Summary
Sfengolipidler, insan hastalıklarında iyi bilinen rollere sahip biyoaktif metabolitlerdir. Kütle spektrometresi ile dokulardaki değişikliklerin karakterize edilmesi, hastalık etiyolojisindeki rolleri ortaya çıkarabilir veya terapötik hedefleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, biyodepolarda kriyoprezervasyon için kullanılan OCT bileşiği, kütle spektrometrisine müdahale eder. OCT'ye gömülü insan dokularındaki sfingolipidleri LC-ESI-MS / MS ile analiz etme yöntemlerini özetliyoruz.
Abstract
Sfengolipidler, insan metabolizmasında ve hastalığında iyi bilinen rollere sahip hücresel bileşenlerdir. Kütle spektrometrisi, sfingolipidlerin bir hastalıkta değişip değişmediğini belirlemek ve sfingolipidlerin klinik olarak hedeflenip hedeflenemeyeceğini araştırmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, dokuları doğrudan cerrahi süitten alan uygun şekilde güçlendirilmiş prospektif çalışmalar zaman alıcı ve teknik, lojistik ve idari olarak zor olabilir. Buna karşılık, retrospektif çalışmalar, doku biyodepolarında genellikle çok sayıda bulunan kriyokorunmuş insan örneklerinden yararlanabilir. Dokuları biyodepolardan temin etmenin diğer avantajları, histoloji, patoloji ve bazı durumlarda klinikopatolojik değişkenler de dahil olmak üzere doku örnekleriyle ilişkili bilgilere erişimi içerir ve bunların hepsi lipidomik verilerle korelasyonları incelemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyonda ve kütle spektrometrisinde kullanılan optimal kesme sıcaklığı bileşiğinin (OCT) uyumsuzluğu ile ilgili teknik sınırlamalar, lipitlerin analizi için teknik bir engeldir. Bununla birlikte, OCT'nin, sfengolipid içeriğini değiştirmeden yıkama ve santrifüjleme döngüleri yoluyla insan biyodepo örneklerinden kolayca çıkarılabileceğini daha önce göstermiştik. Ayrıca, OKT'de kriyokorunmuş insan dokularındaki sfingolipidlerin 16 yıla kadar stabil olduğunu daha önce tespit etmiştik. Bu raporda, OCT'ye gömülü insan dokusu örneklerinde sfingolipidleri analiz etmek için kullanılan adımları ve iş akışını, yıkama dokuları, veri normalizasyonu için dokuların tartılması, lipitlerin ekstraksiyonu, sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS), kütle spektrometrisi veri entegrasyonu, veri normalizasyonu ve veri analizi ile analiz için numunelerin hazırlanması dahil olmak üzere özetlemekteyiz.
Introduction
Sfengolipidler, insan metabolizması ve hastalığındaki rolleri ile bilinen biyoaktif metabolitlerdir 1,2. Hücre göçü, hücre sağkalımı ve ölümü, hücre hareketi, veziküler kaçakçılık, hücresel invazyon ve metastaz, anjiyogenez ve sitokinlerin üretimi gibi karmaşık hücresel süreçleri düzenlerler 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Sfengolipid metabolizmasının düzenlenmesindeki kusurlar, kanserlerin başlamasına ve ilerlemesine katkıda bulunur, kanserlerin ne kadar agresif olduğunu ve kanserlerin tedaviye nasıl tepki verdiğini ve direnç geliştirdiğini belirler 3,10. Bu nedenle, hastalığın etiyolojisi üzerindeki bu geniş etkileri nedeniyle, hastalığa özgü sfengolipid değişikliklerini kesin olarak belirleyebilen analitik yöntemler önemli araçlardır. Kütle spektrometresi (MS), sfengolipid değişikliklerini analiz etmek için en doğru ve güvenilir yöntemdir.
Sfengolipid değişikliklerinin analizi için kullanılabilecek insan örnekleri, cerrahi süitten prospektif olarak veya doku biyodepolarından retrospektif olarak elde edilebilir. Ameliyattan elde edilen taze dokular avantajlıdır çünkü MS veya diğer analitik yöntemlerle doğrudan analiz edilebilirler. Bununla birlikte, dokuların prospektif olarak elde edilmesinin idari, teknik ve lojistik engelleri vardır ve istatistiksel güce ulaşmak için yeterli örnek toplamak zor olabilir. Dokuların biyodepolardan elde edilmesi avantajlıdır, çünkü retrospektif olarak, çok sayıda edinilebilirler ve biyodepolar histoloji ve patolojiyi doğrular, dokuları kriyojenik olarak korumak ve depolamak için standart çalışma prosedürleri kullanır ve korelasyon analizleri için kullanılabilecek klinikopatolojik veriler sağlayabilir. Bununla birlikte, moleküler ve yapısal özellikleri korumak için, biyodepolar dokuları optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömerek kriyoprotektiflik edebilir, ki bu da veri normalleştirme tahlillerine ve sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS) 11 ile sfengolipidlerin nicelleştirilmesine müdahale ettiğini gösterdik. . OCT bileşiğindeki birincil bileşenler olan polivinil alkol ve polietilen glikolün, diğer MS analiz platformlarında iyon baskılanmasına neden olduğu da gösterilmiştir12,13,14,15. Bu nedenle, OCT bileşiği MS tarafından sfengolipidomik analizden önce dokulardan uzaklaştırılmalıdır.
Önceki bir raporda, LC-ESI-MS/MS analizi11 için OCT bileşiğinin insan örneklerinden çıkarılmasına yönelik bir protokolü ve veri normalizasyonu için dokuları tartmak için kullanılan metodolojiyi11 olarak doğrulamıştık. Burada, sfengolipidomik OCT bileşiği çıkarma protokolünün (sOCTrP) adımlarını detaylandırıyoruz ve insan akciğer adenokarsinom tümörlerinden ve normal bitişik tutulmamış dokulardan temsili veriler gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tanımlanmamış insan akciğer dokuları, Virginia Commonwealth Üniversitesi (VCU) Doku ve Veri Toplama ve Analiz Çekirdeğinden, dahili bir inceleme kurulu (IRB) onaylı protokol (#HM2471) kapsamında elde edilmiştir. Farelerin araştırma ve fare dokularının toplanması için kullanılması, VCU kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Bu adımlar doku yıkamadan bir gün önce yapılmalıdır.
