Summary
Sfingolipider er bioaktive metabolitter med veletablerte roller i human sykdom. Karakterisering av endringer i vev med massespektrometri kan avsløre roller i sykdomsetiologi eller identifisere terapeutiske mål. Imidlertid forstyrrer OCT-forbindelsen som brukes til kryopreservering i biorepositorier massespektrometri. Vi skisserer metoder for å analysere sfingolipider i humant vev innebygd i OCT med LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sfingolipider er cellulære komponenter som har veletablerte roller i menneskelig metabolisme og sykdom. Massespektrometri kan brukes til å bestemme om sfingolipider endres i en sykdom og undersøke om sfingolipider kan målrettes klinisk. Imidlertid kan riktig drevne prospektive studier som anskaffer vev direkte fra kirurgisk suite være tidkrevende og teknisk, logistisk og administrativt utfordrende. I motsetning til dette kan retrospektive studier dra nytte av kryopreserverte menneskelige prøver som allerede er tilgjengelige, vanligvis i stort antall, ved vevsbiorepositorier. Andre fordeler ved å anskaffe vev fra biorepositorier inkluderer tilgang til informasjon knyttet til vevsprøver, inkludert histologi, patologi og i noen tilfeller kliniskpatologiske variabler, som alle kan brukes til å undersøke korrelasjoner med lipidomikkdata. Imidlertid er tekniske begrensninger knyttet til inkompatibiliteten til optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) som brukes i kryopreservering og massespektrometri en teknisk barriere for analyse av lipider. Imidlertid har vi tidligere vist at OCT lett kan fjernes fra humane biorepository prøver gjennom sykluser av vasker og sentrifugering uten å endre deres sfingolipidinnhold. Vi har også tidligere fastslått at sfingolipider i humant vev kryopreservert i OCT er stabile i opptil 16 år. I denne rapporten skisserer vi trinnene og arbeidsflyten for å analysere sfingolipider i humane vevsprøver som er innebygd i OCT, inkludert vasking av vev, veiing av vev for datanormalisering, ekstraksjon av lipider, fremstilling av prøver for analyse ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandemmassespektrometri (LC-ESI-MS / MS), massespektrometridataintegrasjon, datanormalisering og dataanalyse.
Introduction
Sfingolipider er bioaktive metabolitter kjent for sine roller i human metabolisme og sykdom 1,2. De regulerer komplekse cellulære prosesser som cellemigrasjon, celleoverlevelse og død, cellebevegelse, vesikulær handel, cellulær invasjon og metastase, angiogenese og produksjon av cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i reguleringen av sfingolipidmetabolisme bidrar til initiering og progresjon av kreft, bestemmer hvor aggressive kreftformer er, og hvordan kreft reagerer på og utvikler motstand mot terapi 3,10. Derfor, på grunn av disse brede effektene på sykdommens etiologi, er analytiske metoder som nettopp kan etablere sykdomsspesifikke sfingolipidendringer, viktige verktøy. Massespektrometri (MS) er den mest nøyaktige og pålitelige metoden for å analysere sfingolipidendringer.
Humane prøver som kan brukes til analyse av sfingolipidendringer, kan oppnås prospektivt fra kirurgisk suite eller retrospektivt fra vevsbiorepositorier. Friskt vev fra kirurgi er fordelaktig fordi de kan analyseres direkte ved MS eller andre analysemetoder. Imidlertid har anskaffelse av vev prospektivt administrative, tekniske og logistiske hindringer, og det kan være utfordrende å samle tilstrekkelige prøver for å nå statistisk styrke. Innhenting av vev fra biorepositorier er fordelaktig fordi de kan anskaffes retrospektivt, i stort antall, og biorepositorier bekrefter histologi og patologi, bruker standard operasjonsprosedyrer for å kryogenisk bevare og lagre vev, og kan gi kliniskpatologiske data som kan brukes til korrelasjonsanalyser. For å bevare molekylære og strukturelle egenskaper kan biorepositorier imidlertid kryopreservere vev ved å legge dem inn i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse, som vi har vist forstyrrer datanormaliseringsanalyser og kvantifisering av sfingolipider ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har også vist seg at polyvinylalkohol og polyetylenglykol, de primære komponentene i OCT-forbindelsen, resulterer i ionundertrykkelse i andre MS-analyseplattformer12,13,14,15. Derfor må OCT-forbindelsen fjernes fra vev før sfingolipidomisk analyse ved MS.
I en tidligere rapport har vi validert en protokoll for fjerning av OCT-forbindelse fra humane prøver for LC-ESI-MS / MS-analyse11 og metoden som brukes for veiing av vev for datanormalisering11. Her beskriver vi trinnene i den sfingolipidomiske OCT-forbindelsesfjerningsprotokollen (sOCTrP) og viser representative data fra humane lungeadenokarsinomtumorer og normale tilstøtende uinvolverte vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avidentifisert humant lungevev ble hentet fra Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core under en intern gjennomgangstavle (IRB) godkjent protokoll (#HM2471). Bruken av mus til forskning og høsting av musevev ble godkjent av VCU institutional animal care and use committee (IACUC).
1. Forberedelse av materialer
MERK: Disse trinnene bør utføres en dag før vevsvasken.
- Formerke og veie 1,5 ml polypropylensentrifugerør med konsise, men klare identifikatorkoder for hver prøve som skal behandles neste dag. Bruk en kjemisk motstandsdyktig permanent markør (se tabell over materialer) som ikke falmer under gjentatt rørhåndtering.
- Åpne et elektronisk regneark og merk påfølgende kolonner med følgende kolonneoverskrifter: tube identifier (ID), tube alone, tube m/tissue og total tissue. Skriv inn røridentifikatorene som skal behandles i kolonnen merket rør-ID.
