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Cancer Research

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक में एम्बेडेड मानव ऊतकों की तैयारी

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62552
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

Summary

स्फिंगोलिपिड्स मानव रोग में अच्छी तरह से स्थापित भूमिकाओं के साथ बायोएक्टिव मेटाबोलाइट्स हैं। मास-स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ ऊतकों में परिवर्तन की विशेषता रोग एटियलजि में भूमिकाओं को प्रकट कर सकती है या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर सकती है। हालांकि, बायोरिपॉजिटरी में क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए उपयोग किया जाने वाला ओसीटी-यौगिक मास-स्पेक्ट्रोमेट्री में हस्तक्षेप करता है। हम एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस के साथ ओसीटी में एम्बेडेड मानव ऊतकों में स्फिंगोलिपिड्स का विश्लेषण करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करते हैं।

Abstract

स्फिंगोलिपिड्स सेलुलर घटक हैं जिनकी मानव चयापचय और बीमारी में अच्छी तरह से स्थापित भूमिकाएं हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या किसी बीमारी में स्फिंगोलिपिड्स बदल जाते हैं और जांच करते हैं कि क्या स्फिंगोलिपिड्स को चिकित्सकीय रूप से लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, सर्जिकल सूट से सीधे ऊतकों को प्राप्त करने वाले उचित रूप से संचालित भावी अध्ययन समय लेने वाले हो सकते हैं, और तकनीकी रूप से, तार्किक और प्रशासनिक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। इसके विपरीत, पूर्वव्यापी अध्ययन पहले से ही उपलब्ध क्रायोप्रिजर्व्ड मानव नमूनों का लाभ उठा सकते हैं, आमतौर पर बड़ी संख्या में, ऊतक बायोरिपॉजिटरी में। बायोरिपॉजिटरी से ऊतकों की खरीद के अन्य फायदों में ऊतक के नमूनों से जुड़ी जानकारी तक पहुंच शामिल है जिसमें हिस्टोलॉजी, पैथोलॉजी और कुछ उदाहरणों में क्लिनिकोपैथोलॉजिकल चर शामिल हैं, जिनमें से सभी का उपयोग लिपिडोमिक्स डेटा के साथ सहसंबंधों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में उपयोग किए जाने वाले इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) की असंगति से संबंधित तकनीकी सीमाएं लिपिड के विश्लेषण के लिए एक तकनीकी बाधा है। हालांकि, हमने पहले दिखाया है कि ओसीटी को मानव बायोरिपोजिटरी नमूनों से उनकी स्फिंगोलिपिड सामग्री को बदले बिना धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन के चक्रों के माध्यम से आसानी से हटाया जा सकता है। हमने पहले यह भी स्थापित किया है कि ओसीटी में क्रायोप्रिजर्व किए गए मानव ऊतकों में स्फिंगोलिपिड्स 16 साल तक स्थिर हैं। इस रिपोर्ट में, हम मानव ऊतक नमूनों में स्फिंगोलिपिड्स का विश्लेषण करने के लिए चरणों और वर्कफ़्लो को रेखांकित करते हैं जो ओसीटी में एम्बेडेड हैं, जिसमें ऊतकों को धोना, डेटा सामान्यीकरण के लिए ऊतकों का वजन करना, लिपिड का निष्कर्षण, तरल क्रोमैटोग्राफी इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस), मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एकीकरण, डेटा सामान्यीकरण और डेटा विश्लेषण द्वारा विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करना शामिल है।

Introduction

स्फिंगोलिपिड्स बायोएक्टिव मेटाबोलाइट्स हैं जो मानव चयापचय और रोग 1,2 में उनकी भूमिकाओं के लिए जाने जाते हैं। वे जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे सेल माइग्रेशन, सेल अस्तित्व और मृत्यु, सेल आंदोलन, वेसिकुलर ट्रैफिकिंग, सेलुलर आक्रमण और मेटास्टेसिस, एंजियोजेनेसिस और साइटोकिन्सके उत्पादन को नियंत्रित करते हैं 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . स्फिंगोलिपिड चयापचय के विनियमन में दोष कैंसर की शुरुआत और प्रगति में योगदान करते हैं, यह निर्धारित करते हैं कि आक्रामक कैंसर कितने आक्रामक हैं, और कैंसर चिकित्सा के प्रतिरोध का जवाब कैसेदेते हैं और विकसित करते हैं 3,10. इसलिए, रोग के एटियलजि पर इन व्यापक प्रभावों के कारण, विश्लेषणात्मक तरीके जो रोग-विशिष्ट स्फिंगोलिपिड परिवर्तनों को ठीक से स्थापित कर सकते हैं, महत्वपूर्ण उपकरण हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) स्फिंगोलिपिड परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए सबसे सटीक और विश्वसनीय तरीका है।

मानव नमूने जिनका उपयोग स्फिंगोलिपिड परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, उन्हें सर्जिकल सूट से या पूर्वव्यापी रूप से ऊतक बायोरिपॉजिटरी से प्राप्त किया जा सकता है। सर्जरी से ताजा ऊतक फायदेमंद होते हैं क्योंकि उन्हें सीधे एमएस या अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, भावी प्रभाव से ऊतकों को प्राप्त करने में प्रशासनिक, तकनीकी और तार्किक बाधाएं हैं, और सांख्यिकीय शक्ति तक पहुंचने के लिए पर्याप्त नमूने एकत्र करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। बायोरिपॉजिटरी से ऊतकों को प्राप्त करना फायदेमंद है क्योंकि उन्हें पूर्वव्यापी रूप से, बड़ी संख्या में अधिग्रहित किया जा सकता है, और बायोरिपॉजिटरी हिस्टोलॉजी और पैथोलॉजी की पुष्टि करते हैं, क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित और संग्रहीत ऊतकों के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं का उपयोग करते हैं, और क्लिनिकोपैथोलॉजिकल डेटा प्रदान कर सकते हैं जिसका उपयोग सहसंबंध विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। हालांकि, आणविक और संरचनात्मक विशेषताओं को संरक्षित करने के लिए, बायोरिपॉजिटरी इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में उन्हें एम्बेड करके ऊतकों को क्रायोप्रिजर्व कर सकते हैं, जिसे हमने दिखाया है कि डेटा सामान्यीकरण परख और तरल क्रोमैटोग्राफी इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस) 11 द्वारा स्फिंगोलिपिड्स की मात्रा का ठहराव में हस्तक्षेप करता है। . यह भी दिखाया गया है कि ओसीटी यौगिक में प्राथमिक घटक पॉलीविनाइल अल्कोहल और पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल, अन्य एमएस विश्लेषण प्लेटफार्मों12,13,14,15 में आयन दमन का परिणाम है। इसलिए, एमएस द्वारा स्फिंगोलिपिडोमिक विश्लेषण से पहले ओसीटी यौगिक को ऊतकों से हटा दिया जाना चाहिए।

पिछली रिपोर्ट में, हमने एलसी-ईएसआई-एमएस /एमएस विश्लेषण 11 के लिए मानव नमूनों से ओसीटी यौगिक को हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल औरडेटा सामान्यीकरण 11 के लिए ऊतकों को तौलने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को मान्य किया है। यहां, हम स्फिंगोलिपिडोमिक ओसीटी यौगिक-निष्कासन प्रोटोकॉल (एसओसीटीआरपी) के चरणों का विस्तार करते हैं और मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा ट्यूमर और सामान्य आसन्न असंबद्ध ऊतकों से प्रतिनिधि डेटा दिखाते हैं।

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Protocol

मानव फेफड़ों के ऊतकों को वर्जीनिया कॉमनवेल्थ यूनिवर्सिटी (वीसीयू) ऊतक और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कोर से आंतरिक समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदित प्रोटोकॉल (#HM2471) के तहत प्राप्त किया गया था। चूहों के ऊतकों के अनुसंधान और कटाई के लिए चूहों के उपयोग को वीसीयू संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सामग्री की तैयारी