- Ertesi gün işlenecek her numune için kısa ama net tanımlayıcı kodlara sahip 1,5 mL polipropilen santrifüj tüplerini önceden etiketleyin ve tartın. Tekrarlanan boru taşıma işleminin altında solmayacak kimyasal olarak dayanıklı kalıcı bir işaretleyici kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Elektronik bir elektronik tablo açın ve ardışık sütunları şu sütun başlıklarıyla etiketleyin: tüp tanımlayıcısı (ID), tek başına tüp, doku/doku içeren tüp ve toplam doku. Tüp kimliği etiketli sütuna işlenecek tüp tanımlayıcılarını girin.
- Analitik teraziyi önceden kalibre edin ve sıfırlayın. Denge plakasının ortasına temiz bir 10 mL Erlenmeyer şişesi yerleştirin (şişe tüp tutucu görevi görecektir). Tartım odasının kapağını kapatın ve kantarı şişeyle darmadağın edin.
- 1,5 mL santrifüj tüplerini tartın. Tüpü şişeye dikkatlice yerleştirin ve tartım odasının kapağını kapatın. Ağırlığın stabilize olmasına izin verin ve ağırlığı yalnızca tüp etiketli sütuna kaydedin.
NOT: Tüpleri tararken 10 mL Erlenmeyer şişesini hareket ettirmekten kaçının. Şişe hareket ettirilirse, şişeyi yeniden ortalayın ve dengeyi yeniden daralın. Kapalı tüpleri bir rafa yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın. - 13 x 100 mm vidalı cam tüpleri ve kapakları tanımlayıcı kodlarla önceden etiketleyin ve 2 mL LC-MS sınıfı metanol ile doldurun. Bunları bir tüp rafına yerleştirin, tüpleri kapatın ve kullanana kadar buzdolabında (4 ° C) saklayın.
NOT: Bir şişe üstü solvent dağıtıcı kullanın (bkz. Biri mevcut değilse, organik çözücüler dağıtırken plastik kullanımından kaçınmak için cam pipetler kullanın. - Ön etiket 13 x 100 mm cam test tüpleri. Test tüplerini oda sıcaklığında örtün ve saklayın.
- Otomatik enjektör şişelerini tanımlayıcı kodlarla önceden etiketleyin. Otomatik enjektör şişelerini örtün ve kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.
- Doku kurutan fitiller hazırlayın.
- Cerrahi makasları LC-MS sınıfı metanole 5 dakika batırarak temizleyin ve ardından temiz bir laboratuvar sınıfı doku ile silin.
- Pudrasız eldivenler kullanarak, laboratuvar sınıfı bir dokunun ucunu (bakınız Malzeme Tablosu) ince konik 30-40 mm'lik bir fitil oluşana kadar döndürün.
- Metanol ile temizlenmiş makas kullanarak, fitili kalın uçta kesin. Fitilleri temiz bir karton kutuya yerleştirin. Tüm numuneleri işlemek için gerekenden iki kat daha fazla fitil yapın.
- Kısaltılmış 1 mL pipet uçları hazırlayın. Metanol ile temizlenmiş cerrahi makas kullanarak, 1 mL'lik pipet ucunun ucundan 4-5 mm kesin, ucu tekrar uç tutucuya yerleştirin. İşlenecek numunelerden iki kat daha fazla ipucu hazırlayın.
NOT: Bunlar, yıkanmış dokuların tüplerden alınmasında kullanılacaktır. Ucun ucuna dokunmayın. - Ön soğutma moleküler biyoloji sınıfı fosfat tamponlu salin (PBS) ila 4 °C (0.5 L yeterlidir). Bu, örnekleri almak için kullanılacaktır. İşlenecek her numune için, 60 mL ultra saf deiyonize suyu önceden soğutun (4 °C).
- Kütle spektrometresi iç standartlarını hazırlayın. Aşağıdaki lipitleri etanol:metanol:su (7:2:1; v/v/v) konsantrasyonunda 25 nmol/mL: d17:1-sfengosin, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol içinde çözün; d17:1-sfengosin-1-fosfat, heptadekasfing-4-enin-1-fosfat; C12-Seramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoyl)-sphing-4-enin; C12-sfingomiyelin (d18:1/C12:0), N-(dodekanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfokolin; C12-glukozilseramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoil)-1-β-glukozil-sphing-4-eine; C12-laktosilseramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoil)-1-ß-laktosil-sphing-4-ene.
2. Doku yıkama
NOT: Bölüm 1'deki tüm adımları bir gün önce tamamlamak, yetenekli bir araştırmacının günde 40 numuneye kadar işlemesine ve günde ~ 10-15 numune almasına izin verir. Sabahın erken saatlerinde başlayın ve bölüm 2.1-3.8'deki tüm adımlar tamamlanana kadar durmayın.
- Dokuların işleneceği gün, biyogüvenlik kabini çalışma alanını bir girdap, tam yüklü bir serolojik pipetör ve bir buz tepsisi ile donatarak hazırlayın. Bu bölümdeki tüm adımlar için, laboratuvar önlüğü, çift kat eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun KKD'ler giyin. DİKKAT: İnsan dokuları ve sıvıları biyotehlikeli maddeler olarak düşünülmeli ve muamele görmelidir.
- Ön soğutma (4 °C) sallanan kova santrifüjünü, 15 mL konik santrifüj tüplerini tutmak için gereken adaptörleri ve santrifüj biyolojik muhafaza kapaklarını tutun. Ön soğutma (4 °C) 1,5 mL santrifüj tüplerini tutabilen sabit açılı bir santrifüj.
- Dokular 15 mL polipropilen santrifüj tüplerine aliquoted edilmezse, önceden etiketlenmiş 15 mL polipropilen tüplere aktarmak için metanol ile temizlenmiş bir spatula (her yeni doku örneği için temiz) kullanın. 15 mL kapakları da etiketleyin.
- 15 mL santrifüj tüplerini tutabilen bir tüp rafını bir buz tepsisine yerleştirin ve tepsiyi buzla doldurun. O gün işlenecek dokuları buz üzerindeki rafa yerleştirerek çözün.
NOT: İşleme için biyodepodan en az 3-4 mg doku talep edilmelidir, çünkü doku yıkama ve tartım protokollerinin bu ağırlıklarda doğru ve güvenilir olduğu daha önce gösterilmiştir11.
- 15 mL santrifüj tüplerini tutabilen bir tüp rafını bir buz tepsisine yerleştirin ve tepsiyi buzla doldurun. O gün işlenecek dokuları buz üzerindeki rafa yerleştirerek çözün.
- Numunelerle birlikte buz tepsisini biyogüvenlik kabinine taşıyın.
- Aşağıda açıklandığı gibi üç sOCTrP döngüsü11 gerçekleştirin (yani, 2.5.1-2.5.5 arasındaki adımları üç kez uygulayın).
