Summary
Her presenterer vi en protokoll for syntese og karakterisering av cerium oksid nanopartikler (nanoceria) for ROS (reaktive oksygen arter) scavenging i vivo, nanoceria imaging i anlegget vev av AC confocal mikroskopi og i vivo overvåking av nanoceria ROS scavenging av AC confocal mikroskopi.
Abstract
Reaktive oksygen arter (ROS) akkumulering er et kjennetegn på anlegget abiotiske stressrespons. ROS spille en dobbel rolle i planter ved å opptre som signalnettverk molekyler på lavt nivå og ødeleggende molekyler på høye nivåer. Akkumulering av ROS i stresset planter kan skade metabolitter, enzymer, lipider og DNA, forårsaker en reduksjon av plantevekst og avkastning. Evne til cerium oksid nanopartikler (nanoceria) katalytisk åtseleter ROS i vivo tilbyr unikt verktøy å forstå og bioengineer anlegget abiotiske stress toleranse. Her presenterer vi en protokoll for å syntetisere og karakterisere poly (akryl) syre belagt nanoceria (PNC), grensesnitt nanopartikler med planter via blad lamina infiltrasjon og overvåke deres distribusjon og ROS scavenging i vivo med AC confocal mikroskopi. Gjeldende molekylære verktøy for å manipulere ROS akkumulering i planter er begrenset til modell arter og krever arbeidskrevende transformasjon metoder. Denne protokollen for i vivo ROS scavenging har potensial til å bli brukt på wild type planter med store blader og blad struktur som Arabidopsis thaliana.
Introduction
Cerium-oksid nanopartikler (nanoceria) er mye brukt i levende organismer, fra grunnleggende forskning til bioteknologi, på grunn av deres forskjellige katalytisk reaktive oksygen arter (ROS) scavenging evne til1,2,3. Nanoceria har ROS scavenging evner på grunn av et stort antall overflaten oksygen stillinger som veksler mellom to oksidasjon stater (Ce3 + og Ce4 +) 4,5,6. Ce3 + dingler obligasjoner renovere effektivt ROS mens gitter påkjenninger på nanoskala fremme regenereringen av disse defekt nettsteder via redoks sykling reaksjoner7. Nanoceria har også blitt nylig brukt for å studere og engineering plante funksjon8,9. Planter under abiotiske stress oppleve opphopning av ROS, forårsaker oksidative skader lipider, proteiner og DNA10. I A. thaliana planter fører nanoceria katalytisk renovering av ROS i vivo til bedre fotosyntese under høy lys, varme og kjøling påkjenninger8. Bruk nanoceria jord også øker skyte biomasse og korn avkastning av hvete (Triticum aestivum)11; raps (Brassica napus) planter behandlet med nanoceria har høyere anlegget biomasse under salt stress12.
Nanoceria tilbyr bioingeniører og plante biologer en nanoteknologi-basert verktøy for å forstå abiotiske stressresponser og forbedre anlegget abiotiske stress toleranse. Nanocerias i vivo ROS scavenging evner er uavhengig av plantearter og lettvinte levering i anlegget vev har potensial til å aktivere bred anvendelse utenfor modell organismer. I motsetning til andre genetisk-baserte metoder krever ikke nanoceria generere anlegget linjer med overuttrykte av antioksidant enzymer for høyere ROS scavenging evne til13. Blad lamina infiltrasjon av nanoceria planter er en praktisk tilnærming til lab-basert forskning.
Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive 1) syntese og karakterisering av negativt ladde poly (akryl) syre nanoceria (PNC), 2) levering og sporing av PNC hele bladet cellene, og 3) overvåking av PNC-aktiverte ROS scavenging i vivo. I denne protokollen, negativt ladde poly (akryl) syre nanoceria (PNC) syntetisert og preget av deres absorpsjon spektrum, etter diameter og zeta potensielle. Vi beskriver en enkelt blad lamina infiltrasjon metode for å levere PNC i anlegget blad vev. I vivo avbildning av hydrogenion distribusjon i mesophyll celler, var en fluorescerende farge (DiI) pleide å merke PNC (DiI-PNC) og observere nanopartikler via AC confocal fluorescens mikroskopi. Til slutt forklare vi hvordan overvåke i vivo PNC ROS scavenging gjennom AC confocal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voksende A. thaliana planter
- Så A. thaliana frø i 5 cm x 5 cm disponibel potter fylt med standard jord blanding. Sette 32 av disse potter i en plast brett fylt med vann (~ 0,5 cm dybde) og overføre det plast brettet med planter i en plante vekst kammer.