नोट: इन चरणों को ऊतक धोने से एक दिन पहले किया जाना चाहिए।

  1. प्रत्येक नमूने के लिए संक्षिप्त लेकिन स्पष्ट पहचानकर्ता कोड के साथ 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को प्री-लेबल और वजन करें जिन्हें अगले दिन संसाधित किया जाएगा। रासायनिक रूप से प्रतिरोधी स्थायी मार्कर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) जो बार-बार ट्यूब हैंडलिंग के तहत फीका नहीं पड़ेगा।
  2. एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट खोलें और निम्नलिखित कॉलम हेडर के साथ लगातार कॉलम लेबल करें: ट्यूब पहचानकर्ता (आईडी), अकेले ट्यूब, ट्यूब डब्ल्यू / ऊतक, और कुल ऊतक। ट्यूब पहचानकर्ता दर्ज करें जिन्हें कॉलम लेबल ट्यूब आईडी में संसाधित किया जाएगा।
  3. पूर्व-कैलिब्रेट और शून्य एक विश्लेषणात्मक पैमाना है। बैलेंस प्लेट के केंद्र में एक साफ 10 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क रखें (फ्लास्क ट्यूब धारक के रूप में कार्य करेगा)। वजन कक्ष के दरवाजे को बंद करें और फ्लास्क के साथ पैमाने को बिछाएं।
  4. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का वजन। फ्लास्क में ट्यूब को सावधानी से रखें और वजन कक्ष के दरवाजे को बंद करें। वजन को स्थिर करने और अकेले लेबल ट्यूब लेबल वाले कॉलम में वजन रिकॉर्ड करने की अनुमति दें।
    नोट: ट्यूबों का वजन करते समय 10 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क को स्थानांतरित करने से बचें। यदि फ्लास्क को स्थानांतरित किया जाता है, तो फ्लास्क को फिर से केंद्रित करें और संतुलन को फिर से व्यवस्थित करें। बंद ट्यूबों को एक रैक में रखें और आवश्यकता होने तक स्टोर करें।
  5. पहचानकर्ता कोड के साथ 13 x 100 मिमी स्क्रू-टॉप ग्लास ट्यूब और कैप को प्री-लेबल करें और उन्हें एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल के 2 एमएल से भरें। उन्हें ट्यूब रैक में रखें, ट्यूबों को कैप करें, और उपयोग होने तक उन्हें रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें।
    नोट: बोतल शीर्ष विलायक डिस्पेंसर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि कोई उपलब्ध नहीं है, तो कार्बनिक सॉल्वैंट्स वितरित करते समय प्लास्टिक के उपयोग से बचने के लिए ग्लास पिपेट का उपयोग करें।
  6. प्री-लेबल 13 x 100 मिमी ग्लास टेस्ट-ट्यूब। कमरे के तापमान पर टेस्ट ट्यूबों को कवर और स्टोर करें।
  7. पहचानकर्ता कोड के साथ ऑटोइंजेक्टर शीशियों को प्री-लेबल करें। उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर ऑटोइंजेक्टर शीशियों को कवर और स्टोर करें।
  8. ऊतक सुखाने वाली बाती तैयार करें।
    1. सर्जिकल कैंची को 5 मिनट के लिए एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल में डुबोकर साफ करके शुरू करें, और फिर उन्हें एक साफ प्रयोगशाला ग्रेड ऊतक के साथ पोंछ दें।
    2. पाउडर मुक्त दस्ताने का उपयोग करके, एक प्रयोगशाला ग्रेड ऊतक के अंत को घुमाएं ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि बारीक पतला 30-40 मिमी बाती न बन जाए।
    3. मेथनॉल से साफ की गई कैंची का उपयोग करके, बाती को मोटे सिरे पर काट लें। एक साफ कारबोर्ड बॉक्स में बाती रखें। सभी नमूनों को संसाधित करने के लिए आवश्यक बाती की संख्या दोगुनी करें।
  9. छोटी 1 एमएल पिपेट युक्तियां तैयार करें। मेथनॉल-साफ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, 1 एमएल पिपेट टिप की नोक से 4-5 मिमी काट लें, और टिप को टिप होल्डर में वापस रखें। संसाधित किए जाने वाले नमूनों की तुलना में दोगुनी युक्तियां तैयार करें।
    नोट: इनका उपयोग ट्यूबों से धोए गए ऊतकों की पुनर्प्राप्ति में किया जाएगा। टिप के अंत को न छुएं।
  10. प्री-चिल आणविक जीव विज्ञान ग्रेड फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से 4 डिग्री सेल्सियस (0.5 एल पर्याप्त है)। इसका उपयोग नमूने प्राप्त करने के लिए किया जाएगा। संसाधित किए जाने वाले प्रत्येक नमूने के लिए, प्री-चिल (4 डिग्री सेल्सियस) 60 एमएल अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी।
  11. मास स्पेक्ट्रोमेट्री आंतरिक मानकों को तैयार करें। इथेनॉल में निम्नलिखित लिपिड को भंग करें: मेथनॉल: पानी (7: 2: 1; वी / वी / वी) 25 एनएमओएल / एमएल की एकाग्रता पर: डी 17: 1-स्फिंगोसिन, (2 एस, 3 आर, 4 ई) -2-एमिनोहेप्टाडेक-4-एने-1,3-डायोल; डी 17: 1-स्फिंगोसिन-1-फॉस्फेट, हेप्टाडेकैस्फेफिंग-4-एनिन-1-फॉस्फेट; C12-Ceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine; सी 12-स्फिंगोमाइलिन (डी 18: 1 / सी 12: 0), एन -(डोडेकैनोयल)-स्फिंग-4-एनिन-1-फॉस्फोकोलाइन; सी 12-ग्लूकोसिलसेरामाइड (डी 18: 1 / सी 12: 0), एन -(डोडेकैनोयल) -1-β-ग्लूकोसिल-स्फिंग-4-ईन; सी 12-लैक्टोसिलसेरामाइड (डी 18: 1 / सी 12: 0), एन -(डोडेकैनोयल) -1-बी-लैक्टोसिल-स्फिंग-4-एन।

2. ऊतक धोना

नोट: एक दिन पहले अनुभाग 1 में सभी चरणों को पूरा करने से एक कुशल शोधकर्ता को प्रति दिन 40 नमूने तक संसाधित करने की अनुमति मिलती है, और नौसिखिए ~ 10-15 नमूने प्रति दिन। सुबह जल्दी शुरू करें और तब तक न रुकें जब तक कि अनुभाग 2.1-3.8 में सभी चरण पूरे न हो जाएं।

