Katalytisk renovering av anlegget reaktive oksygen arter i Vivo av Anionic Cerium oksid nanopartikler
Summary
Her presenterer vi en protokoll for syntese og karakterisering av cerium oksid nanopartikler (nanoceria) for ROS (reaktive oksygen arter) scavenging i vivo, nanoceria imaging i anlegget vev av AC confocal mikroskopi og i vivo overvåking av nanoceria ROS scavenging av AC confocal mikroskopi.
Abstract
Reaktive oksygen arter (ROS) akkumulering er et kjennetegn på anlegget abiotiske stressrespons. ROS spille en dobbel rolle i planter ved å opptre som signalnettverk molekyler på lavt nivå og ødeleggende molekyler på høye nivåer. Akkumulering av ROS i stresset planter kan skade metabolitter, enzymer, lipider og DNA, forårsaker en reduksjon av plantevekst og avkastning. Evne til cerium oksid nanopartikler (nanoceria) katalytisk åtseleter ROS i vivo tilbyr unikt verktøy å forstå og bioengineer anlegget abiotiske stress toleranse. Her presenterer vi en protokoll for å syntetisere og karakterisere poly (akryl) syre belagt nanoceria (PNC), grensesnitt nanopartikler med planter via blad lamina infiltrasjon og overvåke deres distribusjon og ROS scavenging i vivo med AC confocal mikroskopi. Gjeldende molekylære verktøy for å manipulere ROS akkumulering i planter er begrenset til modell arter og krever arbeidskrevende transformasjon metoder. Denne protokollen for i vivo ROS scavenging har potensial til å bli brukt på wild type planter med store blader og blad struktur som Arabidopsis thaliana.
Introduction
Cerium-oksid nanopartikler (nanoceria) er mye brukt i levende organismer, fra grunnleggende forskning til bioteknologi, på grunn av deres forskjellige katalytisk reaktive oksygen arter (ROS) scavenging evne til1,2,3. Nanoceria har ROS scavenging evner på grunn av et stort antall overflaten oksygen stillinger som veksler mellom to oksidasjon stater (Ce3 + og Ce4 +) 4,5,6. Ce3 + dingler obligasjoner renovere effektivt ROS mens gitter påkjenninger på nanoskala fremme regenereringen av disse defekt nettsteder via redoks sykling reaksjoner7. Nanoceria har også blitt nylig brukt for å studere og engineering plante funksjon8,9. Planter under abiotiske stress oppleve opphopning av ROS, forårsaker oksidative skader lipider, proteiner og DNA10. I A. thaliana planter fører nanoceria katalytisk renovering av ROS i vivo til bedre fotosyntese under høy lys, varme og kjøling påkjenninger8. Bruk nanoceria jord også øker skyte biomasse og korn avkastning av hvete (Triticum aestivum)11; raps (Brassica napus) planter behandlet med nanoceria har høyere anlegget biomasse under salt stress12.
Nanoceria tilbyr bioingeniører og plante biologer en nanoteknologi-basert verktøy for å forstå abiotiske stressresponser og forbedre anlegget abiotiske stress toleranse. Nanocerias i vivo ROS scavenging evner er uavhengig av plantearter og lettvinte levering i anlegget vev har potensial til å aktivere bred anvendelse utenfor modell organismer. I motsetning til andre genetisk-baserte metoder krever ikke nanoceria generere anlegget linjer med overuttrykte av antioksidant enzymer for høyere ROS scavenging evne til13. Blad lamina infiltrasjon av nanoceria planter er en praktisk tilnærming til lab-basert forskning.
Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive 1) syntese og karakterisering av negativt ladde poly (akryl) syre nanoceria (PNC), 2) levering og sporing av PNC hele bladet cellene, og 3) overvåking av PNC-aktiverte ROS scavenging i vivo. I denne protokollen, negativt ladde poly (akryl) syre nanoceria (PNC) syntetisert og preget av deres absorpsjon spektrum, etter diameter og zeta potensielle. Vi beskriver en enkelt blad lamina infiltrasjon metode for å levere PNC i anlegget blad vev. I vivo avbildning av hydrogenion distribusjon i mesophyll celler, var en fluorescerende farge (DiI) pleide å merke PNC (DiI-PNC) og observere nanopartikler via AC confocal fluorescens mikroskopi. Til slutt forklare vi hvordan overvåke i vivo PNC ROS scavenging gjennom AC confocal mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi PNC syntese, karakterisering, fluorescerende farge merking og AC confocal avbildning av nanopartikler i anlegget mesophyll celler viser i vivo ROS scavenging aktiviteten deres. PNC er synthesized fra en blanding av cerium nitrat og PAA løsning i ammonium hydroksid. PNC kjennetegnes av absorpsjon spectrophotomery og konsentrasjonen fastsatt ved bruk av øl-Lamberts lov. Zeta potensielle mål bekreftet negativt ladde overflaten av PNC for å forbedre levering til chloroplasts<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av University of California, Riverside og USDA National Institute of Food og landbruk, Luke prosjektet 1009710 J.P.G. Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under Grant nr. 1817363 til J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson’s disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
