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Cancer Research

Preparación de tejidos humanos incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima para el análisis de espectrometría de masas

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62552
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

Summary

Los esfingolípidos son metabolitos bioactivos con funciones bien establecidas en la enfermedad humana. La caracterización de alteraciones en tejidos con espectrometría de masas puede revelar roles en la etiología de la enfermedad o identificar objetivos terapéuticos. Sin embargo, el compuesto OCT utilizado para la criopreservación en biorepositorios interfiere con la espectrometría de masas. Describimos métodos para analizar esfingolípidos en tejidos humanos incrustados en OCT con LC-ESI-MS / MS.

Abstract

Los esfingolípidos son componentes celulares que tienen funciones bien establecidas en el metabolismo humano y la enfermedad. La espectrometría de masas se puede utilizar para determinar si los esfingolípidos están alterados en una enfermedad e investigar si los esfingolípidos pueden ser dirigidos clínicamente. Sin embargo, los estudios prospectivos con la potencia adecuada que adquieren tejidos directamente de la sala quirúrgica pueden llevar mucho tiempo y ser un desafío técnico, logístico y administrativo. En contraste, los estudios retrospectivos pueden aprovechar los especímenes humanos criopreservados ya disponibles, generalmente en grandes cantidades, en biorepositorios de tejidos. Otras ventajas de obtener tejidos de biorepositorios incluyen el acceso a la información asociada con las muestras de tejido, incluida la histología, la patología y, en algunos casos, las variables clínico-patológicas, todas las cuales se pueden utilizar para examinar las correlaciones con los datos lipidómicos. Sin embargo, las limitaciones técnicas relacionadas con la incompatibilidad del compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) utilizado en la criopreservación y espectrometría de masas es una barrera técnica para el análisis de lípidos. Sin embargo, hemos demostrado previamente que la OCT se puede eliminar fácilmente de muestras de biorepositorios humanos a través de ciclos de lavados y centrifugación sin alterar su contenido de esfingolípidos. También hemos establecido previamente que los esfingolípidos en tejidos humanos criopreservados en OCT son estables hasta por 16 años. En este informe, describimos los pasos y el flujo de trabajo para analizar esfingolípidos en muestras de tejido humano que están incrustadas en OCT, incluido el lavado de tejidos, el pesaje de tejidos para la normalización de datos, la extracción de lípidos, la preparación de muestras para su análisis por cromatografía líquida por electronización por electrospray, espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS / MS), integración de datos de espectrometría de masas, normalización de datos y análisis de datos.

Introduction

Los esfingolípidos son metabolitos bioactivos conocidos por su papel en el metabolismo humano y la enfermedad 1,2. Regulan procesos celulares complejos como la migración celular, la supervivencia y muerte celular, el movimiento celular, el tráfico vesicular, la invasión celular y la metástasis, la angiogénesis y la producción de citoquinas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Los defectos en la regulación del metabolismo de los esfingolípidos contribuyen a la iniciación y progresión de los cánceres, determinan cuán agresivos son los cánceres y cómo los cánceres responden y desarrollan resistencia a la terapia 3,10. Por lo tanto, debido a estos amplios impactos en la etiología de la enfermedad, los métodos analíticos que pueden establecer con precisión las alteraciones de los esfingolípidos específicos de la enfermedad son herramientas importantes. La espectrometría de masas (EM) es el método más preciso y fiable para analizar las alteraciones de los esfingolípidos.

Las muestras humanas que se pueden utilizar para el análisis de alteraciones de esfingolípidos se pueden obtener prospectivamente de la sala quirúrgica o retrospectivamente de biorepositorios de tejidos. Los tejidos frescos de la cirugía son ventajosos porque pueden ser analizados directamente por EM u otros métodos analíticos. Sin embargo, la adquisición prospectiva de tejidos tiene obstáculos administrativos, técnicos y logísticos, y recolectar suficientes especímenes para alcanzar el poder estadístico puede ser un desafío. La obtención de tejidos de biorepositorios es ventajosa porque pueden adquirirse retrospectivamente, en grandes cantidades, y los biorepositorios confirman la histología y la patología, utilizan procedimientos operativos estándar para preservar y almacenar tejidos criogénicamente y pueden proporcionar datos clínicopatológicos que pueden usarse para análisis de correlación. Sin embargo, para preservar las características moleculares y estructurales, los biorepositorios pueden criopreservar tejidos incrustándolos en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), que hemos demostrado que interfiere con los ensayos de normalización de datos y la cuantificación de esfingolípidos por cromatografía líquida por electronización por electrospray espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS / MS)11 . También se ha demostrado que el alcohol polivinílico y el polietilenglicol, los componentes principales del compuesto OCT, dan lugar a la supresión de iones en otras plataformas de análisis de EM12,13,14,15. Por lo tanto, el compuesto OCT debe eliminarse de los tejidos antes del análisis esfingolipidómico por SM.

En un informe anterior, hemos validado un protocolo para la eliminación de compuestos OCT de muestras humanas para el análisis LC-ESI-MS/MS11 y la metodología utilizada para el pesaje de tejidos para la normalización de datos11. Aquí, detallamos los pasos del protocolo de eliminación de compuestos de OCT esfingolipidómica (sOCTrP) y mostramos datos representativos de tumores de adenocarcinoma de pulmón humano y tejidos normales adyacentes no comprometidos.

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Protocol

Los tejidos pulmonares humanos no identificados se obtuvieron del Núcleo de Adquisición y Análisis de Tejidos y Datos de Virginia Commonwealth University (VCU) bajo un protocolo aprobado por la junta de revisión interna (IRB) (#HM2471). El uso de ratones para investigación y recolección de tejidos de ratones fue aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales de VCU (IACUC).

1. Preparación de materiales

NOTA: Estos pasos deben realizarse un día antes del lavado de tejidos.