  1. जिस दिन ऊतकों को संसाधित किया जाएगा, उस दिन बायोसेफ्टी कैबिनेट कार्य क्षेत्र को एक भंवर, एक पूरी तरह से चार्ज सीरोलॉजिकल पाइपेटर और एक आइस ट्रे से लैस करके तैयार करें। इस खंड के सभी चरणों के लिए, उचित पीपीई पहनें, जिसमें एक लैब कोट, दस्ताने की दोहरी परत और सुरक्षात्मक चश्मा शामिल हैं। चेतावनी: मानव ऊतकों और तरल पदार्थों को जैव-खतरनाक सामग्री के रूप में माना और माना जाना चाहिए।
  2. प्री-चिल (4 डिग्री सेल्सियस) एक स्विंगिंग बकेट सेंट्रीफ्यूज, 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को रखने के लिए आवश्यक किसी भी एडाप्टर, और सेंट्रीफ्यूज बायोकन्टेनमेंट ढक्कन। प्री-चिल (4 डिग्री सेल्सियस) एक निश्चित कोण सेंट्रीफ्यूज जो 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को पकड़ने में सक्षम है।
  3. यदि ऊतकों को 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में नहीं जोड़ा जाता है, तो उन्हें पूर्व-लेबल 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए मेथनॉल क्लीन्ड स्पैटुला (प्रत्येक नए ऊतक नमूने के लिए साफ) का उपयोग करें। 15 एमएल कैप को भी लेबल करें।
    1. एक बर्फ ट्रे में 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को पकड़ने में सक्षम एक ट्यूब रैक रखें और ट्रे को बर्फ से भरें। ऊतकों को पिघलाएं जो उस दिन बर्फ पर रैक में रखकर संसाधित किए जाएंगे।
      नोट: प्रसंस्करण के लिए बायोरिपॉजिटरी से न्यूनतम 3-4 मिलीग्राम ऊतक का अनुरोध किया जाना चाहिए क्योंकि यह पहले दिखाया गया है कि ऊतक धोने और वजन प्रोटोकॉल इन वजन11 पर सटीक और विश्वसनीय हैं।
  4. नमूने के साथ आइस ट्रे को जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं।
  5. तीन sOCTrP चक्र11 निष्पादित करें जैसा कि नीचे चर्चा की गई है (यानी, चरण 2.5.1-2.5.5 तीन बार निष्पादित करें)।
    1. प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएल बर्फ-ठंडा अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी जोड़ें और उन्हें कसकर कैप करें। ट्यूबों को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने दें।
    2. 10-20 सेकंड के लिए प्रत्येक ट्यूब को सख्ती से भंवर या जब तक ट्यूब की दीवारों पर जमा सभी ऊतक, या एक ऊतक गोली, पूरी तरह से पुन: निलंबित नहीं हो जाती है।
      नोट: एसओसीटीआरपी चक्र 2-3 में, यह महत्वपूर्ण है कि गोली को फिर से निलंबित किया जाए ताकि गोली में कोई भी ओसीटी वॉश समाधान में पतला हो जाए।
    3. ट्यूबों को पूर्व-ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) झूलने वाली बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4,000-5,000 x g पर।
      नोट: सेंट्रीफ्यूज वाहक को बायोकन्टेनमेंट ढक्कन के साथ सील करके सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान उत्पन्न बायोहाजार्डस एरोसोल के उत्पादन और संपर्क से बचें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. सेंट्रीफ्यूज से नमूने प्राप्त करें और बर्फ ट्रे में स्थानांतरित करें। ट्रे को बायोसेफ्टी कैबिनेट में रखें और ट्यूबों को अनकैप करें। टोपी को सहेजें।
    5. सावधानी से धोने के घोल को तैयार करें। ट्यूब में सतह पर तैरने वाले के ~ 0.5 एमएल को छोड़कर गोली में ऊतक सामग्री को उत्तेजित करने से बचें। ट्यूबों को कैप करें और ट्यूबों के साथ लेबल कैप्स का मिलान करके क्रॉस-संदूषण से बचें।
      नोट: चरण 2.5.5 में वॉश सॉल्यूशन (सुपरनैटेंट) एक बायोहाजार्डस सामग्री है; मानव मूल के नमूनों के लिए उपयुक्त जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करते हुए इसे संभालना और निपटान करना।

3. ऊतक वजन (डेटा सामान्यीकरण के लिए)

  1. अंतिम एसओसीटीआरपी धोने के चक्र के बाद, अधिकांश धोने के घोल को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें लेकिन गोली को परेशान करने से बचें। ट्यूब में धोने के घोल के ~ 0.5 एमएल छोड़ दें।
  2. छोटे पिपेट युक्तियों (चरण 1.9 में तैयार) का उपयोग करके, बर्फ-ठंडा पीबीएस के 500 μL लें और इसे ट्यूब में जोड़ें।
    1. एक ही टिप का उपयोग करके, धीरे से गोली को फिर से निलंबित करें और सभी ऊतकों को पुनः प्राप्त करें। ट्यूब और पिपेट टिप दीवारों के पालन से ऊतक हानि को कम करने के लिए अशांत पिपेटिंग से बचें।
  3. पुन: निलंबित ऊतक को इसके संबंधित पूर्व-लेबल और पूर्व-वजन वाले 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और ट्यूब को बर्फ पर रखें। डेटा सेट में सभी ऊतकों के लिए दोहराएं।
  4. 1.5 एमएल ट्यूबों को प्री-चिल्ड सेंट्रीफ्यूज में रखें और 5-7 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 7,000 x g पर ऊतकों को पेलेट करें।
    1. ट्यूबों को पुनः प्राप्त करें और गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना पीबीएस को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें।
  5. ऊतकों को अच्छी तरह से पेलेट करने के लिए 7,000 x g पर अतिरिक्त 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब। ट्यूबों को बर्फ में स्थानांतरित करें।
    नोट: अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन चरण सभी धोने के समाधान और बाती को हटाते समय ऊतक हानि को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि पांच से अधिक नमूने संसाधित होते हैं, तो प्रत्येक पांचवें नमूने को संसाधित करने के बाद 3 मिनट, 7,000 x g सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को दोहराएं ताकि ऊतकों को पेलेट किया जा सके।
  6. चरण 1.8 में तैयार की गई बाती का उपयोग करके, किसी भी शेष धोने के घोल को धीरे से हटा दें। प्रत्येक नमूने के लिए एक साफ बाती का उपयोग करें। बाती के साथ ऊतक को धीरे से दबाना स्वीकार्य है, जो अधिकांश धोने के घोल को हटाने में मदद करेगा लेकिन बाती के पालन से किसी भी ऊतक को खोने से बचाएगा। ट्यूब को बंद करें और इसे बर्फ पर रखें।
  7. हाल ही में कैलिब्रेटेड, टार्ड और शून्य विश्लेषणात्मक संतुलन में प्रत्येक ट्यूब का वजन करें।
    1. ग्लास एर्लेनमेयर फ्लास्क में प्रत्येक ट्यूब रखें और कक्ष का दरवाजा बंद करें। जब वजन स्थिर हो जाता है, तो इसे इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट कॉलम में रिकॉर्ड करें जिसे ट्यूब डब्ल्यू / ऊतक लेबल किया गया है।
    2. वजन करने के बाद, ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें।
  8. बर्फ-ठंडा पीबीएस के 300 μL जोड़ें। एक छोटे पिपेट टिप (चरण 1.9) का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक सभी ऊतकों को पुनः प्राप्त करें और पूर्व-लेबल स्क्रू-टॉप ग्लास ट्यूब (चरण 1.5 में तैयार) में जमा करें जिसमें 2 एमएल बर्फ-ठंडा एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल (ऊतक को मेथनॉल में जोड़ें, ट्यूब के किनारे पर नहीं)।
  9. ऊतक की मात्रा की गणना करें जिसे ट्यूब डब्ल्यू / ऊतक मूल्य से अकेले ट्यूब को घटाकर धोया गया था। कुल ऊतक स्तंभ में इस संख्या को रिकॉर्ड करें। चरण 6.12 में मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा को सामान्य करने के लिए कुल ऊतक मूल्य का उपयोग किया जाएगा।
  10. चरण 4.1-4.15 करने के लिए तैयार होने तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यह एक अच्छा स्टॉपिंग पॉइंट है, और नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर कुछ हफ्तों के लिए सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है। अन्य ऊतक सामान्यीकरण विधियों के लिए, जैसे प्रोटीन एकाग्रता या लिपिड फॉस्फेट सामग्री, रोहरबैक एट अल.11 को देखें।

4. लिपिड निष्कर्षण

नोट: इन चरणों को सुबह में शुरू करना महत्वपूर्ण है, खासकर जब कई नमूने संसाधित किए जाएंगे। शुरू करने से पहले, पानी के स्नान या इनक्यूबेटर को 48 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।