- Forhåndskalibrer og null en analytisk vekt. Plasser en ren 10 ml Erlenmeyer-kolbe i midten av balanseplaten (kolben vil fungere som en rørholder). Lukk veiekammerdøren og trare vekten med kolben.
- Vei 1,5 ml sentrifugerør. Plasser røret forsiktig i kolben og lukk veiekammerdøren. La vekten stabilisere seg og registrer vekten i kolonnen merket rør alene.
MERK: Unngå å flytte 10 ml Erlenmeyer-kolben når du veier slanger. Hvis kolben flyttes, sentrerer kolben på nytt og reparerer balansen på nytt. Plasser de lukkede rørene i et stativ og oppbevar til det er nødvendig. - Formerke 13 x 100 mm skrueformede glassrør og korker med identifikatorkodene og fyll dem med 2 ml LC-MS-metanol. Legg dem i et rørstativ, dekk rørene og oppbevar dem i kjøleskap (4 °C) til bruk.
MERK: Bruk en flaske topp løsemiddel dispenser (se tabell over materialer). Hvis en ikke er tilgjengelig, bruk glasspipetter for å unngå bruk av plast ved dispensering av organiske løsemidler. - Pre-label 13 x 100 mm glass reagensrør. Dekk til og oppbevar reagensrørene ved romtemperatur.
- Formerke autoinjektorflasker med identifikatorkoder. Dekk til og oppbevar hetteglassene med autoinjektor ved romtemperatur til bruk.
- Forbered vevstørkende veker.
- Begynn med å rengjøre kirurgisk saks ved å nedsenke dem i LC-MS-metanol i 5 minutter, og tørk dem deretter med et rent laboratorievev.
- Bruk pulverfrie hansker til å snurre enden av et vev av laboratoriekvalitet (se Materialtabell) til en finkonisk 30-40 mm veke dannes.
- Bruk metanolrenset saks, klipp veken på den tykke enden. Legg veker i en ren kartongboks. Lag dobbelt så mange veker enn det som trengs for å behandle alle prøvene.
- Forbered forkortede 1 ml pipettespisser. Bruk metanolrenset kirurgisk saks, klipp 4-5 mm av spissen på en 1 ml pipettespiss, og plasser spissen tilbake i spissholderen. Forbered dobbelt så mange tips som prøver som skal behandles.
MERK: Disse vil bli brukt i henting av vasket vev fra rør. Ikke berør enden av spissen. - Pre-chill molekylærbiologi grade fosfatbufret saltvann (PBS) til 4 ° C (0,5 L er tilstrekkelig). Dette vil bli brukt til å hente prøver. For hver prøve som skal behandles, forkjøles (4 °C) 60 ml ultrarent avionisert vann.
- Forbered interne standarder for massespektrometri. Oppløs følgende lipider i etanol: metanol: vann (7: 2: 1; v / v / v) i en konsentrasjon på 25 nmol / ml: d17: 1-sfingosin, (2S, 3R, 4E) -2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol; d17:1-sfingosin-1-fosfat, heptadecasphing-4-enin-1-fosfat; C12-Ceramid (d18:1/C12:0), N- (dodecanoyl)-sphing-4-enine; C12-sfingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfokolin; C12-glukosylceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-β-glukosyl-sphing-4-eine; C12-laktosylceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-ß-laktosyl-sphing-4-ene.
2. Vask av vev
MERK: Ved å fullføre alle trinnene i seksjon 1 en dag før, kan en dyktig forsker behandle opptil 40 prøver per dag, og nybegynnere ~ 10-15 prøver per dag. Begynn tidlig om morgenen og ikke stopp før alle trinnene i avsnitt 2.1-3.8 er fullført.
- På dagen da vevet skal behandles, klargjør du arbeidsområdet for biosikkerhetsskapet ved å utstyre det med en virvel, en fulladet serologisk pipetor og en isbrett. For alle trinnene i denne delen, bruk passende PPE, inkludert et laboratoriefrakk, et dobbelt lag med hansker og beskyttende briller. FORSIKTIG: Humant vev og væsker bør vurderes og behandles som biofarlige materialer.
- Forkjøling (4 °C) en svingbar bøtte sentrifuge, eventuelle adaptere som trengs for å holde 15 ml koniske sentrifugerør, og sentrifuge biocontainment lokk. Forkjøling (4 °C) en sentrifuge med fast vinkel som kan holde 1,5 ml sentrifugerør.
- Hvis vev ikke aliquoted i 15 ml polypropylen sentrifuge rør, bruk en metanol renset slikkepott (ren for hver ny vevsprøve) for å overføre dem til pre-merkede 15 ml polypropylen rør. Merk også 15 ml caps.
- Plasser et rørstativ som kan holde 15 ml sentrifugerør i en isbrett og fyll brettet med is. Tine vev som vil bli behandlet den dagen ved å plassere dem i stativet på is.
MERK: Minst 3-4 mg vev bør forespørres fra biorepositoriet for behandling, da det tidligere har vist seg at vevsvask og veieprotokoller er nøyaktige og pålitelige ved disse vektene11.
- Plasser et rørstativ som kan holde 15 ml sentrifugerør i en isbrett og fyll brettet med is. Tine vev som vil bli behandlet den dagen ved å plassere dem i stativet på is.
- Flytt isbrettet med prøvene inn i biosikkerhetsskapet.
- Utfør tre sOCTrP-sykluser11 som omtalt nedenfor (dvs. utfør trinn 2.5.1-2.5.5 tre ganger).
- Tilsett 10 ml iskaldt ultrarent avionisert vann til hvert rør og dekk dem tett. La rørene ruge i 10 minutter.