  1. Preetiquete y pese tubos de centrífuga de polipropileno de 1,5 ml con códigos de identificación concisos pero claros para cada muestra que se procesará al día siguiente. Use un marcador permanente resistente a los productos químicos (consulte la Tabla de materiales) que no se desvanezca bajo el manejo repetido del tubo.
  2. Abra una hoja de cálculo electrónica y etiquete columnas consecutivas con los siguientes encabezados de columna: identificador de tubo (ID), tubo solo, tubo con tejido y tejido total. Introduzca los identificadores de tubo que se procesarán en la columna etiquetada ID de tubo.
  3. Precalibrar y poner a cero una escala analítica. Colocar un erlenmeyer limpio de 10 ml en el centro de la placa de equilibrio (el matraz actuará como portatubos). Cerrar la puerta de la cámara de pesaje y tarar la báscula con el matraz.
  4. Pesar tubos de centrífuga de 1,5 ml. Colocar con cuidado el tubo en el matraz y cerrar la puerta de la cámara de pesaje. Permita que el peso se estabilice y registre el peso solo en el tubo etiquetado con la columna.
    NOTA: Evite mover el erlenmeyer de 10 ml al pesar tubos. Si se mueve el matraz, vuelva a centrar el matraz y vuelva a fijar la balanza. Coloque los tubos cerrados en una rejilla y guárdelos hasta que sea necesario.
  5. Preetiquete los tubos y tapas de vidrio con tapa de rosca de 13 x 100 mm con los códigos de identificación y llénelos con 2 ml de metanol de grado LC-MS. Colóquelos en una rejilla para tubos, tape los tubos y guárdelos en nevera (4 °C) hasta que los use.
    NOTA: Utilice un dispensador de disolvente con tapa de botella (consulte la Tabla de materiales). Si no hay una disponible, use pipetas de vidrio para evitar el uso de plásticos al dispensar disolventes orgánicos.
  6. Preetiqueta tubos de ensayo de vidrio de 13 x 100 mm. Cubra y guarde los tubos de ensayo a temperatura ambiente.
  7. Viales autoinyectores preetiquetados con códigos identificadores. Cubra y guarde los viales del autoinyector a temperatura ambiente hasta que los use.
  8. Prepare mechas para secar tejidos.
    1. Comience limpiando las tijeras quirúrgicas sumergiéndolas en metanol de grado LC-MS durante 5 minutos, y luego límpielas con un pañuelo limpio de laboratorio.
    2. Usando guantes sin polvo, gire el extremo de un tejido de grado de laboratorio (consulte la Tabla de materiales) hasta que se forme una mecha finamente cónica de 30-40 mm.
    3. Usando tijeras limpias con metanol, corte la mecha en el extremo grueso. Coloque las mechas en una caja de cartón limpia. Haga el doble de mechas de las que se necesitarán para procesar todas las muestras.
  9. Prepare puntas de pipeta acortadas de 1 ml. Con tijeras quirúrgicas limpias con metanol, corte 4-5 mm de la punta de una punta de pipeta de 1 ml y vuelva a colocar la punta en el soporte de la punta. Prepare el doble de puntas que las muestras a procesar.
    NOTA: Estos se utilizarán en la recuperación de tejidos lavados de tubos. No toque el extremo de la punta.
  10. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de grado biológico molecular pre-enfriamiento a 4 °C (0,5 L es suficiente). Esto se utilizará para recuperar especímenes. Para cada muestra que se procesará, enfriar previamente (4 °C) 60 ml de agua desionizada ultrapura.
  11. Preparar estándares internos de espectrometría de masas. Disolver los siguientes lípidos en etanol:metanol:agua (7:2:1; v/v/v) a una concentración de 25 nmol/ml: d17:1-esfingosina, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-eno-1,3-diol; D17:1-esfingosina-1-fosfato, heptadecasphing-4-enina-1-fosfato; C12-Ceramida (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-sphing-4-enina; C12-esfingomielina (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-sphing-4-enina-1-fosfocolina; C12-glucosilceramida (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-1-β-glucosil-sphing-4-eine; C12-lactosilceramida (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-1-ß-lactosil-sphing-4-eno.

2. Lavado de pañuelos

NOTA: Completar todos los pasos de la sección 1 un día antes permite a un investigador experto procesar hasta 40 muestras por día, y principiantes ~ 10-15 muestras por día. Comience temprano en la mañana y no se detenga hasta que se completen todos los pasos de las secciones 2.1-3.8.

