Préparation de tissus humains incorporés dans un composé à température de coupe optimale pour analyse par spectrométrie de masse

Summary

Les sphingolipides sont des métabolites bioactifs dont le rôle dans les maladies humaines est bien établi. La caractérisation des altérations dans les tissus par spectrométrie de masse peut révéler des rôles dans l’étiologie de la maladie ou identifier des cibles thérapeutiques. Cependant, le composé OCT utilisé pour la cryoconservation dans les dépôts biologiques interfère avec la spectrométrie de masse. Nous décrivons des méthodes pour analyser les sphingolipides dans les tissus humains incorporés dans la TCO avec LC-ESI-MS/MS.

Abstract

Les sphingolipides sont des composants cellulaires qui ont des rôles bien établis dans le métabolisme humain et la maladie. La spectrométrie de masse peut être utilisée pour déterminer si les sphingolipides sont altérés dans une maladie et déterminer si les sphingolipides peuvent être ciblés cliniquement. Cependant, les études prospectives de bonne puissance qui acquièrent des tissus directement à partir de la salle d’opération peuvent prendre beaucoup de temps et être difficiles sur les plans technique, logistique et administratif. En revanche, les études rétrospectives peuvent tirer parti des spécimens humains cryoconservés déjà disponibles, généralement en grand nombre, dans les dépôts biologiques tissulaires. Parmi les autres avantages de l’obtention de tissus auprès de dépôts biologiques, mentionnons l’accès à l’information associée aux échantillons de tissus, y compris l’histologie, la pathologie et, dans certains cas, les variables clinicopathologiques, qui peuvent toutes être utilisées pour examiner les corrélations avec les données lipidomiques. Cependant, les limitations techniques liées à l’incompatibilité du composé à température de coupe optimale (OCT) utilisé dans la cryoconservation et la spectrométrie de masse constituent une barrière technique pour l’analyse des lipides. Cependant, nous avons déjà montré que la TCO peut être facilement retirée des échantillons humains de biodépôts par des cycles de lavage et de centrifugation sans modifier leur teneur en sphingolipides. Nous avons également précédemment établi que les sphingolipides dans les tissus humains cryoconservés en OCT sont stables jusqu’à 16 ans. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes et le flux de travail pour analyser les sphingolipides dans les échantillons de tissus humains qui sont intégrés dans l’OCT, y compris le lavage des tissus, le pesage des tissus pour la normalisation des données, l’extraction des lipides, la préparation des échantillons pour analyse par chromatographie liquide spectrométrie de masse en tandem par électropulvérisation (LC-ESI-MS / MS), l’intégration des données de spectrométrie de masse, la normalisation des données et l’analyse des données.

Introduction

Les sphingolipides sont des métabolites bioactifs connus pour leurs rôles dans le métabolisme humain et la maladie ^1,2. Ils régulent des processus cellulaires complexes tels que la migration cellulaire, la survie et la mort cellulaires, le mouvement cellulaire, le trafic vésiculeux, l’invasion cellulaire et les métastases, l’angiogenèse et la production de cytokines 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Les défauts dans la régulation du métabolisme des sphingolipides contribuent à l’initiation et à la progression des cancers, déterminent l’agressivité des cancers et la façon dont les cancers répondent et développent une résistance au traitement ^3,10. Par conséquent, en raison de ces vastes répercussions sur l’étiologie de la maladie, les méthodes analytiques qui permettent d’établir avec précision les altérations des sphingolipides spécifiques à la maladie sont des outils importants. La spectrométrie de masse (SM) est la méthode la plus précise et la plus fiable pour analyser les altérations des sphingolipides.

Les échantillons humains qui peuvent être utilisés pour l’analyse des altérations des sphingolipides peuvent être obtenus prospectivement à partir de la salle d’opération ou rétrospectivement à partir de biodépôts tissulaires. Les tissus frais issus de la chirurgie sont avantageux parce qu’ils peuvent être analysés directement par la SEP ou d’autres méthodes analytiques. Cependant, l’acquisition prospective de tissus comporte des obstacles administratifs, techniques et logistiques, et la collecte de suffisamment de spécimens pour atteindre la puissance statistique peut être difficile. L’obtention de tissus auprès de dépôts biologiques est avantageuse parce qu’ils peuvent être acquis rétrospectivement, en grand nombre, et les biodépôts confirment l’histologie et la pathologie, utilisent des procédures opérationnelles normalisées pour préserver et stocker cryogéniquement les tissus, et peuvent fournir des données clinicopathologiques qui peuvent être utilisées pour les analyses de corrélation. Cependant, pour préserver les caractéristiques moléculaires et structurelles, les biodépôts peuvent cryopréserver les tissus en les incorporant dans un composé à température de coupe optimale (OCT), ce qui, nous l’avons montré, interfère avec les essais de normalisation des données et la quantification des sphingolipides par chromatographie liquide spectrométrie de masse en tandem par électropulvérisation (LC-ESI-MS/MS⁾¹¹ . Il a également été démontré que l’alcool polyvinylique et le polyéthylèneglycol, les principaux composants du composé OCT, entraînent la suppression des ions dans d’autres plates-formes d’analyse MS^12,13,14,15. Par conséquent, le composé OCT doit être retiré des tissus avant l’analyse sphingolipidomique par MS.

Dans un rapport précédent, nous avons validé un protocole pour le retrait du composé OCT des échantillons humains pour l’analyse LC-ESI-MS/MS¹¹ et la méthodologie utilisée pour peser les tissus pour la normalisation des données¹¹. Ici, nous détaillons les étapes du protocole d’élimination des composés OCT sphingolilipidomique (sOCTrP) et montrons des données représentatives des tumeurs de l’adénocarcinome pulmonaire humain et des tissus adjacents normaux non impliqués.

Protocol

Les tissus pulmonaires humains anonymisés ont été obtenus auprès du noyau d’acquisition et d’analyse de tissus et de données de la Virginia Commonwealth University (VCU) dans le cadre d’un protocole approuvé par le comité d’examen interne (IRB) (#HM2471). L’utilisation de souris pour la recherche et la récolte de tissus de souris a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UCV.

1. Préparation du matériel

REMARQUE: Ces étapes doivent être effectuées un jour avant le lavage des tissus.