- Her tüpe 10 mL buz gibi soğuk ultra saf deiyonize su ekleyin ve sıkıca kapatın. Tüplerin 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
- Her tüpü 10-20 sn boyunca veya tüpün duvarlarında biriken tüm dokular veya bir doku peleti tamamen yeniden askıya alınana kadar kuvvetli bir şekilde vorteksleyin.
NOT: sOCTrP döngüleri 2-3'te, pelet içindeki herhangi bir OCT'nin yıkama çözeltisine seyreltilmesi için peletin yeniden askıya alınması kritik öneme sahiptir. - Tüpleri önceden soğutulmuş (4 °C) sallanan kova santrifüjüne aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 4.000-5.000 x g'de santrifüj numuneleri.
NOT: Santrifüj taşıyıcılarını bir biyolojik muhafaza kapağı ile kapatarak santrifüjleme sırasında oluşan biyotehlikeli aerosollerin üretilmesini ve bunlara maruz kalmasını önleyin (bkz. - Santrifüjden numuneleri alın ve buz tepsisine aktarın. Tepsiyi bir biyogüvenlik dolabına yerleştirin ve tüplerin kapağını açın. Kapakları kaydedin.
- Yıkama solüsyonunu dikkatlice aspire edin. Tüpün içinde süpernatantın ~ 0.5 mL'sini bırakarak pelet içindeki doku materyalini aspire etmekten kaçının. Tüpleri kapatın ve etiketli kapakları tüplerle eşleştirerek çapraz kontaminasyonu önleyin.
NOT: Adım 2.5.5'teki yıkama çözeltisi (süpernatant) biyotehlikeli bir malzemedir; İnsan kökenli örnekler için uygun biyogüvenlik kurallarına uygun olarak ele alır ve bertaraf eder.
3. Doku tartımı (veri normalleştirme için)
- Son sOCTrP yıkama döngüsünden sonra, yıkama çözeltisinin çoğunu dikkatlice aspire edin, ancak peleti rahatsız etmekten kaçının. Yıkama çözeltisinin ~ 0,5 mL'sini tüpün içinde bırakın.
- Kısaltılmış pipet uçlarını kullanarak (adım 1.9'da hazırlanmıştır), 500 μL buz gibi soğuk PBS alın ve tüpe ekleyin.
- Aynı ucu kullanarak, peleti nazikçe askıya alın ve tüm dokuyu alın. Tüp ve pipet ucu duvarlarına yapışmasıyla doku kaybını azaltmak için türbülanslı pipetlemeden kaçının.
- Yeniden askıya alınmış dokuyu karşılık gelen önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 1,5 mL santrifüj tüpüne ekleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Veri kümesindeki tüm dokular için bu işlemi tekrarlayın.
- 1,5 mL tüpleri önceden soğutulmuş bir santrifüje yerleştirin ve dokuları 5-7 dakika ve 4 ° C boyunca 7.000 x g'de pelet edin.
- Tüpleri alın ve peleti rahatsız etmeden PBS'nin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice aspire edin. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.
- Dokuların iyi peletlenmesini sağlamak için tüpleri 7.000 x g'de 3 dakika daha santrifüj yapın. Tüpleri buza aktarın.
NOT: Ek santrifüjleme adımı, tüm yıkama solüsyonunu ve fitili çıkarırken doku kaybını önlemek için önemlidir. Beşten fazla numune işleniyorsa, dokuların peletlenmiş kalmasını sağlamak için her beşinci numune işlendikten sonra 3 dakika, 7.000 x g santrifüjleme adımını tekrarlayın. - Adım 1.8'de hazırlanan fitilleri kullanarak, kalan yıkama solüsyonunu nazikçe çıkarın. Her numune için temiz bir fitil kullanın. Dokuyu fitil ile nazikçe delmek kabul edilebilir, bu da yıkama çözeltisinin çoğunun çıkarılmasına yardımcı olur, ancak fitile yapışarak herhangi bir doku kaybetmekten kaçınır. Tüpü kapatın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Her tüpü yakın zamanda kalibre edilmiş, katranlanmış ve sıfırlanmış analitik terazide tartın.
- Her tüpü cam Erlenmeyer şişesine yerleştirin ve oda kapısını kapatın. Ağırlık stabilize olduğunda, tüp w / doku etiketli elektronik elektronik tablo sütununa kaydedin.
- Tarttıktan sonra, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.
- 300 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Kısaltılmış bir pipet ucu (adım 1.9) kullanarak, tüm dokuları dikkatlice alın ve 2 mL buz gibi soğuk LC-MS sınıfı metanol içeren önceden etiketlenmiş bir vidalı cam tüpte (adım 1.5'te hazırlanmış) biriktirin (dokuyu tüpün yanına değil, metanole ekleyin).
- Yıkanan doku miktarını, tek başına tüpü w / doku değeri olan tüpten çıkararak hesaplayın. Bu sayıyı toplam doku sütununa kaydedin. Toplam doku değeri, adım 6.12'de kütle spektrometresi verilerini normalleştirmek için kullanılacaktır.
- 4.1-4.15 adımlarını gerçekleştirmeye hazır olana kadar numuneleri -80 °C'de saklayın.
NOT: Bu iyi bir durma noktasıdır ve numuneler -80 ° C'de birkaç hafta boyunca güvenli bir şekilde saklanabilir. Protein konsantrasyonu veya lipid fosfat içeriği gibi diğer doku normalleştirme yöntemleri için Rohrbach ve ark.11'e bakınız.
4. Lipid ekstraksiyonu
NOT: Bu adımlara, özellikle birçok numunenin işleneceği sabah, başlamak önemlidir. Başlamadan önce, bir su banyosunu veya inkübatörü 48 ° C'ye ısıtın.
- Adım 3.8'de hazırlanan numuneleri ve MS lipit standartlarını (adım 1.11'de hazırlanan) dondurucudan alın. 20 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmelerine izin verin.
- Vorteks yapın ve dahili standart çözeltiyi ultrasonik bir su banyosuna ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2-3 dakika boyunca veya numunelere dağıtmadan önce MS lipit standartları tamamen çözülene kadar daldırın. Bu, veri normalleştirmedeki hataları önleyecektir.
- Tekrarlanan bir pipet kullanarak, her tüpe 250 pmol (adım 1.11'de hazırlanan 25 nmol/mL çözeltiden 10 μL) dahili kütle spektrometrisi standartları ekleyin. Tüpleri hafifçe yeniden kapatın.
- Homojenizasyonu kolaylaştırmak için, metanol hacmini 2 mL'ye ayarlayın. Sadece LC-MS/MS sınıfı metanol kullanın.