  1. चरण 3.8 में तैयार किए गए नमूने और एमएस लिपिड मानकों (चरण 1.11 में तैयार) को फ्रीजर से पुनः प्राप्त करें। उन्हें 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान के बराबर होने दें।
  2. भंवर और आंतरिक मानक समाधान को अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में 2-3 मिनट के लिए डुबोएं ( सामग्री की तालिका देखें) या जब तक एमएस लिपिड मानक पूरी तरह से नमूने में वितरण से पहले भंग नहीं हो जाते। यह डेटा सामान्यीकरण में त्रुटियों से बच जाएगा।
  3. दोहराए जाने वाले पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब में आंतरिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मानकों के 250 pmol (चरण 1.11 में तैयार 25 nmol / mL समाधान से 10 μL) जोड़ें। ट्यूबों को हल्के से फिर से कैप करें।
  4. होमोजेनाइजेशन की सुविधा के लिए, मेथनॉल वॉल्यूम को 2 एमएल में समायोजित करें। केवल एलसी-एमएस / एमएस ग्रेड मेथनॉल का उपयोग करें।
  5. एक समय में एक ट्यूब पर काम करते हुए, ऊतक को ट्राइट्यूरेट करने के लिए एक होमोजेनाइज़र का उपयोग करें जब तक कि कोई झुरमुट दिखाई न दे (आमतौर पर 5-20 सेकंड)। होमोजेनाइज़र टिप को एक गोलाकार गति में ले जाएं और धीरे से ट्यूब की दीवार के खिलाफ दबाएं ताकि ट्राइट्यूरेशन में सहायता मिल सके। ट्यूब को फिर से कैप करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करना कि सभी ऊतक बारीक रूप से ट्राइट्यूरेटेड हैं, लिपिड निष्कर्षण को अधिकतम करेगा। होमोजेनाइजेशन से पहले नमूनों में क्लोरोफॉर्म न जोड़ें क्योंकि डिस्पोजेबल होमोजिनाइज़र टिप्स प्लास्टिक से बने होते हैं जो क्लोरोफॉर्म युक्त समाधानों में घुल जाएंगे।
  6. ट्यूब को अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में 45 ° कोण पर 5-10 सेकंड के लिए डुबोएं।
    1. यदि अल्ट्रासोनिक स्नान में डूबने पर कोई ऊतक झुरमुट नहीं बनता है, तो इसे कैप करें, और अगली ट्यूब पर जाएं।
    2. यदि अल्ट्रासोनिक स्नान में ट्यूब डूबने पर ऊतक झुरमुट बनते हैं, तो फिर से समरूप करें, और झुरमुट को लक्षित करें।
    3. इस प्रक्रिया को दोहराएं (अल्ट्रासोनिक स्नान में होमोजेनाइजेशन / विसर्जन) जब तक कि सभी बड़े ऊतक झुरमुट टूट न जाएं।
  7. एक फ्यूम-हुड में, 2: 1: 0.1 मेथनॉल: क्लोरोफॉर्म: पानी के अनुपात को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में एलसी-एमएस ग्रेड क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल जोड़ें (बोतल टॉप डिस्पेंसर का उपयोग करें)। साफ कैप का उपयोग करके, ट्यूबों को कसकर सील करें और दिन के अंत तक बेंचटॉप पर छोड़ दें।
    1. 50 मिलीग्राम या उससे कम वजन वाले ऊतकों के लिए, 4 एमएल की कुल निष्कर्षण मात्रा का उपयोग करें, और बड़े नमूनों के लिए इस अनुपात (50 मिलीग्राम: 4 एमएल निष्कर्षण समाधान) का उपयोग करके समायोजित करें।
  8. उस शाम को छोड़ने से पहले, कसकर ढके हुए ट्यूबों को 48 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें रात भर सेने दें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूबों को कसकर कवर किया जाए ताकि वाष्पीकरण के कारण विलायक अनुपात न बदलें।
  9. अगली सुबह, 48 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से नमूने प्राप्त करें और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000-5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा किसी भी विलायक-अघुलनशील मलबे को गोली मार दें।
  10. एक फ्यूम-हुड में काम करते हुए, सुपरनैटेंट को पूर्व-लेबल 13 x 100 मिमी बोरोसिलिकेट ग्लास टेस्ट-ट्यूब में सावधानीपूर्वक डिकोड करें। डिकैंटिंग की सुविधा के लिए 13 x 100 मिमी ट्यूब को 30-45 ° कोण पर झुकाएं।
    नोट: यदि 12 से अधिक नमूने संसाधित होते हैं, तो सेंट्रीफ्यूज्ड ट्यूबों को विस्तारित अवधि के लिए बैठने की अनुमति न दें क्योंकि चरण 4.10 करते समय छर्रों को नरम कर दिया जाएगा और अघुलनशील मलबे को स्थानांतरित किया जाएगा। इससे बचने के लिए, एक समय में सेंट्रीफ्यूज से केवल 12 ट्यूब लें और अन्य ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करना जारी रखें जब तक कि आप उन्हें डिकैंट करने के लिए तैयार न हों।
  11. ट्यूबों को वैक्यूम कंसंट्रेटर में स्थानांतरित करें जो 13 x 100 मिमी ट्यूबों को रखने में सक्षम है। प्रारंभिक 1 घंटे हीटिंग चरण (40 डिग्री सेल्सियस) के साथ सभी विलायक को वाष्पित करें और अधिकतम वैक्यूम के तहत चलाएं।
  12. वैक्यूम कंसंट्रेटर से ट्यूबों को हटा दें और प्रत्येक ट्यूब में एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल (बोतल टॉप डिस्पेंसर का उपयोग करें) के 500 μL जोड़ें।
  13. सूखे लिपिड अर्क को 5-10 सेकंड के लिए भंवर करके पुन: निलंबित करें, इसके बाद ट्यूब को घुमाते हुए 2 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में 45 ° कोण पर ट्यूबों को डुबोएं। 5 सेकंड के लिए फिर से भंवर करें और एक अतिरिक्त मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में डुबोएं।
    नोट: निकाले गए लिपिड की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है। तब तक आगे न बढ़ें जब तक ट्यूब की दीवार पर सभी सूखे पदार्थ फिर से निलंबित न हो जाएं।
  14. 13 x 100 मिमी ट्यूबों को प्री-चिल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) सेंट्रीफ्यूज में रखें और 20-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000-5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा किसी भी अघुलनशील मलबे को हटा दें।
  15. स्पष्ट सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक पूर्व-लेबल ऑटोइंजेक्टर शीशी में विभाजित करें। ऑटोइंजेक्टर शीशी को 30-45 डिग्री कोण पर झुकाने से डिकैंटिंग की सुविधा मिलेगी। सुनिश्चित करें कि 13 x 100 मिमी ट्यूब की पूरी सामग्री को ऑटोलोडर शीशी में डीकैंटेड किया गया है।
  16. ट्यूबों को कसकर कैप करें और एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण तक ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. एलसी-ईएसआई-एमएस/

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक बाइनरी पंप सिस्टम का उपयोग करती है जो ट्रिपल-क्वाड्रोपोल मोड में संचालित ऑटोइंजेक्टर, डेगैसर और एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम के साथ युग्मित होती है। कॉलम ओवन का उपयोग करके कॉलम तापमान बनाए रखा गया था। उपयोग किए गए उपकरणों के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. मोबाइल चरण A1 (CH 3OH: H2O: HCOOH, 58:41:1, v:v:v, 5 mM अमोनियम फॉर्मेट के साथ) और मोबाइल चरण B1 (CH 3OH: HCOOH, 99:1, v:v, 5 mM अमोनियम फॉर्मेट के साथ) तैयार करें। केवल एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स, पानी और अभिकर्मकों का उपयोग करें।
  2. नमूने के प्रत्येक सेट के लिए, एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल के 500 μL युक्त चार रिक्त ऑटोलोडर शीशियां तैयार करें।
  3. नमूने के प्रत्येक सेट के लिए एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल के 500 μL में चरण 1.11 में तैयार आंतरिक मानक समाधान के 10 μL (प्रत्येक मानक के रूप में लेबल) को पतला करके दो आंतरिक मानक (आईएस के रूप में लेबल) ऑटोलोडर शीशियां तैयार करें।
  4. स्तंभ ओवन तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और आयन स्रोत तापमान को 500 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  5. एमएस विश्लेषण के लिए, स्पेक्ट्रोमीटर के ट्रिपल-क्वाड्रोपोल मोड का उपयोग करें। अग्रदूत आयनों को पारित करने के लिए पहला क्वाड्रोपोल (Q1) सेट करें, जबकि तीसरे क्वाड्रोपोल (Q3) को आणविक रूप से विशिष्ट उत्पाद आयनों (या Q1 या Q3 में कई m/z पर स्कैन) को पारित करने के लिए सेट करें, ताकि क्वाड्रोपोल 2 (Q2) में टकराव को प्रेरित किया जा सके, जो Q1 से 30-120 eV द्वारा ऑफसेट किया जाता है।
  6. 1.0 सेकंड के लक्ष्य स्कैन समय के साथ 120 सेकंड पर एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी जोड़े (एमआरएम) डिटेक्शन विंडो सेट करें। एमआरएम जोड़े, आयनीकरण ऊर्जा और टकराव ऊर्जा की सूची के लिए तालिका 1 देखें।
  7. एलसी चरण में स्फिंगोलिपिड्स को हल करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 0.7 एमएल / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करके, 95% मोबाइल चरण ए 1 और 5% मोबाइल चरण बी 1 के विलायक मिश्रण के साथ 0.5 मिनट के लिए 2.1 (यानी) x 50 मिमी सी 18 रिवर्स चरण कॉलम को बराबर करें।
    1. नमूना इंजेक्शन के बाद, 2.25 मिनट के लिए मोबाइल चरण A1/B1 अनुपात को 95/5 पर बनाए रखें, इसके बाद 1.5 मिनट में 100% B1 तक रैखिक ढाल बनाए रखें, जिसे बाद में 5.5 मिनट के लिए 100% B1 पर रखा जाता है, इसके बाद 0.5 मिनट ग्रेडिएंट वापसी 95/5 A1/B1 पर होती है।
    2. रन के बाद, कॉलम को 0.5 मिनट के लिए 95/5 A1/B1 के मिश्रण के साथ फिर से बराबर करें।
  8. नमूना ऑटोलोडर के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: कुल्ला मात्रा, 500 μL; सुई स्ट्रोक, 52 मिमी (यह प्रत्येक शीशी में शीशी के आकार और मात्रा के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए); कुल्ला करने की गति, 35 μL / नमूना गति, 5.0 μL / कुल्ला करने का समय, 2 सेकंड; आकांक्षा से पहले और बाद में कुल्ला करें; कुल्ला करने का समय, 2 सेकंड।
  9. चरण 4.15 में तैयार किए गए नमूनों को निम्नलिखित क्रम में ऑटोलोडर ट्रे पर रखें: रिक्त; है; कोरा; चरण 4.15 में तैयार किए गए नमूने; रिक्त, आईएस, रिक्त।
  10. LC-ESI-MS/MS द्वारा प्रत्येक नमूने के 5-10 μL का विश्लेषण करें। डेटा सेट में सभी नमूनों के लिए समान मात्रा का विश्लेषण करें।

6. डेटा प्रोसेसिंग, एकीकरण और सामान्यीकरण

नोट: यद्यपि निम्नलिखित चरण विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के लिए एक प्रक्रिया को रेखांकित करते हैं ( सामग्री की तालिका देखें), समकक्ष एलसी-एमएस उपकरणों और सॉफ़्टवेयर पर समान प्रक्रियाओं का उपयोग विश्लेषण किए गए लिपिड वर्गों और संबंधित आंतरिक मानकों के लिए एमआरएम जोड़े को एकीकृत करने के लिए किया जा सकता है।

  1. मात्रा निर्धारण सॉफ़्टवेयर खोलें. क्वांटिटेट टैब में क्वांटिटेशन विज़ार्ड पर डबल क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में, बाएं-सबसे कार्यस्थान में, सही डेटा सेट पर नेविगेट करें और उस पर बाएं क्लिक करें। उपलब्ध नमूने मध्य कार्यस्थान में दिखाए जाएंगे.
  2. विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों को हाइलाइट करें और फिर चयनित नमूने कार्यस्थान में नमूने जोड़ने के लिए दाएं हाथ के तीर पर क्लिक करें। सेटिंग्स और क्वेरी स्क्रीन पर नेविगेट करने के लिए अगला पर क्लिक करें जहां डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स आमतौर पर उपयोग की जाती हैं।
  3. एकीकरण विधि चयन स्क्रीन पर नेविगेट करने के लिए अगला दबाएं। विश्लेषण किए जाने वाले लिपिड के लिए एमआरएम संक्रमण जोड़े युक्त एक उपयुक्त एकीकरण विधि का चयन करें। एमआरएम संक्रमण जोड़े के लिए तालिका 1 देखें। हिट फिनिश.
    नोट: प्रतिधारण समय इंस्ट्रूमेंटेशन और व्यक्तिगत सेटिंग्स के आधार पर अलग-अलग होगा और इसलिए प्रत्येक व्यक्तिगत सेटअप के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए।
  4. नेविगेशन पट्टी में, पीक समीक्षा फलक पर क्लिक करें ताकि MRM जोड़े का निरीक्षण किया जा सके. समीक्षा की सुविधा के लिए, पीक रिव्यू फलक पर राइट-क्लिक करें, स्वचालित ज़ूमिंग को सबसे बड़े शिखर के 100% तक बदलें, और 1.00 - 2.00 मिनट की ज़ूम विंडो।
  5. क्वांटिटेशन डिस्प्ले विंडो पर राइट-क्लिक करें और विश्लेषण और वांछित स्फिंगोलिपिड की जांच का चयन करें। सत्यापित करें कि रिक्त नमूनों में कोई चोटियाँ नहीं हैं और आईएस नमूनों में सही शिखर एकीकृत किया गया है।
  6. अज्ञात नमूने को एकीकृत करना शुरू करें। एक समय में एक स्फिंगोलिपिड वर्ग में काम करते हुए, आंतरिक मानक (यानी, सी 12: 0) के एमआरएम जोड़ी के लिए अवधारण समय का निरीक्षण करें सेरामाइड) और सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर ने सही शिखर को एकीकृत किया है।
  7. एक ही लिपिड वर्ग में विश्लेषणों पर जारी रखें (यानी, सी 14: 0) सेरामाइड, सी 16: 0-सेरामाइड, आदि), कक्षा में सबसे छोटी श्रृंखला-लंबाई लिपिड से शुरू होता है। प्रत्येक श्रृंखला-लंबाई लिपिड के लिए सत्यापित करें कि सॉफ्टवेयर रूटीन ने सही एमआरएम जोड़ी शिखर को एकीकृत किया है।
  8. जब सभी विश्लेषणों को एकीकृत किया गया है, तो विश्लेषण की गई प्रत्येक स्फिंगोलिपिड प्रजातियों के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट बनाएं (उदाहरण के लिए, सेरामाइड्स, स्फिंगोमाइलिन, आदि)। एलसी-एमएस/एमएस मात्रा सॉफ्टवेयर में विश्लेषणों और श्रृंखला-लंबाई के क्रम से मेल खाने के लिए कॉलम हेडर लेबल करें। चरण 3.9 में निर्धारित नमूना आईडी और नमूना सामान्यीकरण भार के लिए एक कॉलम हेडर भी शामिल करें।
    नोट: जैसा कि पहले वर्णित11, अन्य सामान्य सामान्यीकरण उपायों में कुल लिपिड फॉस्फेट सामग्री या प्रोटीन राशि शामिल है।
  9. इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट में सभी विश्लेषणों और आंतरिक मानकों के लिए पीक क्षेत्रों को निर्यात या कॉपी करें।
  10. किसी दिए गए स्फिंगोलिपिड वर्ग के लिए प्रत्येक श्रृंखला-लंबाई प्रजातियों के एकीकृत शिखर क्षेत्र को उसके संबंधित आंतरिक मानक के शिखर क्षेत्र से विभाजित करके डेटा को सामान्य करें। उदाहरण के लिए, C14:0 सेरामाइड, C16:0 सेरामाइड, C18: 1 सेरामाइड, आदि, प्रत्येक को C12: 0 से विभाजित किया जाना चाहिए सेरामाइड आंतरिक मानक शिखर क्षेत्र।
  11. सामान्यीकृत शिखर क्षेत्र (चरण 6.10 में गणना) को आंतरिक मानक की मात्रा के साथ गुणा करके बरामद लिपिड के मोल्स में चोटी क्षेत्र को परिवर्तित करें, जिसे चरण 4.3 में नमूने में जोड़ा गया था। इस प्रोटोकॉल में यह राशि 250 पीमोल है।
  12. प्रत्येक नमूने में लिपिड की सापेक्ष मात्रा प्राप्त करने के लिए, चरण 3.9 में निर्धारित ऊतक वजन द्वारा प्रत्येक लिपिड श्रृंखला-लंबाई के पिकोमोल्स को विभाजित करें। यह ऊतक के प्रति मिलीग्राम लिपिड के पिकोमोल्स की इकाइयां देगा।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम क्रायो-संरक्षित मानव ऊतकों से ओसीटी को हटाने और एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण के लिए ऊतकों का वजन करने के लिए एक विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक सामग्री सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं। चित्र 1 में दिखाया गया एक विशिष्ट प्रयोग के परिणाम हैं जहां 10 मानव फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा ट्यूमर और 10 सामान्य आसन्न ऊतकों को ओसीटी को हटाने के लिए धोया गया था और एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, जैसा कि हमने पहले11 दिखाया है, सेरामाइड्स (चित्रा 1 ए) और मोनोहेक्सोसिल-सेरामाइड्स (चित्रा 1 बी) की विभिन्न श्रृंखला-लंबाई प्रजातियां हैं जो सामान्य आसन्न असंबद्ध ऊतकों की तुलना में फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा ट्यूमर में काफी बढ़ी हुई हैं।

धारा 4 में उल्लिखित लिपिड निष्कर्षण चरणों पर ओसीटी के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों में, 200 मिलीग्राम चूहों के यकृत (सी 57बीएल 6; पुरुष; 14-16 सप्ताह पुराने) को 2 एमएल फॉस्फेट बफर्ड खारा में फिर से निलंबित किया गया और बारीक रूप से ट्राइट्यूरेटेड होने तक समरूप किया गया। परिणामस्वरूप ठीक यकृत निलंबन को तब बड़े पैमाने पर एक प्रोब सोनिकेटर (बर्फ पर 1 मिनट सोनिकेशन के तीन राउंड, बर्फ पर 1 मिनट आराम, 60% शक्ति; माइक्रोटिप) के साथ सोनिकेट किया गया था। इस समाधान से, छह 300 μL यकृत-होमोजेनेट प्रतिकृतियां तैयार की गईं। तीन प्रतिकृतियों के लिए, 200 मिलीग्राम ओसीटी जोड़ा गया था (बायोरिपोजिटरी नमूनों में पाई गई औसत मात्रा11), और अन्य तीन में 200 μL पानी जोड़ा गया था। फिर नमूने को धारा 4 में उल्लिखित चरणों के बाद समानांतर में संसाधित किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, एकल-चरण ब्लिघ-ड्रायर समाधान के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ओसीटी वाले नमूने बादल थे, जबकि पानी वाले नियंत्रण नमूने स्पष्ट थे (चित्रा 2 ए)। एकल-चरण लिपिड निष्कर्षण समाधान में बादल सेंट्रीफ्यूजेशन और व्यापक सोनिकेशन (नहीं दिखाया गया) के बाद भी बना रहा। विलायक के वाष्पित होने के बाद, ओसीटी युक्त नमूनों में बड़े छर्रों (चित्रा 2 बी) थे, जिन्हें जोरदार भंवर और व्यापक सोनिकेशन के तहत भी मेथनॉल में पुनर्गठित नहीं किया जा सकता था। ओसीटी युक्त नमूनों ने विश्लेषण की गई सभी प्रजातियों के आंतरिक मानकों के लिए संकेत का एक बड़ा नुकसान भी दिखाया (चित्रा 3 ए-जी)। हमने पहले यह भी दिखाया है कि ओसीटी युक्त नमूनोंने विश्लेषण किए गए कई स्फिंगोलिपिड्स के लिए संकेत का नुकसान दिखाया।

आमतौर पर, यह उम्मीद की जाती है कि स्फिंगोलिपिड मानक निम्नलिखित क्रम में चित्रा 4 में दिखाए गए अनुसार क्रमिक रूप से अलग हो जाएंगे: डी 17: 1 स्फिंगोसिन, डी 17: 1 स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट, सी 12: 0 लैक्टोसिल-सेरामाइड, सी 12: 0 मोनोहेक्सोसिल-सेरामाइड, सी 12: 0 स्फिंगोमाइलिन, और C12:0 सेरामाइड। इन स्फिंगोलिपिड प्रजातियों में से प्रत्येक के लिए, खंड 5 और पहले11 में वर्णित ढाल और इंस्ट्रूमेंटेशन सेटिंग्स का उपयोग करके, श्रृंखला-लंबाई में प्रत्येक 2-कार्बन वृद्धि के लिए प्रतिधारण समय में लगभग +0.15 मिनट की शिफ्ट होगी। उदाहरण के लिए, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, C14:0-सेरामाइड (चित्रा 5B) C12:0-सेरामाइड (चित्रा 5A) की तुलना में लगभग +0.15 मिनट बाद होगा। फैटी एसिड में एक दोहरे बंधन के परिणामस्वरूप अक्सर प्रतिधारण समय में -0.15 बदलाव होता है, इसलिए सी 16: 0-सेरामाइड (चित्रा 5 सी) में सी 18: 1-सेरामाइड (चित्रा 5 डी) के समान प्रतिधारण समय होगा। हालांकि, लंबी श्रृंखला-लंबाई लिपिड (यानी, सी 24: 0, सी 26: 0) में बड़े प्रतिधारण समय बदलाव हो सकते हैं (चित्रा 5 आई, के, क्रमशः)।

Figure 1
चित्रा 1: फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा और आसन्न असंबद्ध फेफड़ों के ऊतकों के स्फिंगोलिपिड प्रोफाइल। ऊतकों को ओसीटी में क्रायोजेनिक रूप से संग्रहीत किया गया था, पिघलाया गया था, तीन एसओसीटीआरपी चक्रों के साथ संसाधित किया गया था, वजन किया गया था, और एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया था। सेरामाइड (ए), मोनोहेक्सोसिलसेरामाइड (बी), स्फिंगोमाइलिन (सी), लैक्टोसिलसेरामाइड (डी), और स्फिंगोसिन (ई) की संकेतित एसाइल श्रृंखला-लंबाई प्रजातियां; - एसपीएच), स्फिंगोसिन -1-फोप्सेट (एफ; एस 1 पी, डायहाइड्रो-एसपीएच (ई), और डायहाइड्रो-एस 1 पी (एफ) की मात्रा निर्धारित की गई थी। एन = 10 ट्यूमर और एन = 10 आसन्न असंबद्ध ऊतक। बॉक्स प्लॉट औसत (काली रेखा) और न्यूनतम से अधिकतम की मूंछें दिखाते हैं, महत्वपूर्ण नहीं हैं; , पी≤0.005; , पी ≤ 0.0005। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ओसीटी के साथ और बिना निकाले गए नमूनों की प्रतिनिधि छवियां। माउस लिवर को समरूप और सोनिकेट किया गया, छह समान नमूनों में विभाजित किया गया: 200 मिलीग्राम ओसीटी को तीन नमूनों में जोड़ा गया और अन्य तीन में पानी मिलाया गया। (ए) मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म को 2: 1: 0.1 मेथनॉल: क्लोरोफॉर्म: पानी (वी: वी: वी) के अनुपात को प्राप्त करने के लिए मिलाया गया था, रात भर 48 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन, इसके बाद सेंट्रीफ्यूजेशन, ओसीटी वाले नमूनों के सुपरनैटेंट बादल थे और सोनिकेशन, भंवर, या सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट नहीं किए जा सकते थे। (ख) विलायक वाष्पीकरण के बाद, ओसीटी युक्त नमूनों से एक बड़ी गोली बरामद की गई थी जिसे व्यापक सोनिकेशन और भंवर के बाद 05 एमएल मेथनॉल में पूरी तरह से पुनर्गठित नहीं किया जा सका था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ओसीटी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में स्फिंगोलिपिड मानकों का एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस परिमाणीकरण। माउस लिवर को समरूप, सोनिकेट किया गया और छह समान नमूनों में विभाजित किया गया। छह नमूनों में से तीन में, 200 मिलीग्राम ओसीटी जोड़ा गया था, जबकि अन्य तीन में, पानी जोड़ा गया था। आंतरिक मानकों, मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म को जोड़ने के बाद, नमूनों को समान रूप से संसाधित किया गया और निकाले गए लिपिड का विश्लेषण एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा किया गया। संक्षिप्तीकरण: एसपीएच, स्फिंगोसिन; एस 1 पी, स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट। काले तीर संकेतित स्फिंगोलिपिड के लिए सही एमआरएम जोड़ी को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: स्फिंगोलिपिड मानकों के एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी जोड़े के लिए सापेक्ष प्रतिधारण समय। माउस लिवर को समरूप और सोनिक किया गया था; आंतरिक मानक, मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म जोड़ा गया; एलसी-ईएसआई-एमएस /एमएस द्वारा निकाले गए और विश्लेषण किए गए लिपिड संकेतित लिपिड (ए-एफ) के कई प्रतिक्रिया निगरानी जोड़े के प्रतिधारण समय दिखाए गए हैं। तरल क्रोमैटोग्राफी ढाल के दौरान लिपिड के सापेक्ष क्रम पर ध्यान दें। संक्षिप्तीकरण: एसपीएच, स्फिंगोसिन; एस 1 पी, स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट; एसएम, स्फिंगोमाइलिन। एक्स-अक्ष मिनटों में एमआरएम जोड़ी प्रतिधारण समय है। वाई-अक्ष एमआरएम जोड़े के लिए संकेत तीव्रता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस एमआरएम जोड़े के अवधारण समय में एसाइल श्रृंखला-लंबाई निर्भर बदलाव। माउस लिवर को समरूप और सोनिक किया गया था; आंतरिक मानक, मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म जोड़ा गया; और एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा निकाले गए और विश्लेषण किए गए लिपिड दिखाए गए प्रतिधारण समय और संकेतित लिपिड के एमआरएम जोड़े हैं। विभिन्न लिपिड (ए-के) के लिए एसाइल-चेन लंबाई में वृद्धि के साथ प्रतिधारण समय में बदलाव पर ध्यान दें, जो आमतौर पर प्रति 2-कार्बन वृद्धि में +0.15 मिनट प्रतिधारण समय से मेल खाती है। एक डबल बॉन्ड के परिणामस्वरूप -0.15 मिनट प्रतिधारण समय शिफ्ट (डी, एच, जे) होगा। हालांकि, लंबी श्रृंखला लिपिड के लिए, प्रतिधारण समय में सापेक्ष वृद्धि लंबी हो सकती है (जी-के)। एक्स-अक्ष मिनटों में एमआरएम जोड़ी प्रतिधारण समय है। वाई-अक्ष एमआरएम जोड़े के लिए संकेत तीव्रता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए एमआरएम जोड़े, आयनीकरण पैरामीटर और टकराव ऊर्जा। डीपी, डी-क्लस्टरिंग क्षमता; सीई, टकराव ऊर्जा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ओसीटी एक सामान्य दीर्घकालिक क्रायो-संरक्षण एजेंट है जिसका उपयोग बायोरिपॉजिटरी में किया जाता है। हालांकि, ओसीटी के परिणामस्वरूप आयन दमन हो सकता है जब ऊतकों का विश्लेषण विभिन्न मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफार्मों 12,13,14,15 द्वारा किया जाता है, या एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस 11 द्वारा नमूनों का विश्लेषण किए जाने पर सिग्नल का नुकसान होता है। क्रायोसंरक्षित ऊतकों में ओसीटी ऊतक सामान्यीकरण विधियों जैसे कि वजन और प्रोटीन परिमाणीकरण परख जैसे ब्रैडफोर्ड और बीसीए11 में भी हस्तक्षेप कर सकता है। यहां, हम मानव ऊतकों से ओसीटी को हटाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जाता है। प्रोटोकॉल को अन्य ऊतक स्रोतों का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जो फेफड़े नहीं हैं, या चूहों के ऊतकों से जैसा कि हमने पहलेवर्णित किया है 11। इसके अलावा, अन्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा सामान्यीकरण रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है, जिनमें हमने पहले11 का वर्णन किया है, साथ ही साथ अन्य मान्य तरीके भी शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह उन ऊतकों के विश्लेषण के लिए पर्याप्त नहीं है जिन्हें पहले फॉर्मलाडेहाइड या किसी अन्य फिक्सिंग एजेंट के साथ तय किया गया है। यह केवल उन ऊतकों के लिए पर्याप्त है जिन्हें ठीक नहीं किया गया है और ओसीटी में क्रायोप्रिजर्व किया गया है। इसके अलावा, यह विधि उन ऊतकों को संसाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है जिनका वजन 1-2 मिलीग्राम से कम होता है क्योंकि एसओसीटीआरपी चरणों और ट्यूबों के बीच स्थानांतरण के दौरान हमेशा कुछ ऊतक हानि होती है। मानक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग करके ऐसे छोटे ऊतकों का वजन करना मुश्किल होगा, और किसी भी बचे हुए पीबीएस को बाती चरण के दौरान नहीं हटाया जाएगा जो प्रयोगात्मक त्रुटि में बहुत योगदान देगा। इस विधि के साथ ओसीटी को हटाने के लिए ऊतकों को धोते समय नीचे अन्य महत्वपूर्ण विचार दिए गए हैं।

इस प्रोटोकॉल के सुचारू निष्पादन को सुनिश्चित करने के लिए, विशेष रूप से यदि कई नमूने संसाधित किए जाएंगे, तो अनुभाग 1 में उल्लिखित चरणों को समय से पहले किया जाना चाहिए, जिसमें प्री-लेबलिंग और प्री-वज़निंग 1.5 एमएल ट्यूब, प्री-लेबलिंग 13 x 100 मिमी स्क्रू कैप ट्यूब और कैप, 13 x 100 मिमी कल्चर ट्यूब और ऑटोइंजेक्टर शीशियां, सभी बाती तैयार करना, 1 एमएल पिपेट टिप्स को पूर्व-छोटा करना, और प्री-चिलिंग वॉश समाधान। यह उस दिन किए जाने वाले समय लेने वाली प्रक्रियाओं को रोक देगा जिस दिन ऊतकों को धोया जाएगा, जिससे देरी हो सकती है। सामान्य तौर पर, हम पाते हैं कि यदि इनमें से कई चरणों को एक दिन पहले किया जाता है, तो एक अनुभवी शोधकर्ता एक सामान्य कार्यदिवस में 30-40 नमूने धो सकता है। हालांकि, क्योंकि पहला सुझाया गया स्टॉपिंग पॉइंट यह है कि सभी ऊतकों को धोया, तौला गया है, और मेथनॉल में रखा गया है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है, समय से पहले 1.5 एमएल प्री-वजन और लेबलिंग नहीं करने से दक्षता प्रभावित होगी और 30-40 ऊतकों को धोने के लिए आवश्यक समय की लंबाई बढ़ जाएगी।

ऊतक वजन सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, क्योंकि त्रुटियां या लापरवाही डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करेगी क्योंकि वे डेटा सामान्यीकरण में ले जाएंगे। यह महत्वपूर्ण है कि वजन के लिए उपयोग किए जाने वाले विश्लेषणात्मक संतुलन को कैलिब्रेट किया जाए, ठीक से शून्य किया जाए, और तारांकित किया जाए। तदनुसार, बाती का उपयोग करते समय, जितना संभव हो उतना धोने के घोल को हटाना महत्वपूर्ण है, खासकर 5 मिलीग्राम से कम वजन वाले ऊतकों के लिए। इन ऊतक भारों पर, बचा हुआ धोने का समाधान वजन को एक बड़े प्रतिशत से गलत बना देगा और डेटा सामान्यीकरण में त्रुटि के रूप में ले जाएगा। धोने के घोल को हटाते समय, हम पाते हैं कि ऊतकों को कई सेकंड के लिए बाती के साथ धीरे से छुआ जा सकता है ताकि बाती से आसंजन द्वारा ऊतक के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना जितना संभव हो उतना धोने के घोल को हटाया जा सके। हालांकि, धोए जा रहे प्रत्येक ऊतक प्रकार को बाती के आसंजन के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, और प्रोटोकॉल में इन चरणों को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।

ऊतक धोने के वर्कफ़्लो को सुविधाजनक बनाने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में बायोरिपॉजिटरी से ऊतक शेविंग का अनुरोध किया जाए। यह धोने से पहले ऊतकों की हैंडलिंग को कम कर देगा।

ऊतकों को धोते समय, यदि तीसरे एसओसीटीआरपी चक्र के बाद ट्यूब के तल पर एक जेल जैसी सामग्री देखी जाती है, तो यह संकेत है कि सभी ओसीटी को हटाया नहीं गया है और अधिक एसओसीटीआरपी चक्रों की आवश्यकता है। इस बात का ट्रैक रखें कि कितने चक्रों की आवश्यकता है, और स्थिरता के लिए, डेटा सेट में सभी नमूनों में समान संख्या में एसओसीटीआरपी चक्र करें। हमने पहले 9 एसओसीटीआरपी चक्रों का मूल्यांकन किया है औरऊतकों में स्फिंगोलिपिड्स की कमी पर कोई प्रभाव नहीं पाया है।

धोने के घोल को हटाने के लिए बाती का उपयोग करते समय, ऊतक को धीरे से दबाने से यह सुनिश्चित होगा कि सभी धोने का समाधान हटा दिया गया है। यह ऊतक वजन अनुमान की सटीकता को बढ़ाता है। हालांकि, बहुत छोटे ऊतकों के साथ बहुत सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि ये बाती से चिपक सकते हैं और परिणामस्वरूप नमूना का नुकसान हो सकता है। जितना संभव हो उतना समाधान निकालने के लिए एक ही ट्यूब के लिए कई बाती का उपयोग करना सहायक होता है। क्रॉस-नमूना संदूषण को रोकने के लिए, हमेशा प्रत्येक नमूने के लिए एक नया, और साफ, बाती का उपयोग करें। बाती बनाते समय, प्रयोगशाला ग्रेड ऊतक ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें क्योंकि हमने पहले इनका परीक्षण किया था और पाया कि इसमें दूषित स्फिंगोलिपिड्स11 की नगण्य मात्रा थी। अन्य सामग्रियों से विक्स का उपयोग किया जा सकता है यदि उन्हें वर्णित11 के रूप में परीक्षण किया जाता है।

वजन के बाद 1.5 एमएल ट्यूबों से नमूने प्राप्त करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि सभी ऊतकों को पुनर्प्राप्त किया जाए। ऐसा करने में विफल रहने पर डेटा सामान्यीकरण में त्रुटियां होंगी। यदि सभी ऊतकों को पुनर्प्राप्त करने के लिए अधिक पीबीएस की आवश्यकता होती है, तो निष्कर्षण दक्षता में अंतर से बचने के लिए अन्य सभी ट्यूबों में उपयोग किए जाने वाले पीबीएस की समान मात्रा जोड़ें जो पीबीएस की विभिन्न मात्रा वाले नमूनों के परिणामस्वरूप हो सकता है। 2: 1: 0.1 मेथनॉल: क्लोरोफॉर्म: पानी अनुपात बनाए रखने के लिए पानी की मात्रा में किसी भी वृद्धि के लिए क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल वॉल्यूम समायोजित करें।

नमूनों को पिघलाते समय, यह महत्वपूर्ण है कि यह कदम बर्फ पर किया जाए ताकि स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट जैसे लेबिल लिपिड के क्षरण से बचा जा सके। ओसीटी के तरल अवस्था में होने तक नमूनों को पूरी तरह से पिघलाने से इसे हटाने में भी सुविधा होगी क्योंकि यह शुरुआती धोने के चरणों के दौरान गोली के रूप में रहने के बजाय ठंडे धोने के घोल में अधिक आसानी से घुल जाएगा।

कभी-कभी, विशेष रूप से फेफड़ों के ऊतकों को धोते समय, ऐसे टुकड़े होंगे जो पेलेट नहीं होंगे और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद धोने के समाधान के शीर्ष पर तैरेंगे। सावधानी के साथ, धोने के समाधान को हटाने के लिए तैरते ऊतकों के नीचे एस्पिरेटेड टिप को डुबोने से आकांक्षा के दौरान नुकसान को रोका जा सकता है।

होमोजेनाइजेशन से पहले नमूनों में क्लोरोफॉर्म न जोड़ें क्योंकि डिस्पोजेबल होमोजेनाइज़र टिप्स प्लास्टिक से बने होते हैं और क्लोरोफॉर्म युक्त समाधानों में घुल जाएंगे। यह नमूनों में लिपिड के एलसी-एमएस / एमएस परिमाणीकरण को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है। इसलिए, सामान्य तौर पर, प्लास्टिक का उपयोग जो सॉल्वैंट्स के प्रतिरोधी नहीं हैं, क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल वितरित करते समय टाला जाना चाहिए। ये सॉल्वैंट्स भी विषाक्त हैं और इन्हें उचित फ्यूम हुड में संभाला जाना चाहिए। मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म जैसे विलायक को संभालते समय उपयुक्त पीपीई पहनें।

मानव ऊतकों को एक उपयुक्त जैव सुरक्षा कैबिनेट (जैसे, वर्ग द्वितीय) में संसाधित किया जाना चाहिए। उपयोगकर्ताओं को मानव मूल के जैव-खतरनाक सामग्री और तरल पदार्थों की हैंडलिंग में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए जैसे कि उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना और नमूनों के संपर्क में आने वाली किसी भी सतह या उपकरण को दूषित करना। उपयोगकर्ताओं को धोने की प्रक्रिया के दौरान उपयोग की जाने वाली किसी भी सतह या उपकरण (सेंट्रीफ्यूज, सेंट्रीफ्यूज वाहक और एडाप्टर, पिपेटर्स, वोर्टेक्सर्स, फ्यूम हुड सतहों, बैलेंस, ग्लासवेयर, आइस ट्रे, कंप्यूटर कीबोर्ड, कंप्यूटर माउस, आदि) को अच्छी तरह से कीटाणुरहित करना चाहिए (सुझाए गए परिशोधन के लिए सामग्री की तालिका देखें)। प्रयोगशाला के सदस्यों को ऊतक धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण या हुड का उपयोग नहीं करना चाहिए जब तक कि उन्हें अच्छी तरह से कीटाणुरहित नहीं किया जाता है। स्टील की सतहों और इलेक्ट्रॉनिक्स पर ब्लीच के उपयोग से बचें।

कई नमूनों को संसाधित करते समय, लिपिड निष्कर्षण चरणों के दौरान री-कैपिंग चरणों में क्लीन कैप का उपयोग करके क्रॉस संदूषण को रोकने के लिए सावधानी बरतें। यदि उन्हें लेबल किया जाता है तो कैप्स का भी फिर से उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, व्यवहार में, हम पाते हैं कि मार्कर ब्लैक कैप्स पर खराब दिखते हैं, और चिपकने वाले लेबल रात भर 48 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन के दौरान ट्यूबों से गिर जाते हैं।

स्फिंगोलिपिड्स रोग और मानव कैंसर के एटियलजि में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, इन रोगों में स्फिंगोलिपिड चयापचय परिवर्तनों को सटीक रूप से परिभाषित करने में बहुत रुचि है क्योंकि वे चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट कर सकते हैं। हालांकि, शोधकर्ताओं के लिए आसानी से सुलभ कई ऊतक ओसीटी में क्रायोप्रिजर्व हैं, जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ संगत नहीं है। इस प्रकार, यहां वर्णित विस्तृत प्रोटोकॉल मात्रात्मक स्फिंगोलिपिडोमिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त ऊतकों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करेगा, और इस प्रकार मानव रोग और कैंसर में लिपिड चयापचय परिवर्तन के जीव विज्ञान की हमारी समझ को बढ़ाने में मदद करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अनुसंधान परियोजना की सेवाएं और समर्थन वीसीयू मैसी कैंसर सेंटर ऊतक और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कोर और वीसीयू लिपिडोमिक्स और मेटाबोलॉमिक्स कोर द्वारा प्रदान किए गए थे, जो एनआईएच-एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट पी 30सीए016059 से वित्त पोषण के साथ आंशिक रूप से समर्थित हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स आर 21सीए 232234 (सैंटियागो लीमा) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13x100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 581300-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

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References

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मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक में एम्बेडेड मानव ऊतकों की तैयारी
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Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S.… More

Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S. Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (170), e62552, doi:10.3791/62552 (2021).

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