- Kraftig virvel hvert rør i 10-20 s eller til alt vevet som er avsatt på rørets vegger, eller en vevpellets, er fullstendig resuspendert.
MERK: I sOCTrP sykluser 2-3 er det avgjørende at pelleten resuspenderes slik at eventuell OCT i pelleten fortynnes i vaskeoppløsningen. - Overfør rørene til den forkjølte (4 °C) svingbare bøttesentrifugen. Sentrifugeprøver ved 4 000-5 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Unngå generering av og eksponering for biofarlige aerosoler generert under sentrifugering ved å forsegle sentrifugebærerne med et biocontainmentlokk (se materialtabell). - Hent prøver fra sentrifugen og overfør til isbrettet. Plasser brettet i et biosikkerhetsskap og avslutt rørene. Lagre capsene.
- Aspirer vaskeoppløsningen forsiktig. Unngå å aspirere vevsmaterialet i pelleten ved å etterlate ~ 0,5 ml av supernatanten i røret. Dekk rørene og unngå krysskontaminering ved å matche merkede hetter med rør.
MERK: Vaskeoppløsningen (supernatanten) i trinn 2.5.5 er et biofarlig materiale; håndtere og avhende den i henhold til retningslinjer for biosikkerhet som er egnet for prøver av menneskelig opprinnelse.
3. Vevsveiing (for datanormalisering)
- Etter den siste sOCTrP vaskesyklusen, aspirer forsiktig det meste av vaskeoppløsningen, men unngå å forstyrre pelleten. La ~0,5 ml av vaskeoppløsningen ligge i røret.
- Bruk de forkortede pipettespissene (tilberedt i trinn 1.9), ta opp 500 μL iskald PBS og legg den til røret.
- Bruk samme spiss, forsiktig resuspend pelleten og hent alt vev. Unngå turbulent pipettering for å redusere vevstap ved å feste seg til rør- og pipettespissveggene.
- Tilsett det resuspenderte vevet til det tilsvarende forhåndsmerkede og forhåndsveide 1,5 ml sentrifugerøret og legg røret på is. Gjenta for alle vev i datasettet.
- Plasser 1,5 ml rørene i en forkjølt sentrifuge og pellets vevet ved 7000 x g i 5-7 minutter og 4 °C.
- Hent rør og aspirer forsiktig så mye av PBS som mulig uten å forstyrre pelleten. Legg røret tilbake på is.
- Sentrifugerrør i ytterligere 3 minutter ved 7000 x g for å sikre at vevet er godt pelletert. Overfør rørene til is.
MERK: Det ekstra sentrifugeringstrinnet er viktig for å forhindre vevstap når du fjerner all vaskeløsning og fukttransport. Hvis du behandler mer enn fem prøver, gjenta sentrifugeringstrinnet på 3 minutter og 7000 x g etter at hver femte prøve er behandlet for å sikre at vev forblir pelletert. - Bruk vekene som er tilberedt i trinn 1.8, og fjern forsiktig eventuell gjenværende vaskeoppløsning. Bruk en ren veke for hver prøve. Det er akseptabelt å forsiktig dab vevet med veken, noe som vil bidra til å fjerne det meste av vaskeoppløsningen, men unngå å miste vev ved å overholde veken. Lukk røret og legg det på is.
- Vei hvert rør i den nylig kalibrerte, tjærede og nullstilte analytiske vekten.
- Plasser hvert rør i glasset Erlenmeyer kolbe og lukk kammerdøren. Når vekten har stabilisert seg, noter den i den elektroniske regnearkkolonnen merket rør m / vev.
- Etter veiing, legg røret tilbake på is.
- Tilsett 300 μL iskald PBS. Bruk en forkortet pipettespiss (trinn 1.9), hent forsiktig alt vev og avleir i et forhåndsmerket skrueglassrør (fremstilt i trinn 1.5) som inneholder 2 ml iskald LC-MS-metanol (tilsett vevet til metanolen, ikke til siden av røret).
- Beregn mengden vev som ble vasket ved å trekke røret alene fra rørets m/vevsverdi. Registrer dette tallet i den totale vevskolonnen. Den totale vevsverdien vil bli brukt til å normalisere massespektrometridata i trinn 6.12.
- Oppbevar prøvene ved -80 °C til de er klare til å utføre trinn 4.1-4.15.
MERK: Dette er et godt stoppested, og prøvene kan lagres trygt i et par uker ved -80 °C. For andre vevsnormaliseringsmetoder, som proteinkonsentrasjon eller lipidfosfatinnhold, se Rohrbach et al.11.
4. Lipid ekstraksjon
MERK: Det er viktig å begynne disse trinnene om morgenen, spesielt når mange prøver skal behandles. Før du starter, forvarm et vannbad eller en inkubator til 48 °C.
- Hent prøvene utarbeidet i trinn 3.8 og MS-lipidstandardene (utarbeidet i trinn 1.11) fra fryseren. La dem balansere til romtemperatur i 20 minutter.
- Vortex og senk den interne standardløsningen i et ultralydvannbad (se materialtabell) i 2-3 minutter eller til MS-lipidstandardene er fullstendig oppløst før dispensering i prøver. Dette vil unngå feil i datanormalisering.
- Bruk en repeterende pipette til å tilsette 250 pmol (10 μL fra 25 nmol/ml oppløsningen fremstilt i trinn 1.11) av interne massespektrometristandarder til hvert rør. Dekk rørene lett på nytt.
- For å lette homogenisering, juster metanolvolumet til 2 ml. Bruk bare METANOL AV LC-MS/MS-kvalitet.