- Her seferinde bir tüp çalışarak, hiçbir küme görünmeyene kadar (tipik olarak 5-20 s) dokuyu tritürize etmek için bir homojenizatör kullanın. Homojenizatör ucunu dairesel bir hareketle hareket ettirin ve tritürasyona yardımcı olmak için tüp duvarına hafifçe bastırın. Tüpü tekrar kapatın.
NOT: Tüm dokuların ince bir şekilde tritüe edilmesini sağlamak, lipit ekstraksiyonunu en üst düzeye çıkaracaktır. Tek kullanımlık homojenizatör uçları kloroform içeren çözeltiler içinde çözünecek plastikten yapıldığından, homojenizasyondan önce numunelere kloroform eklemeyin. - Tüpü 45 ° açıyla 5-10 s için ultrasonik bir su banyosuna batırın.
- Ultrasonik banyoya daldırıldıktan sonra hiçbir doku kümelenmesi oluşmazsa, kapağı kapatın ve bir sonraki tüpe geçin.
- Tüp ultrasonik banyoya daldırıldığında doku kümeleri oluşursa, yeniden homojenize edin ve kümeleri hedefleyin.
- Tüm büyük doku kümeleri kırılana kadar bu işlemi (homojenizasyon / ultrasonik banyoya daldırma) yinelemeli olarak tekrarlayın.
- Bir duman davlumbazında, 2: 1: 0.1 metanol: kloroform: su oranını elde etmek için her tüpe LC-MS sınıfı kloroform ve metanoform ekleyin (bir şişe üstü dağıtıcı kullanın). Temiz kapaklar kullanarak, tüpleri sıkıca kapatın ve günün sonuna kadar tezgahın üzerinde bırakın.
- 50 mg veya daha hafif dokular için, toplam ekstraksiyon hacmi 4 mL'dir ve daha büyük numuneler için bu oranı (50 mg: 4 mL ekstraksiyon çözeltisi) kullanarak ayarlayın.
- O akşam ayrılmadan önce, sıkıca kapatılmış tüpleri 48 ° C'lik bir su banyosuna veya inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin.
NOT: Solvent oranlarının buharlaşma nedeniyle değişmemesi için tüplerin sıkıca kapatılması çok önemlidir. - Ertesi sabah, numuneleri 48 °C su banyosundan alın ve 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000-5.000 x g'de santrifüjleme yoluyla solventte çözünmeyen kalıntıları pelet edin.
- Bir duman davlumbazında çalışarak, süpernatantı önceden etiketlenmiş 13 x 100 mm borosilikat cam test tüplerine dikkatlice boşaltın. Dekantasyonu kolaylaştırmak için 13 x 100 mm'lik tüpü 30-45° açıyla eğin.
NOT: 12'den fazla numune işleniyorsa, santrifüj tüplerin uzun süre oturmasına izin vermeyin, çünkü peletler yumuşayacak ve adım 4.10 gerçekleştirilirken çözünmeyen döküntüler aktarılacaktır. Bunu önlemek için, bir seferde santrifüjden sadece 12 tüp çıkarın ve diğer tüpleri boşaltmaya hazır olana kadar santrifüj yapmaya devam edin. - Tüpleri 13 x 100 mm tüpleri tutabilen bir vakum yoğunlaştırıcısına aktarın. Tüm çözücüleri ilk 1 saatlik ısıtma adımıyla (40 ° C) buharlaştırın ve maksimum vakum altında çalıştırın.
- Tüpleri vakum yoğunlaştırıcıdan çıkarın ve her tüpe 500 μL LC-MS sınıfı metanol ekleyin (bir şişe üstü dağıtıcı kullanın).
- Kurutulmuş lipit ekstraktlarını 5-10 s boyunca vorteks yaparak yeniden askıya alın, ardından tüpü döndürürken tüpleri ultrasonik su banyosunda 2 dakika boyunca 45 ° 'lik bir açıyla daldırın. 5 s için yeniden vorteks yapın ve bir dakika daha ultrasonik su banyosuna daldırın.
NOT: Bu, ekstrakte edilen lipitlerin maksimum geri kazanımını sağlamak için kritik bir adımdır. Tüpün duvarındaki tüm kurutulmuş malzeme yeniden askıya alınana kadar ilerlemeyin. - 13 x 100 mm'lik tüpleri önceden soğutulmuş (4 °C) bir santrifüje yerleştirin ve çözünmeyen kalıntıları 20-30 dakika boyunca 4 °C'de 4.000-5.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin.
- Berraklaştırılmış süpernatantı önceden etiketlenmiş bir otomatik enjektör şişesine dikkatlice bildirin. Otomatik enjektör şişesinin 30-45° açıyla eğilmesi dekantasyonu kolaylaştıracaktır. 13 x 100 mm'lik tüpün tüm içeriğinin otomatik yükleyici şişesine boşaltıldığından emin olun.
- Tüpleri sıkıca kapatın ve LC-ESI-MS/MS ile analiz edilene kadar tüpleri -80 °C'de saklayın.
5. LC-ESI-MS/MS analizi
NOT: Aşağıdaki prosedür, üçlü dörtlü modda çalışan bir otomatik enjektör, degazör ve LC-MS/MS sistemine bağlı bir ikili pompa sistemi kullanır. Kolon sıcaklığı bir kolon fırını kullanılarak korunmuştur. Kullanılan ekipmanla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Mobil faz A1 (CH 3 OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, 5 mM amonyum formatlı) ve mobil faz B1'i (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, 5 mM amonyum formatlı) hazırlayın. Sadece LC-MS sınıfı çözücüler, su ve reaktifler kullanın.
- Her numune seti için, 500 μL LC-MS sınıfı metanol içeren dört Boş otomatik yükleyici şişesi hazırlayın.
- Her numune seti için, 500 μL LC-MS sınıfı metanol içinde adım 1.11'de hazırlanan dahili standart çözeltinin 10 μL'sini (her standart toplam 250 pmol) seyrelterek iki Dahili Standart (IS olarak etiketli) otomatik yükleyici şişesi hazırlayın.
- Kolon fırın sıcaklığını 60 °C'ye, iyon kaynağı sıcaklığını ise 500 °C'ye ayarlayın.
- MS / MS analizi için, spektrometrenin üçlü-dörtlü modunu kullanın. İlk kuadrupolü (Q1) öncü iyonları geçecek şekilde ayarlarken, üçüncü kuadrupole (Q3) moleküler olarak ayırt edici ürün iyonlarını (veya Q1 veya Q3'te çoklu m / z boyunca bir taramayı) geçirecek şekilde ayarlarken, Q1'den 30-120 eV ile dengelenen dörtlü 2'de (Q2) çarpışmalı ayrışmaları indüklemek için N2'yi kullanın.
