Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحضير الأنسجة البشرية المضمنة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل لتحليل مطياف الكتلة

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62552
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

Summary

Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا لها أدوار راسخة في الأمراض البشرية. يمكن أن يكشف توصيف التغيرات في الأنسجة باستخدام قياس الطيف الكتلي عن أدوار في مسببات المرض أو تحديد الأهداف العلاجية. ومع ذلك ، فإن مركب OCT المستخدم للحفظ بالتبريد في المستودعات الحيوية يتداخل مع قياس الطيف الكتلي. نحدد طرقا لتحليل الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المضمنة في OCT باستخدام LC-ESI-MS / MS.

Abstract

Sphingolipids هي مكونات خلوية لها أدوار راسخة في التمثيل الغذائي البشري والمرض. يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد ما إذا كانت الدهون السفينغولية تتغير في المرض والتحقيق فيما إذا كان يمكن استهداف السفينغوليبيدات سريريا. ومع ذلك ، فإن الدراسات المستقبلية التي تعمل بالطاقة بشكل صحيح والتي تكتسب الأنسجة مباشرة من الجناح الجراحي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، وتحديا تقنيا ولوجستيا وإداريا. في المقابل ، يمكن للدراسات بأثر رجعي الاستفادة من العينات البشرية المحفوظة بالتبريد المتاحة بالفعل ، عادة بأعداد كبيرة ، في المستودعات الحيوية للأنسجة. تشمل المزايا الأخرى لشراء الأنسجة من المستودعات الحيوية الوصول إلى المعلومات المرتبطة بعينات الأنسجة بما في ذلك الأنسجة وعلم الأمراض وفي بعض الحالات المتغيرات السريرية المرضية ، والتي يمكن استخدامها جميعا لفحص الارتباطات مع بيانات الدهون. ومع ذلك ، فإن القيود التقنية المتعلقة بعدم توافق مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) المستخدم في الحفظ بالتبريد وقياس الطيف الكتلي هي حاجز تقني لتحليل الدهون. ومع ذلك ، فقد أظهرنا سابقا أنه يمكن إزالة OCT بسهولة من عينات المستودع الحيوي البشري من خلال دورات الغسيل والطرد المركزي دون تغيير محتواها من السفينغوليبيد. لقد أثبتنا سابقا أن الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد في OCT مستقرة لمدة تصل إلى 16 عاما. في هذا التقرير ، نحدد الخطوات وسير العمل لتحليل الدهون السفينغولية في عينات الأنسجة البشرية المضمنة في OCT ، بما في ذلك أنسجة الغسيل ، ووزن الأنسجة لتطبيع البيانات ، واستخراج الدهون ، وإعداد العينات للتحليل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة التأين بالرش الكهربائي لقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-ESI-MS / MS) ، تكامل بيانات قياس الطيف الكتلي ، تطبيع البيانات ، وتحليل البيانات.

Introduction

Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا معروفة بأدوارها في التمثيل الغذائي البشري والمرض 1,2. أنها تنظم العمليات الخلوية المعقدة مثل هجرة الخلايا ، وبقاء الخلية وموتها ، وحركة الخلايا ، والاتجار الحويصلي ، والغزو الخلوي وورم خبيث ، وتكوين الأوعية ، وإنتاج السيتوكينات1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تساهم العيوب في تنظيم استقلاب السفينغوليبيد في بدء السرطانات وتطورها ، وتحديد مدى عدوانية السرطانات ، وكيف تستجيب السرطانات للعلاج وتطور مقاومته 3,10. لذلك ، بسبب هذه التأثيرات الواسعة على مسببات المرض ، فإن الطرق التحليلية التي يمكن أن تحدد بدقة تغيرات السفينغوليبيد الخاصة بالمرض هي أدوات مهمة. قياس الطيف الكتلي (MS) هو الطريقة الأكثر دقة وموثوقية لتحليل تغيرات السفينغوليبيد.

يمكن الحصول على العينات البشرية التي يمكن استخدامها لتحليل تغيرات السفينغوليبيد بشكل مستقبلي من الجناح الجراحي أو بأثر رجعي من المستودعات الحيوية للأنسجة. الأنسجة الطازجة من الجراحة مفيدة لأنه يمكن تحليلها مباشرة عن طريق مرض التصلب العصبي المتعدد أو طرق تحليلية أخرى. ومع ذلك ، فإن الحصول على الأنسجة بشكل مستقبلي ينطوي على عقبات إدارية وتقنية ولوجستية ، وقد يكون جمع عينات كافية للوصول إلى القوة الإحصائية أمرا صعبا. يعد الحصول على الأنسجة من المستودعات الحيوية مفيدا لأنه يمكن الحصول عليها بأثر رجعي ، بأعداد كبيرة ، وتؤكد المستودعات الحيوية علم الأنسجة وعلم الأمراض ، وتستخدم إجراءات التشغيل القياسية للحفاظ على الأنسجة وتخزينها بالتبريد ، ويمكن أن توفر بيانات سريرية مرضية يمكن استخدامها لتحليلات الارتباط. ومع ذلك ، للحفاظ على السمات الجزيئية والهيكلية ، قد تحافظ المستودعات الحيوية على الأنسجة بالتبريد عن طريق تضمينها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، والذي أظهرنا أنه يتداخل مع مقايسات تطبيع البيانات والقياس الكمي للسفينغوليبيدات بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي الترادفي للتأين بالرش الكهربائي (LC-ESI-MS / MS)11 . وقد تبين أيضا أن كحول البولي فينيل والبولي إيثيلين جلايكول ، المكونات الأساسية في مركب OCT ، تؤدي إلى قمع الأيونات في منصات تحليل MS الأخرى12،13،14،15. لذلك ، يجب إزالة مركب OCT من الأنسجة قبل تحليل sphingolipidomic بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد.

في تقرير سابق ، قمنا بالتحقق من صحة بروتوكول لإزالة مركب OCT من العينات البشرية لتحليل LC-ESI-MS / MS11 والمنهجية المستخدمة لوزن الأنسجة لتطبيع البيانات11. هنا ، نقوم بتفصيل خطوات بروتوكول إزالة مركب OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ونعرض بيانات تمثيلية من أورام سرطان الرئة الغدي البشري والأنسجة الطبيعية المجاورة غير المصابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على أنسجة الرئة البشرية غير المحددة الهوية من جامعة فرجينيا كومنولث (VCU) الأنسجة والحصول على البيانات وتحليلها الأساسية بموجب بروتوكول (IRB) المعتمد من مجلس المراجعة الداخلية (IRB) (#HM2471). تمت الموافقة على استخدام الفئران للبحث وحصاد أنسجة الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لجامعة فرجينيا كومنولث.

1. تحضير المواد

ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات قبل يوم واحد من غسل الأنسجة.