- Arbeid ett rør om gangen, bruk en homogenisator for å triturere vevet til ingen klumper er synlige (vanligvis 5-20 s). Beveg homogenisatorspissen i en sirkulær bevegelse og trykk forsiktig mot rørveggen for å hjelpe triturasjon. Dekk røret på nytt.
MERK: Å sikre at alle vev er fint triturert, vil maksimere lipidekstraksjonen. Ikke tilsett kloroform til prøver før homogenisering, da engangshomogenisatorspissene er laget av plast som vil oppløses i oppløsninger som inneholder kloroform. - Senk røret i en 45 ° vinkel i et ultralyd vannbad i 5-10 s.
- Hvis det ikke dannes vevsklumper ved nedsenking i ultralydbadet, må du dekke det og gå videre til neste rør.
- Hvis vevsklumper dannes når røret er nedsenket i ultralydbadet, re-homogeniserer og retter seg mot klumpene.
- Gjenta denne prosessen (homogenisering / nedsenking i et ultralydbad) iterativt til alle store vevsklumper er brutt opp.
- I en avtrekksvifte, tilsett LC-MS grade kloroform og metanol til hvert rør (bruk en flaske topp dispenser) for å oppnå et forhold på 2: 1: 0.1 metanol: kloroform: vann. Bruk rene hetter, tett rørene tett og la stå på benken til slutten av dagen.
- For vev som veier 50 mg eller mindre, bruk et totalt ekstraksjonsvolum på 4 ml, og juster med dette forholdet (50 mg:4 ml ekstraksjonsløsning) for større prøver.
- Før du forlater den kvelden, legg de tett kappede rørene i et 48 ° C vannbad eller inkubator og inkuber dem over natten.
MERK: Det er viktig at rørene er tett avkortet slik at løsningsmiddelforholdene ikke endres på grunn av fordampning. - Neste morgen, hent prøvene fra 48 ° C vannbad og pellet eventuelle løsemiddel-uoppløselige rusk ved sentrifugering ved 4,000-5,000 x g ved 4 ° C i 20 minutter.
- Arbeid i en avtrekksvifte, dekanter supernatanten forsiktig inn i de forhåndsmerkede 13 x 100 mm borosilikatglassreagensrørene. Vipp 13 x 100 mm røret i en vinkel på 30-45° for å lette dekanteringen.
MERK: Hvis du behandler mer enn 12 prøver, må du ikke la sentrifugerrørene sitte i lengre perioder, da pellets vil myke opp og uoppløselig rusk vil bli overført når du utfører trinn 4.10. For å unngå dette, ta bare 12 rør ut av sentrifugen om gangen og fortsett å sentrifugere de andre rørene til du er klar til å dekantere dem. - Overfør rørene til en vakuumkonsentrator som er i stand til å holde 13 x 100 mm rør. Fordamp alt løsemiddel med et innledende 1 timers oppvarmingstrinn (40 °C) og kjør under maksimalt vakuum.
- Fjern rør fra vakuumkonsentratoren og tilsett 500 μL LC-MS grade metanol (bruk en flaske dispenser) til hvert rør.
- Resuspend de tørkede lipidekstraktene ved vortexing i 5-10 s, etterfulgt av nedsenkende rør i en 45 ° vinkel i et ultralydvannbad i 2 minutter mens du roterer røret. Re-vortex for 5 s og nedsenk i ultralyd vannbad i et ekstra minutt.
MERK: Dette er et kritisk skritt for å sikre maksimal utvinning av ekstraherte lipider. Ikke gå videre før alt tørket materiale på rørveggen er resuspendert. - Plasser 13 x 100 mm rørene i en forkjølt (4 °C) sentrifuge og fjern uoppløselig rusk ved sentrifugering ved 4 000-5 000 x g ved 4 °C i 20-30 minutter.
- Dekanter forsiktig den avklarte supernatanten i et forhåndsmerket autoinjektorhetteglass. Å vippe hetteglasset med autoinjektor i en vinkel på 30-45° vil lette dekanteringen. Forsikre deg om at hele innholdet i 13 x 100 mm slangen er dekantert i autoloaderflasken.
- Sett stramt lokk på slangene og oppbevar slangene ved -80 °C inntil de analyseres av LC-ESI-MS/MS.
5. LC-ESI-MS/MS-analyse
MERK: Følgende fremgangsmåte bruker et binært pumpesystem koblet til et autoinjektor-, lufter- og LC-MS/MS-system som opererer i trippel-kvadrupolmodus. Kolonnetemperaturen ble opprettholdt ved hjelp av en kolonneovn. Se tabell over materialer for detaljer om utstyret som brukes.
- Forbered mobil fase A1 (CH 3 OH: H2O: HCOOH, 58: 41: 1, v: v: v, med 5 mM ammoniumformat) og mobil fase B1 (CH3OH: HCOOH, 99: 1, v: v, med 5 mM ammoniumformat). Bruk bare løsemidler, vann og reagenser av LC-MS-klasse.
- For hvert sett med prøver, klargjør fire blanke autoloader hetteglass som inneholder 500 μL LC-MS grade metanol.
- For hvert sett med prøver klargjør du to hetteglass med autoloader (etikett som IS) ved å fortynne 10 μL (250 pmol totalt hver standard) av den interne standardløsningen fremstilt i trinn 1.11 i 500 μL LC-MS grade metanol.
- Sett kolonneovntemperaturen til 60 °C, og ionekildetemperaturen til 500 °C.
- For MS / MS-analysen, bruk trippel-quadrupole-modusen til spektrometeret. Sett den første kvadrupolen (Q1) til å passere forløperioner, mens du setter den tredje kvadrupolen (Q3) til å passere molekylært distinkte produktioner (eller en skanning over flere m / z i Q1 eller Q3) ved hjelp av N2 for å kollisjonelt indusere dissosiasjoner i kvadrupol 2 (Q2), som er forskjøvet fra Q1 med 30-120 eV.