- Çoklu reaksiyon izleme çiftleri (MRM) algılama penceresini hedef tarama süresi 1,0 sn olacak şekilde 120 sn olarak ayarlayın. MRM çiftlerinin, iyonlaşma enerjilerinin ve çarpışma enerjilerinin listesi için Tablo 1'e bakın.
- LC adımındaki sfingolipidleri çözmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: 0,7 mL/dak'lık bir akış hızı kullanarak, 2,1 (i.d) x 50 mm C18 ters faz kolonunu 0,5 dakika boyunca %95 mobil faz A1 ve %5 mobil faz B1'lik bir çözücü karışımı ile dengeleyin.
- Numune enjeksiyonundan sonra, mobil faz A1 / B1 oranını 2,25 dakika boyunca 95/5'te tutun, ardından 1,5 dakika boyunca% 100 B1'e doğrusal bir gradyan izleyin, daha sonra 5,5 dakika boyunca% 100 B1'de tutulur, ardından 95/5 A1 / B1'e 0,5 dakikalık bir gradyan dönüşü gelir.
- Çalıştırmadan sonra, sütunu 0,5 dakika boyunca 95/5 A1 / B1 karışımı ile yeniden dengeleyin.
- Numune otomatik yükleyici için aşağıdaki ayarları kullanın: durulama hacmi, 500 μL; iğne strok, 52 mm (bu, her şişedeki şişe boyutuna ve hacmine bağlı olarak ayarlanmalıdır); durulama hızı, 35 μL/s; örnekleme hızı, 5,0 μL/s; durulama daldırma süresi, 2 s; durulama modu, aspirasyondan önce ve sonra; durulama süresi,2 s.
- Adım 4.15'te hazırlanan numuneleri otomatik yükleyici tepsisine aşağıdaki sırayla yerleştirin: Boş; DİR; Boş; Adım 4.15'te hazırlanan örnekler; Boş, IS, Boş.
- Her numunenin 5-10 μL'sini LC-ESI-MS/MS ile analiz edin.
6. Veri işleme, entegrasyon ve normalleştirme
NOT: Aşağıdaki adımlar belirli yazılımlar için bir prosedürü özetlese de (bkz. Malzeme Tablosu), eşdeğer LC-MS cihazları ve yazılımları üzerindeki benzer prosedürler, analiz edilen lipit sınıfları ve ilgili dahili standartlar için MRM çiftlerini entegre etmek için kullanılabilir.
- Nicelik yazılımını açın. Quantitate sekmesinde Quantitation Wizard'a çift tıklayın. Açılır pencerede, en soldaki çalışma alanında, doğru veri kümesine gidin ve üzerine sol tıklayın. Kullanılabilir örnekler orta çalışma alanında gösterilir.
- Analiz edilecek örnekleri vurgulayın ve ardından Seçili Örnekler çalışma alanına örnekler eklemek için sağ taraftaki oka tıklayın. Varsayılan ayarların genellikle kullanıldığı ayarlara ve sorgu ekranına gitmek için İleri'ye tıklayın.
- Entegrasyon yöntemi seçim ekranına gitmek için İleri'ye basın. Analiz edilecek lipitler için MRM geçiş çiftlerini içeren uygun bir entegrasyon yöntemi seçin. MRM geçiş çiftleri için Tablo 1'e bakın. Son'a basın.
NOT: Bekletme süreleri, ölçümlü izleme ve bireysel ayarlara bağlı olarak değişir ve bu nedenle her bir kurulum için doğrulanması gerekir. - Gezinti çubuğunda, MRM çiftlerinin incelenebilmesi için Peak Review (En İyi İnceleme) bölmesine tıklayın. Gözden geçirmeyi kolaylaştırmak için, En Yüksek Gözden Geçirme bölmesine sağ tıklayın, Otomatik Yakınlaştırma'yı en büyük zirvenin %100'üne ve 1,00 - 2,00 dakikalık bir Yakınlaştırma Penceresi'ne değiştirin.
- Quantitation Display penceresine sağ tıklayın ve Analyte ve incelenmek üzere istenen sfingolipidi seçin. Boş örneklerde tepe noktası olmadığını ve doğru tepe noktasının IS örneklerine entegre edildiğini doğrulayın.
- Bilinmeyen örnekleri entegre etmeye başlayın. Bir seferde bir sfengolipid sınıfı çalışarak, iç standardın MRM çifti için tutma süresini inceleyin (yani, C12: 0 seramid) ve yazılımın doğru tepe noktasını entegre ettiğinden emin olun.
- Aynı lipit sınıfındaki analitlere devam edin (yani, C14: 0 seramid, C16:0-seramid, vb.), sınıftaki en kısa zincir uzunluğundaki lipitle başlar. Her zincir uzunluğundaki lipit için yazılım rutininin doğru MRM çifti zirvesini entegre ettiğini doğrulayın.
- Tüm analitler entegre edildiğinde, analiz edilen her sfengolipid türü için elektronik bir elektronik tablo oluşturun (örneğin, seramidler, sfingomiyelinler, vb.). Sütun başlıklarını, LC-MS/MS niceleme yazılımındaki analitlerin ve zincir uzunluklarının sırasına uyacak şekilde etiketleyin. Ayrıca, adım 3.9'da belirlenen örnek kimliği ve örnek normalleştirme ağırlıkları için bir sütun başlığı ekleyin.
NOT: Daha önce tarif edildiği gibi11, diğer yaygın normalizasyon önlemleri arasında toplam lipid fosfat içeriği veya protein miktarı bulunur. - Tüm analitler ve dahili standartlar için tepe alanlarını elektronik elektronik tabloya aktarın veya kopyalayın.
- Belirli bir sfengolipid sınıfı için her zincir uzunluğundaki türün entegre tepe alanını, karşılık gelen iç standardının tepe alanına bölerek verileri normalleştirin. Örneğin, C14:0 seramid, C16:0 seramid, C18:1 seramid, vb., her biri C12:0'a bölünmelidir. seramid iç standart tepe bölgesi.
- Pikomollerdeki normalleştirilmiş pik alanın (adım 6.10'da hesaplanan) 4.3. adımda numuneye eklenen iç standart miktarı ile çarpılmasıyla elde edilen pik alanı geri kazanılan lipit mollerine dönüştürün. Bu protokolde bu miktar 250 pmol'dür.