- Angi veksten kammer innstillingene som følger: 200 µmol/ms fotosynteseaktiviteten aktiv stråling (PAR), 24 ± 1 ° C dag og 21 ± 1 ° C natt, 60% fukt og 14/10 h dag/natt lyset regimet, henholdsvis.
- Tynn hver pott å forlate bare én enkelt anlegg etter en uke med spiring. Ta note å holde seedlings med samme størrelse i hver pott.
- Vann potter av helle vann direkte på plast brett en gang annenhver dag. Vokse planter i fire uker. A. thaliana planter er klar for videre bruk.
2. syntese og karakterisering av PNC
- Veie 1,08 g cerium (III) nitrat og oppløse den i 2,5 mL molekylærbiologi klasse vann i et 50 mL konisk rør.
- Veie 4.5 g av poly (akryl) syre og oppløse den i 5 mL molekylærbiologi klasse vann i et 50 mL konisk rør.
- Blande disse to løsninger på 2000 rpm i 15 min med en digital vortex blandebatteri.
- Overføring 15 mL ammonium hydroksid løsning (7,2 M) til en 50 mL glass kanne.
- Mens du rører på 500 rpm, legg blandingen fra trinn 2.3 dropwise ammonium hydroksid løsningen og rør på 500 rpm ved romtemperatur for 24 hr i avtrekksvifte.
- Dekk kanne med et stykke papir å unngå betydelige tap av løsningen under overnatting reaksjonen.
- Etter 24 timer, overføre den resulterende løsningen slik 50 mL koniske og sentrifuge det 3900 x g 1t å fjerne alle mulig rusk og store agglomerates.
- Overføre denne 22,5 mL supernatant løsning til tre 15 mL 10 kDa filtre og fyll resten av filteret med molekylær klasse vann for å lage en total fortynning av 45 mL.
- Andre reagenser med en Borstemmaskin sentrifuge ved å legge til nedbryting et 15 mL 10 kDa filter og sentrifuge 3900 x g for 15 min. Gjenta dette trinnet minst seks ganger renser supernatant løsningen fra gratis polymerer.
- Måle absorbansen av eluent i hver syklus med en UV-VIS spektrofotometer fra 220-700 nm å sikre ingen gratis polymerer og andre finnes i den endelige PNC løsningen.
- Ta samlet PNC løsningen 5 mL sprøyte og filter mot et 20 nm pore størrelse sprøyte filter. Samle filtrerte PNC løsningen i en 50 mL konisk rør.
- Ta en utvannet endelig PNC løsning i plast søppel og måle sin absorbansen med UV-VIS spektrofotometer fra 220-700 nm. PNC absorbansen peak er 271 nm.
- Beregn konsentrasjonen ved hjelp Beer-Lambert lov: A = εCL. Er absorbansen peak verdien for et gitt utvalg, ɛ er molar absorpsjon koeffisient PNC (cm-1 M-1), L er hvor optisk bane (cuvette bredde, 1 cm i denne metoden) og C er molar konsentrasjonen av målt nanopartikler.
- Mål etter diameter og zeta potensialet i syntetisert PNC bruker en partikkel størrelse og zeta potensielle analyzer (figur 1).
- Lagre den endelige PNC løsningen i kjøleskap (4 ° C) inntil videre bruk.
Merk: Se Wu et al. 8 for protokollen mer om PNC karakterisering.
3. merking PNC med DiI fluorescerende farge
- Bland 0,4 mL av 5 mM (58 mg/L) PNC med 3,6 mL molekylærbiologi klasse vann i en 20 mL hetteglass og rør på 500 rpm.