- Still inn deteksjonsvinduet for flere reaksjonsovervåkingspar (MRM) til 120 s med en målskannetid på 1,0 s. Se tabell 1 for en liste over MRM-par, ioniseringsenergier og kollisjonsenergier.
- Bruk følgende parametere for å løse sfingolipider i LC-trinnet: Bruk en strømningshastighet på 0,7 ml / min, og juster en 2,1 (i.d) x 50 mm C18 omvendt fasekolonne i 0,5 minutter med en løsningsmiddelblanding av 95% mobil fase A1 og 5% mobil fase B1.
- Etter prøveinjeksjon opprettholder du mobilfase A1/B1-forholdet på 95/5 i 2,25 minutter, etterfulgt av en lineær gradient til 100 % B1 over 1,5 minutter, som deretter holdes på 100 % B1 i 5,5 minutter, etterfulgt av en graderingsretur på 0,5 minutter til 95/5 A1/B1.
- Etter kjøringen balanserer du kolonnen på nytt med en blanding av 95/5 A1/B1 i 0,5 min.
- Bruk følgende innstillinger for prøveautolasteren: skyllevolum, 500 μL; kanyleslag, 52 mm (dette bør justeres avhengig av hetteglassets størrelse og volum i hvert hetteglass); skyllehastighet, 35 μL / s; prøvetakingshastighet, 5,0 μL / s; skyll dip tid, 2 s; skyll modus, før og etter aspirasjon; skyll tid,2 s.
- Plasser prøver klargjort i trinn 4.15 på et autoloaderbrett i følgende rekkefølge: Blank; ER; Blank; Prøver utarbeidet i trinn 4.15; Tom, IS, Tom.
- Analyser 5-10 μL av hver prøve med LC-ESI-MS/MS. Analyser samme volum for alle prøvene i datasettet.
6. Databehandling, integrasjon og normalisering
MERK: Selv om følgende trinn skisserer en prosedyre for spesifikk programvare (se Materialtabell), kan lignende prosedyrer på ekvivalente LC-MS-instrumenter og programvare brukes til å integrere MRM-par for de analyserte lipidklassene og tilsvarende interne standarder.
- Åpne kvantifiseringsprogramvaren. I kategorien Kvantitat dobbeltklikker du på Quantitation Wizard. I popup-vinduet, i arbeidsområdet lengst til venstre, navigerer du til riktig datasett og venstreklikker på det. De tilgjengelige eksemplene vises i det midterste arbeidsområdet.
- Merk eksemplene som skal analyseres, og klikk deretter på høyrepilen for å legge til prøver i arbeidsområdet Valgte eksempler . Klikk på Neste for å navigere til innstillings- og spørringsskjermen der standardinnstillingene vanligvis brukes.
- Truffet Neste for å navigere til skjermbildet for valg av integrasjonsmetode. Velg en passende integrasjonsmetode som inneholder MRM-overgangspar for lipider som skal analyseres. Se tabell 1 for MRM-overgangspar. Trykk på Fullfør.
MERK: Oppbevaringstiden varierer avhengig av instrumentering og individuelle innstillinger, og må derfor verifiseres for hvert enkelt oppsett. - I navigasjonsfeltet klikker du på Peak Review-ruten slik at MRM-par kan inspiseres. For å lette gjennomgangen, høyreklikk på Peak Review-ruten , endre automatisk zooming til 100% av største topp, og et zoomvindu på 1,00 - 2,00 minutter.
- Høyreklikk på Quantitation Display-vinduet og velg Analyte og ønsket sfingolipid som skal undersøkes. Kontroller at det ikke er noen topper i Blank-prøvene, og at riktig topp er integrert i IS-prøvene.
- Begynn å integrere ukjente eksempler. Arbeid en sfingolipidklasse om gangen, inspiser retensjonstiden for MRM-paret i den interne standarden (dvs. C12: 0 ceramid) og sørg for at programvaren har integrert riktig topp.
- Fortsett på analyttene i samme lipidklasse (dvs. C14: 0 ceramid, C16:0-ceramid, etc.), som begynner med det korteste lipidet i kjeden i klassen. Kontroller for hver kjedelengde lipid at programvarerutinen har integrert riktig MRM-partopp.
- Når alle analyttene er integrert, oppretter du et elektronisk regneark for hver sfingolipidart som er analysert (f.eks. ceramider, sfingomyeliner osv.). Merk kolonneoverskrifter for å matche rekkefølgen på analyttene og kjedelengdene i LC-MS / MS-kvantifiseringsprogramvaren. Ta også med en kolonneoverskrift for eksempel-ID og normaliseringsvekt for eksempler bestemt i trinn 3.9.
MERK: Som tidligere beskrevet11, inkluderer andre vanlige normaliseringstiltak totalt lipidfosfatinnhold eller proteinmengde. - Eksporter eller kopier toppområdene for alle analyser og interne standarder til det elektroniske regnearket.
- Normaliser data ved å dele det integrerte toppområdet for hver kjedelengdeart for en gitt sfingolipidklasse med toppområdet for den tilsvarende interne standarden. For eksempel C14:0 ceramid, C16:0 ceramid, C18:1 ceramid, etc., skal hver deles med C12:0 ceramid internt standard toppområde.
- Konverter toppareal til mol lipid gjenvunnet ved å multiplisere det normaliserte toppområdet (beregnet i trinn 6.10) med mengden intern standard i picomoleer som ble tilsatt prøven i trinn 4.3. I denne protokollen er denne mengden 250 pmol.