- Her numunedeki nispi lipit miktarını elde etmek için, her bir lipit zinciri uzunluğunun pikomollerini adım 3.9'da belirlenen doku ağırlığına bölün. Bu, mg doku başına lipit pikomol birimleri verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, OKT'yi kriyo-korunmuş insan dokularından çıkarmak ve LC-ESI-MS / MS ile analiz edilmek üzere dokuları tartmak için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu prosedür için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Şekil 1'de gösterilenler, 10 insan akciğer adenokarsinom tümörünün ve 10 normal bitişik dokunun OKT'yi çıkarmak için yıkandığı ve LC-ESI-MS / MS tarafından analiz edildiği tipik bir deneyin sonuçlarıdır. Önemli olarak, daha önce11'de gösterdiğimiz gibi, akciğer adenokarsinom tümörlerinde normal bitişik tutulmamış dokulara kıyasla önemli ölçüde artmış olan çeşitli zincir uzunluğundaki seramidler (Şekil 1A) ve monohekzosil-seramidler (Şekil 1B) vardır.
OCT'nin bölüm 4'te özetlenen lipit ekstraksiyon adımları üzerindeki etkisini değerlendirmek için yapılan kontrol deneylerinde, 200 mg fare karaciğeri (C57BL6; erkekler; 14-16 haftalık) 2 mL fosfat tamponlu salin içinde yeniden askıya alındı ve ince tritüre edilene kadar homojenize edildi. Ortaya çıkan ince karaciğer süspansiyonu daha sonra bir prob sonikatör ile kapsamlı bir şekilde sonikleştirildi (buz üzerinde 1 dakikalık sonikasyonun üç turu, buzda 1 dakika dinlenme,% 60 güç; mikrotip). Bu çözeltiden altı adet 300 μL karaciğer-homojenat replikası hazırlandı. Üç kopyaya, 200 mg OCT eklendi (biyodepo örneklerinde bulunan ortalama miktar11) ve diğer üçüne 200 μL su eklendi. Örnekler daha sonra bölüm 4'te özetlenen adımları izleyerek paralel olarak işlendi. Önemli olarak, tek fazlı Bligh-Kurutucu çözeltisinin santrifüjlenmesini takiben, OCT içeren numuneler bulanıkken, su içeren kontrol numuneleri berraktı (Şekil 2A). Tek fazlı lipit ekstraksiyon çözeltisindeki bulanıklık, artan santrifüjleme ve kapsamlı sonikasyondan sonra bile devam etti (gösterilmedi). Çözücü buharlaştırıldıktan sonra, OCT içeren numuneler, güçlü vorteks ve kapsamlı sonikasyon altında bile metanolde yeniden oluşturulamayan büyük peletlere sahipti (Şekil 2B). OCT içeren örnekler ayrıca analiz edilen tüm türlerin iç standartları için büyük bir sinyal kaybı göstermiştir (Şekil 3A-G). Ayrıca daha önce OCT içeren örneklerin, analiz edilen sfingolipidlerin çoğu için sinyal kaybı gösterdiğini göstermiştik11.
Tipik olarak, sfengolipid standartlarının Şekil 4'te gösterildiği gibi aşağıdaki sırayla sıralı olarak ortaya çıkması beklenir: d17: 1 sfingosin, d17: 1 sfingosin-1-fosfat, C12: 0 laktosil-seramid, C12:0 monohekzosil-seramid, C12:0 sfingomiyelin ve C12:0 seramid. Bu sfengolipid türlerinin her biri için, bölüm 5 ve daha önce11'de açıklanan gradyan ve enstrümantasyon ayarlarını kullanarak, zincir uzunluğundaki her 2 karbonlu artış için tutma süresinde yaklaşık +0.15 dakikalık bir kayma olacaktır. Örneğin, Şekil 5'te gösterildiği gibi, C14:0-seramid (Şekil 5B), C12:0-seramidden yaklaşık +0,15 dakika sonra süzülecektir (Şekil 5A). Yağ asidindeki bir çift bağ genellikle tutma süresinde -0.15'lik bir kaymaya neden olur, bu nedenle C16: 0-seramid (Şekil 5C), C18: 1-seramid'e benzer bir tutma süresine sahip olacaktır (Şekil 5D). Bununla birlikte, daha uzun zincir uzunluğundaki lipitler (yani, C24: 0, C26: 0) daha büyük tutma süresi kaymalarına sahip olabilir (sırasıyla Şekil 5I, K).
Şekil 1: Akciğer adenokarsinomlarının ve bitişik tutulmamış akciğer dokularının sfengolipid profilleri. Dokular OCT'de kriyojenik olarak depolandı, çözüldü, üç sOCTrP döngüsü ile işlendi, tartıldı ve LC-ESI-MS / MS tarafından analiz edildi. Belirtilen açil zincir boyu seramid (A), monohekzosilseramid (B), sfingomiyelin (C), laktosilseramid (D) ve sfengozin (E; Sph), sfengosin-1-fopshate (F; S1P), dihidro-Sph (E) ve dihidro-S1P (F) ölçüldü. n = 10 tümör ve n = 10 bitişik tutulmamış doku. Kutu grafikleri medyanları (siyah çizgi) ve minimum ila maks. ns'lik bıyıkları gösterir, önemli değildir; , s≤0.005; , p 0.0005 ≤. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OCT'li ve OCT'siz ayıklanan numunelerin temsili görüntüleri. Fare karaciğerleri homojenize edildi ve sonikleştirildi, altı özdeş örneğe ayrıldı: üç numuneye 200 mg OCT ve diğer üçüne su eklendi. (A) 2: 1: 0.1 metanol: kloroform: su (v: v) oranına ulaşmak için metanol ve kloroform eklendikten sonra, 48 ° C'de gece boyunca inkübasyon, ardından santrifüjleme yapıldıktan sonra, OCT içeren numunelerin süpernatantları bulanıktı ve sonikasyon, vorteks veya santrifüjleme ile açıklığa kavuşturulamadı. (B) Solvent buharlaşmasını takiben, kapsamlı sonikasyon ve vorteksten sonra 0.5 mL metanol içinde tamamen yeniden oluşturulamayan OCT içeren örneklerden büyük bir pelet geri kazanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OCT'nin varlığında veya yokluğunda sfengolipid standartlarının LC-ESI-MS/MS miktarının belirlenmesi. Fare karaciğerleri homojenize edildi, sonikleştirildi ve altı özdeş örneğe bölündü. Altı numuneden üçüne 200 mg OCT eklenirken, diğer üçüne su eklendi. İç standartların, metanol ve kloroformun eklenmesinden sonra, numuneler aynı şekilde işlendi ve ekstrakte edilen lipitler LC-ESI-MS / MS ile analiz edildi. Kısaltmalar: Sph, sfengosin; S1P, sfengosin-1-fosfat. Siyah oklar, belirtilen sfengolipid için doğru MRM çiftine işaret eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sfengolipid standartlarının LC-ESI-MS / MS