  1. El día en que se procesarán los tejidos, prepare el área de trabajo del gabinete de bioseguridad equipándola con un vórtice, un pipeta serológico completamente cargado y una bandeja de hielo. Para todos los pasos de esta sección, use el EPP adecuado, incluida una bata de laboratorio, una doble capa de guantes y gafas protectoras. PRECAUCIÓN: Los tejidos y fluidos humanos deben considerarse y tratarse como materiales biopeligrosos.
  2. Preenfriar (4 °C) una centrífuga de cuchara oscilante, los adaptadores necesarios para sostener tubos de centrífuga cónicos de 15 ml y tapas de biocontención de centrífugas. Preenfriar (4 °C) una centrífuga de ángulo fijo capaz de contener tubos de centrífuga de 1,5 ml.
  3. Si los tejidos no están alicitados en tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml, use una espátula limpia con metanol (limpia para cada nueva muestra de tejido) para transferirlos a tubos de polipropileno de 15 ml preetiquetados. Etiquete también las tapas de 15 ml.
    1. Coloque un estante de tubos capaz de contener tubos centrífugos de 15 ml en una bandeja de hielo y llene la bandeja con hielo. Descongele los tejidos que se procesarán ese día colocándolos en la rejilla sobre hielo.
      NOTA: Se debe solicitar un mínimo de 3-4 mg de tejido al biorepositorio para su procesamiento, ya que se ha demostrado previamente que los protocolos de lavado y pesaje de tejidos son precisos y confiables en estos pesos11.
  4. Mueva la bandeja de hielo con las muestras al gabinete de bioseguridad.
  5. Realice tres ciclos de sOCTrP11 como se explica a continuación (es decir, realice los pasos 2.5.1-2.5.5 tres veces).
    1. Agregue 10 ml de agua desionizada ultrapura helada a cada tubo y cúbralos herméticamente. Deje que los tubos se incuben durante 10 minutos.
    2. Vórtice vigorosamente cada tubo durante 10-20 s o hasta que todo el tejido depositado en las paredes del tubo, o un gránulo de tejido, esté completamente resuspendido.
      NOTA: En los ciclos 2-3 de sOCTrP, es fundamental que el pellet se resuspenda para que cualquier OCT en el pellet se diluya en la solución de lavado.
    3. Transfiera los tubos a la centrífuga de cangilón oscilante preenfriada (4 °C). Centrifugar muestras a 4.000-5.000 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Evite la generación y exposición a aerosoles biopeligrosos generados durante la centrifugación sellando los portadores de la centrífuga con una tapa de biocontención (ver Tabla de materiales).
    4. Recupere muestras de la centrífuga y transfiéralas a la bandeja de hielo. Coloque la bandeja en un gabinete de bioseguridad y destape los tubos. Guarde las tapas.
    5. Aspire cuidadosamente la solución de lavado. Evite aspirar el material tisular en el gránulo dejando ~0.5 ml del sobrenadante en el tubo. Tapa los tubos y evita la contaminación cruzada haciendo coincidir las tapas etiquetadas con los tubos.
      NOTA: La solución de lavado (sobrenadante) en el paso 2.5.5 es un material biopeligroso; manipularlo y desecharlo siguiendo las pautas de bioseguridad apropiadas para especímenes de origen humano.

3. Pesaje de tejidos (para normalización de datos)

  1. Después del último ciclo de lavado sOCTrP, aspire cuidadosamente la mayor parte de la solución de lavado, pero evite alterar el pellet. Deje ~0.5 ml de la solución de lavado en el tubo.
  2. Con las puntas de pipeta acortadas (preparadas en el paso 1.9), tomar 500 μL de PBS helado y añadirlo al tubo.
    1. Usando la misma punta, resuspenda suavemente el pellet y recupere todo el tejido. Evite el pipeteo turbulento para disminuir la pérdida de tejido mediante su adherencia a las paredes de la punta del tubo y la pipeta.
  3. Agregue el tejido resuspendido a su tubo de centrífuga de 1,5 ml preetiquetado y pesado y coloque el tubo sobre hielo. Repita el procedimiento para todos los tejidos del conjunto de datos.
  4. Colocar los tubos de 1,5 ml en una centrífuga prerefrigerada y granular los tejidos a 7.000 x g durante 5-7 min y 4 °C.
    1. Recupere los tubos y aspire cuidadosamente la mayor cantidad posible de PBS sin alterar el pellet. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo.
  5. Tubos de centrífuga durante 3 minutos adicionales a 7.000 x g para garantizar que los tejidos estén bien granulados. Transfiera los tubos al hielo.
    NOTA: El paso de centrifugación adicional es importante para evitar la pérdida de tejido al eliminar toda la solución de lavado y la absorción. Si procesa más de cinco muestras, repita el paso de centrifugación de 3 minutos y 7,000 x g después de procesar cada quinta muestra para garantizar que los tejidos permanezcan peletizados.
  6. Con las mechas preparadas en el paso 1.8, retire suavemente cualquier solución de lavado restante. Use una mecha limpia para cada muestra. Es aceptable frotar suavemente el tejido con la mecha, lo que ayudará a eliminar la mayor parte de la solución de lavado, pero evitará perder tejido por la adherencia a la mecha. Cierre el tubo y colóquelo sobre hielo.
  7. Pese cada tubo en la balanza analítica recientemente calibrada, tarada y puesta a cero.
    1. Coloque cada tubo en el erlenmeyer de vidrio y cierre la puerta de la cámara. Cuando el peso se haya estabilizado, regístrelo en la columna de la hoja de cálculo electrónica etiquetada como tubo con tejido.
    2. Después de pesar, vuelva a colocar el tubo sobre hielo.
  8. Añadir 300 μL de PBS helado. Con una punta de pipeta acortada (paso 1.9), recupere cuidadosamente todo el tejido y devuélvalo en un tubo de vidrio con tapa de rosca preetiquetado (preparado en el paso 1.5) que contenga 2 ml de metanol de grado LC-MS helado (agregue el tejido al metanol, no al lado del tubo).
  9. Calcule la cantidad de tejido que se lavó restando el tubo solo del tubo con valor de tejido. Registre este número en la columna total de tejido. El valor total del tejido se utilizará para normalizar los datos de espectrometría de masas en el paso 6.12.
  10. Conservar las muestras a -80 °C hasta que estén listas para realizar los pasos 4.1-4.15.
    NOTA: Este es un buen punto de parada, y las muestras se pueden almacenar de forma segura durante un par de semanas a -80 ° C. Para otros métodos de normalización tisular, como la concentración de proteínas o el contenido de fosfato lipídico, consultar Rohrbach et al.11.

4. Extracción de lípidos

NOTA: Es importante comenzar estos pasos por la mañana, especialmente cuando se procesarán muchas muestras. Antes de empezar, precaliente un baño maría o una incubadora a 48 °C.

  1. Extraer del congelador las muestras preparadas en el paso 3.8 y los patrones lipídicos MS (preparados en el paso 1.11). Deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  2. Vortex y sumerja la solución estándar interna en un baño de agua ultrasónico (consulte la Tabla de materiales) durante 2-3 minutos o hasta que los patrones de lípidos MS se disuelvan completamente antes de dispensar en las muestras. Esto evitará errores en la normalización de datos.
  3. Con una pipeta de repetición, añadir 250 pmol (10 μL de la solución de 25 nmol/ml preparada en el paso 1.11) de patrones internos de espectrometría de masas a cada tubo. Vuelva a tapar los tubos ligeramente.
  4. Para facilitar la homogeneización, ajuste el volumen de metanol a 2 ml. Utilice únicamente metanol de grado LC-MS/MS.
  5. Trabajando un tubo a la vez, use un homogeneizador para triturar el tejido hasta que no haya grumos visibles (típicamente 5-20 s). Mueva la punta del homogeneizador con movimientos circulares y presione suavemente contra la pared del tubo para ayudar a la trituración. Vuelva a tapar el tubo.
    NOTA: Asegurarse de que todos los tejidos estén finamente triturados maximizará la extracción de lípidos. No agregue cloroformo a las muestras antes de la homogeneización, ya que las puntas desechables del homogeneizador están hechas de plástico que se disolverá en soluciones que contienen cloroformo.
  6. Sumerja el tubo en un ángulo de 45° en un baño de agua ultrasónico durante 5-10 s.
    1. Si no se forman grumos de tejido al sumergirlo en el baño ultrasónico, cúbralo y pase al siguiente tubo.
    2. Si se forman grumos de tejido cuando el tubo se sumerge en el baño ultrasónico, vuelva a homogeneizar y apunte a los grupos.
    3. Repita este proceso (homogeneización / inmersión en un baño ultrasónico) iterativamente hasta que todos los grupos de tejido grandes se rompan.
  7. En una campana extractora, agregue cloroformo y metanol de grado LC-MS a cada tubo (use un dispensador de botella) para lograr una proporción de 2: 1: 0.1 metanol: cloroformo: agua. Usando tapas limpias, selle los tubos herméticamente y déjelos en la mesa de trabajo hasta el final del día.
    1. Para tejidos que pesen 50 mg o menos, use un volumen de extracción total de 4 ml y ajuste usando esta proporción (solución de extracción de 50 mg: 4 ml) para muestras más grandes.
  8. Antes de salir esa noche, coloque los tubos bien tapados en un baño de agua o incubadora a 48 °C e incubarlos durante la noche.
    NOTA: Es fundamental que los tubos estén bien tapados para que las proporciones de disolvente no cambien debido a la evaporación.
  9. A la mañana siguiente, recuperar las muestras del baño maría a 48 °C y granular cualquier residuo insoluble en disolvente por centrifugación a 4.000-5.000 x g a 4 °C durante 20 min.
  10. Trabajando en una campana extractora, decanta cuidadosamente el sobrenadante en los tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 13 x 100 mm preetiquetados. Incline el tubo de 13 x 100 mm en un ángulo de 30-45° para facilitar la decantación.
    NOTA: Si procesa más de 12 muestras, no permita que los tubos centrífugos reposen durante largos períodos de tiempo, ya que los gránulos se ablandarán y se transferirán residuos insolubles al realizar el paso 4.10. Para evitar esto, solo saque 12 tubos de la centrífuga a la vez y continúe centrifugando los otros tubos hasta que esté listo para decantarlos.
  11. Transfiera los tubos a un concentrador de vacío capaz de contener tubos de 13 x 100 mm. Evaporar todo el disolvente con un paso inicial de calentamiento de 1 h (40 °C) y correr bajo el vacío máximo.
  12. Retire los tubos del concentrador de vacío y agregue 500 μL de metanol de grado LC-MS (use un dispensador de tapa de botella) a cada tubo.
  13. Resuspenda los extractos lipídicos secos haciendo vórtice durante 5-10 s, seguido de tubos de inmersión en un ángulo de 45 ° en un baño de agua ultrasónico durante 2 minutos mientras gira el tubo. Vuelva a vorámice durante 5 s y sumérjase en un baño de agua ultrasónico durante un minuto adicional.
    NOTA: Este es un paso crítico para asegurar la máxima recuperación de los lípidos extraídos. No avance hasta que todo el material seco en la pared del tubo haya sido resuspendido.
  14. Colocar los tubos de 13 x 100 mm en una centrífuga preenfriada (4 °C) y eliminar cualquier residuo insoluble por centrifugación a 4.000-5.000 x g a 4 °C durante 20-30 min.
  15. Decantar cuidadosamente el sobrenadante clarificado en un vial de autoinyector preetiquetado. Inclinar el vial del autoinyector en un ángulo de 30-45° facilitará la decantación. Asegúrese de que todo el contenido del tubo de 13 x 100 mm se decanta en el vial del cargador automático.
  16. Tapar los tubos herméticamente y almacenar los tubos a -80 °C hasta que se analicen por LC-ESI-MS/MS.

5. Análisis LC-ESI-MS/MS

NOTA: El siguiente procedimiento utiliza un sistema de bomba binaria acoplado a un autoinyector, desgasificador y sistema LC-MS/MS que funciona en modo triple cuadrupolo. La temperatura de la columna se mantuvo utilizando un horno de columna. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el equipo utilizado.

  1. Preparar la fase móvil A1 (CH 3 OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, con formiato de amonio de 5 mM) y la fase móvil B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, con formiato de amonio de 5 mM). Use solo solventes, agua y reactivos de grado LC-MS.
  2. Para cada conjunto de muestras, prepare cuatro viales de autocargador Blank que contengan 500 μL de metanol de grado LC-MS.
  3. Para cada conjunto de muestras, preparar dos viales de autocargador de patrón interno (etiqueta como IS) diluyendo 10 μL (250 pmol en total cada patrón) de la solución patrón interna preparada en el paso 1.11 en 500 μL de metanol de grado LC-MS.
  4. Ajuste la temperatura del horno de columna a 60 °C y la temperatura de la fuente de iones a 500 °C.
  5. Para el análisis MS/MS, utilice el modo triple-cuadrupolo del espectrómetro. Establezca el primer cuadrupolo (Q1) para pasar iones precursores, mientras que el tercer cuadrupolo (Q3) para pasar iones producto molecularmente distintivos (o un escaneo a través de múltiples m / z en Q1 o Q3) usando N2 para inducir disociaciones colisionales en el cuadrupolo 2 (Q2), que se desplaza de Q1 en 30-120 eV.
  6. Establezca la ventana de detección de pares de monitoreo de reacción múltiple (MRM) en 120 s con un tiempo de escaneo objetivo de 1.0 s. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de pares MRM, energías de ionización y energías de colisión.
  7. Utilice los siguientes parámetros para resolver los esfingolípidos en la etapa LC: utilizando un caudal de 0,7 ml/min, equilibre una columna de fase inversa C18 de 2,1 (i.d) x 50 mm durante 0,5 min con una mezcla de disolventes de fase móvil A1 al 95% y fase móvil B1 al 5%.
    1. Después de la inyección de la muestra, mantenga la relación de fase móvil A1/B1 en 95/5 durante 2,25 min, seguida de un gradiente lineal al 100% B1 durante 1,5 min, que luego se mantiene al 100% B1 durante 5,5 min, seguido de un retorno de gradiente de 0,5 min a 95/5 A1/B1.
    2. Después de la carrera, vuelva a equilibrar la columna con una mezcla de 95/5 A1/B1 durante 0,5 min.
  8. Utilice los siguientes ajustes para el cargador automático de muestras: volumen de enjuague, 500 μL; carrera de la aguja, 52 mm (esto debe ajustarse según el tamaño del vial y el volumen de cada vial); velocidad de enjuague, 35 μL/s; velocidad de muestreo, 5,0 μL/s; tiempo de inmersión en el enjuague, 2 s; modo de enjuague, antes y después de la aspiración; Tiempo de enjuague,2 s.
  9. Coloque las muestras preparadas en el paso 4.15 en una bandeja de cargador automático en el orden siguiente: En blanco; ES; Espacio en blanco; Muestras preparadas en el paso 4.15; En blanco, ES, en blanco.
  10. Analice 5-10 μL de cada muestra mediante LC-ESI-MS/MS. Analice el mismo volumen para todas las muestras del conjunto de datos.

6. Procesamiento, integración y normalización de datos

NOTA: Aunque los siguientes pasos describen un procedimiento para software específico (consulte la Tabla de materiales), se pueden usar procedimientos similares en instrumentos y software LC-MS equivalentes para integrar pares MRM para las clases de lípidos analizadas y los estándares internos correspondientes.

  1. Abra el software de cuantificación. En la pestaña Cuantificar , haga doble clic en el Asistente de cuantificación. En la ventana emergente, en el espacio de trabajo situado más a la izquierda, navegue hasta el conjunto de datos correcto y haga clic izquierdo sobre él. Las muestras disponibles se mostrarán en el espacio de trabajo central.
  2. Resalte las muestras que se van a analizar y, a continuación, haga clic en la flecha de la derecha para añadir muestras al espacio de trabajo Muestras seleccionadas . Haga clic en Siguiente para navegar a la pantalla de configuración y consulta donde normalmente se usa la configuración predeterminada.
  3. Pulse Siguiente para navegar a la pantalla de selección del método de integración. Seleccione un método de integración apropiado que contenga pares de transición MRM para los lípidos que se analizarán. Consulte la Tabla 1 para los pares de transición MRM. Pulsa Finalizar.
    NOTA: Los tiempos de retención variarán según la instrumentación y la configuración individual y, por lo tanto, deben verificarse para cada configuración individual.
  4. En la barra de navegación, haga clic en el panel Revisión de picos para que se puedan inspeccionar los pares de MRM. Para facilitar la revisión, haga clic con el botón derecho en el panel Revisión de pico, cambie el Zoom automático al 100% del pico más grande y una ventana de zoom de 1,00 a 2,00 minutos.
  5. Haga clic con el botón derecho en la ventana de visualización de cuantificación y seleccione Analito y el esfingolípido deseado a examinar. Compruebe que no hay picos en las muestras en blanco y que se ha integrado el pico correcto en las muestras IS.
  6. Comience a integrar muestras desconocidas. Trabajando una clase de esfingolípidos a la vez, inspeccione el tiempo de retención para el par MRM del estándar interno (es decir, C12: 0 ceramida) y asegúrese de que el software ha integrado el pico correcto.
  7. Continuar con los analitos en la misma clase de lípidos (es decir, C14:0 ceramida, C16:0-ceramida, etc.), comenzando con el lípido de cadena más corto de la clase. Verifique para cada lípido de longitud de cadena que la rutina del software haya integrado el pico de par MRM correcto.
  8. Cuando todos los analitos hayan sido integrados, cree una hoja de cálculo electrónica para cada especie de esfingolípido analizada (por ejemplo, ceramidas, esfingomielinas, etc.). Etiquete los encabezados de columna para que coincidan con el orden de los analitos y las longitudes de cadena en el software de cuantificación LC-MS/MS. Incluya también un encabezado de columna para el ID de muestra y los pesos de normalización de muestra determinados en el paso 3.9.
    NOTA: Como se describió anteriormente11, otras medidas comunes de normalización incluyen el contenido total de fosfato lipídico o la cantidad de proteína.
  9. Exporte o copie las áreas pico para todos los analitos y estándares internos a la hoja de cálculo electrónica.
  10. Normalice los datos dividiendo el área de pico integrada de cada especie de longitud de cadena para una clase de esfingolípidos dada por el área de pico de su estándar interno correspondiente. Por ejemplo, C14:0 ceramida, C16:0 ceramida, C18:1 ceramida, etc., cada uno debe dividirse por el C12:0 Área de pico estándar interna de ceramida.
  11. Convertir el área pico en moles de lípidos recuperados multiplicando el área pico normalizada (calculada en el paso 6.10) por la cantidad de patrón interno, en picomoles, que se agregó a la muestra en el paso 4.3. En este protocolo, esta cantidad es de 250 pmol.
  12. Para obtener la cantidad relativa de lípidos en cada muestra, divida los picomoles de cada longitud de cadena lipídica por el peso del tejido determinado en el paso 3.9. Esto dará unidades de picomoles de lípidos por mg de tejido.

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Representative Results

En este protocolo, describimos en detalle un método para eliminar la OCT de tejidos humanos criopreservados y pesar los tejidos para su análisis por LC-ESI-MS / MS. Los materiales necesarios para este procedimiento se enumeran en la Tabla de materiales. En la Figura 1 se muestran los resultados de un experimento típico en el que se lavaron 10 tumores de adenocarcinoma de pulmón humano y 10 tejidos adyacentes normales para eliminar la OCT y se analizaron mediante LC-ESI-MS/MS. Es importante destacar que, como hemos demostrado anteriormente 11, hay varias especies de ceramidas (Figura 1A) y monohexosil-ceramidas (Figura 1B) que están significativamente elevadas en los tumores de adenocarcinoma de pulmón en comparación con los tejidos adyacentes normales no comprometidos.

En experimentos de control para evaluar el efecto de la OCT en los pasos de extracción de lípidos descritos en la sección 4, 200 mg de hígados de ratones (C57BL6; machos; 14-16 semanas de edad) se resuspendieron en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato y se homogeneizaron hasta que se trituraron finamente. La suspensión hepática fina resultante se sonicó extensamente con un sonicador de sonda (tres rondas de sonicación de 1 minuto en hielo, 1 minuto de reposo en hielo, 60% de potencia; micropunta). A partir de esta solución, se prepararon seis réplicas de homogeneizado hepático de 300 μL. A tres réplicas, se agregaron 200 mg de OCT (cantidad promedio encontrada en muestras de biorepositorios11), y 200 μL de agua se agregaron a los otros tres. Las muestras se procesaron en paralelo siguiendo los pasos descritos en la sección 4. Es importante destacar que, después de la centrifugación de la solución monofásica Bligh-Dryer, las muestras que contenían OCT estaban turbias, mientras que las muestras de control que contenían agua eran claras (Figura 2A). La turbidez en la solución de extracción de lípidos monofásica persistió incluso después de una mayor centrifugación y una sonicación extensa (no se muestra). Después de que el solvente se evaporó, las muestras que contenían OCT tenían gránulos grandes (Figura 2B), que no podían reconstituirse en metanol incluso bajo vórtice vigoroso y sonicación extensa. Las muestras que contienen OCT también mostraron una gran pérdida de señal para los estándares internos de todas las especies analizadas (Figura 3A-G). También hemos demostrado previamente que las muestras que contienen OCT mostraron pérdida de señal para muchos de los esfingolípidos analizados11.

Típicamente, se espera que los patrones de esfingolípidos se eluyan secuencialmente como se muestra en la Figura 4 en el siguiente orden: d17:1 esfingosina, d17:1 esfingosina-1-fosfato, C12:0 ctosil-ceramida, C12:0 monohexosil-ceramida, C12:0 esfingomielina y C12:0 ceramida. Para cada una de estas especies de esfingolípidos, utilizando los ajustes de gradiente e instrumentación descritos en la sección 5 y anteriormente 11, habrá aproximadamente un cambio de +0.15 min en el tiempo de retención por cada aumento de 2 carbonos en la longitud de la cadena. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 5, C14:0-ceramida (Figura 5B) eluirá aproximadamente +0,15 min más tarde que C12:0-ceramida (Figura 5A). Un doble enlace en el ácido graso a menudo resulta en un cambio de -0.15 en el tiempo de retención, por lo que C16: 0-ceramida (Figura 5C) tendrá un tiempo de retención similar a C18: 1-ceramida (Figura 5D). Sin embargo, los lípidos de cadena más larga (es decir, C24:0, C26:0) pueden tener mayores cambios de tiempo de retención (Figura 5I, K, respectivamente).

Figure 1
Figura 1: Perfiles de esfingolípidos de adenocarcinomas de pulmón y tejidos pulmonares adyacentes no comprometidos. Los tejidos se almacenaron criogénicamente en OCT, se descongelaron, se procesaron con tres ciclos de sOCTrP, se pesaron y se analizaron mediante LC-ESI-MS / MS. Los niveles están en pmol por mg de tejido. Las especies indicadas de ceramida (A), monohexosilceramida (B), esfingomielina (C), lactosilceramida (D) y esfingosisina (E; Sph), esfingosina-1-phopshate (F; Se cuantificaron S1P), dihidro-Sph (E) y dihidro-S1P (F). n = 10 tumores y n = 10 tejidos adyacentes no comprometidos. Los diagramas de caja muestran medianas (línea negra) y bigotes de mínimo a máx. ns, no significativos; , p≤0,005; , p ≤ 0,0005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas de muestras extraídas con y sin OCT. Los hígados de ratón se homogeneizaron y sonicaron, divididos en seis muestras idénticas: se agregaron 200 mg de OCT a tres muestras y agua a las otras tres. (A) Después de agregar metanol y cloroformo para lograr una relación de 2: 1: 0.1 metanol: cloroformo: agua (v: v: v), incubación nocturna a 48 ° C, seguida de centrifugación, los sobrenadantes de las muestras que contenían OCT estaban turbios y no podían aclararse por sonicación, vórtice o centrifugación. (B) Después de la evaporación del disolvente, se recuperó un pellet grande de muestras que contenían OCT que no pudieron reconstituirse completamente en 0,5 ml de metanol después de una extensa sonicación y vórtice. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cuantificación LC-ESI-MS/MS de patrones de esfingolípidos en presencia o ausencia de OCT. Los hígados de ratón fueron homogeneizados, sonicados y divididos en seis muestras idénticas. A tres de las seis muestras, se agregaron 200 mg de OCT, mientras que a las otras tres, se agregó agua. Después de la adición de patrones internos, metanol y cloroformo, las muestras se procesaron de manera idéntica y los lípidos extraídos se analizaron mediante LC-ESI-MS / MS. Se muestran pares de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) de los lípidos indicados (A-F) y las áreas pico integradas correspondientes (G). Abreviaturas: Sph, esfingosina; S1P: esfingosina-1-fosfato. Las flechas negras apuntan al par MRM correcto para el esfingolípido indicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tiempos de retención relativos para pares de monitorización de reacciones múltiples LC-ESI-MS/MS de patrones de esfingolípidos. Los hígados de ratón fueron homogeneizados y sonicados; normas internas, metanol y cloroformo añadidos; y lípidos extraídos y analizados por LC-ESI-MS/MS. Se muestran los tiempos de retención de múltiples pares de monitorización de reacciones de los lípidos indicados (A-F). Tenga en cuenta el orden relativo en que los lípidos eluyen durante el gradiente de cromatografía líquida. Abreviaturas: Sph, esfingosina; S1P: esfingosina-1-fosfato; SM: esfingomielina. El eje X es el tiempo de retención del par MRM en minutos. El eje Y es la intensidad de la señal para los pares MRM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cambio dependiente de la longitud de la cadena acilo en el tiempo de retención de los pares LC-ESI-MS/MS MRM. Los hígados de ratón fueron homogeneizados y sonicados; normas internas, metanol y cloroformo añadidos; y lípidos extraídos y analizados por LC-ESI-MS/MS. Se muestran los tiempos de retención y los pares MRM de los lípidos indicados. Tenga en cuenta el cambio en el tiempo de retención con el aumento de la longitud de la cadena de acilo para varios lípidos (A-K), que generalmente corresponde a un tiempo de retención de +0.15 min por aumento de 2 carbonos. Un doble enlace dará como resultado un cambio de tiempo de retención de -0.15 min (D, H, J). Sin embargo, para lípidos de cadena más larga, el aumento relativo en el tiempo de retención puede ser más largo (G-K). El eje X es el tiempo de retención del par MRM en minutos. El eje Y es la intensidad de la señal para los pares MRM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Pares MRM, parámetros de ionización y energías de colisión para el análisis LC-ESI-MS/MS. DP, potencial de desagrupamiento; CE, energía de colisión. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

La OCT es un agente de criopreservación común a largo plazo utilizado en biorepositorios. Sin embargo, la OCT puede resultar en supresión iónica cuando los tejidos son analizados por varias plataformas de espectrometría de masas12,13,14,15, o resultar en pérdida de señal cuando las muestras son analizadas por LC-ESI-MS/MS 11. La OCT en tejidos criopreservados también puede interferir con los métodos de normalización tisular, como los ensayos de pesaje y cuantificación de proteínas, como Bradford y BCA11. Aquí, presentamos un protocolo detallado para eliminar OCT de tejidos humanos y posteriormente ser analizado por espectrometría de masas. El protocolo puede modificarse para utilizar otras fuentes de tejido que no sean de pulmón, o de tejidos de ratones como hemos descrito anteriormente11. Además, se pueden utilizar otras estrategias de normalización de datos de espectrometría de masas, incluidas las que hemos descrito anteriormente11, así como otros métodos validados.

Una limitación importante de este protocolo es que no es adecuado para el análisis de tejidos que han sido fijados previamente con formaldehído u otro agente fijador. Solo es adecuado para tejidos que no han sido fijados y han sido criopreservados en OCT. Además, este método no es adecuado para procesar tejidos que pesan menos de 1-2 mg, ya que siempre hay cierta pérdida de tejido durante los pasos de sOCTrP y las transferencias entre tubos. Será difícil pesar tejidos tan pequeños utilizando una escala analítica estándar, y cualquier PBS sobrante que no se elimine durante la etapa de absorción contribuirá en gran medida al error experimental. A continuación se presentan otras consideraciones importantes al lavar los tejidos para eliminar la OCT con este método.

Para garantizar la ejecución sin problemas de este protocolo, especialmente si se procesarán muchas muestras, los pasos descritos en la sección 1 deben realizarse con anticipación, incluido el etiquetado previo y el pesaje previo de tubos de 1,5 ml, el etiquetado previo de tubos y tapas de tapones de rosca de 13 x 100 mm, tubos de cultivo de 13 x 100 mm y viales de autoinyectores, preparación de todas las mechas, preacortamiento de puntas de pipeta de 1 ml, y soluciones de lavado preenfriadas. Esto evitará que los procedimientos que consumen mucho tiempo tengan que realizarse el día en que se lavarán los tejidos, lo que puede provocar retrasos. En general, encontramos que si muchos de estos pasos se realizan el día anterior, un investigador experimentado puede lavar 30-40 muestras en un día de trabajo normal. Sin embargo, debido a que el primer punto de parada sugerido es después de que todos los tejidos hayan sido lavados, pesados y colocados en metanol y almacenados a -80 ° C, no realizar 1,5 ml de pesaje previo y etiquetado con anticipación afectará la eficiencia y extenderá el tiempo requerido para lavar 30-40 tejidos.

El pesaje de tejidos es uno de los pasos más importantes, ya que los errores o el descuido afectarán la calidad de los datos, ya que se trasladarán a la normalización de los datos. Es fundamental que la balanza analítica utilizada para el pesaje se calibre, se ponga a cero correctamente y se tarifique. En consecuencia, cuando se usan mechas, es importante eliminar la mayor cantidad posible de solución de lavado, especialmente para tejidos que pesen menos de 5 mg. En estos pesos de tejido, la solución de lavado sobrante hará que el pesaje sea inexacto en un gran porcentaje y se traslade como un error en la normalización de datos. Al retirar la solución de lavado, encontramos que los tejidos se pueden tocar suavemente con la mecha durante varios segundos para eliminar la mayor cantidad de solución de lavado posible sin provocar pérdidas significativas de tejido por adhesión a la mecha. Sin embargo, cada tipo de tejido que se lava debe probarse para determinar su adhesión a las mechas, y estos pasos en el protocolo se ajustan en consecuencia.

Para facilitar el flujo de trabajo de lavado de tejidos, se recomienda solicitar virutas de tejido del biorepositorio en tubos de polipropileno de 15 ml. Esto reducirá la manipulación de los pañuelos antes del lavado.

Al lavar tejidos, si se observa un material similar a un gel en la parte inferior de un tubo después del tercer ciclo de sOCTrP, esto es indicativo de que no se ha eliminado toda la OCT y se necesitan más ciclos de sOCTrP. Realice un seguimiento de cuántos ciclos se necesitan y, para mantener la coherencia, realice el mismo número de ciclos sOCTrP en todas las muestras del conjunto de datos. Hemos evaluado previamente hasta 9 ciclos de sOCTrP y no encontramos ningún efecto sobre el agotamiento de los esfingolípidos en los tejidos11.

Cuando use mechas para eliminar la solución de lavado, frotar suavemente el pañuelo asegurará que se elimine toda la solución de lavado. Esto aumenta la precisión de la estimación del peso del tejido. Sin embargo, se debe tener mucho cuidado con los tejidos muy pequeños, ya que estos pueden adherirse a la mecha y provocar la pérdida de muestras. Es útil usar varias mechas para el mismo tubo para eliminar la mayor cantidad de solución posible. Para evitar la contaminación cruzada de la muestra, utilice siempre una mecha nueva y limpia para cada muestra. Al hacer mechas, use tejido de grado de laboratorio (ver Tabla de materiales) ya que las probamos previamente y encontramos que contienen una cantidad insignificante de esfingolípidos contaminantes11. Se pueden usar mechas de otros materiales si se prueban como se describe11.

Al recuperar muestras de tubos de 1,5 ml después del pesaje, es fundamental que se recupere todo el tejido. De lo contrario, se producirán errores en la normalización de los datos. Si se necesita más PBS para recuperar todo el tejido, agregue la cantidad equivalente de PBS utilizada a todos los demás tubos para evitar diferencias en la eficiencia de extracción que podrían resultar de muestras que contienen diferentes cantidades de PBS. Ajuste los volúmenes de cloroformo y metanol para tener en cuenta cualquier aumento en el volumen de agua para mantener una relación 2: 1: 0.1 metanol: cloroformo: agua.

Al descongelar muestras, es importante que este paso se realice en hielo para evitar la degradación de lípidos lábiles como la esfingosina-1-fosfato. La descongelación completa de las muestras hasta que la OCT esté en estado líquido también facilitará su eliminación, ya que se disolverá más fácilmente en la solución de lavado en frío en lugar de permanecer como un pellet durante los primeros pasos de lavado.

Ocasionalmente, especialmente al lavar tejidos pulmonares, habrá fragmentos que no se granularán y flotarán sobre la solución de lavado después de la centrifugación. Con cuidado, sumergir la punta de aspiración debajo de los tejidos flotantes para eliminar la solución de lavado puede prevenir la pérdida durante la aspiración.

No agregue cloroformo a las muestras antes de la homogeneización, ya que las puntas desechables del homogeneizador están hechas de plástico y se disolverán en soluciones que contienen cloroformo. Esto puede afectar significativamente la cuantificación LC-MS/MS de los lípidos en las muestras. Por lo tanto, en general, se debe evitar el uso de plásticos que no sean resistentes a los disolventes al dispensar cloroformo y metanol. Estos disolventes también son tóxicos y deben manipularse en una campana extractora adecuada. Use el EPP adecuado cuando manipule disolventes como metanol y cloroformo.

Los tejidos humanos deben procesarse en un gabinete de bioseguridad apropiado (por ejemplo, Clase II). Los usuarios deben estar capacitados en el manejo de materiales y fluidos biopeligrosos de origen humano y seguir protocolos de seguridad, como usar equipo de protección personal adecuado y descontaminar cualquier superficie o equipo que entre en contacto con muestras. Los usuarios deben desinfectar minuciosamente (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el descontaminante sugerido) cualquier superficie o equipo (centrífugas, portadores y adaptadores de centrífugas, pipetas, vórtices, superficies de campanas extractoras, balanzas, cristalería, bandejas de hielo, teclados de computadora, mouse de computadora, etc.) utilizados durante el procedimiento de lavado. Los miembros del laboratorio no deben usar equipos o capuchas utilizadas para lavar pañuelos de papel hasta que hayan sido desinfectados a fondo. Evite el uso de lejía en superficies de acero y productos electrónicos.

Al procesar muchas muestras, tenga cuidado para evitar la contaminación cruzada utilizando tapas limpias en los pasos de retapado durante los pasos de extracción de lípidos. Las tapas también se pueden reutilizar si están etiquetadas. Sin embargo, en la práctica, encontramos que los marcadores se destacan mal en las tapas negras, y las etiquetas adhesivas se caen de los tubos durante la incubación nocturna a 48 ° C.

Los esfingolípidos se demuestran actores importantes en la etiología de la enfermedad y los cánceres humanos. Por lo tanto, existe un gran interés en definir con precisión las alteraciones del metabolismo de los esfingolípidos en estas enfermedades, ya que pueden revelar dianas terapéuticas. Sin embargo, muchos de los tejidos que son fácilmente accesibles para los investigadores están criopreservados en OCT, lo que no es compatible con el análisis de espectrometría de masas. Por lo tanto, el protocolo detallado descrito aquí ampliará el repertorio de tejidos adecuados para el análisis esfingolipidómico cuantitativo y, por lo tanto, ayudará a aumentar nuestra comprensión de la biología de las alteraciones del metabolismo lipídico en enfermedades humanas y cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los servicios y el apoyo del proyecto de investigación fueron proporcionados por el Núcleo de Adquisición y Análisis de Tejidos y Datos del Centro de Cáncer Masey de VCU y el Núcleo de Lipidómica y Metabolómica de VCU, que son apoyados en parte con fondos de la Subvención de Apoyo al Centro de Cáncer P30CA016059 del NIH-NCI. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R21CA232234 (Santiago Lima).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13x100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 581300-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

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References

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