- Legge til 24 µL 1, 1-dioctadecyl-3,3, 3, 3-tetramethylindocarbocyanine-perklorat fargestoff løsning (DiI, 2,5 mg/mL, fortynnet i DMSO) i 176 µL av DMSO (dimethyl sulfoxide) å gjøre DiI fargestoff løsningen.
- Legge DiI fargestoff dropwise til PNC løsningen, røring 1000 RPM for 1 min ved omgivelsestemperatur.
- Overføre denne resulterende blandingen i et 15 mL 10 kDa filter og fylle røret til toppen med molekylærbiologi klasse vann for å lage den totale fortynning 15 mL.
- Rense DiI merket PNC (DiI-PNC) løsning fra DMSO og alle mulige gratis DiI fargestoff med en Borstemmaskin sentrifugering 15 mL 10 kDa filteret 3900 x g i 5 min.
- Gjenta trinn 3.5 minst fem ganger.
- Filtrere de endelige DiI-PNC løsningene gjennom et 20 nm pore størrelse sprøyte filter.
- Måle absorbansen av siste DiI-PNC UV-VIS spectrophotometry og Beregn konsentrasjonen ifølge Beer-Lambert lov (figur 2). Se trinn 2.13 for mer informasjon.
- Lagre det i et kjøleskap på 4 ° C for videre bruk.
4. infiltrasjon av anlegget blader med PNC
- Legge til 0,1 mL infiltrasjon buffer (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, justert av HCl) i 0.9 mL 0,5 mM PNC eller DiI-PNC løsning og vortex det. Bruk en løsning 10 mM TES infiltrasjon bufferen som en negativ kontroll.
- Overføre 0,2 mL PNC eller DiI-PNC infiltrasjon løsningen til en 1 mL steril needleless sprøyte. Trykk for å fjerne alle mulig luftbobler.
- Hente anlegget fra vekst kammer like før infiltrasjon med nanopartikler å unngå mulig stomata nedleggelse under lysforholdene i rommet.
- Før infiltrasjon, mål klorofyll innholdet fra A. thaliana blader med lik størrelse med en klorofyll meter. Måle hvert blad med tre replikat (hver kopiere består av minst tre målinger)14. Velg A. thaliana blader med lignende klorofyll innhold for infiltrasjon eksperimentet.
- Infiltrere bladene sakte med nylig PNC eller DiI-PNC løsningen ved forsiktig å trykke spissen av needleless mot bunnen av blad lamina (abaxial side) og trykk ned stempelet (Figur 3A).
- Forsiktig tørke av overflødig løsningen som forblir på overflaten av blad lamina (Figur 3B) bruker en delikate oppgaven vindusvisker (Figur 3C) og etiketten anlegget. Bruk nye delikate oppgaven kluter for hver gruppe med blader.
- Holde den infiltrere A. thaliana planter på benken for blad tilpasning og inkubasjon med PNC eller DiI-PNC 3 h.
Merk: Infiltrere A. thaliana planter er så klar for videre bruk (Figur 3D).
5. forberedelse av blad prøver til AC Confocal mikroskopi
- Rulle en ert størrelse mengden observasjon gel til om en 1 cm radius (Figur 4A) og deretter spredt ut før det er 1 mm tynn på et glass lysbilde (Figur 4B).
- Bruke en kork borer (diameter 0,3 cm) å skjære ut et rundskriv delen i sentrum av observasjon gel på glass lysbildet (Figur 4C).
- Fyll kuttet vel helt med perfluorodecalin (PFD) for dypere og bedre AC confocal tenkelig oppløsning i blad vev.
- Bruke en kork borer (diameter 0,2 cm) å samle blad plater fra tilpasset DiI-PNC infiltrert A. thaliana planter (Figur 4D).
- Montere blad platen i PFD fylt ansiktet infiltrere (abaxial) siden av bladet opp.
- Sett en firkantet dekkglassvæske på blad platen og trykk forsiktig skyve dekkglassvæske jevnt å forsegle den med av observasjon gel og ingen luftbobler fortsatt fanget (Figur 4E).
6. imaging DiI-PNC blad vev av AC Confocal mikroskopi
- Bruke en 40 X linsen i en invertert laserskanning AC confocal mikroskop.
- Slippe to til tre dråper ddH2O på den 40 X linsen.
- Plass forberedt DiI-PNC infiltrert blad eksempel lysbildet på de inverterte 40 X objektive linsen.
- Kontroller at siden dekkglassvæske men ikke glass skyve kontakt direkte med ddH2O på linsen.
- Finn et område av interesse i eksemplet under mikroskopet laserlys eller lysende felt.
- Start mikroskop programvare og slå Argon laser (angitt ved 20%).
- Angi hullet å samle en optisk skive mindre enn 2 µm og en linje gjennomsnittlig 4.
- Image utvalget med AC confocal mikroskop innstillinger: 514 nm laser eksitasjon (30%). Z-Stack snittykkelse: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (for DiI-PNC imaging); PMT2: 700-800 nm (for chloroplast imaging).
- Ta representant AC confocal bilder av blad prøver fra ulike individer, minst tre biologiske replikerer.
7. imaging PNC i vivo ROS Scavenging av AC Confocal mikroskopi
- Forberede 25 µM 2, 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, en farge for å angi en generell ROS) og 10 µM dihydroethidium (DHE, en farge for å angi superoxide anion) fargestoffer i TES infiltrasjon buffer (pH 7.5) i 1,5 mL microcentrifuge rør, separat.
- Bruke en kork borer (diameter 0,2 cm) for å samle blad plater fra tilpasset PNC infiltrert A. thaliana planter.
- Bruk skarp spissen av tang til å gjøre tre-fire hull på blad plater å akselerere fargestoff lasting prosessen.
- Overføring bladet plater å microcentrifuge rør med H2DCFDA og DHE separat og Inkuber i 30 min under mørket.
- Etter inkubasjon skyll bladet plater med ddH2O tre ganger og montere den i glasset lysbilde med observasjon gel (se protokollen seksjon 5).
- Sett lysbildet på AC confocal mikroskopet og manuelt fokus til et område av bladet mesophyll cellene. Se protokollen del 6 for detaljer.
- Utsette blad platene til UV-A (405 nm) laser for 3 min å generere ROS og registrere ROS signalet intensitet endres i tidsserier ("xyt") per blad plate.
- Bilde blad platen med AC confocal mikroskop innstillinger: 40 X vann mål; 496 nm laser eksitasjon; PMT1: 500-600 nm (til DHE og DCFDA dye oppdagelse). PMT2: 700-800 nm (for chloroplasts gjenkjenning). Bruk en plante infiltrert med bare infiltrasjon buffer løsning som kontrollen negative.
8. PNC Scavenging av H2O2i vitro
- Gjennomføre CAT (catalase) mimetic aktiviteten for syntetisert PNC vitro ved følgende metoder i tidligere publikasjoner3,8,15
- Legge til 45,4 µL av 1 x TES infiltrasjon buffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, justert av HCl), PNC (60 nM, 3 µL), og H2O2 (2 µM, 1 µL) inn i en brønn (hvite runde 96 godt bunnplaten), og bland det forsiktig av pipettering.
- Legge til 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (arbeider konsentrasjon 100 µM, 0,5 µL) og pepperrotperoksidase (HRP; arbeider konsentrasjon 0,2 U/mL, 0.1 µL) i brønnen, forsiktig bland det av pipettering, og ruge det for 30 min. 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reagerer med H2O2 og konverteres til resorufin i nærvær av HRP.
- Pakk platen med aluminiumsfolie å unngå lys under incubation.
- Forberede en negativ kontroll ved hjelp av reaksjon buffer eller vann for å erstatte H2O2.
- Bortsett fra den lager løsningen, forberede alle andre løsninger ved omgivelsestemperatur.
- Etter inkubasjon, med en plate leser, overvåke absorbansen på 560 nm å bruke resorufin for å angi nivået av H2O2. Angi regime på 0, 2, 5, 10, 20 og 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PNC syntese og karakterisering .
PNC ble syntetisert, renset og preget følgende metoden beskrevet i protokollen del 2. Figur 1 En viser fargeleggingen løsninger av cerium nitrat, PAA, blandingen av cerium nitrat og PAA og PNC. En fargeendring fra hvit til lys gul vises etter PNC er syntetisert. Etter rensing med en 10 kDa filter, PNC var preget med et UV-VIS spektrofotometer. En toppen av absorbansen for PNC ble observert 271 nm (figur 1B). Den siste eluent ble også målt med UV-VIS å bekrefte at ikke-reagert kjemikaliene ble vasket under rensingen. Etter diameter og zeta potensialet i syntetisert PNC ble målt med en partikkel størrelse og zeta potensielle analyzer (figur 1C).
PNC merking med DiI fargestoff .
For å fastslå fordelingen av nanopartikler i vivo, PNC ble merket med et fluorescerende DiI fargestoff etter metoden beskrevet i protokollen avsnitt 3. DiI fargestoff bygger i PNC belegget spontant siden det kan kapsle inn hydrofobe domenene i polymer-belegg nanoceria16. Etter tilføyer DiI fargestoff til PNC løsning, en rask fargeendring til rosa ble observert (figur 2A). DiI merket PNC var så renset med en 10 kDa filter og preget av en UV-VIS spectrophotometry. Tre klare topper av absorbansen for DiI merket PNC ble observert (figur 2B). Den siste eluent ble målt ved UV-VIS spectrophotometry å bekrefte at ikke-reagert kjemikaliene ble vasket under rensingen.
Blad Lamina infiltrasjon.
PNC eller DiI-PNC ble levert i A. thaliana blad blad lamina infiltrasjon metoden som beskrevet i protokollen del 4. Bladet var infiltrert på fire forskjellige steder å sikre full blad området var parfyme med PNC løsning (Figur 3A). Alle gjenværende løsning ble fjernet fra blad overflaten (Figur 3B og 3 C). Blad fargen endres under infiltrasjon fra grønt til mørkere grønne (Figur 3D). Sprøyten var forsiktig presset mot bladet å unngå fysisk skade.
Blad eksempel forberedelse til fluorescens mikroskopi.
Blad prøver ble montert på glass lysbilder i en observasjon gel gjort godt fylt med PFD. Etter rullende ert størrelse observasjon gel på lysbildet (Figur 4A og 4B), ble en godt gjort i flat gel (Figur 4C). Deretter ble nylagde blad platen overført til brønnen tidligere fylt med PFD løsning (Figur 4D). En dekkglassvæske ble brukt til nakkens blad prøven på lysbildet (Figur 4E).
AC confocal imaging i DiI-PNC i vivo .
DiI-PNC infiltrert A. thaliana bladene ble brukt for å fastslå fordelingen av DiI-PNC i bladet mesophyll celler via AC confocal imaging (figur 5et og 5B). For å visualisere colocalization mellom DiI-PNC og chloroplasts, var DiI-PNC infiltrert blad prøvene begeistret med en 514 nm laser. Utslipp av DiI-PNC ble satt på 550-615 nm å unngå mulig forstyrrelser av chloroplast pigmenter signaler etter ~ 650 nm17. Klorofyll auto-fluorescens fra chloroplasts oppdaget fra 700-800 nm. AC confocal tenkelig innstillingene ble satt (laser makt og vinning) for å sikre at ingen DiI fargestoff signaler ble oppdaget i kontroll blad prøven (infiltrert med bare buffer) (figur 5C). Colocalization av DiI-PNC med chloroplasts i bladet mesophyll cellene kan observeres av overleggsbilde oppdaget DiI-PNC og chloroplast pigment autofluorescence (figur 5D).
AC confocal avbildning av PNC ROS scavenging i vivo .