çoklu reaksiyon izleme çiftleri için göreceli tutma süreleri. Fare karaciğerleri homojenize edildi ve sonikleştirildi; iç standartlar, metanol ve kloroform eklendi; ve LC-ESI-MS / MS tarafından ekstrakte edilen ve analiz edilen lipitler. Gösterilenler, belirtilen lipitlerin (A-F) çoklu reaksiyon izleme çiftlerinin tutma süreleridir. Sıvı kromatografi gradyanı sırasında lipitlerin süzüldüğü göreceli sıraya dikkat edin. Kısaltmalar: Sph, sfengosin; S1P, sfengosin-1-fosfat; SM, sfingomiyelin. X ekseni, dakika cinsinden MRM çifti tutma süresidir. Y ekseni, MRM çiftleri için sinyal yoğunluğudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: LC-ESI-MS/MS MRM çiftlerinin tutma süresinde açil zincir uzunluğuna bağlı kayma. Fare karaciğerleri homojenize edildi ve sonikleştirildi; iç standartlar, metanol ve kloroform eklendi; ve LC-ESI-MS/MS tarafından ekstrakte edilen ve analiz edilen lipitler. Gösterilen retansiyon süreleri ve belirtilen lipitlerin MRM çiftleridir. Çeşitli lipitler (A-K) için artan açil zinciri uzunluğu ile tutma süresindeki değişime dikkat edin, bu da tipik olarak 2 karbonlu artış başına +0.15 dakikalık bir tutma süresine karşılık gelir. Çift bağ, -0,15 dakikalık bir tutma süresi kayması (D, H, J) ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, daha uzun zincirli lipitler için, retansiyon süresindeki göreceli artış daha uzun olabilir (G-K). X ekseni, dakika cinsinden MRM çifti tutma süresidir. Y ekseni, MRM çiftleri için sinyal yoğunluğudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: LC-ESI-MS/MS analizi için MRM çiftleri, iyonizasyon parametreleri ve çarpışma enerjileri. DP, kümelenme potansiyeli; CE, çarpışma enerjisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OKT, biyodepolarda kullanılan yaygın bir uzun süreli kriyo-koruma ajanıdır. Bununla birlikte, dokular çeşitli kütle spektrometresi platformları12,13,14,15 tarafından analiz edildiğinde OCT, iyon baskılanmasına neden olabilir veya numuneler LC-ESI-MS / MS11 tarafından analiz edildiğinde sinyal kaybına neden olabilir. Kriyokorunmuş dokulardaki OCT, Bradford ve BCA11 gibi tartım ve protein niceleme testleri gibi doku normalleştirme yöntemlerine de müdahale edebilir. Burada, OCT'yi insan dokularından uzaklaştırmak ve daha sonra kütle spektrometrisi ile analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, akciğer olmayan diğer doku kaynaklarını veya daha önce tanımladığımız gibi fare dokularından kullanmak için değiştirilebilir11. Ek olarak, daha önce11'i tanımladıklarımız ve diğer doğrulanmış yöntemler de dahil olmak üzere diğer kütle spektrometresi veri normalleştirme stratejileri kullanılabilir.
Bu protokolün önemli bir sınırlaması, daha önce formaldehit veya başka bir sabitleme maddesi ile sabitlenmiş dokuların analizi için yeterli olmamasıdır. Sadece OCT'de sabitlenmemiş ve kriyokorunmuş dokular için yeterlidir. Ek olarak, bu yöntem 1-2 mg'dan daha hafif dokuların işlenmesi için yeterli değildir, çünkü sOCTrP adımları ve tüpler arasındaki transferler sırasında her zaman bir miktar doku kaybı vardır. Bu tür küçük dokuları standart bir analitik terazi kullanarak tartmak zor olacaktır ve fitil aşamasında çıkarılmayan kalan PBS, deneysel hataya büyük katkıda bulunacaktır. Aşağıda, OCT'yi bu yöntemle gidermek için dokuları yıkarken dikkat edilmesi gereken diğer önemli hususlar bulunmaktadır.
Bu protokolün sorunsuz bir şekilde uygulanmasını sağlamak için, özellikle de çok sayıda numune işlenecekse, 1,5 mL tüplerin ön etiketlenmesi ve ön tartılması, 13 x 100 mm vidalı kapak tüplerinin ve kapaklarının ön etiketlemesi, 13 x 100 mm kültür tüplerinin ve otomatik enjektör şişelerinin hazırlanması, tüm fitillerin hazırlanması, 1 mL pipet uçlarının önceden kısaltılması dahil olmak üzere bölüm 1'de özetlenen adımlar önceden gerçekleştirilmelidir. ve ön soğutma yıkama çözeltileri. Bu, dokuların yıkanacağı gün zaman alıcı prosedürlerin yapılması gerektiğini önleyecek ve bu da gecikmelere neden olabilir. Genel olarak, bu adımların birçoğu bir gün önce gerçekleştirilirse, deneyimli bir araştırmacının normal bir iş gününde 30-40 örneği yıkayabileceğini görüyoruz. Bununla birlikte, önerilen ilk durma noktası, tüm dokular yıkandıktan ve tartıldıktan ve metanole yerleştirildikten ve -80 ° C'de saklandıktan sonra, önceden 1,5 mL ön tartım ve etiketleme yapılmaması verimliliği etkileyecek ve 30-40 dokuyu yıkamak için gereken süreyi uzatacaktır.
Doku tartımı en önemli adımlardan biridir, çünkü hatalar veya dikkatsizlik, veri normalleştirmeye taşınacağı için veri kalitesini etkileyecektir. Tartım için kullanılan analitik terazinin kalibre edilmesi, uygun şekilde sıfırlanması ve katranlanması çok önemlidir. Buna göre, fitil kullanırken, özellikle 5 mg'dan daha hafif dokular için yıkama çözeltisinin mümkün olduğunca çıkarılması önemlidir. Bu doku ağırlıklarında, artık yıkama çözeltisi tartımı büyük bir oranda yanlış yapar ve veri normalleştirmede bir hata olarak taşınır. Yıkama solüsyonunu çıkarırken, fitile yapışarak önemli doku kayıplarına yol açmadan mümkün olduğunca fazla yıkama solüsyonunu çıkarmak için dokulara birkaç saniye boyunca hafifçe dokunulabildiğini görüyoruz. Bununla birlikte, yıkanan her doku tipi fitillere yapışma açısından test edilmeli ve protokoldeki bu adımlar buna göre ayarlanmalıdır.
Doku yıkama iş akışını kolaylaştırmak için, 15 mL polipropilen tüplerdeki biyodepodan doku talaşı talep edilmesi önerilir. Bu, yıkamadan önce dokuların işlenmesini azaltacaktır.