  1. قم بالتسمية المسبقة ووزن أنابيب الطرد المركزي المصنوعة من مادة البولي بروبيلين سعة 1.5 مل مع رموز معرف موجزة ولكن واضحة لكل عينة ستتم معالجتها في اليوم التالي. استخدم علامة دائمة مقاومة كيميائيا (انظر جدول المواد) لن تتلاشى تحت معالجة الأنبوب المتكررة.
  2. افتح جدول بيانات إلكترونيا وقم بتسمية الأعمدة المتتالية برؤوس الأعمدة التالية: معرف الأنبوب (ID) والأنبوب وحده والأنبوب الذي يحتوي على نسيج والنسيج الكلي. أدخل معرفات الأنبوب التي ستتم معالجتها في العمود المسمى معرف الأنبوب.
  3. المعايرة المسبقة والصفر مقياس تحليلي. ضع قارورة Erlenmeyer نظيفة سعة 10 مل في وسط لوحة التوازن (ستعمل القارورة كحامل أنبوب). أغلق باب غرفة الوزن واترك الميزان بالقارورة.
  4. تزن 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. ضع الأنبوب بعناية في القارورة وأغلق باب غرفة الوزن. اسمح للوزن بالاستقرار وسجل الوزن في العمود المسمى الأنبوب وحده.
    ملاحظة: تجنب تحريك دورق Erlenmeyer سعة 10 مل عند وزن الأنابيب. إذا تم تحريك القارورة ، فأعد توسيط القارورة وأعد التوازن. ضع الأنابيب المغلقة في رف وقم بتخزينها لحين الحاجة.
  5. قم بتسمية الأنابيب والأغطية الزجاجية اللولبية مقاس 13 × 100 مم مسبقا برموز المعرف واملأها ب 2 مل من الميثانول من الدرجة LC-MS. ضعها في رف أنبوبي ، وقم بتغطية الأنابيب ، وقم بتخزينها في الثلاجة (4 درجات مئوية) حتى الاستخدام.
    ملاحظة: استخدم موزع مذيب علوي الزجاجة (انظر جدول المواد). إذا لم يكن أحدها متاحا ، فاستخدم الماصات الزجاجية لتجنب استخدام البلاستيك عند توزيع المذيبات العضوية.
  6. أنابيب اختبار زجاجية 13 × 100 مم قبل التسمية. قم بتغطية وتخزين أنابيب الاختبار في درجة حرارة الغرفة.
  7. قوارير الحاقن التلقائي قبل التسمية مع رموز المعرف. قم بتغطية وتخزين قوارير الحاقن التلقائي في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
  8. تحضير فتائل تجفيف الأنسجة.
    1. ابدأ بتنظيف المقص الجراحي عن طريق غمره في ميثانول بدرجة LC-MS لمدة 5 دقائق ، ثم امسحه بمنديل نظيف من الدرجة المختبرية.
    2. باستخدام قفازات خالية من المسحوق ، قم بتدوير نهاية نسيج من الدرجة المختبرية (انظر جدول المواد) حتى يتم تشكيل فتيل مدبب بدقة 30-40 مم.
    3. باستخدام مقص منظف بالميثانول ، اقطع الفتيل على الطرف السميك. ضع الفتائل في صندوق كاربوارد نظيف. اصنع ضعف عدد الفتائل مما هو مطلوب لمعالجة جميع العينات.
  9. تحضير نصائح ماصة 1 مل مختصرة. باستخدام مقص جراحي منظف بالميثانول ، اقطع 4-5 مم من طرف طرف ماصة سعة 1 مل ، وضع الطرف مرة أخرى في حامل الطرف. قم بإعداد ضعف عدد النصائح مثل العينات المراد معالجتها.
    ملاحظة: سيتم استخدامها في استرجاع الأنسجة المغسولة من الأنابيب. لا تلمس نهاية الحافة.
  10. قبل التبريد البيولوجيا الجزيئية الصف الفوسفات المخزن المالحة (PBS) إلى 4 °C (0.5 لتر كافية). سيتم استخدام هذا لاسترداد العينات. لكل عينة ستتم معالجتها ، قبل التبريد (4 درجات مئوية) 60 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
  11. إعداد المعايير الداخلية لقياس الطيف الكتلي. إذابة الدهون التالية في الإيثانول: الميثانول: الماء (7: 2: 1 ؛ v / v / v) بتركيز 25 نانومول / مل: d17: 1-sphingosine ، (2S ، 3R ، 4E) -2-aminoheptadec-4-ene-1،3-diol ؛ D17: 1-سفينغوسين-1-فوسفات ، سباعي -4-إينين-1-فوسفات ؛ C12-سيراميد (d18: 1 / C12: 0) ، N- (دوديكانويل) - سفينج -4-إنين ؛ C12-سفينغوميلين (د18:1/ج12:0), N- (دوديكانويل)-سفينغ-4-إينين-1-فوسفوكولين; C12-جلوكوزيل سيراميد (د18: 1 / C12: 0) ، N- (دوديكانويل) -1-β-جلوكوزيل سفينج -4-إيين ؛ C12-لاكتوسيلسيراميد (d18: 1 / C12: 0) ، N- (دوديكانويل) -1-ß-لاكتوسيل-سفينج -4-إن.

2. غسل الأنسجة

ملاحظة: يسمح إكمال جميع الخطوات الواردة في القسم 1 قبل يوم واحد للباحث الماهر بمعالجة ما يصل إلى 40 عينة يوميا ، والمبتدئين ~ 10-15 عينة يوميا. ابدأ في الصباح الباكر ولا تتوقف حتى تكتمل جميع الخطوات في الأقسام 2.1-3.8.