- For å oppnå den relative mengden lipid i hver prøve, del picomolene av hver lipidkjedelengde med vevsvekten bestemt i trinn 3.9. Dette vil gi enheter av picomoles av lipid per mg vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen beskriver vi i detalj en metode for å fjerne OCT fra kryokonservert menneskelig vev og veie vevet for analyse av LC-ESI-MS / MS. Materialene som kreves for denne prosedyren er oppført i materialtabell. Vist i figur 1 er resultater av et typisk eksperiment der 10 humane lungeadenokarsinomtumorer og 10 normale tilstøtende vev ble vasket for å fjerne OCT og analysert av LC-ESI-MS / MS. Viktigere, som vi tidligere har vist11, er det forskjellige kjedelengdearter av ceramider (figur 1A) og monohexosyl-ceramider (figur 1B) som er signifikant forhøyet i lungeadenokarsinomtumorer sammenlignet med normale tilstøtende ikke-involverte vev.
I kontrolleksperimenter for å vurdere effekten av OCT på lipidekstraksjonstrinnene beskrevet i avsnitt 4, ble 200 mg muselever (C57BL6; hanner, 14-16 uker gamle) resuspendert i 2 ml fosfatbufret saltvann og homogenisert til de ble fint triturert. Den resulterende fine leversuspensjonen ble deretter grundig sonikert med en sondesonicator (tre runder med 1 min sonikering på is, 1 min hvile på is, 60% kraft; mikrotip). Fra denne løsningen ble seks 300 μL leverhomogenatreplikasjoner fremstilt. Til tre replikasjoner ble 200 mg OCT tilsatt (gjennomsnittlig mengde funnet i biorepositorieprøver11), og 200 μL vann ble tilsatt til de tre andre. Prøvene ble deretter behandlet parallelt etter trinnene som er beskrevet i avsnitt 4. Viktigere, etter sentrifugering av enfaset Bligh-Dryer-løsning, var prøver som inneholdt OCT uklare, mens kontrollprøvene som inneholdt vann var klare (figur 2A). Uklarheten i enfaset lipidekstraksjonsløsning vedvarte selv etter økt sentrifugering og omfattende sonikering (ikke vist). Etter at løsningsmidlet var fordampet, hadde prøver som inneholdt OCT store pellets (figur 2B), som ikke kunne rekonstitueres i metanol selv under kraftig vortexing og omfattende sonikering. Prøver som inneholdt OCT viste også et stort tap av signal for interne standarder for alle analyserte arter (figur 3A-G). Vi har også tidligere vist at prøver som inneholder OCT viste tap av signal for mange av sfingolipidene som ble analysert11.
Vanligvis forventes det at sfingolipidstandardene vil eluere sekvensielt som vist i figur 4 i følgende rekkefølge: d17: 1 sfingosin, d17: 1 sfingosin-1-fosfat, C12: 0 laktosyl-ceramid, C12:0 monoheksosyl-ceramid, C12:0 sfingomyelin og C12:0 ceramid. For hver av disse sfingolipidartene, ved bruk av gradient- og instrumenteringsinnstillingene beskrevet i avsnitt 5 og tidligere11, vil det være omtrent et skifte på +0,15 minutter i retensjonstiden for hver 2-karbonøkning i kjedelengde. For eksempel, som vist i figur 5, vil C14:0-ceramid (figur 5B) eluere ca. +0,15 min senere enn C12:0-ceramid (figur 5A). En dobbeltbinding i fettsyren resulterer ofte i et -0,15 skifte i retensjonstid, så C16: 0-ceramid (figur 5C) vil ha en retensjonstid som ligner på C18: 1-ceramid (figur 5D). Imidlertid kan lengre kjedelengdelipider (dvs. C24: 0, C26: 0) ha større retensjonstidsforskyvninger (henholdsvis figur 5I, K).
Figur 1: Sfingolipidprofiler av lungeadenokarsinomer og tilstøtende ikke-involverte lungevev. Vev ble kryogenisk lagret i OCT, tint, behandlet med tre sOCTrP-sykluser, veid og analysert av LC-ESI-MS / MS. Nivåene er i pmol per mg vev. De angitte acylkjedelengdeartene ceramid (A), monoheksosylceramid (B), sfingomyelin (C), laktosylceramid (D) og sfingosin (E; Sph), sfingosin-1-phopshate (F; S1P), dihydro-Sph (E) og dihydro-S1P (F) ble kvantifisert. n = 10 svulster og n = 10 tilstøtende uinvolverte vev. Boksplott viser medianer (svart linje) og værhår fra min til maks. ns, ikke signifikant; , s≤0.005; , s ≤ 0,0005. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av ekstraherte prøver med og uten OCT. Muselever ble homogenisert og sonikert, delt inn i seks identiske prøver: 200 mg OCT ble tilsatt til tre prøver og vann til de tre andre. (A) Etter at metanol og kloroform ble tilsatt for å oppnå et forhold på 2: 1: 0,1 metanol: kloroform: vann (v: v: v), inkubasjon over natten ved 48 ° C, etterfulgt av sentrifugering, var supernatantene av prøver som inneholdt OCT overskyet og kunne ikke avklares ved sonikering, vortexing eller sentrifugering. (B) Etter løsningsmiddelfordampning ble det gjenvunnet en stor pellet fra prøver som inneholdt OCT som ikke kunne rekonstitueres fullstendig i 0,5 ml metanol etter omfattende sonikering og vortexing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: LC-ESI-MS/MS kvantifisering av sfingolipidstandarder i nærvær eller fravær av OCT. Muselever ble homogenisert, sonikert og delt inn i seks identiske prøver. Til tre av de seks prøvene ble 200 mg OCT tilsatt, mens til de tre andre ble vann tilsatt. Etter tilsetning av interne standarder, metanol og kloroform ble prøver behandlet identisk og ekstraherte lipider ble analysert av LC-ESI-MS / MS. Vist er flere reaksjonsovervåkingspar (MRM) av de angitte lipidene (A-F) og tilsvarende