Dokuları yıkarken, üçüncü sOCTrP döngüsünden sonra bir tüpün dibinde jel benzeri bir malzeme gözlenirse, bu, tüm OCT'lerin çıkarılmadığının ve daha fazla sOCTrP döngüsüne ihtiyaç duyulduğunu gösterir. Kaç döngünün gerekli olduğunu takip edin ve tutarlılık için, veri kümesindeki tüm örneklerde aynı sayıda sOCTrP döngüsü gerçekleştirin. Daha önce 9 sOCTrP döngüsüne kadar değerlendirdik ve dokulardaki sfengolipidlerin tükenmesi üzerinde hiçbir etki bulamadık11.
Yıkama solüsyonunu çıkarmak için fitil kullanırken, dokuyu nazikçe delmek, tüm yıkama çözeltisinin çıkarılmasını sağlayacaktır. Bu, doku ağırlığı tahmininin doğruluğunu arttırır. Bununla birlikte, çok küçük dokularla büyük özen gösterilmelidir, çünkü bunlar fitile yapışabilir ve numune kaybına neden olabilir. Mümkün olduğunca fazla çözeltiyi çıkarmak için aynı tüp için birkaç fitil kullanmak yararlıdır. Numuneler arası kontaminasyonu önlemek için, her numune için daima yeni ve temiz bir fitil kullanın. Fitil yaparken, daha önce test ettiğimiz ve ihmal edilebilir miktarda kirletici sfingolipid içerdiği tespit edildiği için laboratuvar sınıfı doku kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız)11. Diğer malzemelerden elde edilen fitiller, tarif edildiği gibi test edilirse kullanılabilir11.
Tartımdan sonra 1,5 mL tüplerden numuneler alınırken, tüm dokuların geri kazanılması kritik öneme sahiptir. Bunun yapılmaması, veri normalleştirmede hatalara neden olur. Tüm dokuyu kurtarmak için daha fazla PBS'ye ihtiyaç duyulursa, farklı miktarlarda PBS içeren numunelerden kaynaklanabilecek ekstraksiyon verimliliğindeki farklılıkları önlemek için diğer tüm tüplere kullanılan eşdeğer miktarda PBS ekleyin. 2: 1: 0.1 metanol: kloroform: su oranını korumak için su hacmindeki herhangi bir artışı hesaba katmak için kloroform ve metanol hacimlerini ayarlayın.
Örnekleri çözerken, sfengosin-1-fosfat gibi kararsız lipitlerin bozulmasını önlemek için bu adımın buz üzerinde yapılması önemlidir. OCT sıvı halde olana kadar numunelerin tamamen çözülmesi, erken yıkama aşamalarında pelet olarak kalmak yerine soğuk yıkama çözeltisinde daha kolay çözüleceği için çıkarılmasını da kolaylaştıracaktır.
Bazen, özellikle akciğer dokularını yıkarken, peletlenmeyecek ve santrifüjlemeden sonra yıkama çözeltisinin üstünde yüzecek parçalar olacaktır. Yıkama solüsyonunu çıkarmak için aspirasyon ucunu yüzen dokuların altına daldırmak, aspirasyon sırasında kaybı önleyebilir.
Tek kullanımlık homojenizatör uçları plastikten yapıldığından ve kloroform içeren çözeltiler içinde çözüneceğinden homojenizasyondan önce numunelere kloroform eklemeyin. Bu, numunelerdeki lipitlerin LC-MS / MS miktarını önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, genel olarak, kloroform ve metanol dağıtımı sırasında çözücülere dayanıklı olmayan plastiklerin kullanımından kaçınılmalıdır. Bu çözücüler de toksiktir ve uygun bir duman davlumbazında kullanılmalıdır. Metanol ve kloroform gibi çözücüleri kullanırken uygun KKD kullanın.
İnsan dokuları uygun bir biyogüvenlik kabininde işlenmelidir (örneğin, Sınıf II). Kullanıcılar, biyotehlikeli maddelerin ve insan kaynaklı sıvıların taşınması konusunda eğitilmeli ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek ve numunelerle temas eden herhangi bir yüzey veya ekipmanı dekontamine etmek gibi güvenlik protokollerini takip etmelidir. Kullanıcılar, yıkama prosedürü sırasında kullanılan herhangi bir yüzeyi veya ekipmanı (santrifüjler, santrifüj taşıyıcıları ve adaptörleri, pipetörler, girdaplar, duman davlumbaz yüzeyleri, teraziler, cam eşyalar, buz tepsileri, bilgisayar klavyeleri, bilgisayar faresi vb.) iyice dezenfekte etmelidir (önerilen dekontaminant için Malzeme Tablosuna bakınız). Laboratuvar üyeleri, iyice dezenfekte edilene kadar doku yıkama için kullanılan ekipman veya davlumbazları kullanmamalıdır. Çelik yüzeylerde ve elektroniklerde çamaşır suyu kullanımından kaçının.
Birçok numuneyi işlerken, lipit ekstraksiyon adımları sırasında yeniden kapaklama adımlarında temiz kapaklar kullanarak çapraz kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun. Kapaklar etiketlendiklerinde de yeniden kullanılabilirler. Bununla birlikte, pratikte, işaretleyicilerin siyah kapaklarda zayıf bir şekilde öne çıktığını ve yapışkan etiketlerin gece boyunca 48 ° C inkübasyon sırasında tüplerden düştüğünü görüyoruz.
Sfengolipidler, hastalık ve insan kanserlerinin etiyolojisinde önemli oyuncular olarak gösterilmiştir. Bu nedenle, bu hastalıklardaki sfengolipid metabolizması değişikliklerinin terapötik hedefleri ortaya çıkarabileceği için kesin olarak tanımlanmasına büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, araştırmacılar tarafından kolayca erişilebilen dokuların çoğu, kütle spektrometrisi analizi ile uyumlu olmayan OCT'de kriyokorunmuştur. Bu nedenle, burada açıklanan ayrıntılı protokol, kantitatif sfengolipidomik analiz için yeterli doku repertuarını genişletecek ve böylece insan hastalığı ve kanserindeki lipit metabolizması değişikliklerinin biyolojisi hakkındaki anlayışımızı arttırmaya yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Araştırma projesinin hizmetleri ve desteği, kısmen NIH-NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA016059'un finansmanıyla desteklenen VCU Massey Kanser Merkezi Doku ve Veri Toplama ve Analiz Çekirdeği ve VCU Lipidomik ve Metabolomik Çekirdeği tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeleri Enstitüleri R21CA232234 (Santiago Lima) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S.
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J.
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