  1. في اليوم الذي ستتم فيه معالجة الأنسجة ، قم بإعداد منطقة عمل خزانة السلامة البيولوجية عن طريق تجهيزها بدوامة ، وماصة مصلية مشحونة بالكامل ، وصينية ثلج. لجميع الخطوات في هذا القسم ، ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر وطبقة مزدوجة من القفازات والنظارات الواقية. تنبيه: يجب اعتبار الأنسجة والسوائل البشرية ومعالجتها كمواد خطرة بيولوجيا.
  2. قبل التبريد (4 °C) جهاز طرد مركزي دلو متأرجح ، وأي محولات مطلوبة لعقد أنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 مل ، وأغطية الاحتواء الحيوي لأجهزة الطرد المركزي. قبل التبريد (4 °C) جهاز طرد مركزي ثابت الزاوية قادر على حمل أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  3. إذا لم يتم نقل الأنسجة إلى أنابيب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين سعة 15 مل ، فاستخدم ملعقة تنظيف بالميثانول (نظيفة لكل عينة أنسجة جديدة) لنقلها إلى أنابيب بولي بروبيلين سعة 15 مل مصنفة مسبقا. قم بتسمية أغطية 15 مل أيضا.
    1. ضع رف أنبوب قادر على حمل أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل في صينية ثلج واملأ الدرج بالثلج. قم بإذابة الأنسجة التي ستتم معالجتها في ذلك اليوم عن طريق وضعها في الرف على الجليد.
      ملاحظة: يجب طلب ما لا يقل عن 3-4 ملغ من الأنسجة من المستودع الحيوي للمعالجة حيث ثبت سابقا أن بروتوكولات غسل الأنسجة ووزنها دقيقة وموثوقة في هذه الأوزان11.
  4. انقل صينية الثلج مع العينات إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  5. قم بإجراء ثلاث دورات sOCTrP11 كما هو موضح أدناه (أي تنفيذ الخطوات 2.5.1-2.5.5 ثلاث مرات).
    1. أضف 10 مل من الماء المثلج عالي النقاء منزوع الأيونات إلى كل أنبوب وقم بتغطيتها بإحكام. اسمح للأنابيب بالحضانة لمدة 10 دقائق.
    2. دوامة بقوة كل أنبوب لمدة 10-20 ثانية أو حتى يتم إعادة إحياء جميع الأنسجة المودعة على جدران الأنبوب ، أو بيليه الأنسجة ، تماما.
      ملاحظة: في دورات sOCTrP 2-3, من الأهمية بمكان إعادة تعليق الحبيبات بحيث يتم تخفيف أي OCT في الحبيبات في محلول الغسيل.
    3. انقل الأنابيب إلى جهاز الطرد المركزي للدلو المتأرجح المبرد مسبقا (4 درجات مئوية). عينات الطرد المركزي في 4000-5000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تجنب توليد الهباء الجوي الخطير بيولوجيا والتعرض له أثناء الطرد المركزي عن طريق إغلاق حاملات أجهزة الطرد المركزي بغطاء احتواء حيوي (انظر جدول المواد).
    4. استرجع العينات من جهاز الطرد المركزي وانقلها إلى صينية الثلج. ضع الدرج في خزانة السلامة الحيوية وفك الأنابيب. احفظ الأحرف الكبيرة.
    5. استنشاق بعناية حل الغسيل. تجنب استنشاق مادة الأنسجة في الحبيبات عن طريق ترك ~ 0.5 مل من المادة الطافية في الأنبوب. قم بتغطية الأنابيب وتجنب التلوث المتبادل عن طريق مطابقة الأغطية الموسومة بالأنابيب.
      ملاحظة: محلول الغسيل (المادة الطافية) في الخطوة 2.5.5 هو مادة خطرة بيولوجيا. التعامل معها والتخلص منها باتباع إرشادات السلامة الأحيائية المناسبة للعينات من أصل بشري.

3. وزن الأنسجة (لتطبيع البيانات)

  1. بعد دورة الغسيل الأخيرة من sOCTrP ، استنشق بعناية معظم محلول الغسيل ولكن تجنب إزعاج الحبيبات. اترك ~ 0.5 مل من محلول الغسيل في الأنبوب.
  2. باستخدام أطراف الماصة المختصرة (المعدة في الخطوة 1.9) ، تناول 500 ميكرولتر من PBS المثلج وأضفه إلى الأنبوب.
    1. باستخدام نفس الطرف ، أعد تعليق الحبيبات برفق واسترجع جميع الأنسجة. تجنب السحب المضطرب لتقليل فقد الأنسجة من خلال الالتصاق بجدران الأنبوب وطرف الماصة.
  3. أضف الأنسجة المعاد تعليقها إلى أنبوب الطرد المركزي المقابل المسمى مسبقا والوزن مسبقا سعة 1.5 مل وضع الأنبوب على الثلج. كرر لجميع الأنسجة في مجموعة البيانات.
  4. ضع الأنابيب سعة 1.5 مل في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا وقم بتكوير الأنسجة على 7000 × جم لمدة 5-7 دقائق و 4 درجات مئوية.
    1. استرجع الأنابيب واستنشق بعناية أكبر قدر ممكن من PBS دون إزعاج الحبيبات. ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج.
  5. أنابيب الطرد المركزي لمدة 3 دقائق إضافية عند 7000 × جم لضمان تكوير الأنسجة جيدا. نقل الأنابيب إلى الجليد.
    ملاحظة: خطوة الطرد المركزي الإضافية مهمة لمنع فقدان الأنسجة عند إزالة كل محلول الغسيل والفتيل. في حالة معالجة أكثر من خمس عينات، كرر خطوة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق و7000 × جم بعد معالجة كل عينة خامسة لضمان بقاء الأنسجة محبوطة.
  6. باستخدام الفتائل المحضرة في الخطوة 1.8 ، قم بإزالة أي محلول غسيل متبقي برفق. استخدم فتيل نظيف لكل عينة. من المقبول أن تمسح المنديل برفق بالفتيل ، مما سيساعد على إزالة معظم محلول الغسيل ولكن تجنب فقدان أي منديل عن طريق الالتصاق بالفتيل. أغلق الأنبوب وضعه على الثلج.
  7. قم بوزن كل أنبوب في الميزان التحليلي الذي تمت معايرته مؤخرا وقطرانه وصفره.
    1. ضع كل أنبوب في قارورة Erlenmeyer الزجاجية وأغلق باب الغرفة. عندما يستقر الوزن ، قم بتسجيله في عمود جدول البيانات الإلكتروني المسمى أنبوب مع منديل.
    2. بعد الوزن ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج.
  8. أضف 300 ميكرولتر من PBS المثلج. باستخدام طرف ماصة قصير (الخطوة 1.9) ، استرجع بعناية جميع الأنسجة واودعها في أنبوب زجاجي لولبي ملصقة مسبقا (معد في الخطوة 1.5) يحتوي على 2 مل من الميثانول المثلج LC-MS (أضف الأنسجة إلى الميثانول ، وليس إلى جانب الأنبوب).
  9. احسب كمية الأنسجة التي تم غسلها عن طريق طرح الأنبوب وحده من الأنبوب مع قيمة الأنسجة. سجل هذا الرقم في عمود إجمالي الأنسجة. سيتم استخدام القيمة الإجمالية للأنسجة لتطبيع بيانات قياس الطيف الكتلي في الخطوة 6.12.
  10. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لتنفيذ الخطوات 4.1-4.15.
    ملاحظة: هذه نقطة توقف جيدة ، ويمكن تخزين العينات بأمان لبضعة أسابيع عند -80 درجة مئوية. بالنسبة لطرق تطبيع الأنسجة الأخرى ، مثل تركيز البروتين أو محتوى فوسفات الدهون ، راجع Rohrbach et al.11.

4. استخراج الدهون

ملاحظة: من المهم أن تبدأ هذه الخطوات في الصباح ، خاصة عندما تتم معالجة العديد من العينات. قبل البدء ، قم بتسخين حمام مائي أو حاضنة مسبقا إلى 48 درجة مئوية.