integrerte toppområder (G). Forkortelser: Sph, sfingosin; S1P, sfingosin-1-fosfat. Svarte piler peker på riktig MRM-par for det angitte sfingolipidet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Relative retensjonstider for LC-ESI-MS/MS flere reaksjonsovervåkingspar av sfingolipidstandarder. Muselever ble homogenisert og sonikert; interne standarder, metanol og kloroform tilsatt; og lipider ekstrahert og analysert av LC-ESI-MS / MS. Vist er retensjonstider for flere reaksjonsovervåkingspar av de angitte lipidene (A-F). Legg merke til den relative rekkefølgen der lipider eluerer under væskekromatografigradienten. Forkortelser: Sph, sfingosin; S1P, sfingosin-1-fosfat; SM, sfingomyelin. X-aksen er MRM-parretensjonstid i minutter. Y-aksen er signalintensitet for MRM-parene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Acylkjedelengdeavhengig forskyvning i retensjonstid for LC-ESI-MS/MS MRM-par. Muselever ble homogenisert og sonikert; interne standarder, metanol og kloroform tilsatt; og lipider ekstrahert og analysert av LC-ESI-MS / MS. Vist er retensjonstider og MRM-par av de angitte lipidene. Legg merke til skiftet i retensjonstid med økende acylkjedelengde for forskjellige lipider (A-K), som vanligvis tilsvarer en +0,15 min retensjonstid per 2-karbonøkning. En dobbeltbinding vil resultere i et tidsforskyvning på -0,15 min (D,H,J). For lipider med lengre kjede kan imidlertid den relative økningen i retensjonstiden være lengre (G-K). X-aksen er MRM-parretensjonstid i minutter. Y-aksen er signalintensitet for MRM-parene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: MRM-par, ioniseringsparametere og kollisjonsenergier for LC-ESI-MS / MS-analyse. DP, de-clustering potensial; CE, kollisjonsenergi. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT er et vanlig langsiktig kryo-bevaringsmiddel som brukes i biorepositorier. OCT kan imidlertid resultere i ioneundertrykkelse når vev analyseres av forskjellige massespektrometriplattformer12,13,14,15, eller resultere i tap av signal når prøver analyseres av LC-ESI-MS / MS 11. OCT i kryopreservert vev kan også forstyrre vevsnormaliseringsmetoder som veiing og proteinkvantifiseringsanalyser som Bradford og BCA11. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å fjerne OCT fra menneskelig vev og deretter analyseres ved massespektrometri. Protokollen kan modifiseres til å bruke andre vevskilder som ikke er lunge, eller fra musevev som vi tidligere har beskrevet11. I tillegg kan andre normaliseringsstrategier for massespektrometridata brukes, inkludert de vi tidligere har beskrevet11, samt andre validerte metoder.
En viktig begrensning av denne protokollen er at den ikke er tilstrekkelig for analyse av vev som tidligere er festet med formaldehyd eller et annet fikseringsmiddel. Det er bare tilstrekkelig for vev som ikke er løst og har blitt kryopreservert i OCT. I tillegg er denne metoden ikke tilstrekkelig for behandling av vev som veier mindre enn 1-2 mg, da det alltid er noe vevstap under sOCTrP-trinnene og overføringer mellom rør. Det vil være vanskelig å veie slike små vev ved hjelp av en standard analytisk skala, og eventuelle rester av PBS som ikke fjernes i løpet av transportstadiet, vil bidra sterkt til den eksperimentelle feilen. Nedenfor er andre viktige hensyn når du vasker vev for å fjerne OCT med denne metoden.
For å sikre en jevn utførelse av denne protokollen, spesielt hvis mange prøver vil bli behandlet, bør trinn som er skissert i avsnitt 1 utføres på forhånd, inkludert forhåndsmerking og forveiing av 1,5 ml rør, formerking av 13 x 100 mm skrukorkrør og -lokk, 13 x 100 mm kulturrør og autoinjektorflasker, klargjøring av alle veker, forkorting av 1 ml pipettespisser, og forkjøling av vaskeløsninger. Dette vil forhindre at tidkrevende prosedyrer må utføres den dagen vevet skal vaskes, noe som kan føre til forsinkelser. Generelt finner vi at hvis mange av disse trinnene utføres dagen før, kan en erfaren forsker vaske 30-40 prøver på en vanlig arbeidsdag. Men fordi det første foreslåtte stoppestedet er etter at alt vev er vasket, veid og plassert i metanol og lagret ved -80 °C, vil det å ikke utføre 1,5 ml forveiing og merking på forhånd påvirke effektiviteten og forlenge tiden som kreves for å vaske 30-40 vev.
Vevsveiing er et av de viktigste trinnene, da feil eller uforsiktighet vil påvirke datakvaliteten da de vil overføres til datanormalisering. Det er avgjørende at den analytiske vekten som brukes til veiing, kalibreres, nullstilles riktig og tjæres. Følgelig, når du bruker veker, er det viktig å fjerne så mye av vaskeoppløsningen som mulig, spesielt for vev som veier mindre enn 5 mg. Ved disse vevsvektene vil rester av vaskeoppløsning gjøre veiingen unøyaktig med en stor prosentandel og overføres som en feil i datanormalisering. Når du fjerner vaskeoppløsningen, finner vi at vev kan berøres forsiktig med veken i flere sekunder for å fjerne så mye vaskeoppløsning som mulig uten å føre til betydelige tap av vev ved vedheft til veken. Imidlertid bør hver vevstype som vaskes testes for vedheft til veker, og disse trinnene i protokollen justeres tilsvarende.
