana , nanoceria catalítico eliminação de ROS na vivo leva a fotossíntese da planta melhorada sob alta luz, calor e refrigeração salienta8. Aplicação nanoceria para o solo também aumentos atirar rendimento da biomassa e o grão de trigo (Triticum aestivum)11; as plantas de canola (Brassica napus) tratadas com nanoceria têm maior biomassa de plantas sob estresse sal12.
Nanoceria oferecer bioengineers e biólogos da planta uma ferramenta baseada em nanotecnologia para compreender as respostas de estresse abiótico e aumentar a tolerância de estresse abiótico de planta. Na vivo ROS eliminação capacidades do Nanoceria são independentes das espécies de plantas, e a entrega fácil nos tecidos vegetais tem o potencial para permitir ampla aplicação fora de organismos modelo. Ao contrário de outros métodos baseados em geneticamente, nanoceria não exigem gerando linhas de planta com a superexpressão de enzimas antioxidantes para ROS maior eliminação de capacidade13. Infiltração de lâmina de folha de nanoceria de plantas é uma abordagem prática para a pesquisa em laboratório.
O objetivo geral do presente protocolo é para descrever 1) a síntese e caracterização de poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) a entrega e rastreamento de PNC em toda as células da folha e 3) a vigilância de eliminação ROS PNC-habilitado em vivo. Neste protocolo, poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) são sintetizados e caracterizada pelo seu espectro de absorção, diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta. Nós descrevemos um método de infiltração de lâmina de folha simples para lançar PNC para fábrica de tecidos da folha. Para imagens em vivo de nanopartículas distribuição dentro das células do mesofilo, uma tintura fluorescente (DiI) foi usada para rotular PNC (DiI-PNC) e observar as nanopartículas através de microscopia de fluorescência confocal. Finalmente, vamos explicar como monitorar na vivo PNC ROS eliminação através de microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos PNC síntese, caracterização, tintura fluorescente rotulagem e imagem latente confocal das nanopartículas dentro de células do mesofilo de vegetais para expor seu na vivo ROS eliminação atividade. PNC são sintetizados a partir de uma mistura de PAA solução de hidróxido de amónio e nitrato de cério. PNC caracterizam-se por spectrophotomery de absorção e a concentração de determinada usando a lei da cerveja-Lambert. Medições de potencial zeta confirmaram a superfície…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Riverside e USDA National Institute of Food e agricultura, projeto Hatch 1009710 para J.P.G. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. 1817363 de J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
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