  1. استرجع العينات المحضرة في الخطوة 3.8 ومعايير MS الدهنية (المعدة في الخطوة 1.11) من المجمد. اسمح لهم بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. دوامة واغمر المحلول القياسي الداخلي في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة 2-3 دقائق أو حتى يتم إذابة معايير الدهون MS بالكامل قبل الاستغناء عنها في العينات. سيؤدي ذلك إلى تجنب الأخطاء في تطبيع البيانات.
  3. باستخدام ماصة متكررة ، أضف 250 pmol (10 μL من محلول 25 نانومول / مل المحضر في الخطوة 1.11) من معايير قياس الطيف الكتلي الداخلي لكل أنبوب. أعد تغطية الأنابيب برفق.
  4. لتسهيل التجانس ، اضبط حجم الميثانول على 2 مل. استخدم فقط الميثانول من الدرجة LC-MS / MS.
  5. عند عمل أنبوب واحد في كل مرة ، استخدم الخالط لسحن الأنسجة حتى لا تظهر كتل (عادة 5-20 ثانية). حرك طرف الخالط بحركة دائرية واضغط برفق على جدار الأنبوب للمساعدة في التثليج. أعد تغطية الأنبوب.
    ملاحظة: التأكد من أن جميع الأنسجة يتم سحنها بدقة سيزيد من استخراج الدهون. لا تقم بإضافة الكلوروفورم إلى العينات قبل التجانس لأن أطراف الخالط القابل للتصرف مصنوعة من البلاستيك الذي يذوب في المحاليل التي تحتوي على الكلوروفورم.
  6. اغمر الأنبوب بزاوية 45 درجة في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 5-10 ثوان.
    1. إذا لم تتشكل كتل الأنسجة عند الغمر في الحمام بالموجات فوق الصوتية ، فقم بتغطيتها وانتقل إلى الأنبوب التالي.
    2. إذا تشكلت كتل الأنسجة عند غمر الأنبوب في الحمام بالموجات فوق الصوتية ، فقم بإعادة التجانس واستهداف الكتل.
    3. كرر هذه العملية (التجانس / الغمر في حمام بالموجات فوق الصوتية) بشكل متكرر حتى يتم تكسير جميع كتل الأنسجة الكبيرة.
  7. في غطاء الدخان ، أضف الكلوروفورم والميثانول بدرجة LC-MS إلى كل أنبوب (استخدم موزع أعلى الزجاجة) لتحقيق نسبة 2: 1: 0.1 ميثانول: كلوروفورم: ماء. باستخدام أغطية نظيفة ، أغلق الأنابيب بإحكام واتركها على سطح الطاولة حتى نهاية اليوم.
    1. بالنسبة للأنسجة التي تزن 50 مجم أو أقل ، استخدم حجم استخراج إجمالي يبلغ 4 مل ، واضبط باستخدام هذه النسبة (محلول استخراج 50 مجم: 4 مل) للعينات الأكبر.
  8. قبل مغادرة ذلك المساء ، ضع الأنابيب المغطاة بإحكام في حمام مائي أو حاضنة بدرجة حرارة 48 درجة مئوية واحتضانها طوال الليل.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تكون الأنابيب مغطاة بإحكام حتى لا تتغير نسب المذيبات بسبب التبخر.
  9. في صباح اليوم التالي ، استرجع العينات من الحمام المائي 48 درجة مئوية وحبيبات أي حطام غير قابل للذوبان في المذيبات عن طريق الطرد المركزي عند 4000-5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  10. من خلال العمل في غطاء دخان ، قم بصب المادة الطافية بعناية في أنابيب اختبار زجاج البورسليكات مقاس 13 × 100 مم المسماة مسبقا. قم بإمالة الأنبوب مقاس 13 × 100 مم بزاوية 30-45 درجة لتسهيل الصب.
    ملاحظة: في حالة معالجة أكثر من 12 عينة, لا تسمح لأنابيب الطرد المركزي بالجلوس لفترات طويلة من الوقت حيث ستنعم الكريات وسيتم نقل الحطام غير القابل للذوبان عند تنفيذ الخطوة 4.10. لتجنب ذلك ، أخرج 12 أنبوبا فقط من جهاز الطرد المركزي في المرة الواحدة واستمر في طرد الأنابيب الأخرى حتى تكون جاهزا لصبها.
  11. انقل الأنابيب إلى مكثف فراغ قادر على حمل أنابيب 13 × 100 مم. قم بتبخير جميع المذيبات بخطوة تسخين أولية 1 ساعة (40 درجة مئوية) وقم بتشغيلها تحت أقصى فراغ.
  12. قم بإزالة الأنابيب من مكثف الفراغ وأضف 500 ميكرولتر من الميثانول بدرجة LC-MS (استخدم موزع أعلى الزجاجة) إلى كل أنبوب.
  13. أعد تعليق مستخلصات الدهون المجففة عن طريق الدوامة لمدة 5-10 ثوان ، تليها أنابيب غمر بزاوية 45 درجة في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 2 دقيقة أثناء تدوير الأنبوب. أعد الدوامة لمدة 5 ثوان وانغمس في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة إضافية.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة لضمان أقصى قدر من استرداد الدهون المستخرجة. لا تمضي قدما حتى يتم إعادة استبدال جميع المواد المجففة الموجودة على جدار الأنبوب.
  14. ضع الأنابيب مقاس 13 × 100 مم في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) وقم بإزالة أي حطام غير قابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 4000-5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
  15. صب بعناية الطافية الموضحة في قارورة حاقن ذاتي ملصقة مسبقا. إن إمالة قارورة الحاقن التلقائي بزاوية 30-45 درجة سيسهل الصب. تأكد من أن محتويات الأنبوب مقاس 13 × 100 مم بالكامل مصبوغة في قارورة أداة التحميل التلقائي.
  16. قم بتغطية الأنابيب بإحكام وتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS.

5. تحليل LC-ESI-MS / MS

ملاحظة: يستخدم الإجراء التالي نظام مضخة ثنائية مقترنا بنظام حاقن تلقائي ومزيل للغاز ونظام LC-MS/MS يعمل في وضع رباعي الأقطاب الثلاثي. تم الحفاظ على درجة حرارة العمود باستخدام فرن العمود. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المعدات المستخدمة.