For å lette arbeidsflyten for vevsvask, anbefales det at vevsspon blir bedt om fra biorepository i 15 ml polypropylenrør. Dette vil redusere håndteringen av vev før vask.
Når du vasker vev, hvis et gellignende materiale observeres i bunnen av et rør etter den tredje sOCTrP-syklusen, er dette en indikasjon på at ikke all OCT er fjernet og flere sOCTrP-sykluser er nødvendig. Hold oversikt over hvor mange sykluser som trengs, og for konsistens, utfør samme antall sOCTrP-sykluser i alle prøver i datasettet. Vi har tidligere evaluert opptil 9 sOCTrP-sykluser og fant ingen effekt på deplesjon av sfingolipider i vev11.
Når du bruker veker for å fjerne vaskeoppløsningen, vil forsiktig dabbing av vevet sikre at all vaskeoppløsning fjernes. Dette øker nøyaktigheten av estimering av vevsvekt. Imidlertid må det utvises stor forsiktighet med svært små vev, da disse kan holde seg til veken og resultere i tap av prøve. Det er nyttig å bruke flere veker for samme rør for å fjerne så mye løsning som mulig. For å forhindre kryssprøvekontaminering, bruk alltid en ny og ren veke for hver prøve. Når du lager veker, bruk laboratoriekvalitetsvev (se materialtabell) som vi tidligere testet disse og funnet å inneholde en ubetydelig mengde forurensende sfingolipider11. Veker fra andre materialer kan brukes hvis de er testet som beskrevet11.
Ved henting av prøver fra 1,5 ml rør etter veiing er det avgjørende at alt vev gjenopprettes. Hvis du ikke gjør det, vil det føre til feil i datanormalisering. Hvis det er behov for mer PBS for å gjenopprette alt vevet, legger du til tilsvarende mengde PBS som brukes til alle andre rør for å unngå forskjeller i ekstraksjonseffektivitet som kan skyldes prøver som inneholder forskjellige mengder PBS. Juster kloroform- og metanolvolumene for å ta hensyn til eventuell økning i vannvolumet for å opprettholde et forhold på 2: 1: 0,1 metanol: kloroform: vann.
Ved tining av prøver er det viktig at dette trinnet gjøres på is for å unngå nedbrytning av labile lipider som sfingosin-1-fosfat. Fullstendig tining av prøver til OCT er i flytende tilstand vil også lette fjerningen, da det lettere vil bli oppløst i kaldvaskeløsningen i stedet for å forbli som pellet under tidlige vasketrinn.
Av og til, spesielt når du vasker lungevev, vil det være fragmenter som ikke vil pelletere og vil flyte på toppen av vaskeoppløsningen etter sentrifugering. Med forsiktighet kan nedsenking av aspirasjonsspissen under det flytende vevet for å fjerne vaskeoppløsningen forhindre tap under aspirasjon.
Ikke tilsett kloroform til prøver før homogenisering, da engangshomogenisatorspissene er laget av plast og vil oppløses i oppløsninger som inneholder kloroform. Dette kan ha betydelig innvirkning på LC-MS / MS-kvantifiseringen av lipider i prøvene. Derfor bør bruk av plast som ikke er motstandsdyktig mot løsningsmidler generelt unngås ved dispensering av kloroform og metanol. Disse løsningsmidlene er også giftige og bør håndteres i en passende avtrekkshette. Bruk passende PPE ved håndtering av løsningsmiddel som metanol og kloroform.
Humant vev skal behandles i et egnet biosikkerhetsskap (f.eks. klasse II). Brukere bør få opplæring i håndtering av biofarlige materialer og væsker av menneskelig opprinnelse og følge sikkerhetsprotokoller som bruk av passende personlig verneutstyr og dekontaminering av overflater eller utstyr som kommer i kontakt med prøver. Brukere bør grundig desinfisere (se materialtabellen for foreslått dekontaminant) enhver overflate eller utstyr (sentrifuger, sentrifugebærere og adaptere, pipettorer, virvler, overflater på avtrekksviften, vekter, glassvarer, isbrett, tastaturer, datamus osv.) som brukes under vaskeprosedyren. Labmedlemmer skal ikke bruke utstyr eller hetter som brukes til vevsvask før de er grundig desinfisert. Unngå bruk av blekemiddel på ståloverflater og elektronikk.
Når du behandler mange prøver, må du være forsiktig for å forhindre krysskontaminering ved bruk av rene lokk i re-capping-trinn under lipidekstraksjonstrinnene. Caps kan også gjenbrukes hvis de er merket. I praksis finner vi imidlertid at markører skiller seg dårlig ut på de svarte hettene, og selvklebende etiketter faller av rør under inkubasjonen over natten 48 °C.
Sfingolipider er demonstrert viktige aktører i etiologien av sykdom og humane kreftformer. Derfor er det stor interesse for nøyaktig å definere endringene i sfingolipidmetabolismen i disse sykdommene, da de kan avsløre terapeutiske mål. Imidlertid er mange av vevene som er lett tilgjengelige for forskere kryopreservert i OCT, noe som ikke er kompatibelt med massespektrometrianalyse. Dermed vil den detaljerte protokollen beskrevet her utvide repertoaret av vev som er tilstrekkelig for kvantitativ sfingolipidomisk analyse, og dermed bidra til å øke vår forståelse av biologien til lipidmetabolismeendringer i menneskelig sykdom og kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Tjenester og støtte til forskningsprosjektet ble levert av VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core og VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som støttes delvis med finansiering fra NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S.
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J.
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