1. Préétiqueter et peser des tubes centrifugés en polypropylène de 1,5 mL avec des codes d’identification concis mais clairs pour chaque échantillon qui sera traité le lendemain. Utilisez un marqueur permanent résistant aux produits chimiques (voir le tableau des matériaux) qui ne se décolorera pas lors de la manipulation répétée du tube.
2. Ouvrez une feuille de calcul électronique et étiquetez les colonnes consécutives avec les en-têtes de colonne suivants : identificateur de tube (ID), tube seul, tube avec tissu et tissu total. Entrez les identificateurs de tube qui seront traités dans la colonne intitulée ID de tube.
3. Pré-calibrer et zéro une échelle analytique. Placer une fiole d’erlenmeyer propre de 10 ml au centre de la balance (la fiole servira de porte-tube). Fermez la porte de la chambre de pesée et tare la balance avec la fiole.
4. Peser 1,5 mL de tubes à centrifuger. Placez délicatement le tube dans le ballon et fermez la porte de la chambre de pesée. Laissez le poids se stabiliser et notez le poids dans la colonne étiquetée tube seul.
   REMARQUE : Évitez de déplacer l’erlenmeyer de 10 ml lorsque vous pesez des tubes. Si la fiole est déplacée, recentrer la fiole et refonder la balance. Placez les tubes fermés dans une grille et rangez-les jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
5. Pré-étiquetez les tubes et bouchons en verre à vis de 13 x 100 mm avec les codes d’identification et remplissez-les avec 2 ml de méthanol de qualité LC-MS. Placez-les dans une grille à tubes, bouchonnez-les et conservez-les au réfrigérateur (4 °C) jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : Utilisez un distributeur de solvant en bouteille (voir le tableau des matériaux). S’il n’y en a pas, utilisez des pipettes en verre pour éviter l’utilisation de plastiques lors de la distribution de solvants organiques.
6. Pré-étiquetage de tubes à essai en verre de 13 x 100 mm. Couvrir et entreposer les tubes à essai à température ambiante.
7. Flacons d’auto-injecteurs pré-étiquetés avec codes d’identification. Couvrir et conserver les flacons d’auto-injecteur à température ambiante jusqu’à utilisation.
8. Préparez des mèches de séchage des tissus.
   1. Commencez par nettoyer les ciseaux chirurgicaux en les immergeant dans du méthanol de qualité LC-MS pendant 5 minutes, puis essuyez-les avec un mouchoir propre de qualité laboratoire.
   2. À l’aide de gants sans poudre, faites tourner l’extrémité d’un tissu de qualité laboratoire (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce qu’une mèche finement effilée de 30 à 40 mm soit formée.
   3. À l’aide de ciseaux nettoyés au méthanol, coupez la mèche à l’extrémité épaisse. Placez les mèches dans une boîte en carton propre. Faites le double du nombre de mèches qu’il en faudra pour traiter tous les échantillons.
9. Préparez des embouts de pipette raccourcis de 1 mL. À l’aide de ciseaux chirurgicaux nettoyés au méthanol, coupez 4 à 5 mm de l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 ml et replacez la pointe dans le porte-pointe. Préparez deux fois plus de pointes que d’échantillons à traiter.
   NOTE: Ceux-ci seront utilisés dans la récupération des tissus lavés des tubes. Ne touchez pas l’extrémité de la pointe.
10. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de qualité biologie moléculaire pré-refroidissement à 4 °C (0,5 L suffit). Cela sera utilisé pour récupérer des spécimens. Pour chaque échantillon qui sera traité, prérefroidir (4 °C) 60 mL d’eau désionisée ultra-pure.
11. Préparer des étalons internes de spectrométrie de masse. Dissoudre les lipides suivants dans l’éthanol:méthanol:eau (7:2:1; v/v/v) à une concentration de 25 nmol/mL : d17:1-sphingosine, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ène-1,3-diol; d17:1-sphingosine-1-phosphate, heptadécasphing-4-énine-1-phosphate; C12-céramide (d18:1/C12:0), N-(dodécanoyl)-sphing-4-énine; C12-sphingomyéline (d18:1/C12:0), N-(dodécanoyl)-sphing-4-énine-1-phosphocholine; C12-glucosylcéramide (d18:1/C12:0), N-(dodécanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine; C12-lactosylcéramide (d18:1/C12:0), N-(dodécanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ène.

2. Lavage des mouchoirs

REMARQUE : Le fait de compléter toutes les étapes de la section 1 un jour avant permet à un chercheur qualifié de traiter jusqu’à 40 échantillons par jour et aux novices ~ 10 à 15 échantillons par jour. Commencez tôt le matin et ne vous arrêtez pas tant que toutes les étapes des sections 2.1 à 3.8 ne sont pas terminées.