  1. تحضير المرحلة المتنقلة A1 (CH 3 OH: H2O: HCOOH ، 58:41: 1 ، v: v: v ، مع 5 mM فورمات الأمونيوم) والمرحلة المتنقلة B1 (CH3OH: HCOOH ، 99: 1 ، v: v ، مع 5 mM فورمات الأمونيوم). استخدم فقط المذيبات والماء والكواشف من الدرجة LC-MS.
  2. لكل مجموعة من العينات ، قم بإعداد أربع قوارير ذاتية التحميل فارغة تحتوي على 500 ميكرولتر من الميثانول من الدرجة LC-MS.
  3. لكل مجموعة من العينات ، قم بإعداد قارورتين للتحميل التلقائي للمعيار الداخلي (الملصق كما هو) عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر (إجمالي 250 pmol لكل معيار) من المحلول القياسي الداخلي المحضر في الخطوة 1.11 في 500 ميكرولتر من الميثانول من الدرجة LC-MS.
  4. اضبط درجة حرارة فرن العمود على 60 درجة مئوية ، ودرجة حرارة مصدر الأيونات على 500 درجة مئوية.
  5. لتحليل MS / MS ، استخدم الوضع الرباعي الثلاثي لمقياس الطيف. اضبط الرباعي الأول (Q1) لتمرير أيونات السلائف ، بينما قم بتعيين الرباعي الثالث (Q3) لتمرير أيونات المنتج المميزة جزيئيا (أو المسح عبر عدة م / ض في Q1 أو Q3) باستخدام N2 للحث على التفكك التصادمي في رباعي القطب 2 (Q2) ، والذي يتم إزاحته من Q1 بمقدار 30-120 eV.
  6. اضبط نافذة الكشف عن أزواج مراقبة التفاعل المتعدد (MRM) على 120 ثانية مع وقت مسح مستهدف يبلغ 1.0 ثانية. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على قائمة بأزواج MRM وطاقات التأين وطاقات التصادم.
  7. استخدم المعلمات التالية لحل الدهون السفينغولية في خطوة LC: باستخدام معدل تدفق يبلغ 0.7 مل / دقيقة ، قم بموازنة عمود طور عكسي 2.1 (i.d) × 50 mm C18 لمدة 0.5 دقيقة مع خليط مذيب من 95٪ من المرحلة المتنقلة A1 و 5٪ من المرحلة المتنقلة B1.
    1. بعد حقن العينة ، حافظ على نسبة المرحلة المتنقلة A1 / B1 عند 95/5 لمدة 2.25 دقيقة ، متبوعة بتدرج خطي إلى 100٪ B1 على مدار 1.5 دقيقة ، والذي يتم الاحتفاظ به بعد ذلك عند 100٪ B1 لمدة 5.5 دقيقة ، متبوعا بعودة تدرج 0.5 دقيقة إلى 95/5 A1 / B1.
    2. بعد التشغيل ، أعد توازن العمود بمزيج من 95/5 A1 / B1 لمدة 0.5 دقيقة.
  8. استخدم الإعدادات التالية لنموذج التحميل التلقائي: حجم الشطف ، 500 ميكرولتر ؛ ضربة إبرة ، 52 مم (يجب تعديل ذلك حسب حجم القارورة وحجمها في كل قارورة) ؛ سرعة الشطف ، 35 ميكرولتر / ثانية ؛ سرعة أخذ العينات ، 5.0 ميكرولتر / ثانية ؛ شطف تراجع الوقت ، 2 ثانية ؛ وضع الشطف ، قبل وبعد الطموح ؛ وقت الشطف ، 2 ثانية.
  9. ضع العينات المعدة في الخطوة 4.15 على درج أداة التحميل التلقائي بالترتيب التالي: فارغ؛ هل; خلبي; العينات المعدة في الخطوة 4.15 ؛ فارغ ، هو ، فارغ.
  10. تحليل 5-10 ميكرولتر من كل عينة بواسطة LC-ESI-MS / MS. تحليل نفس الحجم لجميع العينات في مجموعة البيانات.

6. معالجة البيانات وتكاملها وتطبيعها

ملاحظة: على الرغم من أن الخطوات التالية تحدد إجراء لبرامج معينة (انظر جدول المواد) ، يمكن استخدام إجراءات مماثلة على أدوات وبرامج LC-MS المكافئة لدمج أزواج MRM لفئات الدهون التي تم تحليلها والمعايير الداخلية المقابلة.

  1. افتح برنامج القياس الكمي. في علامة التبويب Quantitate ، انقر نقرا مزدوجا فوق معالج الكمية. في النافذة المنبثقة ، في أقصى مساحة العمل اليسرى ، انتقل إلى مجموعة البيانات الصحيحة وانقر عليها بزر الماوس الأيسر. سيتم عرض العينات المتاحة في مساحة العمل الوسطى.
  2. قم بتمييز العينات المراد تحليلها ثم انقر فوق السهم الأيمن لإضافة عينات إلى مساحة عمل العينات المحددة . انقر فوق التالي للانتقال إلى شاشة الإعدادات والاستعلام حيث يتم استخدام الإعدادات الافتراضية عادة.
  3. نجاح التالى للانتقال إلى شاشة اختيار طريقة التكامل . حدد طريقة تكامل مناسبة تحتوي على أزواج انتقالية MRM لتحليل الليبيدات. راجع الجدول 1 لمعرفة أزواج انتقال MRM. ضرب إنهاء.
    ملاحظة: ستختلف أوقات الاحتفاظ وفقا للأجهزة والإعدادات الفردية وبالتالي يجب التحقق منها لكل إعداد فردي.
  4. في شريط التنقل ، انقر فوق جزء مراجعة الذروة بحيث يمكن فحص أزواج MRM. لتسهيل المراجعة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق جزء مراجعة الذروة ، وقم بتغيير التكبير التلقائي إلى 100٪ من أكبر ذروة ، ونافذة تكبير / تصغير من 1.00 - 2.00 دقيقة.
  5. انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة عرض الكمية وحدد Analyte والدهون السفينغولية المطلوبة ليتم فحصها. تحقق من عدم وجود قمم في العينات الفارغة وأنه تم دمج الذروة الصحيحة في عينات IS.
  6. ابدأ في دمج عينات غير معروفة. من خلال العمل على فئة واحدة من السفينغوليبيد في كل مرة ، افحص وقت الاحتفاظ بزوج MRM للمعيار الداخلي (أي C12: 0 ceramide) وتأكد من أن البرنامج قد دمج الذروة الصحيحة.
  7. استمر في التحليلات في نفس فئة الدهون (أي C14: 0 سيراميد ، C16: 0-سيراميد ، إلخ) ، بدءا من أقصر سلسلة من الدهون في الفصل. تحقق لكل دهن بطول السلسلة من أن روتين البرنامج قد دمج ذروة زوج MRM الصحيحة.
  8. عندما يتم دمج جميع التحليلات ، قم بإنشاء جدول بيانات إلكتروني لكل نوع من أنواع السفينغوليبيد التي تم تحليلها (على سبيل المثال ، السيراميد ، السفينغوميلين ، إلخ). قم بتسمية رؤوس الأعمدة لمطابقة ترتيب التحليلات وأطوال السلسلة في برنامج القياس الكمي LC-MS / MS. قم أيضا بتضمين رأس عمود لمعرف العينة وأوزان تسوية العينة المحددة في الخطوة 3.9.
    ملاحظة: كما هو موضح سابقا11 ، تشمل تدابير التطبيع الشائعة الأخرى إجمالي محتوى فوسفات الدهون أو كمية البروتين.
  9. تصدير أو نسخ مناطق الذروة لجميع التحليلات والمعايير الداخلية إلى جدول البيانات الإلكتروني.
  10. تطبيع البيانات عن طريق قسمة منطقة الذروة المتكاملة لكل نوع بطول السلسلة لفئة معينة من السفينغوليبيد على منطقة الذروة في المعيار الداخلي المقابل لها. على سبيل المثال، C14:0 سيراميد ، C16: 0 سيراميد ، سيراميد C18: 1 ، وما إلى ذلك ، يجب قسمة كل منها على C12: 0 منطقة الذروة القياسية الداخلية للسيراميد.
  11. حول منطقة الذروة إلى مولات من الدهون المستردة بضرب منطقة الذروة الطبيعية (المحسوبة في الخطوة 6.10) بكمية المعيار الداخلي ، في picomoles ، التي تمت إضافتها إلى العينة في الخطوة 4.3. في هذا البروتوكول ، هذا المبلغ هو 250 pmmol.
  12. للحصول على الكمية النسبية من الدهون في كل عينة ، قسم البيكومول لكل طول سلسلة دهنية على وزن الأنسجة المحدد في الخطوة 3.9. هذا سيعطي وحدات من picomoles من الدهون لكل ملغ من الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل طريقة لإزالة OCT من الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد ووزن الأنسجة لتحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS. يتم سرد المواد المطلوبة لهذا الإجراء في جدول المواد. يظهر في الشكل 1 نتائج تجربة نموذجية حيث تم غسل 10 أورام غدية رئوية بشرية و 10 أنسجة مجاورة طبيعية لإزالة OCT وتحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS. الأهم من ذلك ، كما أوضحنا سابقا11 ، هناك أنواع مختلفة بطول السلسلة من السيراميد (الشكل 1 أ) وأحادي الهكسوسيل سيراميد (الشكل 1 ب) مرتفعة بشكل كبير في أورام سرطان الرئة الغدي مقارنة بالأنسجة المجاورة الطبيعية غير المصابة.