PNC i 10 mM TES buffer løsning ble levert til A. thaliana blader via blad lamina infiltrasjon metoden som beskrevet i protokollen § 7. DHE (dihydroethidium) og H2DCFDA (2 ', 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate) fluorescerende fargestoffer brukes å visualisere ROS anlegget vev8,18. H2DCFDA er kjent til fluorescerende DCF (2 ', 7-dichlorofluorescein, angir graden av generelle oksidativt stress) på grunn av spalting av acetate grupper av ROS19. DHE er et mer spesifikke fargestoff for superoxide anion har fluorescerende produktet (2-hydroxyethidium) øke ved reaksjon med en superoxide anion20. I vivo ROS scavenging aktiveres av PNC ble kartlagt i blad plater måle DHE og DCF fargestoff fluorescens intensitet endringer (tall 6A og 6B). PNC infiltrert blad prøvene var begeistret med 496 nm laser. Utslipp av DHE og DCF fargestoff ble satt på 500-600 nm å unngå mulig forstyrrelser med chloroplast auto-fluorescens signaler. Pigment auto-fluorescens fra chloroplasts oppdaget fra 700-800 nm. Etter 3 minutter UV stress, signaler ROS fargestoff i PNC og buffer-infiltrert blad prøver ble overvåket separat. Sammenlignet med kontrollen for nei-hydrogenion buffer (NNP), PNC infiltrert blader viste signifikant mindre ROS-aktivert fluorescerende DCF fargestoff signal (figur 6en). Lignende resultater ble også funnet med superoxide anion-aktivert DHE fargestoff, hvor PNC infiltrert blader hadde betydelig mindre DHE fargestoff intensitet enn bufferen infiltrert kontroll blader (figur 6B).
PNC katten mimetic aktivitet analysen . Analysen av PNC scavenging H2O2 ble beskrevet i protokollen punkt 8. En reduksjon av resorufin som angir H2O2 nivå i reaksjonsblandingen inneholder PNC ble observert (figur 7), bekrefter katten mimetic aktiviteten til syntetisert PNC.
Figur 1 : Syntese og karakterisering av PNC. A. coloration cerium nitrat, poly akryl acid (PAA), blanding av cerium nitrat og PAA, og syntetisert PNC (PAA belagt cerium oksid nanopartikler, lys gul). B. absorbance spekteret av PNC målt ved UV-VIS spectrophotometry. C. Hydrodynamic diameter og zeta potensialet i syntetisert PNC. Mener ± standardfeil (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : PNC merking med DiI fluorescerende fargestoff. A. PNC (lys gul) og DiI fargestoff merket PNC løsning (DiI-PNC, rosa). B. absorbance spekteret av DiI-PNC løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Leaf lamina infiltrasjon av PNC eller DiI-PNC. A. A. thaliana blad før infiltrasjon. Løsningen i sprøyten er DiI-PNC. B. blad infiltrert med DiI-PNC. C. rengjøring gjenværende løsningen fra blad overflaten med delikate oppgaven tørker. D. renset A. thaliana blad infiltrert med DiI-PNC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Utarbeidelse av blad eksempellysbilder. A. mikroskopi objektglass med ert størrelse observasjon gels. B. lysbilde med flat observasjon gels. C. lysbilde med flat observasjon gel har en brønn på midten. D. Skyv med blad plater i observasjon gel godt fylt med perfluorodecalin (PFD) løsning. E. lysbilde med blad plater immobilisert av cover slip. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Bildebehandling DiI-PNC i bladet mesophyll celler via AC confocal mikroskopi. A. Leaf prøven er montert på en invertert AC confocal mikroskop har en 40 X vann nedsenking linsen. B. AC confocal mikroskop brukes til tenkelig DiI-PNC og chloroplasts. C. Chloroplast auto-fluorescens registreres i bufferen infiltrert blad prøver uten nanopartikler (NNP). D. DiI-PNC signal og chloroplast auto-fluorescens er fotografert i DiI-PNC infiltrert blad prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Overvåking PNC ROS scavenging i planta via AC confocal mikroskopi. A. DCF fluorescerende farge (for overvåking generelle ROS signal) er betydelig lavere i mesophyll celler av PNC infiltrert planter enn bufferen kontroll (ingen nanopartikler, NNP). B. redusert DHE fluorescerende farge (for overvåking superoxide anion) i mesophyll celler av PNC infiltrert planter i forhold til buffer kontroll (NNP). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Catalase (CAT) mimetic aktivitet av PNC. I nærvær av pepperrotperoksidase, fluorescerende sonden reagerer med hydrogen peroxide og konverteres til resorufin (absorbansen 560 nm). Absorbansen av resorufin, som er veiledende hydrogenperoksid nivåer, var overvåket på 560 nm. PNC viste en katten mimetic aktivitet. Mener ± SE (standardfeilen) (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi PNC syntese, karakterisering, fluorescerende farge merking og AC confocal avbildning av nanopartikler i anlegget mesophyll celler viser i vivo ROS scavenging aktiviteten deres. PNC er synthesized fra en blanding av cerium nitrat og PAA løsning i ammonium hydroksid. PNC kjennetegnes av absorpsjon spectrophotomery og konsentrasjonen fastsatt ved bruk av øl-Lamberts lov. Zeta potensielle mål bekreftet negativt ladde overflaten av PNC for å forbedre levering til chloroplasts8. Merking av PNC med et fluorescerende DiI fargestoff gjør i vivo bildebehandling av AC confocal mikroskopi i bladet mesophyll celler der nanopartikler viser høye nivåer av colocalization med chloroplasts. Med DHE og DCF fluorescerende fargestoffer, bekreftet vi PNC loven som en potent scavenger superoxide anion og ROS i vivo.
Metoden for å syntetisere PNC er en enkel step-wise prosedyre som genererer cerium-oksid nanopartikler kontrollert størrelse, negativ ladning og ROS scavenging evner16. Andre metoder, som termisk hydrolyse, krever høye temperaturer og dyre kjemi utstyr21,22. Syntese og karakterisering av PNC er en rimelig metode med vanlige laboratorieutstyr. Det krever ikke en bratt læringskurve sammenlignet med genetiske metoder i planter basert på overuttrykte en antioksidant enzymet, f.eks, TORV, APXog katten, for scavenging ROS arter i modellen systemer23. PNC er en robust, vannløselige ROS katalytisk åtseldyr som ikke krever arbeidskrevende kloning og transformasjon metoder som er avhengige av anleggets genetisk tractability og tilgjengelige molekylær verktøykasse.
Et viktig skritt i denne protokollen er sprøyte-baserte infiltrasjon av bladet mesophyll cellene med PNC. Infiltrasjon av nanopartikler i levende planter bør gjøres forsiktig for å unngå fysisk skade blad24. Dermed som protokollen trinn 4 av metoder, skyv mot blad overflaten med sprøyten å unngå rive eller punktering abaxial blad overflaten. Det er bedre å infiltrere fra abaxial overflaten av A. thaliana blad siden det har høyere øverst tetthet adaxial overflaten25,26. Videre en bufferløsning PNC eller DiI-PNC innen fysiologisk pH (~ pH 7.5) benyttes blad lamina infiltrasjon. Et viktig skritt i denne protokollen er å bruke riktig konsentrasjonen av PNC til studerte anlegget vev. I denne protokollen var 50 mg/L av PNC ikke giftig for A. thaliana blader mens katalytisk PNC ROS scavenging. Noen begrensninger av gjeldende hydrogenion leveringsmåte gjelder 1) ikke plantearter har tykke og voksaktig neglebåndene eller lav øverst tettheter, 2) ikke skalerbar for programmer i feltet 3) de høye kostnadene ved en AC confocal mikroskopi-system for å overvåke i vivo hydrogenion distribusjon og ROS scavenging.
Denne protokollen demonstrerer bruken av ROS scavenging PNC for å studere og forbedre abiotiske stress toleranse i planter gjennom en lettvint metode for blad lamina infiltrasjon. ROS akkumulering er ledsaget av abiotiske stress i planter, som igjen reduserer fotosyntese, vekst, og gi8,27,28. Anlegget genetiske modifikasjoner metoder for ROS manipulasjon i vivo er ofte begrenset til plantearter modell mens PNC ROS-scavenging har potensial til å brukes på ulike vill-type plantearter. Blad lamina infiltrasjon er en praktisk forskning å øke ROS scavenging blad vev for å forstå og engineering anlegget abiotiske stress toleranse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av University of California, Riverside og USDA National Institute of Food og landbruk, Luke prosjektet 1009710 J.P.G. Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under Grant nr. 1817363 til J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