1. Le jour où les tissus seront traités, préparez l’aire de travail de l’armoire de biosécurité en l’équipant d’un vortexeur, d’un pipeteur sérologique complètement chargé et d’un bac à glace. Pour toutes les étapes de cette section, portez l’EPI approprié, y compris une blouse de laboratoire, une double couche de gants et des lunettes de protection. ATTENTION : Les tissus et liquides humains doivent être considérés et traités comme des matières biologiques dangereuses.
2. Prérefroidir (4 °C) une centrifugeuse à godet oscillant, tous les adaptateurs nécessaires pour contenir des tubes de centrifugation coniques de 15 ml et des couvercles de bioconfinement de centrifugeuses. Pré-refroidissement (4 °C) : centrifugeuse à angle fixe capable de contenir des tubes à centrifuger de 1,5 mL.
3. Si les tissus ne sont pas aliquotes dans des tubes centrifugés en polypropylène de 15 mL, utiliser une spatule nettoyée au méthanol (propre pour chaque nouvel échantillon de tissu) pour les transférer dans des tubes en polypropylène prémarqués de 15 mL. Étiquetez également les capsules de 15 mL.
   1. Placez un support tubulaire capable de contenir des tubes à centrifuger de 15 ml dans un bac à glace et remplissez le bac de glace. Décongeler les tissus qui seront traités ce jour-là en les plaçant dans la grille sur de la glace.
      REMARQUE : Un minimum de 3 à 4 mg de tissu doit être demandé au biodépôt pour traitement, car il a déjà été démontré que les protocoles de lavage et de pesée des tissus sont précis et fiables à ces poids¹¹.
4. Déplacez le bac à glace contenant les échantillons dans l’enceinte de biosécurité.
5. Effectuez trois cycles sOCTrP¹¹ comme indiqué ci-dessous (c.-à-d. effectuez les étapes 2.5.1-2.5.5 trois fois).
   1. Ajouter 10 ml d’eau désionisée ultra-pure glacée à chaque tube et les recouvrir hermétiquement. Laisser les tubes incuber pendant 10 min.
   2. Tourbillonner vigoureusement chaque tube pendant 10-20 s ou jusqu’à ce que tout le tissu déposé sur les parois du tube, ou une pastille de tissu, soit complètement remis en suspension.
      NOTE: Dans les cycles 2-3 de sOCTrP, il est essentiel que la pastille soit remise en suspension afin que toute OCT contenue dans la pastille soit diluée dans la solution de lavage.
   3. Transférer les tubes dans la centrifugeuse à godet pivotant prérefroidie (4 °C). Centrifuger des échantillons à 4 000-5 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
      NOTA : Éviter la production d’aérosols biologiques dangereux et l’exposition à ceux-ci pendant la centrifugation en scellant les supports de centrifugation à l’aide d’un couvercle de bioconfinement (voir le tableau des matières).
   4. Prélever des échantillons de la centrifugeuse et les transférer dans le bac à glace. Placez le plateau dans une armoire de biosécurité et décapsulez les tubes. Enregistrez les bouchons.
   5. Aspirez soigneusement la solution de lavage. Évitez d’aspirer le tissu dans la pastille en laissant ~0,5 mL du surnageant dans le tube. Boucher les tubes et éviter la contamination croisée en faisant correspondre les bouchons étiquetés avec les tubes.
      NOTA: La solution de lavage (le surnageant) à l’étape 2.5.5 est une matière dangereuse biologique; le manipuler et l’éliminer conformément aux directives de biosécurité appropriées pour les spécimens d’origine humaine.

3. Pesage des tissus (pour la normalisation des données)

1. Après le dernier cycle de lavage sOCTrP, aspirez soigneusement la majeure partie de la solution de lavage, mais évitez de déranger la pastille. Laisser ~0,5 mL de la solution de lavage dans le tube.
2. À l’aide des pointes de pipettes raccourcies (préparées à l’étape 1.9), prenez 500 μL de PBS glacé et ajoutez-le au tube.
   1. À l’aide de la même pointe, remettre doucement la pastille en suspension et récupérer tous les tissus. Évitez le pipetage turbulent pour diminuer la perte de tissu par son adhérence aux parois du tube et de l’extrémité de la pipette.
3. Ajouter le tissu remis en suspension à son tube à centrifuger pré-étiqueté et pré-pesé correspondant de 1,5 mL et placer le tube sur de la glace. Répétez l’opération pour tous les tissus de l’ensemble de données.
4. Placer les tubes de 1,5 mL dans une centrifugeuse prérefroidie et enduire les mouchoirs en granulés à 7 000 x g pendant 5 à 7 minutes et 4 °C.
   1. Récupérez les tubes et aspirez soigneusement autant de PBS que possible sans déranger la pastille. Replacez le tube sur la glace.
5. Tubes centrifugeuses pendant 3 minutes supplémentaires à 7 000 x g pour s’assurer que les tissus sont bien enrobés. Transférer les tubes dans de la glace.
   REMARQUE: L’étape de centrifugation supplémentaire est importante pour éviter la perte de tissu lors du retrait de toute solution de lavage et de l’évacuation. Si vous traitez plus de cinq échantillons, répétez l’étape de centrifugation de 3 min, 7 000 x g après chaque cinquième échantillon pour vous assurer que les tissus restent granulés.
6. À l’aide des mèches préparées à l’étape 1.8, retirez délicatement toute solution de lavage restante. Utilisez une mèche propre pour chaque échantillon. Il est acceptable de tamponner doucement le tissu avec la mèche, ce qui aidera à éliminer la majeure partie de la solution de lavage, mais évitera de perdre du tissu par adhérence à la mèche. Fermez le tube et placez-le sur de la glace.
7. Pesez chaque tube dans la balance analytique récemment étalonnée, tarée et mise à zéro.
   1. Placer chaque tube dans l’erlenmeyer en verre et fermer la porte de la chambre. Lorsque le poids s’est stabilisé, enregistrez-le dans la colonne de la feuille de calcul électronique intitulée tube avec tissu.
   2. Après pesée, replacez le tube sur de la glace.
8. Ajouter 300 μL de PBS glacé. À l’aide d’un embout de pipette raccourci (étape 1.9), prélever soigneusement tous les tissus et les déposer dans un tube de verre à bouchon à vis pré-étiqueté (préparé à l’étape 1.5) contenant 2 ml de méthanol glacé de qualité LC-MS (ajouter le tissu au méthanol, pas sur le côté du tube).
9. Calculez la quantité de tissu qui a été lavée en soustrayant le tube seul du tube avec la valeur du tissu. Notez ce nombre dans la colonne de tissu total. La valeur totale du tissu sera utilisée pour normaliser les données de spectrométrie de masse à l’étape 6.12.
10. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer les étapes 4.1 à 4.15.
    REMARQUE: C’est un bon point d’arrêt, et les échantillons peuvent être stockés en toute sécurité pendant quelques semaines à -80 ° C. Pour d’autres méthodes de normalisation tissulaire, telles que la concentration de protéines ou la teneur en phosphate lipidique, voir Rohrbach et ^coll.11.

4. Extraction des lipides

REMARQUE : Il est important de commencer ces étapes le matin, en particulier lorsque de nombreux échantillons seront traités. Avant de commencer, préchauffez un bain-marie ou un incubateur à 48 °C.

1. Retirer du congélateur les échantillons préparés à l’étape 3.8 et les étalons lipidiques de la SEP (préparés à l’étape 1.11). Laissez-les s’équilibrer à température ambiante pendant 20 min.
2. Vortex et immerger la solution étalon interne dans un bain-marie à ultrasons (voir le tableau des matériaux) pendant 2-3 minutes ou jusqu’à ce que les étalons lipidiques MS soient complètement dissous avant d’être distribués dans des échantillons. Cela évitera les erreurs de normalisation des données.
3. À l’aide d’une pipette répétitive, ajouter 250 pmol (10 μL de la solution de 25 nmol/mL préparée à l’étape 1.11) d’étalons internes de spectrométrie de masse dans chaque tube. Reboucher légèrement les tubes.
4. Pour faciliter l’homogénéisation, ajuster le volume de méthanol à 2 mL. N’utilisez que du méthanol de qualité LC-MS/MS.
5. En travaillant un tube à la fois, utilisez un homogénéisateur pour triturer le tissu jusqu’à ce qu’aucune touffe ne soit visible (généralement 5-20 s). Déplacez l’embout de l’homogénéisateur dans un mouvement circulaire et appuyez doucement contre la paroi du tube pour faciliter la trituration. Reboucher le tube.
   REMARQUE: S’assurer que tous les tissus sont finement triturés maximisera l’extraction des lipides. N’ajoutez pas de chloroforme aux échantillons avant l’homogénéisation, car les embouts d’homogénéisateur jetables sont faits de plastique qui se dissoudra dans des solutions contenant du chloroforme.
6. Immergez le tube à un angle de 45° dans un bain-marie à ultrasons pendant 5-10 s.
   1. Si aucun amas de tissu ne se forme lors de l’immersion dans le bain à ultrasons, coiffez-le et passez au tube suivant.
   2. Si des amas de tissu se forment lorsque le tube est immergé dans le bain à ultrasons, réhomogénéiser et cibler les amas de tissus.
   3. Répétez ce processus (homogénéisation/immersion dans un bain à ultrasons) de manière itérative jusqu’à ce que tous les gros amas de tissus soient brisés.
7. Dans une hotte, ajoutez du chloroforme et du méthanol de qualité LC-MS à chaque tube (utilisez un distributeur de capsule) pour obtenir un rapport de 2:1:0,1 méthanol:chloroforme:eau. À l’aide de bouchons propres, scellez hermétiquement les tubes et laissez-les sur la paillasse jusqu’à la fin de la journée.
   1. Pour les tissus pesant 50 mg ou moins, utiliser un volume d’extraction total de 4 mL et ajuster en utilisant ce rapport (solution d’extraction de 50 mg:4 mL) pour les échantillons plus gros.
8. Avant de partir ce soir-là, placez les tubes hermétiquement bouchés dans un bain-marie ou un incubateur à 48 °C et incuberez-les pendant la nuit.
   NOTE: Il est essentiel que les tubes soient bien bouchés afin que les rapports de solvant ne changent pas en raison de l’évaporation.
9. Le lendemain matin, prélever les échantillons du bain-marie à 48 °C et ensemencer tous les débris insolubles dans les solvants par centrifugation à 4 000-5 000 x g à 4 °C pendant 20 min.
10. En travaillant dans une hotte, décanter soigneusement le surnageant dans les tubes à essai en verre borosilicaté pré-étiquetés de 13 x 100 mm. Inclinez le tube de 13 x 100 mm à un angle de 30-45° pour faciliter la décantation.
    REMARQUE : Si vous traitez plus de 12 échantillons, ne laissez pas les tubes centrifugés reposer pendant de longues périodes, car les pastilles ramolliront et les débris insolubles seront transférés lors de l’exécution de l’étape 4.10. Pour éviter cela, ne retirez que 12 tubes de la centrifugeuse à la fois et continuez à centrifuger les autres tubes jusqu’à ce que vous soyez prêt à les décanter.
11. Transférer les tubes dans un concentrateur à vide capable de contenir des tubes de 13 x 100 mm. Évaporer tout le solvant avec une étape initiale de chauffage de 1 h (40 °C) et faire fonctionner sous vide maximal.
12. Retirez les tubes du concentrateur sous vide et ajoutez 500 μL de méthanol de qualité LC-MS (utilisez un distributeur à capsule) dans chaque tube.
13. Remettez en suspension les extraits lipidiques séchés en vortex pendant 5-10 s, puis en immergeant les tubes à un angle de 45° dans un bain-marie à ultrasons pendant 2 min tout en faisant tourner le tube. Re-vortex pendant 5 s et plongez dans un bain-marie à ultrasons pendant une minute supplémentaire.
    NOTE: Il s’agit d’une étape critique pour assurer la récupération maximale des lipides extraits. N’avancez pas tant que toute la matière séchée sur la paroi du tube n’a pas été remise en suspension.
14. Placer les tubes de 13 x 100 mm dans une centrifugeuse prérefroidie (4 °C) et éliminer tous les débris insolubles par centrifugation à 4 000-5 000 x g à 4 °C pendant 20-30 min.
15. Décanter soigneusement le surnageant clarifié dans un flacon auto-injecteur pré-étiqueté. L’inclinaison du flacon d’auto-injecteur à un angle de 30 à 45° facilitera la décantation. Assurez-vous que tout le contenu du tube de 13 x 100 mm est décanté dans le flacon du chargeur automatique.
16. Boucher hermétiquement les tubes et stocker les tubes à -80 °C jusqu’à l’analyse par LC-ESI-MS/MS.

5. Analyse LC-ESI-MS/MS

REMARQUE: La procédure suivante utilise un système de pompe binaire couplé à un auto-injecteur, un dégazeur et un système LC-MS/MS fonctionnant en mode triple-quadrupole. La température de la colonne a été maintenue à l’aide d’un four à colonne. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur l’équipement utilisé.

1. Préparer la phase mobile A1 (CH₃OH:H₂O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, avec formate d’ammonium 5 mM) et la phase mobile B1 (CH_3OH:HCOOH, 99:1, v:v, avec formate d’ammonium 5 mM). Utilisez uniquement des solvants de qualité LC-MS, de l’eau et des réactifs.
2. Pour chaque ensemble d’échantillons, préparer quatre flacons de chargeur automatique à blanc contenant 500 μL de méthanol de qualité LC-MS.
3. Pour chaque jeu d’échantillons, préparer deux flacons de chargeur automatique de l’étalon interne (étiqueter comme IS) en diluant 10 μL (250 pmol au total pour chaque étalon) de la solution étalon interne préparée à l’étape 1.11 dans 500 μL de méthanol de qualité LC-MS.
4. Réglez la température du four à colonne sur 60 °C et la température de la source d’ions sur 500 °C.
5. Pour l’analyse MS/MS, utilisez le mode triple-quadripôle du spectromètre. Régler le premier quadripôle (Q1) pour passer des ions précurseurs, tandis que le troisième quadripôle (Q3) pour passer des ions produits moléculairement distinctifs (ou un balayage sur plusieurs m / z dans Q1 ou Q3) en utilisant N2 pour induire des dissociations collisionnelles dans le quadripôle 2 (Q2), qui est décalé de Q1 de 30 à 120 eV.
6. Réglez la fenêtre de détection des paires de surveillance de réactions multiples (MRM) sur 120 s avec un temps d’analyse cible de 1,0 s. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir une liste des paires MRM, des énergies d’ionisation et des énergies de collision.
7. Utilisez les paramètres suivants pour résoudre les sphingolipides à l’étape LC : en utilisant un débit de 0,7 mL/min, équilibrer une colonne de phase inverse C18 de 2,1 (i.d) x 50 mm pendant 0,5 min avec un mélange de solvants de 95 % de phase mobile A1 et de 5 % de phase mobile B1.
   1. Après l’injection de l’échantillon, maintenir le rapport de phase mobile A1/B1 à 95/5 pendant 2,25 min, suivi d’un gradient linéaire à 100% B1 sur 1,5 min, qui est ensuite maintenu à 100% B1 pendant 5,5 min, suivi d’un retour de gradient de 0,5 min à 95/5 A1/B1.
   2. Après l’exécution, rééquilibrer la colonne avec un mélange de 95/5 A1/B1 pendant 0,5 min.
8. Utilisez les paramètres suivants pour le chargeur automatique d’échantillons : volume de rinçage, 500 μL ; course d’aiguille, 52 mm (elle doit être ajustée en fonction de la taille et du volume du flacon dans chaque flacon); vitesse de rinçage, 35 μL/s; vitesse d’échantillonnage, 5,0 μL/s; temps de rinçage, 2 s; mode rinçage, avant et après aspiration; Temps de rinçage,2 s.
9. Placez les échantillons préparés à l’étape 4.15 sur un plateau de chargeur automatique dans l’ordre suivant : Blanc ; EST; Blanc; Échantillons préparés à l’étape 4.15; Vide, IS, Vide.
10. Analyser 5-10 μL de chaque échantillon par LC-ESI-MS/MS. Analyser le même volume pour tous les échantillons de l’ensemble de données.

6. Traitement, intégration et normalisation des données

REMARQUE : Bien que les étapes suivantes décrivent une procédure pour un logiciel spécifique (voir le tableau des matériaux), des procédures similaires sur des instruments et des logiciels LC-MS équivalents peuvent être utilisées pour intégrer des paires de MRM pour les classes de lipides analysées et les étalons internes correspondants.

1. Ouvrez le logiciel de quantification. Dans l’onglet Quantitate, double-cliquez sur l’assistant de quantification. Dans la fenêtre contextuelle, dans l’espace de travail le plus à gauche, accédez au jeu de données correct et cliquez dessus avec le bouton gauche de la souris. Les exemples disponibles seront affichés dans l’espace de travail du milieu.
2. Mettez en surbrillance les échantillons à analyser, puis cliquez sur la flèche de droite pour ajouter des échantillons à l’espace de travail Échantillons sélectionnés . Cliquez sur Suivant pour accéder à l’écran des paramètres et de la requête où les paramètres par défaut sont généralement utilisés.
3. Appuyez sur Suivant pour accéder à l’écran de sélection de la méthode d’intégration. Choisir une méthode d’intégration appropriée contenant des paires de transition MRM pour les lipides à analyser. Reportez-vous au Tableau 1 pour les paires de transition MRM. Appuyez sur Terminer.
   REMARQUE: Les temps de rétention varient en fonction de l’instrumentation et des paramètres individuels et doivent donc être vérifiés pour chaque configuration individuelle.
4. Dans la barre de navigation, cliquez sur le volet Examen des pics afin que les paires MRM puissent être inspectées. Pour faciliter la révision, cliquez avec le bouton droit sur le volet Révision des pics, définissez le zoom automatique sur 100 % du pic le plus grand et une fenêtre de zoom de 1,00 à 2,00 minutes.
5. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre Affichage de la quantification et sélectionnez Analyte et le sphingolipide souhaité à examiner. Vérifiez qu’il n’y a pas de pics dans les échantillons blancs et que le pic correct a été intégré dans les échantillons IS.
6. Commencez à intégrer des échantillons inconnus. En travaillant une classe de sphingolipides à la fois, inspecter le temps de rétention de la paire MRM de l’étalon interne (c.-à-d. C12:0 céramide) et s’assurer que le logiciel a intégré le bon pic.
7. Continuer sur les analytes de la même classe lipidique (c.-à-d. C14:0 céramide, C16:0-céramide, etc.), en commençant par le lipide de longueur de chaîne le plus court de la classe. Vérifiez pour chaque lipide de longueur de chaîne que la routine logicielle a intégré le pic de paire MRM correct.
8. Lorsque tous les analytes ont été intégrés, créer un tableur électronique pour chaque espèce de sphingolipides analysée (p. ex. céramides, sphingomyélines, etc.). Étiquetez les en-têtes de colonne pour qu’ils correspondent à l’ordre des analytes et des longueurs de chaîne dans le logiciel de quantification LC-MS/MS. Inclure également un en-tête de colonne pour l’ID de l’échantillon et les poids de normalisation de l’échantillon déterminés à l’étape 3.9.
   NOTE: Comme décrit précédemment¹¹, d’autres mesures de normalisation courantes comprennent la teneur totale en phosphate lipidique ou la quantité de protéines.
9. Exportez ou copiez les zones de pic pour tous les analytes et les étalons internes dans la feuille de calcul électronique.
10. Normaliser les données en divisant l’aire de pic intégrée de chaque espèce de longueur de chaîne pour une classe de sphingolipides donnée par l’aire de pic de son étalon interne correspondant. Par exemple, C14:0 céramide, C16:0 céramide, céramide C18:1, etc., doivent être divisés par le C12:0 zone de pic standard interne du céramide.
11. Convertir la surface du pic en moles de lipides récupérées en multipliant la surface du pic normalisée (calculée à l’étape 6.10) par la quantité d’étalon interne, en picomoles, qui a été ajoutée à l’échantillon à l’étape 4.3. Dans ce protocole, cette quantité est de 250 pmol.
12. Pour obtenir la quantité relative de lipides dans chaque échantillon, diviser les picomoles de chaque longueur de chaîne lipidique par le poids tissulaire déterminé à l’étape 3.9. Cela donnera des unités de picomoles de lipides par mg de tissu.

Representative Results

Dans ce protocole, nous décrivons en détail une méthode pour éliminer la TCO des tissus humains cryoconservés et peser les tissus pour analyse par LC-ESI-MS/MS. Les matériaux requis pour cette procédure sont énumérés dans le tableau des matériaux. La figure 1 présente les résultats d’une expérience typique dans laquelle 10 tumeurs d’adénocarcinome pulmonaire humain et 10 tissus adjacents normaux ont été lavés pour éliminer l’OCT et analysés par LC-ESI-MS/MS. Il est important de noter que, comme nous l’avons déjà montré¹¹, il existe diverses espèces de céramides de longueur de chaîne (Figure 1A) et de monohexosyl-céramides (Figure 1B) qui sont significativement élevées dans les tumeurs d’adénocarcinome pulmonaire par rapport aux tissus adjacents normaux non impliqués.

Dans les expériences de contrôle visant à évaluer l’effet de la TCO sur les étapes d’extraction lipidique décrites à la section 4, 200 mg de foies de souris (C57BL6; mâles; âgés de 14 à 16 semaines) ont été remis en suspension dans 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate et homogénéisés jusqu’à trituration fine. La suspension hépatique fine résultante a ensuite été largement soniquée avec un sonicateur de sonde (trois tours de 1 min de sonication sur glace, 1 min de repos sur glace, 60% de puissance; microtip). À partir de cette solution, six répétitions d’homogénat hépatique de 300 μL ont été préparées. À trois répétitions, 200 mg de TCO ont été ajoutés (quantité moyenne trouvée dans les échantillons de dépôt biologique¹¹) et 200 μL d’eau ont été ajoutés aux trois autres. Les échantillons ont ensuite été traités en parallèle en suivant les étapes décrites à la section 4. Il est important de noter qu’après la centrifugation de la solution monophasée de Bligh-Dryer, les échantillons contenant de l’OCT étaient troubles, tandis que les échantillons témoins contenant de l’eau étaient clairs (figure 2A). La nébulosité dans la solution d’extraction lipidique monophasée a persisté même après une centrifugation accrue et une sonication étendue (non illustrée). Après évaporation du solvant, les échantillons contenant de l’OCT avaient de grosses pastilles (figure 2B), qui ne pouvaient pas être reconstituées en méthanol, même sous un tourbillon vigoureux et une sonication étendue. Les échantillons contenant de la TCO ont également montré une perte importante de signal pour les étalons internes de toutes les espèces analysées (figure 3A-G). Nous avons également montré précédemment que les échantillons contenant de l’OCT présentaient une perte de signal pour de nombreux sphingolipides analysés¹¹.

En règle générale, on s’attend à ce que les étalons de sphingolipides éluent séquentiellement, comme le montre la figure 4, dans l’ordre suivant : d17:1 sphingosine, d17:1 sphingosine-1-phosphate, C12:0 lactosyl-céramide, C12:0 monohexosyl-céramide, C12:0 sphingomyéline, et C12:0 céramide. Pour chacune de ces espèces de sphingolipides, en utilisant les paramètres de gradient et d’instrumentation décrits à la section 5 et précédemment 11, il y aura un décalage d’environ +^0,15 min dans le temps de rétention pour chaque augmentation de 2 carbones de la longueur de la chaîne. Par exemple, comme le montre la figure 5, le céramide C14:0 (figure 5B) éluera environ +0,15 min plus tard que le céramide C12:0 (figure 5A). Une double liaison dans l’acide gras entraîne souvent un décalage de -0,15 dans le temps de rétention, de sorte que le céramide C16:0 (Figure 5C) aura un temps de rétention similaire à celui du céramide C18:1 (Figure 5D). Cependant, les lipides de longueur de chaîne plus longue (c.-à-d. C24:0, C26:0) peuvent avoir des décalages de temps de rétention plus importants (Figure 5I, K, respectivement).

Figure 1 : Profils sphingolipides des adénocarcinomes pulmonaires et des tissus pulmonaires adjacents non impliqués. Les tissus ont été cryogéniquement stockés dans des OCT, décongelés, traités avec trois cycles sOCTrP, pesés et analysés par LC-ESI-MS / MS. Les niveaux sont en pmol par mg de tissu. Les espèces de céramification (A), de monohexosylcéramide (B), de sphingomyéline (C), de lactosylcéramide (D) et de sphingosine (E; Sph), sphingosine-1-phopshate (F; S1P), dihydro-Sph (E) et dihydro-S1P (F) ont été quantifiés. n = 10 tumeurs et n = 10 tissus adjacents non impliqués. Les diagrammes en boîte montrent des médianes (ligne noire) et des moustaches de min à max. ns, non significatives; , p≤0,005; , p ≤ 0,0005. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives des échantillons extraits avec et sans OCT. Les foies de souris ont été homogénéisés et soniqués, divisés en six échantillons identiques : 200 mg de TCO ont été ajoutés à trois échantillons et de l’eau aux trois autres. (A) Après l’addition de méthanol et de chloroforme pour obtenir un rapport de 2:1:0,1 méthanol:chloroforme:eau (v:v:v), incubation nocturne à 48 °C, suivie d’une centrifugation, les surnageants des échantillons contenant de la TCO étaient troubles et ne pouvaient pas être clarifiés par sonication, vortex ou centrifugation. (B) Après l’évaporation du solvant, une grosse pastille a été récupérée à partir d’échantillons contenant de l’OCT qui n’ont pas pu être entièrement reconstitués dans 0,5 mL de méthanol après une sonication et un vortex étendus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Quantification LC-ESI-MS/MS des étalons de sphingolipides en présence ou en l’absence de OCT. Les foies de souris ont été homogénéisés, soniqués et divisés en six échantillons identiques. À trois des six échantillons, 200 mg d’OCT ont été ajoutés, tandis qu’aux trois autres, de l’eau a été ajoutée. Après l’ajout d’étalons internes, de méthanol et de chloroforme, les échantillons ont été traités de manière identique et les lipides extraits ont été analysés par LC-ESI-MS/MS. On voit les paires de surveillance de réactions multiples (MRM) des lipides indiqués (A-F) et les zones de pics intégrées correspondantes (G). Abréviations : Sph, sphingosine; S1P, sphingosine-1-phosphate. Les flèches noires pointent vers la paire MRM correcte pour le sphingolipide indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Temps de rétention relatifs pour les paires de surveillance des réactions multiples LC-ESI-MS/MS d’étalons sphingolipides. Les foies de souris ont été homogénéisés et soniqués; étalons internes, ajout de méthanol et de chloroforme; et les lipides extraits et analysés par LC-ESI-MS/MS. Les temps de rétention de plusieurs paires de surveillance de réaction des lipides indiqués (A-F) sont indiqués. Notez l’ordre relatif dans lequel les lipides éluent pendant le gradient de chromatographie liquide. Abréviations : Sph, sphingosine; S1P, sphingosine-1-phosphate; SM, sphingomyéline. L’axe X représente le temps de rétention des paires MRM en minutes. L’axe des Y représente l’intensité du signal pour les paires MRM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Décalage dépendant de la longueur de la chaîne acyle dans le temps de rétention des paires LC-ESI-MS/MS MRM. Les foies de souris ont été homogénéisés et soniqués; étalons internes, ajout de méthanol et de chloroforme; et les lipides extraits et analysés par LC-ESI-MS/MS. Les temps de rétention et les paires MRM des lipides indiqués sont indiqués. Notez le décalage du temps de rétention avec l’augmentation de la longueur de la chaîne acyle pour divers lipides (A-K), ce qui correspond généralement à un temps de rétention de +0,15 min par augmentation de 2 carbones. Une double liaison entraînera un décalage de temps de rétention de -0,15 min (D, H, J). Cependant, pour les lipides à chaîne plus longue, l’augmentation relative du temps de rétention peut être plus longue (G-K). L’axe X représente le temps de rétention des paires MRM en minutes. L’axe des Y représente l’intensité du signal pour les paires MRM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Paires MRM, paramètres d’ionisation et énergies de collision pour l’analyse LC-ESI-MS/MS. DP, potentiel de dégroupage; CE, énergie de collision. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

L’OCT est un agent de cryoconservation à long terme couramment utilisé dans les dépôts biologiques. Cependant, la TCO peut entraîner la suppression des ions lorsque les tissus sont analysés par diverses plates-formes de spectrométrie de masse^12,13,14,15, ou entraîner une perte de signal lorsque les échantillons sont analysés par LC-ESI-MS/MS ¹¹. La TCO dans les tissus cryoconservés peut également interférer avec les méthodes de normalisation tissulaire telles que les tests de pesée et de quantification des protéines tels que Bradford et BCA¹¹. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour éliminer l’OCT des tissus humains et ensuite être analysé par spectrométrie de masse. Le protocole peut être modifié pour utiliser d’autres sources tissulaires qui ne sont pas pulmonaires, ou à partir de tissus de souris comme nous l’avons décrit^{précédemment 11}. En outre, d’autres stratégies de normalisation des données de spectrométrie de masse peuvent être utilisées, y compris celles que nous avons décrites précédemment¹¹, ainsi que d’autres méthodes validées.

Une limitation importante de ce protocole est qu’il n’est pas adéquat pour l’analyse des tissus qui ont été préalablement fixés avec du formaldéhyde ou un autre agent fixateur. Il n’est adéquat que pour les tissus qui n’ont pas été fixés et qui ont été cryoconservés en OCT. De plus, cette méthode n’est pas adéquate pour le traitement des tissus pesant moins de 1 à 2 mg, car il y a toujours une perte de tissu pendant les étapes de sOCTrP et les transferts entre les tubes. Il sera difficile de peser de tels petits tissus à l’aide d’une échelle analytique standard, et tout PBS restant non enlevé pendant la phase de mèche contribuera grandement à l’erreur expérimentale. Vous trouverez ci-dessous d’autres considérations importantes lors du lavage des mouchoirs pour éliminer la TCO avec cette méthode.

Afin d’assurer la bonne exécution de ce protocole, en particulier si de nombreux échantillons seront traités, les étapes décrites à la section 1 doivent être effectuées à l’avance, y compris le préétiquetage et la prépesée des tubes de 1,5 mL, le prémarquage des tubes et des bouchons à vis de 13 x 100 mm, des tubes de culture de 13 x 100 mm et des flacons d’auto-injecteurs, la préparation de toutes les mèches, le préraccourcissement des embouts de pipette de 1 mL, et des solutions de lavage pré-refroidissage. Cela évitera que des procédures fastidieuses soient effectuées le jour où les tissus seront lavés, ce qui peut entraîner des retards. En général, nous constatons que si bon nombre de ces étapes sont effectuées la veille, un chercheur expérimenté peut laver 30 à 40 échantillons au cours d’une journée de travail normale. Cependant, étant donné que le premier point d’arrêt suggéré est après que tous les tissus ont été lavés, pesés, placés dans du méthanol et stockés à -80 ° C, ne pas effectuer de prépesée et d’étiquetage de 1,5 ml à l’avance aura une incidence sur l’efficacité et prolongera le temps nécessaire pour laver 30 à 40 tissus.

Le pesage des tissus est l’une des étapes les plus importantes, car les erreurs ou la négligence auront un impact sur la qualité des données car elles se répercuteront sur la normalisation des données. Il est essentiel que la balance analytique utilisée pour le pesage soit étalonnée, correctement mise à zéro et tarée. Par conséquent, lors de l’utilisation de mèches, il est important d’enlever autant de solution de lavage que possible, en particulier pour les tissus pesant moins de 5 mg. À ces poids de tissus, les restes de solution de lavage rendront le pesage imprécis d’un pourcentage élevé et se répercuteront comme une erreur dans la normalisation des données. Lors du retrait de la solution de lavage, nous constatons que les tissus peuvent être doucement touchés avec la mèche pendant plusieurs secondes pour éliminer autant de solution de lavage que possible sans entraîner de pertes importantes de tissu par adhérence à la mèche. Cependant, chaque type de tissu lavé doit être testé pour l’adhérence aux mèches, et ces étapes du protocole ajustées en conséquence.

Pour faciliter le flux de travail de lavage des tissus, il est recommandé de demander des copeaux de tissu à partir du biodépôt dans des tubes en polypropylène de 15 mL. Cela réduira la manipulation des mouchoirs avant le lavage.

Lors du lavage des tissus, si un matériau semblable à un gel est observé au fond d’un tube après le troisième cycle sOCTrP, cela indique que tous les OCT n’ont pas été enlevés et que d’autres cycles sOCTrP sont nécessaires. Gardez une trace du nombre de cycles nécessaires et, pour plus de cohérence, effectuez le même nombre de cycles sOCTrP dans tous les échantillons de l’ensemble de données. Nous avons déjà évalué jusqu’à 9 cycles de sOCTrP et n’avons trouvé aucun effet sur la déplétion des sphingolipides dans les tissus¹¹.

Lorsque vous utilisez des mèches pour enlever la solution de lavage, tamponnez doucement le mouchoir en papier pour vous assurer que toute la solution de lavage est éliminée. Cela augmente la précision de l’estimation du poids des tissus. Cependant, il faut faire très attention aux très petits tissus car ils peuvent coller à la mèche et entraîner la perte de l’échantillon. Il est utile d’utiliser plusieurs mèches pour le même tube afin d’éliminer autant de solution que possible. Pour éviter la contamination croisée des échantillons, utilisez toujours une mèche neuve et propre pour chaque échantillon. Lors de la fabrication de mèches, utilisez des tissus de qualité laboratoire (voir le tableau des matériaux), car nous les avons déjà testés et avons constaté qu’ils contenaient une quantité négligeable de sphingolipides contaminants¹¹. Les mèches d’autres matériaux peuvent être utilisées si elles sont testées comme décrit¹¹.

Lors de la récupération d’échantillons dans des tubes de 1,5 mL après pesée, il est essentiel que tous les tissus soient récupérés. Ne pas le faire entraînera des erreurs dans la normalisation des données. Si plus de PBS est nécessaire pour récupérer tout le tissu, ajouter la quantité équivalente de PBS utilisée à tous les autres tubes pour éviter les différences d’efficacité d’extraction qui pourraient résulter d’échantillons contenant différentes quantités de PBS. Ajuster les volumes de chloroforme et de méthanol pour tenir compte de toute augmentation du volume d’eau afin de maintenir un rapport méthanol:chloroforme:eau de 2:1:0,1.

Lors de la décongélation des spécimens, il est important que cette étape soit effectuée sur la glace pour éviter la dégradation des lipides labiles tels que la sphingosine-1-phosphate. La décongélation complète des échantillons jusqu’à ce que l’OCT soit à l’état liquide facilitera également son élimination, car il sera plus facilement dissous dans la solution de lavage à froid plutôt que de rester sous forme de granulés pendant les premières étapes de lavage.

Parfois, en particulier lors du lavage des tissus pulmonaires, il y aura des fragments qui ne granuleront pas et flotteront sur la solution de lavage après la centrifugation. Avec soin, l’immersion de l’embout d’aspiration sous les mouchoirs flottants pour éliminer la solution de lavage peut prévenir la perte pendant l’aspiration.

N’ajoutez pas de chloroforme aux échantillons avant l’homogénéisation, car les embouts d’homogénéisateur jetables sont en plastique et se dissolvent dans des solutions contenant du chloroforme. Cela peut avoir un impact significatif sur la quantification LC-MS/MS des lipides dans les échantillons. Par conséquent, en général, l’utilisation de plastiques qui ne sont pas résistants aux solvants devrait être évitée lors de la distribution de chloroforme et de méthanol. Ces solvants sont également toxiques et doivent être manipulés dans une hotte appropriée. Porter l’EPI approprié lorsque vous manipulez des solvants tels que le méthanol et le chloroforme.

Les tissus humains doivent être traités dans une enceinte de biosécurité appropriée (p. ex. classe II). Les utilisateurs doivent être formés à la manipulation des matières et des fluides biologiques dangereux d’origine humaine et suivre les protocoles de sécurité tels que le port d’un équipement de protection individuelle approprié et la décontamination de toute surface ou équipement qui entre en contact avec des échantillons. Les utilisateurs doivent désinfecter soigneusement (voir le tableau des matériaux pour le décontaminant suggéré) toute surface ou équipement (centrifugeuses, supports et adaptateurs de centrifugeuses, pipettes, vortexers, surfaces de hotte aspirante, balances, verrerie, bacs à glace, claviers d’ordinateur, souris d’ordinateur, etc.) utilisé pendant la procédure de lavage. Les membres du laboratoire ne doivent pas utiliser l’équipement ou les cagoules utilisés pour le lavage des tissus avant d’avoir été soigneusement désinfectés. Évitez l’utilisation d’eau de Javel sur les surfaces en acier et les appareils électroniques.

Lors du traitement de nombreux échantillons, soyez prudent pour éviter la contamination croisée en utilisant des bouchons propres lors des étapes de rebouchage pendant les étapes d’extraction des lipides. Les bouchons peuvent également être réutilisés s’ils sont étiquetés. Cependant, dans la pratique, nous constatons que les marqueurs se démarquent mal sur les bouchons noirs et que les étiquettes adhésives tombent des tubes pendant l’incubation nocturne à 48 °C.

Les sphingolipides jouent un rôle important dans l’étiologie des maladies et des cancers humains. Par conséquent, il y a un grand intérêt à définir précisément les altérations du métabolisme des sphingolipides dans ces maladies, car elles peuvent révéler des cibles thérapeutiques. Cependant, de nombreux tissus facilement accessibles aux chercheurs sont cryoconservés dans un OCT, ce qui n’est pas compatible avec l’analyse par spectrométrie de masse. Ainsi, le protocole détaillé décrit ici élargira le répertoire de tissus adéquats pour l’analyse sphingolilipidomique quantitative, et contribuera ainsi à accroître notre compréhension de la biologie des altérations du métabolisme des lipides dans les maladies humaines et le cancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	581300-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400