في تجارب التحكم لتقييم تأثير OCT على خطوات استخراج الدهون الموضحة في القسم 4 ، تم إعادة تعليق 200 ملغ من كبد الفئران (C57BL6 ؛ الذكور ؛ 14-16 أسبوعا) في 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ومتجانسة حتى يتم سحنها بدقة. ثم تم تعليق الكبد الناعم الناتج على نطاق واسع باستخدام صوتنة مسبار (ثلاث جولات من 1 دقيقة صوتنة على الجليد ، 1 دقيقة راحة على الجليد ، 60٪ طاقة ؛ ميكروتيب). من هذا الحل ، تم تحضير ستة مكررات متجانسة الكبد 300 ميكرولتر. إلى ثلاث نسخ مكررة ، تمت إضافة 200 ملغ من OCT (متوسط الكمية الموجودة في عينات المستودع الحيوي11) ، وأضيف 200 ميكرولتر من الماء إلى الثلاثة الآخرين. ثم تمت معالجة العينات بالتوازي باتباع الخطوات الموضحة في القسم 4. الأهم من ذلك ، بعد الطرد المركزي لمحلول Bligh-Dryer أحادي الطور ، كانت العينات التي تحتوي على OCT غائمة بينما كانت عينات التحكم التي تحتوي على الماء واضحة (الشكل 2 أ). استمرت الغيوم في محلول استخراج الدهون أحادي الطور حتى بعد زيادة الطرد المركزي والصوتنة الواسعة (غير معروضة). بعد تبخير المذيب ، كانت العينات التي تحتوي على OCT تحتوي على كريات كبيرة (الشكل 2B) ، والتي لا يمكن إعادة تشكيلها في الميثانول حتى في ظل الدوامة القوية والصوتنة الواسعة. أظهرت العينات التي تحتوي على OCT أيضا فقدانا كبيرا للإشارة للمعايير الداخلية لجميع الأنواع التي تم تحليلها (الشكل 3A-G). لقد أظهرنا سابقا أيضا أن العينات التي تحتوي على OCT أظهرت فقدان الإشارة للعديد من الدهون السفينغولية التي تم تحليلها11.

عادة ، من المتوقع أن تتلاشى معايير السفينغوليبيد بالتتابع كما هو موضح في الشكل 4 بالترتيب التالي: د17: 1 سفينغوسين ، د17: 1 سفينغوسين -1-فوسفات ، ج12: 0 لاكتوسيل سيراميد ، C12: 0 أحادي هكسوسيل سيراميد ، C12: 0 سفينغوميلين ، و C12: 0 سيراميد. لكل نوع من أنواع sphingolipid هذه ، باستخدام إعدادات التدرج والأجهزة الموضحة في القسم 5 وسابقا 11 ، سيكون هناك ما يقرب من +0.15 دقيقة تحول في وقت الاحتفاظ لكل زيادة 2 كربون في طول السلسلة. على سبيل المثال ، كما هو موضح في الشكل 5 ، فإن C14: 0-ceramide (الشكل 5B) سوف يتحلل بعد +0.15 دقيقة تقريبا من C12: 0-ceramide (الشكل 5A). غالبا ما تؤدي الرابطة المزدوجة في الأحماض الدهنية إلى تحول -0.15 في وقت الاحتفاظ ، لذلك سيكون ل C16: 0-ceramide (الشكل 5C) وقت احتفاظ مشابه ل C18: 1-ceramide (الشكل 5D). ومع ذلك ، قد يكون للدهون الأطول بطول السلسلة (أي C24: 0 ، C26: 0) تحولات زمنية أكبر للاحتفاظ (الشكل 5I ، K ، على التوالي).

Figure 1
الشكل 1: ملامح Sphingolipid للأورام الغدية الرئوية وأنسجة الرئة المجاورة غير المصابة. تم تخزين الأنسجة بالتبريد في OCT ، وإذابتها ، ومعالجتها بثلاث دورات sOCTrP ، ووزنها ، وتحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS. المستويات في pmol لكل ملغ من الأنسجة. الأنواع المشار إليها بطول سلسلة الأسيل من السيراميد (A) ، أحادي الهكسوسيلسيراميد (B) ، سفينغوميلين (C) ، لاكتوسيلسيراميد (D) ، وأبو الهول (E ؛ Sph) ، سفينغوسين -1-فوبشات (F ؛ تم تحديد كمية S1P) وثنائي هيدرو-Sph (E) وثنائي هيدرو-S1P (F). n = 10 أورام و n = 10 أنسجة متجاورة غير متورطة. تظهر مخططات الصندوق المتوسطات (الخط الأسود) والشعيرات من min إلى max. ns ، ليست كبيرة ؛ ، ص≤0.005; ، ص ≤ 0.0005. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية للعينات المستخرجة مع OCT وبدونه. تم تجانس كبد الفئران وصوتنة ، مقسمة إلى ست عينات متطابقة: تمت إضافة 200 ملغ من OCT إلى ثلاث عينات والماء إلى العينات الثلاث الأخرى. (أ) بعد إضافة الميثانول والكلوروفورم لتحقيق نسبة 2: 1: 0.1 ميثانول: كلوروفورم: ماء (v: v: v) ، حضانة ليلية عند 48 درجة مئوية ، تليها الطرد المركزي ، كانت طاف العينات التي تحتوي على OCT غائمة ولا يمكن توضيحها عن طريق الصوتنة أو الدوامة أو الطرد المركزي. (ب) بعد تبخر المذيب ، تم استرداد حبيبات كبيرة من عينات تحتوي على OCT لا يمكن إعادة تشكيلها بالكامل في 0.5 مل من الميثانول بعد صوتنة ودوامات واسعة النطاق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي LC-ESI-MS / MS لمعايير السفينغوليبيد في وجود أو عدم وجود OCT. تم تجانس كبد الفئران وصوتنة وتقسيمها إلى ست عينات متطابقة. إلى ثلاث عينات من أصل ست ، تمت إضافة 200 ملغ من OCT ، بينما تمت إضافة الماء إلى العينات الثلاث الأخرى. بعد إضافة المعايير الداخلية والميثانول والكلوروفورم ، تمت معالجة العينات بشكل متماثل وتم تحليل الدهون المستخرجة بواسطة LC-ESI-MS / MS. تظهر أزواج مراقبة التفاعل المتعدد (MRM) للدهون المشار إليها (A-F) ، ومناطق الذروة المتكاملة المقابلة (G). الاختصارات: Sph ، سفينغوسين. S1P ، سفينغوسين -1-فوسفات. تشير الأسهم السوداء إلى زوج MRM الصحيح ل sphingolipid المشار إليه. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: أوقات الاحتفاظ النسبية لأزواج مراقبة التفاعل المتعدد LC-ESI-MS / MS لمعايير السفينغوليبيد. تم تجانس كبد الفأر وصوتنة. المعايير الداخلية ، الميثانول ، والكلوروفورم المضافة ؛ والدهون المستخرجة والمحللة بواسطة LC-ESI-MS / MS. تظهر أوقات الاحتفاظ بأزواج مراقبة التفاعل المتعددة للدهون المشار إليها (A-F). لاحظ الترتيب النسبي الذي تتلاشى به الليبيدات أثناء تدرج الكروماتوغرافيا السائلة. الاختصارات: Sph ، سفينغوسين. S1P ، سفينغوسين -1-فوسفات ؛ SM ، سفينغوميلين. المحور X هو وقت الاحتفاظ بزوج MRM بالدقائق. المحور Y هو شدة الإشارة لأزواج MRM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: التحول المعتمد على طول سلسلة الأسيل في وقت الاحتفاظ بأزواج LC-ESI-MS / MS MRM. تم تجانس كبد الفأر وصوتنة. المعايير الداخلية ، الميثانول ، والكلوروفورم المضافة ؛ والليبيدات المستخرجة والمحللة بواسطة LC-ESI-MS/MS. موضحة هي أوقات الاحتفاظ وأزواج MRM من الليبيدات المشار إليها. لاحظ التحول في وقت الاحتفاظ مع زيادة طول سلسلة الأسيل للدهون المختلفة (A-K) ، والذي يتوافق عادة مع +0.15 دقيقة من وقت الاحتفاظ لكل زيادة 2 كربون. ستؤدي الرابطة المزدوجة إلى تحول وقت الاحتفاظ -0.15 دقيقة (D ، H ، J). ومع ذلك ، بالنسبة للدهون ذات السلسلة الأطول ، قد تكون الزيادة النسبية في وقت الاحتفاظ أطول (G-K). المحور X هو وقت الاحتفاظ بزوج MRM بالدقائق. المحور Y هو شدة الإشارة لأزواج MRM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: أزواج MRM ومعلمات التأين وطاقات التصادم لتحليل LC-ESI-MS / MS. DP ، إمكانية إزالة التجميع ؛ CE ، طاقة الاصطدام. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OCT هو عامل شائع للحفاظ على التبريد على المدى الطويل يستخدم في المستودعات الحيوية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي OCT إلى قمع الأيونات عندما يتم تحليل الأنسجة بواسطة منصات قياس الطيف الكتلي المختلفة12،13،14،15 ، أو يؤدي إلى فقدان الإشارة عند تحليل العينات بواسطة LC-ESI-MS /MS 11. يمكن أن يتداخل OCT في الأنسجة المحفوظة بالتبريد أيضا مع طرق تطبيع الأنسجة مثل الوزن ومقايسات قياس البروتين مثل Bradford و BCA11. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإزالة OCT من الأنسجة البشرية ثم يتم تحليله لاحقا بواسطة قياس الطيف الكتلي. يمكن تعديل البروتوكول لاستخدام مصادر الأنسجة الأخرى التي ليست الرئة ، أو من أنسجة الفئران كما وصفنا سابقا11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام استراتيجيات تطبيع بيانات قياس الطيف الكتلي الأخرى ، بما في ذلك تلك التي وصفناها سابقا11 ، بالإضافة إلى طرق أخرى تم التحقق من صحتها.

أحد القيود المهمة لهذا البروتوكول هو أنه غير كاف لتحليل الأنسجة التي تم إصلاحها مسبقا باستخدام الفورمالديهايد أو عامل تثبيت آخر. إنه مناسب فقط للأنسجة التي لم يتم إصلاحها وتم حفظها بالتبريد في OCT. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة ليست كافية لمعالجة الأنسجة التي تزن أقل من 1-2 ملغ حيث يوجد دائما بعض فقدان الأنسجة أثناء خطوات sOCTrP والنقل بين الأنابيب. سيكون من الصعب وزن هذه الأنسجة الصغيرة باستخدام مقياس تحليلي قياسي ، وأي بقايا PBS لم تتم إزالتها خلال مرحلة الفتل ستساهم بشكل كبير في الخطأ التجريبي. فيما يلي اعتبارات مهمة أخرى عند غسل المناديل لإزالة OCT بهذه الطريقة.

لضمان التنفيذ السلس لهذا البروتوكول ، خاصة إذا تمت معالجة العديد من العينات ، يجب تنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 1 مسبقا ، بما في ذلك وضع العلامات المسبقة وأنابيب 1.5 مل قبل الوزن ، ووضع العلامات المسبقة على أنابيب وأغطية غطاء لولبي 13 × 100 مم ، وأنابيب ثقافة 13 × 100 مم ، وقوارير حاقن ذاتي ، وإعداد جميع الفتائل ، قبل تقصير 1 مل من أطراف الماصة ، وحلول الغسيل قبل التبريد. هذا سيمنع الإجراءات التي تستغرق وقتا طويلا والتي يجب إجراؤها في اليوم الذي سيتم فيه غسل المناديل ، مما قد يؤدي إلى تأخير. بشكل عام ، نجد أنه إذا تم تنفيذ العديد من هذه الخطوات في اليوم السابق ، يمكن للباحث المتمرس غسل 30-40 عينة في يوم عمل عادي. ومع ذلك ، نظرا لأن نقطة التوقف الأولى المقترحة هي بعد غسل جميع الأنسجة ووزنها ووضعها في الميثانول وتخزينها عند -80 درجة مئوية ، فإن عدم إجراء 1.5 مل من الوزن المسبق ووضع العلامات في وقت مبكر سيؤثر على الكفاءة ويطيل طول الوقت اللازم لغسل 30-40 منديلا.

يعد وزن الأنسجة أحد أهم الخطوات ، حيث ستؤثر الأخطاء أو الإهمال على جودة البيانات لأنها ستنتقل إلى تطبيع البيانات. من الأهمية بمكان معايرة الميزان التحليلي المستخدم في الوزن وتصفيره بشكل صحيح وقطرانه. وفقا لذلك ، عند استخدام الفتائل ، من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من محلول الغسيل ، خاصة بالنسبة للأنسجة التي يقل وزنها عن 5 ملغ. في أوزان الأنسجة هذه ، سيجعل محلول الغسيل المتبقي الوزن غير دقيق بنسبة كبيرة ويتم ترحيله كخطأ في تطبيع البيانات. عند إزالة محلول الغسيل ، نجد أنه يمكن لمس المناديل برفق بالفتيل لعدة ثوان لإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الغسيل دون التسبب في خسائر كبيرة في الأنسجة عن طريق الالتصاق بالفتيل. ومع ذلك ، يجب اختبار كل نوع من الأنسجة التي يتم غسلها للتأكد من الالتصاق بالفتائل ، ويتم تعديل هذه الخطوات في البروتوكول وفقا لذلك.

لتسهيل سير عمل غسل الأنسجة ، يوصى بطلب نشارة الأنسجة من المستودع الحيوي في أنابيب البولي بروبلين سعة 15 مل. هذا سوف يقلل من التعامل مع الأنسجة قبل الغسيل.

عند غسل المناديل ، إذا لوحظت مادة تشبه الهلام في قاع الأنبوب بعد دورة sOCTrP الثالثة ، فهذا يدل على أنه لم تتم إزالة جميع OCT وأن هناك حاجة إلى المزيد من دورات sOCTrP. تتبع عدد الدورات المطلوبة ، ومن أجل الاتساق ، قم بإجراء نفس العدد من دورات sOCTrP في جميع العينات في مجموعة البيانات. لقد قمنا سابقا بتقييم ما يصل إلى 9 دورات sOCTrP ولم نجد أي تأثير على استنفاد الدهون السفينغولية في الأنسجة11.

عند استخدام الفتائل لإزالة محلول الغسيل ، فإن غمس المنديل برفق سيضمن إزالة كل محلول الغسيل. هذا يزيد من دقة تقدير وزن الأنسجة. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر الشديد مع الأنسجة الصغيرة جدا لأنها يمكن أن تلتصق بالفتيل وتؤدي إلى فقدان العينة. من المفيد استخدام عدة فتائل لنفس الأنبوب لإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول. لمنع التلوث عبر العينات ، استخدم دائما فتيل جديد ونظيف لكل عينة. عند صنع الفتائل ، استخدم أنسجة من الدرجة المختبرية (انظر جدول المواد) حيث اختبرناها سابقا ووجدنا أنها تحتوي على كمية ضئيلة من الدهون السفينغولية الملوثة11. يمكن استخدام فتائل من مواد أخرى إذا تم اختبارها كما هو موضح11.

عند استرجاع العينات من أنابيب سعة 1.5 مل بعد الوزن ، من الأهمية بمكان استعادة جميع الأنسجة. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى حدوث أخطاء في تطبيع البيانات. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من PBS لاستعادة جميع الأنسجة ، أضف الكمية المكافئة من PBS المستخدمة في جميع الأنابيب الأخرى لتجنب الاختلافات في كفاءة الاستخراج التي قد تنتج عن عينات تحتوي على كميات مختلفة من PBS. اضبط أحجام الكلوروفورم والميثانول لحساب أي زيادة في حجم الماء للحفاظ على نسبة 2: 1: 0.1 ميثانول: كلوروفورم: ماء.

عند إذابة العينات ، من المهم أن تتم هذه الخطوة على الجليد لتجنب تدهور الدهون المرنة مثل sphingosine-1-phosphate. إن إذابة العينات بالكامل حتى يصبح OCT في حالة سائلة سيسهل أيضا إزالته حيث سيتم إذابته بسهولة أكبر في محلول الغسيل البارد بدلا من البقاء كحبيبات أثناء خطوات الغسيل المبكرة.

في بعض الأحيان ، خاصة عند غسل أنسجة الرئة ، ستكون هناك شظايا لن تكبل وستطفو فوق محلول الغسيل بعد الطرد المركزي. بحذر ، يمكن أن يؤدي غمر طرف الشفط أسفل المناديل العائمة لإزالة محلول الغسيل إلى منع الفقد أثناء الشفط.

لا تقم بإضافة الكلوروفورم إلى العينات قبل التجانس لأن أطراف الخالط القابل للتصرف مصنوعة من البلاستيك وسوف تذوب في المحاليل التي تحتوي على الكلوروفورم. يمكن أن يؤثر هذا بشكل كبير على القياس الكمي LC-MS / MS للدهون في العينات. لذلك ، بشكل عام ، يجب تجنب استخدام المواد البلاستيكية غير المقاومة للمذيبات عند الاستغناء عن الكلوروفورم والميثانول. هذه المذيبات سامة أيضا ويجب التعامل معها في غطاء دخان مناسب. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع المذيبات مثل الميثانول والكلوروفورم.

وينبغي معالجة الأنسجة البشرية في خزانة مناسبة للسلامة الأحيائية (مثل الفئة الثانية). يجب تدريب المستخدمين على التعامل مع المواد والسوائل الخطرة بيولوجيا من أصل بشري واتباع بروتوكولات السلامة مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة وتطهير أي سطح أو معدات تتلامس مع العينات. يجب على المستخدمين تطهير أي سطح أو معدات (أجهزة الطرد المركزي ، وناقلات ومحولات أجهزة الطرد المركزي ، والماصات ، والدوامات ، وأسطح غطاء الدخان ، والموازين ، والأواني الزجاجية ، وصواني الثلج ، ولوحات مفاتيح الكمبيوتر ، وفأرة الكمبيوتر ، وما إلى ذلك) المستخدمة أثناء إجراء الغسيل. يجب على أعضاء المختبر عدم استخدام المعدات أو الشفاطات المستخدمة لغسل الأنسجة حتى يتم تطهيرها تماما. تجنب استخدام المبيض على الأسطح الفولاذية والإلكترونيات.

عند معالجة العديد من العينات ، توخ الحذر لمنع التلوث المتبادل باستخدام أغطية نظيفة في خطوات إعادة السد أثناء خطوات استخراج الدهون. يمكن أيضا إعادة استخدام الأغطية إذا تم تصنيفها. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، نجد أن العلامات تبرز بشكل سيئ على الأغطية السوداء ، وأن الملصقات اللاصقة تسقط من الأنابيب أثناء حضانة 48 درجة مئوية طوال الليل.

تظهر Sphingolipids لاعبين مهمين في مسببات الأمراض والسرطانات البشرية. لذلك ، هناك اهتمام كبير بالتحديد الدقيق لتغيرات استقلاب السفينغوليبيد في هذه الأمراض لأنها قد تكشف عن أهداف علاجية. ومع ذلك ، فإن العديد من الأنسجة التي يسهل على الباحثين الوصول إليها يتم حفظها بالتبريد في OCT ، وهو غير متوافق مع تحليل قياس الطيف الكتلي. وبالتالي ، فإن البروتوكول التفصيلي الموصوف هنا سيوسع ذخيرة الأنسجة الكافية للتحليل الكمي للسفينغوليبدوميك ، وبالتالي يساعد على زيادة فهمنا لبيولوجيا تغيرات التمثيل الغذائي للدهون في الأمراض البشرية والسرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تقديم الخدمات والدعم للمشروع البحثي من قبل مركز VCU Massey للسرطان للحصول على الأنسجة والبيانات وتحليلها الأساسية و VCU Lipidomics and Metabolomics Core ، والتي يتم دعمها جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز السرطان NIH-NCI P30CA016059. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R21CA232234 (سانتياغو ليما).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13x100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 581300-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
  2. Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
  3. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  4. Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
  5. Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
  6. Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
  7. Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
  8. Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
  9. Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
  10. Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
  11. Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
  12. Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
  13. Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
  14. Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
  15. Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 170 ، علم الدهون ، سفينغوليبيد ، المستودع الحيوي ، OCT ، سرطان الرئة ، سرطان الرئة الغدي ، سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، الورم ، مركب درجة حرارة القطع الأمثل ، LC-ESI-MS / MS ، قياس الطيف الكتلي
تحضير الأنسجة البشرية المضمنة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل لتحليل مطياف الكتلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S.… More

Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S. Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (170), e62552, doi:10.3791/62552 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter