Summary
スフィンゴ脂質は、ヒトの疾患において十分に確立された役割を有する生理活性代謝物である。質量分析で組織の変化を特徴づけることで、疾患の病因における役割を明らかにしたり、治療標的を特定したりすることができます。しかし、バイオリポジトリでの凍結保存に使用されるOCT化合物は、質量分析を妨害します。OCTに包埋したヒト組織中のスフィンゴ脂質をLC-ESI-MS/MSで解析する方法を概説する。
Abstract
スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患において十分に確立された役割を有する細胞成分である。質量分析は、スフィンゴ脂質が疾患において変化しているかどうかを決定し、スフィンゴ脂質が臨床的に標的化できるかどうかを調べるために使用することができる。ただし、手術室から直接組織を取得する適切な検出力の前向き研究は、時間がかかり、技術的、ロジスティック的、および管理的に困難な場合があります。対照的に、後ろ向き研究は、組織バイオリポジトリですでに入手可能な、通常は大量に凍結保存されたヒト検体を利用することができます。バイオレポジトリーから組織を調達する他の利点には、組織学、病理学、および場合によっては臨床病理学的変数を含む組織標本に関連する情報へのアクセスが含まれ、これらはすべてリピドミクスデータとの相関を調べるために使用することができる。しかしながら、凍結保存および質量分析に使用される最適切断温度化合物(OCT)の非適合性に関連する技術的限界は、脂質の分析のための技術的障壁である。しかし、OCTは、スフィンゴ脂質含有量を変えることなく、洗浄と遠心分離のサイクルを通じて、ヒトバイオリポジトリ標本から簡単に除去できることを以前に示しました。また、OCTで凍結保存されたヒト組織中のスフィンゴ脂質は、最大16年間安定していることを以前に確立しました。本報告では、OCTに埋め込まれたヒト組織検体中のスフィンゴ脂質分析の手順とワークフローについて、組織の洗浄、データ正規化のための組織の計量、脂質の抽出、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)による分析用サンプルの調製、質量分析データ統合、データ正規化、データ解析などについて概説する。
Introduction
スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患における役割で知られている生理活性代謝物です1,2。それらは、細胞移動、細胞の生存と死、細胞の動き、小胞輸送、細胞の浸潤と転移、血管新生、サイトカインの産生などの複雑な細胞プロセスを調節します1,2,3,4,5,6,7,8,9 .スフィンゴ脂質代謝の調節における欠陥は、癌の開始および進行に寄与し、癌がどれほど攻撃的であるか、および癌がどのように反応し、治療に対する耐性を発達させるかを決定する3,10。したがって、疾患の病因に対するこれらの広範な影響のために、疾患特異的スフィンゴ脂質の変化を正確に確立できる分析方法は重要なツールです。質量分析(MS)は、スフィンゴ脂質の変化を分析するための最も正確で信頼性の高い方法です。
スフィンゴ脂質の変化の分析に使用できるヒト検体は、手術室から前向きに、または組織バイオリポジトリから遡及的に取得できます。手術からの新鮮な組織は、MSまたは他の分析方法によって直接分析することができるので有利である。ただし、組織を前向きに取得するには、管理上、技術上、およびロジスティック上のハードルがあり、統計的検出力に到達するのに十分な標本を収集することは困難な場合があります。バイオレポジトリーから組織を取得することは、遡及的に大量に取得でき、バイオリポジトリは組織学と病理を確認し、標準的な操作手順を使用して組織を極低温で保存し、相関分析に使用できる臨床病理学的データを提供できるため、有利です。しかし、分子的および構造的特徴を維持するために、バイオリポジトリは組織を最適切断温度(OCT)化合物に埋め込むことによって凍結保存することができ、これはデータ正規化アッセイおよび液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)によるスフィンゴ脂質の定量を妨げることを示しました11。.また、OCT化合物の主成分であるポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールが、他のMS分析プラットフォームにおいてイオン抑制をもたらすことも示されている12、13、14、15。したがって、OCT化合物は、MSによるスフィンゴリピドミック分析の前に組織から除去する必要があります。
以前のレポートでは、LC-ESI-MS/MS分析のためのヒト検体からのOCT化合物の除去プロトコル11 と、データ正規化のための組織の計量に使用される方法論11を検証しました。ここでは、スフィンゴリピドミックOCT化合物除去プロトコル(sOCTrP)の手順を詳述し、ヒト肺腺癌腫瘍および正常な隣接非関与組織からの代表的なデータを示します。
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Protocol
匿名化されたヒト肺組織は、内部レビュー委員会(IRB)が承認したプロトコル(#HM2471)に基づいて、バージニアコモンウェルス大学(VCU)の組織およびデータ収集および分析コアから取得されました。マウス組織の研究および収穫のためのマウスの使用は、VCU施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された。
1.材料の準備
注意: これらの手順は、ティッシュ洗浄の前日に実行する必要があります。
- 1.5 mLのポリプロピレン製遠心チューブに、翌日処理される各サンプルの簡潔で明確な識別コードを付けて事前にラベルを付け、計量します。繰り返しチューブを取り扱っても色あせしない耐薬品性のある永久マーカー( 材料の表を参照)を使用してください。
- 電子スプレッドシートを開き、連続する列に次の列ヘッダーを付けます:チューブ識別子(ID)、チューブのみ、組織付きチューブ、および全組織。処理されるチューブ識別子を [チューブ ID] というラベルの付いた列に入力します。
- 分析スケールを事前に校正し、ゼロにします。清潔な10mL三角フラスコをバランスプレートの中央に置きます(フラスコはチューブホルダーとして機能します)。計量室のドアを閉め、フラスコで体重計を風袋引きします。
- 1.5 mLの遠沈管の重量を量ります。チューブをフラスコに慎重に置き、計量チャンバーのドアを閉じます。重量を安定させ、カラムラベル付きチューブのみに重量を記録します。
注意: チューブの重量を量るときは、10mLの三角フラスコを動かさないでください。フラスコを動かした場合は、フラスコを中央に戻し、天びんを風袋引きします。閉じたチューブをラックに入れ、必要になるまで保管します。 - 13 x 100 mmスクリュートップガラス管とキャップに識別コードを事前にラベル付けし、2 mLのLC-MSグレードメタノールを充填します。それらをチューブラックに入れ、チューブに蓋をして、使用するまで冷蔵庫(4°C)に保管します。
注意: ボトルトップ溶剤ディスペンサーを使用してください( 材料の表を参照)。利用できない場合は、有機溶剤を分注するときにプラスチックを使用しないようにガラスピペットを使用してください。 - ラベル付け済みの13 x 100 mmガラス試験管。試験管を覆い、室温で保管します。
- オートインジェクターバイアルにIDコードを付けて事前にラベル付けします。オートインジェクターバイアルを覆い、使用するまで室温で保管します。
- 組織乾燥芯を準備します。
- まず、外科用はさみをLC-MSグレードのメタノールに5分間浸して洗浄し、次に清潔な実験室グレードの組織で拭きます。
- パウダーフリーの手袋を使用して、細かく先細りの30〜40 mmの芯が形成されるまで、実験室グレードの組織( 材料の表を参照)の端を回転させます。
- メタノールで洗浄したはさみを使用して、太い端の芯を切ります。芯をきれいな段ボール箱に入れます。すべてのサンプルを処理するために必要な芯の数を2倍にします。
- 短縮した1 mLピペットチップを準備します。メタノール洗浄した外科用ハサミを使用して、1 mLピペットチップの先端から4〜5 mmを切り取り、チップホルダーに戻します。処理するサンプルの2倍のチップを準備します。
注:これらは、チューブから洗浄された組織の回収に使用されます。先端の端には触れないでください。 - 分子生物学グレードのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を4°Cにプレチルします(0.5 Lで十分です)。これは標本を回収するために使用されます。処理する各サンプルについて、60 mLの超高純度脱イオン水をプレチル(4°C)します。
- 質量分析の内部標準を準備します。以下の脂質をエタノール:メタノール:水(7:2:1;v / v / v)に25 nmol / mLの濃度で溶解します:d17:1-スフィンゴシン、(2S,3R,4E)-2-アミノヘプタデカ-4-エン-1,3-ジオール;D17:1-スフィンゴシン-1-リン酸、ヘプタデカスフィン-4-エニン-1-リン酸;C12-セラミド (d18:1/C12:0), N-(ドデカノイル)-スフィン-4-エニン;C12-スフィンゴミエリン(d18:1 / C12:0)、N-(ドデカノイル)-スフィン-4-エニン-1-ホスホコリン;C12-グルコシルセラミド(d18:1 / C12:0)、N-(ドデカノイル)-1-β-グルコシル-スフィン-4-エイネ;C12-ラクトシルセラミド(d18:1 / C12:0)、N-(ドデカノイル)-1-β-ラクトシル-スフィン-4-エン。
2.ティッシュ洗浄
注:セクション1のすべてのステップを1日前に完了すると、熟練した研究者は1日あたり最大40サンプル、初心者は1日あたり~10〜15サンプルを処理できます。早朝から始めて、セクション2.1〜3.8のすべてのステップが完了するまで停止しないでください。
- 組織が処理される日に、ボルテクサー、完全に充電された血清学的ピペッター、および製氷皿を装備して、バイオセーフティキャビネットの作業エリアを準備します。このセクションのすべての手順で、白衣、二重層の手袋、保護眼鏡など、適切なPPEを着用してください。注意: 人間の組織や体液は、バイオハザード物質と見なし、扱う必要があります。
- スイングバケット遠心分離機、15 mL 円錐形遠心分離管を保持するために必要なアダプター、および遠心分離機の生物学的封じ込め蓋をプレチル(4°C)します。1.5 mLの遠沈管を保持できる固定角度遠心分離機をプレチル(4°C)します。
- 組織が15 mLポリプロピレン遠心チューブに分注されていない場合は、メタノールで洗浄したスパチュラ(新しい組織サンプルごとに洗浄)を使用して、事前にラベル付けされた15 mLポリプロピレンチューブに移します。15 mLキャップにもラベルを付けます。
- 15 mLの遠心チューブを保持できるチューブラックを製氷皿に入れ、トレイに氷を入れます。その日に処理されるティッシュを氷上のラックに入れて解凍します。
注:組織の洗浄と計量のプロトコルがこれらの重量で正確で信頼できることが以前に示されているため、処理のためにバイオリポジトリから最低3〜4 mgの組織を要求する必要があります11。
- 15 mLの遠心チューブを保持できるチューブラックを製氷皿に入れ、トレイに氷を入れます。その日に処理されるティッシュを氷上のラックに入れて解凍します。
- サンプルの入った製氷皿をバイオセーフティキャビネットに移動します。
- 以下で説明するように、sOCTrPサイクル11 を3回実行します(つまり、手順2.5.1〜2.5.5を3回実行します)。
- 氷冷した超高純度脱イオン水10mLを各チューブに加え、しっかりと蓋をします。チューブを10分間インキュベートします。
- 各チューブを10〜20秒間、またはチューブの壁に堆積したすべての組織または組織ペレットが完全に再懸濁されるまで、激しくボルテックスします。
注:sOCTrPサイクル2〜3では、ペレット内のOCTが洗浄液に希釈されるように、ペレットを再懸濁することが重要です。 - チューブを事前に冷却された(4°C)スイングバケット遠心分離機に移します。サンプルを4,000-5,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
注意: 遠心分離機キャリアを生物学的封じ込め蓋で密封することにより、遠心分離中に発生するバイオハザードエアロゾルの生成と曝露を回避します(材料の表を参照)。 - 遠心分離機からサンプルを取り出し、製氷皿に移します。トレイをバイオセーフティキャビネットに入れ、チューブのキャップを外します。キャップを保存します。
- 洗浄液を慎重に吸引します。チューブ内に~0.5 mLの上清を残して、ペレット内の組織材料を吸引しないでください。チューブにキャップをし、ラベルの付いたキャップとチューブを一致させることで相互汚染を回避します。
注意: ステップ2.5.5の洗浄液(上清)はバイオハザード物質です。人間由来の標本に適したバイオセーフティガイドラインに従って取り扱い、廃棄してください。
3.組織計量(データ正規化用)
- 最後のsOCTrP洗浄サイクルの後、洗浄液の大部分を注意深く吸引しますが、ペレットを乱さないようにしてください。チューブに~0.5 mLの洗浄液を残します。
- 短縮したピペットチップ(ステップ1.9で調製)を使用して、500 μLの氷冷PBSを採取し、チューブに加えます。
- 同じチップを使用して、ペレットを静かに再懸濁し、すべての組織を取り出します。チューブとピペットの先端壁への付着による組織の損失を減らすために、乱流ピペッティングを避けてください。
- 再懸濁した組織を、対応する事前にラベル付けされ、事前に計量された1.5 mL遠心チューブに追加し、チューブを氷上に置きます。データセット内のすべての組織に対して繰り返します。
- 1.5 mLチューブを事前に冷却した遠心分離機に入れ、組織を7,000 x g で5〜7分間、4°Cでペレット化します。
- チューブを回収し、ペレットを乱すことなくできるだけ多くのPBSを注意深く吸引します。チューブを氷の上に戻します。
- 遠心分離管を7,000 x gでさらに3分間使用して、組織が適切にペレット化されていることを確認します。チューブを氷に移します。
注意: 追加の遠心分離ステップは、すべての洗浄液と吸湿発散液を除去する際の組織の損失を防ぐために重要です。5つ以上のサンプルを処理する場合、5つのサンプルが処理されるごとに3分間、7,000 x g の遠心分離ステップを繰り返して、組織がペレットのままであることを確認する。 - 手順1.8で準備した芯を使用して、残っている洗浄液をそっと取り除きます。サンプルごとにきれいな芯を使用してください。芯でティッシュを軽くたたくことは許容されます、それは洗浄液の大部分を取り除くのを助けますが、芯への付着によって組織を失うことを避けます。チューブを閉じて氷の上に置きます。
- 最近校正、風袋引き、ゼロにした分析天びんの各チューブの重量を量ります。
- 各チューブをガラス製の三角フラスコに入れ、チャンバーのドアを閉じます。体重が安定したら、ティッシュ付きのチューブというラベルの付いた電子スプレッドシートの列に記録します。
- 計量後、チューブを氷上に戻します。
- 300 μLの氷冷PBSを加えます。短くしたピペットチップ(ステップ1.9)を使用して、すべての組織を注意深く取り出し、2 mLの氷冷LC-MSグレードのメタノールを含む事前にラベル付けされたスクリュートップガラスチューブ(ステップ1.5で調製)に堆積させます(組織をチューブの側面ではなくメタノールに追加します)。
- チューブからチューブだけを差し引いて洗浄した組織の量を計算します。この数を全組織列に記録します。総組織値は、ステップ6.12で質量分析データを正規化するために使用されます。
- 手順4.1〜4.15を実行する準備ができるまで、サンプルを-80°Cで保管します。
注:これは良い停止点であり、サンプルは-80°Cで数週間安全に保管できます。 タンパク質濃度や脂質リン酸含量などの他の組織正常化方法については、Rohrbach et al.11を参照してください。
4.脂質抽出
注:特に多くのサンプルが処理される朝にこれらの手順を開始することが重要です。開始する前に、水浴またはインキュベーターを48°Cに予熱します。
- ステップ3.8で調製したサンプルとMS脂質標準物質(ステップ1.11で調製)を冷凍庫から取り出します。室温に20分間平衡化させます。
- 内部標準液を超音波水浴( 材料の表を参照)に2〜3分間、またはMS脂質標準が完全に溶解するまで渦巻き、浸してからサンプルに分注します。これにより、データの正規化のエラーを回避できます。
- 繰り返しピペットを使用して、250 pmol(ステップ1.11で調製した25 nmol/mL溶液から10 μL)の内部質量分析標準物質を各チューブに加えます。チューブを軽くキャップし直します。
- 均質化を容易にするために、メタノール容量を2mLに調整します。LC-MS/MSグレードのメタノールのみを使用してください。
- 一度に1本のチューブを作業し、ホモジナイザーを使用して、塊が見えなくなるまで組織を粉砕します(通常は5〜20秒)。ホモジナイザーの先端を円を描くように動かし、チューブの壁をそっと押して粉砕を支援します。チューブをキャップし直します。
注:すべての組織が細かく粉砕されていることを確認すると、脂質抽出が最大になります。使い捨てホモジナイザーの先端はクロロホルムを含む溶液に溶解するプラスチックでできているため、均質化前にサンプルにクロロホルムを追加しないでください。 - チューブを超音波水浴に45°の角度で5〜10秒間浸します。
- 超音波浴に浸しても組織の塊が形成されない場合は、キャップをして次のチューブに進みます。
- チューブを超音波浴に浸したときに組織の塊が形成された場合は、再均質化し、塊を標的にします。
- このプロセス(均質化/超音波浴への浸漬)を、すべての大きな組織塊が破壊されるまで繰り返し繰り返します。
- ヒュームフードで、LC-MSグレードのクロロホルムとメタノールを各チューブに追加し(ボトルトップディスペンサーを使用)、メタノール:クロロホルム:水の比率を2:1:0.1にします。清潔なキャップを使用して、チューブをしっかりと密封し、一日の終わりまでベンチトップに置いておきます。
- 重量が50 mg以下の組織の場合、総抽出量4 mLを使用し、より大きな標本の場合はこの比率(50 mg:4 mL抽出溶液)を使用して調整します。
- その夜出発する前に、しっかりと蓋をしたチューブを48°Cの水浴またはインキュベーターに入れ、一晩インキュベートします。
注意: 蒸発によって溶媒比が変化しないように、チューブにしっかりと蓋をすることが重要です。 - 翌朝、48°Cの水浴からサンプルを取り出し、4,000-5,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、溶媒不溶性の破片をペレット化します。
- ヒュームフード内で作業し、上清を事前にラベル付けされた13 x 100 mmホウケイ酸ガラス試験管に慎重にデカントします。デカンテーションを容易にするために、13 x 100 mmのチューブを30〜45°の角度で傾けます。
注意: 12を超えるサンプルを処理する場合は、ステップ4.10を実行するとペレットが柔らかくなり、不溶性の破片が移動するため、遠心分離チューブを長時間放置しないでください。これを回避するには、一度に12本のチューブを遠心分離機から取り出し、デカントする準備ができるまで他のチューブを遠心分離し続けます。 - チューブを13 x 100 mmのチューブを保持できる真空濃縮器に移します。最初の1時間の加熱ステップ(40°C)ですべての溶媒を蒸発させ、最大真空下で実行します。
- 真空濃縮器からチューブを取り外し、各チューブに500 μLのLC-MSグレードのメタノール(ボトルトップディスペンサーを使用)を追加します。
- 乾燥した脂質抽出物を5〜10秒間ボルテックスして再懸濁し、チューブを回転させながら超音波水浴に45°の角度で2分間浸します。5秒間再ボルテックスし、超音波水浴にさらに1分間浸します。
注:これは、抽出された脂質の最大回収を確実にするための重要なステップです。チューブの壁にある乾燥した材料がすべて再懸濁されるまで、先に進まないでください。 - 13 x 100 mmチューブをプレチルド(4°C)遠心分離機に入れ、4,000-5,000 x g で4°Cで20〜30分間遠心分離して不溶性の破片を取り除きます。
- 清澄化した上清を、事前にラベル付けされたオートインジェクターバイアルに慎重にデカントします。オートインジェクターバイアルを30〜45°の角度で傾けると、デカンテーションが容易になります。13 x 100 mmチューブの内容物全体がオートローダーバイアルにデカントされていることを確認します。
- チューブにしっかりと蓋をし、LC-ESI-MS/MSで分析するまで-80°Cで保管してください。
5. LC-ESI-MS/MS 分析
注意: 次の手順では、トリプル四重極モードで動作するオートインジェクター、デガッサー、およびLC-MS / MSシステムに結合されたバイナリポンプシステムを使用します。カラム温度はカラムオーブンを用いて維持した。使用する機器の詳細については、 材料表 を参照してください。
- 移動相A1(CH3OH:H2O:HCOOH、58:41:1、v:v:v、5 mMギ酸アンモニウムを含む)および移動相B1(CH3OH:HCOOH、99:1、v:v、5 mMギ酸アンモニウム)を準備します。LC-MSグレードの溶媒、水、試薬のみを使用してください。
- サンプルセットごとに、500 μLのLC-MSグレードのメタノールを含む4つのブランクオートローダーバイアルを準備します。
- サンプルのセットごとに、ステップ1.11で調製した内部標準液10 μL(各標準物質の合計250 pmol)を500 μLのLC-MSグレードメタノールで希釈することにより、2つの内部標準(ISとしてラベル付け)オートローダーバイアルを準備します。
- カラムオーブン温度を60°C、イオン源温度を500°Cに設定します。
- MS/MS分析には、分光器のトリプル四重極モードを利用します。最初の四重極(Q1)をプリカーサーイオンを通過するように設定し、3番目の四重極(Q3)を分子的に特徴的なプロダクトイオンを通過させる(またはQ1またはQ3の複数のm/zにわたるスキャン)ように設定し、N2を使用してQ1から30〜120 eVオフセットされた四重極2(Q2)の解離を衝突誘導します。
- 多重反応モニタリングペア(MRM)検出ウィンドウを120秒に設定し、ターゲットスキャン時間を1.0秒に設定します。MRMペア、イオン化エネルギー、および衝突エネルギーのリストについては、 表1 を参照してください。
- LCステップでスフィンゴ脂質を分離するには、次のパラメータを使用します:0.7 mL/minの流速を使用して、95%移動相A1と5%移動相B1の溶媒混合物で2.1(i.d)x 50 mm C18逆相カラムを0.5分間平衡化します。
- サンプル注入後、移動相A1/B1比を95/5で2.25分間維持し、続いて1.5分間にわたって100%B1への線形勾配を維持し、その後100%B1で5.5分間保持した後、0.5分間グラジエントして95/5 A1/B1に戻します。
- 実行後、95/5 A1/B1の混合物でカラムを0.5分間再平衡化します。
- サンプルオートローダーには次の設定を使用します:すすぎ量、500 μL;針ストローク、52 mm(これは各バイアルのバイアルのサイズと容量に応じて調整する必要があります);すすぎ速度、35μL/秒;サンプリング速度、5.0 μL/秒;すすぎ浸漬時間、2秒;吸引前後のすすぎモード。すすぎ時間、2秒。
- 手順 4.15 で準備したサンプルを次の順序でオートローダ トレイに置きます。です;空砲;ステップ4.15で調製したサンプル;空白、IS、空白。
- LC-ESI-MS/MS で各サンプルの 5-10 μL を分析し、データセット内のすべてのサンプルについて同じ量を分析します。
6. データ処理、統合、正規化
注:次の手順では、特定のソフトウェア( 材料表を参照)の手順の概要を説明しますが、同等のLC-MS機器およびソフトウェアで同様の手順を使用して、分析された脂質クラスおよび対応する内部標準のMRMペアを統合することができます。
- 定量ソフトウェアを開きます。 [ 定量]タブで、 定量ウィザードをダブルクリックします。ポップアップウィンドウの左端のワークスペースで、正しいデータセットに移動して左クリックします。使用可能なサンプルは、中央のワークスペースに表示されます。
- 分析するサンプルを強調表示し、右側の矢印をクリックして、選択したサンプルワークスペースに サンプル を追加します。[ 次へ ]をクリックして、デフォルト設定が通常使用される設定およびクエリ画面に移動します。
- [ 次へ ]をクリックして、統合方法の選択画面に移動します。分析する脂質のMRM遷移ペアを含む適切な統合方法を選択します。MRM 遷移ペアについては 、表 1 を参照してください。ヒット 終了.
注意: 保持時間は計装と個々の設定によって異なるため、個々のセットアップごとに確認する必要があります。 - ナビゲーション バーで、[ ピーク レビュー ] ウィンドウをクリックして、MRM ペアを検査できるようにします。レビューを容易にするには、[ ピーク レビュー ] ウィンドウを右クリックし、[ 自動ズーム] を 最大ピークの 100% に変更し、 ズーム ウィンドウ を 1.00 分から 2.00 分に変更します。
- 定量表示ウィンドウを右クリックし、分析種と検査するスフィンゴ脂質を選択します。ブランクサンプルにピークがないこと、およびISサンプルに正しいピークが積分されていることを確認します。
- 未知のサンプルの統合を開始します。一度に1つのスフィンゴ脂質クラスを作業し、内部標準のMRMペアの保持時間を調べます(つまり、C12:0セラミド)を選択し、ソフトウェアが正しいピークを統合していることを確認します。
- 同じ脂質クラスの分析種(すなわち、C14:0セラミド、C16:0-セラミドなど)、クラスで最も短い鎖長脂質から始めます。各鎖長脂質について、ソフトウェアルーチンが正しいMRMペアピークを内蔵していることを確認します。
- すべての分析対象物が統合されたら、分析対象のスフィンゴ脂質種(セラミド、スフィンゴミエリンなど)ごとに電子スプレッドシートを作成します。LC-MS/MS定量ソフトウェアで分析対象物の順序と鎖長に一致するように列ヘッダーにラベルを付けます。また、手順 3.9 で決定したサンプル ID とサンプル正規化の重みの列ヘッダーも含めます。
注:前述のように11、他の一般的な正規化尺度には、総リン酸脂質含量またはタンパク質量が含まれる。 - すべての分析種と内部標準のピーク領域を電子スプレッドシートにエクスポートまたはコピーします。
- 特定のスフィンゴ脂質クラスの各鎖長種の積分ピーク面積を、対応する内部標準のピーク面積で割ることにより、データを正規化します。たとえば、C14:0セラミド、C16:0セラミド、C18:1セラミドなどは、それぞれC12:0で分割する必要がありますセラミド内部標準ピーク面積。
- ピーク面積を、正規化されたピーク面積(ステップ6.10で計算)に、ステップ4.3でサンプルに添加した内部標準物質(ピコモール)の量を乗じることによって回収された脂質のモルに変換します。このプロトコルでは、この量は250pmolです。
- 各サンプル中の脂質の相対量を取得するには、各脂質鎖長のピコモルをステップ3.9で決定された組織重量で割ります。これにより、組織1mgあたりの脂質のピコモルの単位が得られます。
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Representative Results
このプロトコルでは、凍結保存されたヒト組織からOCTを除去し、LC-ESI-MS/MSによる分析のために組織を計量する方法について詳しく説明します。この手順に必要な材料は、材料表にリストされています。図1に示すのは、10個のヒト肺腺癌腫瘍と10個の正常隣接組織を洗浄してOCTを除去し、LC-ESI-MS/MSで分析した典型的な実験の結果です。 重要なことに、11を以前に示したように、肺腺癌腫瘍では、正常な隣接非関与組織と比較して有意に上昇しているセラミド(図1A)およびモノヘキソシルセラミド(図1B)にはさまざまな鎖長種があります。
セクション4で概説した脂質抽出ステップに対するOCTの効果を評価するための対照実験では、200 mgのマウス肝臓(C57BL6;男性;14〜16週齢)を2 mLのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、細かく粉砕されるまでホモジナイズしました。得られた微細な肝臓懸濁液を、次いで、プローブ超音波処理器(氷上で1分間の超音波処理、氷上での1分間の休息、60%パワー;マイクロチップの3ラウンド)で広範囲に超音波処理した。この溶液から、6つの300 μL肝臓ホモジネート複製物を調製しました。3回の反復に、200 mgのOCTを加え(バイオリポジトリ標本11に見られる平均量)、他の3回に200 μLの水を加えました。次に、サンプルは、セクション4で概説した手順に従って並行して処理されました。重要なことに、単相Bligh-Dryer溶液の遠心分離後、OCTを含むサンプルは白濁していましたが、水を含む対照サンプルは透明でした(図2A)。単相脂質抽出溶液中の白濁は、遠心分離の増加および広範な超音波処理(図示せず)の後でさえ持続した。溶媒が蒸発した後、OCTを含むサンプルは、激しいボルテックスおよび広範な超音波処理の下でもメタノール中で再構成することができなかった大きなペレット(図2B)を有した。OCTを含む試料はまた、分析された全ての種の内部標準について大きなシグナル損失を示した(図3A〜G)。また、OCTを含むサンプルは、分析されたスフィンゴ脂質の多くでシグナルの喪失を示したことも以前に示しました11。
典型的には、スフィンゴ脂質標準物質は、図4に示すように、D17:1スフィンゴシン、D17:1スフィンゴシン-1-リン酸、C12:0の順序で順次溶出することが予想される。ラクトシルセラミド、C12:0モノヘキソシルセラミド、C12:0スフィンゴミエリン、およびC12:0セラミド。これらのスフィンゴ脂質種のそれぞれについて、セクション5および以前の11で説明した勾配と計装の設定を使用すると、鎖長が2炭素増加するごとに保持時間に約+0.15分のシフトがあります。例えば、図5に示すように、C14:0-セラミド(図5B)は、C12:0-セラミド(図5A)よりも約+0.15分遅れて溶出します。脂肪酸の二重結合は保持時間が-0.15シフトすることが多いため、C16:0-セラミド(図5C)の保持時間はC18:1-セラミド(図5D)と同様になります。ただし、鎖長の脂質が長いほど(C24:0、C26:0)、保持時間のシフトが大きくなる可能性があります(それぞれ図5I、K)。
図1:肺腺癌および隣接する関与していない肺組織のスフィンゴ脂質プロファイル。 組織をOCTに極低温保存し、解凍し、3つのsOCTrPサイクルで処理し、重量を測定し、LC-ESI-MS/MSで分析しました。示されたアシル鎖長種のセラミド(A)、モノヘキソシルセラミド(B)、スフィンゴミエリン(C)、ラクトシルセラミド(D)、およびスフィンゴシン(E;Sph)、スフィンゴシン-1-ホプシャート(F;S1P)、ジヒドロ-Sph(E)、およびジヒドロ-S1P(F)を定量した。n = 10個の腫瘍およびn = 10個の隣接する非関与組織。箱ひげ図は、中央値(黒い線)と最小から最大nsのひげを示していますが、有意ではありません。、p≤0.005;、p ≤ 0.0005。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:OCTの有無にかかわらず抽出したサンプルの代表的な画像。 マウス肝臓をホモジナイズし、超音波処理し、6つの同一のサンプルに分割した:200mgのOCTを3つのサンプルに添加し、他の3つに水を加えた。(A)メタノールとクロロホルムを加えて2:1:0.1のメタノール:クロロホルム:水(v:v:v)の比率を達成した後、48°Cで一晩インキュベートした後、遠心分離を行った後、OCTを含むサンプルの上清は白濁し、超音波処理、ボルテックス、または遠心分離によって清澄化できませんでした。(B)溶媒蒸発に続いて、広範な超音波処理およびボルテックスの後に0.5mLのメタノール中で完全に再構成できなかったOCTを含むサンプルから大きなペレットを回収した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:OCTの存在下または非存在下でのスフィンゴ脂質標準のLC-ESI-MS/MS定量。 マウスの肝臓をホモジナイズし、超音波処理し、6つの同一のサンプルに分割した。6つのサンプルのうち3つに200 mgのOCTを加え、他の3つには水を加えました。内部標準物質、メタノール、クロロホルムを添加した後、サンプルを同様に処理し、抽出した脂質をLC-ESI-MS/MSで分析しました。 示された脂質(A-F)の多重反応モニタリング(MRM)ペア、および対応する積分ピーク面積(G)が示されています。略語:Sph、スフィンゴシン;S1P、スフィンゴシン-1-リン酸。黒い矢印は、示されたスフィンゴ脂質の正しいMRMペアを指しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:スフィンゴ脂質標準のLC-ESI-MS/MS多重反応モニタリングペアの相対保持時間。 マウスの肝臓をホモジナイズし、超音波処理した。内部標準、メタノール、およびクロロホルムを追加。LC-ESI-MS/MS によって抽出および分析された脂質は、示された脂質(A-F)の複数の反応モニタリングペアの保持時間を示す。液体クロマトグラフィー勾配中に脂質が溶出する相対的な順序に注意してください。略語:Sph、スフィンゴシン;S1P、スフィンゴシン-1-リン酸;SM、スフィンゴミエリン。X 軸は MRM ペアの保持時間 (分単位) です。Y 軸は MRM ペアの信号強度です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:LC-ESI-MS/MS MRMペアの保持時間のアシル鎖長依存的なシフト。 マウスの肝臓をホモジナイズし、超音波処理した。内部標準、メタノール、およびクロロホルムを追加。LC-ESI-MS/MS によって抽出および分析された脂質は、示された脂質の保持時間とMRMペアです。さまざまな脂質(A-K)のアシル鎖長の増加に伴う保持時間の変化に注目してください、これは通常、2-炭素増加あたりの+0.15分の保持時間に相当します。二重結合により、保持時間シフト(D、H、J)が-0.15分になります。しかしながら、より長い鎖状脂質の場合、保持時間の相対的な増加はより長くなり得る(G−K)。X 軸は MRM ペアの保持時間 (分単位) です。Y 軸は MRM ペアの信号強度です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:LC-ESI-MS/MS分析のためのMRMペア、イオン化パラメータ、および衝突エネルギー。DP、脱クラスタリングの可能性。CE、衝突エネルギー。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
OCTは、バイオリポジトリで使用される一般的な長期凍結保存剤です。しかしながら、OCTは、組織が様々な質量分析プラットフォーム12、13、14、15によって分析されるときにイオン抑制をもたらし、またはサンプルがLC-ESI-MS/MS 11によって分析されるときにシグナルの損失をもたらし得る。凍結保存された組織中のOCTは、ブラッドフォードやBCA11などの計量やタンパク質定量アッセイなどの組織正常化方法にも干渉する可能性があります。ここでは、ヒト組織からOCTを除去し、その後質量分析によって分析するための詳細なプロトコルを提示します。プロトコルは、肺ではない他の組織源を使用するように、または我々が以前に説明したようにマウス組織からのものを使用するように改変され得る11。さらに、我々が以前に説明したものを含む他の質量分析データ正規化戦略11、ならびに他の検証された方法を用いることができる。
このプロトコルの重要な制限は、ホルムアルデヒドまたは他の固定剤で以前に固定された組織の分析には十分ではないことです。固定されておらず、OCTで凍結保存されている組織にのみ適しています。さらに、この方法は、sOCTrPステップおよびチューブ間の移動中に常にいくらかの組織損失があるため、重量が1〜2 mg未満の組織の処理には適していません。標準的な分析スケールを使用してこのような小さな組織を計量することは困難であり、吸湿発散段階で除去されなかった残りのPBSは実験誤差に大きく影響します。以下は、この方法でOCTを除去するために組織を洗浄する際の他の重要な考慮事項です。
このプロトコルを円滑に実行するために、特に多くのサンプルを処理する場合は、1.5 mLチューブの事前標識と計量、13 x 100 mmスクリューキャップチューブとキャップ、13 x 100 mm培養チューブ、オートインジェクターバイアルの事前標識、すべての芯の準備、1 mLピペットチップの事前短縮など、セクション1で概説されている手順を事前に実行する必要があります。 およびプレチル洗浄液。これにより、ティッシュを洗浄する日に時間のかかる手順を実行する必要がなくなり、遅延につながる可能性があります。一般に、これらのステップの多くが前日に実行された場合、経験豊富な研究者は通常の作業日に30〜40個の検体を洗浄できることがわかりました。ただし、最初に提案された停止点は、すべての組織を洗浄し、計量し、メタノールに入れて-80°Cで保存した後であるため、事前に1.5 mLの事前計量と標識を行わないと、効率に影響を与え、30〜40の組織を洗浄するために必要な時間が長くなります。
組織の計量は、エラーや不注意がデータの正規化に引き継がれるため、データ品質に影響を与えるため、最も重要なステップの1つです。計量に使用される分析天びんを校正し、適切にゼロ調整し、風袋引きすることが重要です。したがって、芯を使用する場合、特に5 mg未満の組織の重量では、できるだけ多くの洗浄液を除去することが重要です。これらの組織重量では、残りの洗浄液は計量を大幅に不正確にし、データの正規化のエラーとして持ち越されます。洗浄液を除去する場合、芯への付着による組織の大きな損失につながることなく、組織を芯で数秒間穏やかに接触させて、できるだけ多くの洗浄液を除去できることがわかりました。ただし、洗浄される各組織タイプは、芯への接着についてテストする必要があり、プロトコルのこれらのステップはそれに応じて調整されます。
組織洗浄ワークフローを容易にするために、組織の削りくずを15 mLポリプロピレンチューブのバイオリポジトリから要求することをお勧めします。これにより、洗浄前のティッシュの取り扱いが軽減されます。
組織を洗浄するときに、3回目のsOCTrPサイクル後にチューブの底にゲル状の物質が観察された場合、これはすべてのOCTが除去されたわけではなく、より多くのsOCTrPサイクルが必要であることを示しています。必要なサイクル数を追跡し、一貫性を保つために、データセット内のすべての検体で同じ数のsOCTrPサイクルを実行します。これまでに最大9回のsOCTrPサイクルを評価しましたが、組織内のスフィンゴ脂質の枯渇には影響が見られませんでした11。
芯を使用して洗浄液を除去する場合は、ティッシュを軽くたたくと、すべての洗浄液が確実に除去されます。これにより、組織重量推定の精度が向上します。ただし、非常に小さな組織では、芯に付着して標本が失われる可能性があるため、細心の注意を払う必要があります。できるだけ多くの溶液を除去するために、同じチューブに複数の芯を使用すると便利です。サンプル間の汚染を防ぐために、サンプルごとに常に新しい清潔な芯を使用してください。芯を作るときは、以前にこれらをテストし、ごくわずかな量の汚染スフィンゴ脂質が含まれていることがわかったため、実験室グレードの組織( 材料の表を参照)を使用してください11。他の材料からの芯は、それらが説明されたようにテストされれば使用することができる11。
計量後に1.5 mLチューブから検体を回収する場合、すべての組織を回収することが重要です。そうしないと、データの正規化でエラーが発生します。すべての組織を回収するためにさらにPBSが必要な場合は、異なる量のPBSを含むサンプルに起因する可能性のある抽出効率の違いを回避するために、他のすべてのチューブに使用される同等の量のPBSを追加します。水量の増加を考慮してクロロホルムとメタノールの量を調整し、メタノール:クロロホルム:水の比率を2:1:0.1に維持します。
試料を解凍するときは、スフィンゴシン-1-リン酸などの不安定な脂質の分解を避けるために、このステップを氷上で行うことが重要です。OCTが液体状態になるまでサンプルを完全に解凍すると、初期の洗浄ステップでペレットとして残るのではなく、低温洗浄液に溶解しやすくなるため、OCTの除去も容易になります。
時折、特に肺組織を洗浄する場合、ペレット化せず、遠心分離後に洗浄液の上に浮かぶ破片があります。注意して、吸引チップを浮遊組織の下に浸して洗浄液を除去すると、吸引中の損失を防ぐことができます。
使い捨てホモジナイザーチップはプラスチック製で、クロロホルムを含む溶液に溶解するため、均質化前にサンプルにクロロホルムを追加しないでください。これは、サンプル中の脂質のLC-MS/MS定量に大きな影響を与える可能性があります。したがって、一般に、クロロホルムとメタノールを分配するときは、溶剤に耐性のないプラスチックの使用は避ける必要があります。これらの溶剤も有毒であり、適切なヒュームフードで取り扱う必要があります。メタノールやクロロホルムなどの溶剤を取り扱うときは、適切なPPEを着用してください。
ヒト組織は、適切なバイオセーフティキャビネット(クラスIIなど)で処理する必要があります。ユーザーは、バイオハザード物質および人間由来の液体の取り扱いについて訓練を受け、適切な個人用保護具の着用や、標本と接触する表面または機器の除染などの安全プロトコルに従う必要があります。ユーザーは、洗浄手順中に使用される表面または機器(遠心分離機、遠心分離機キャリアおよびアダプター、ピペッター、ボルテックス、ヒュームフード表面、天びん、ガラス製品、製氷皿、コンピューターのキーボード、コンピューターマウスなど)を完全に消毒する必要があります(推奨される除染剤については 、材料の表 を参照してください)。ラボのメンバーは、完全に消毒されるまで、組織洗浄に使用される機器やフードを使用しないでください。鋼の表面や電子機器への漂白剤の使用は避けてください。
多くのサンプルを処理する場合は、脂質抽出ステップ中の再キャップステップでクリーンキャップを使用してクロスコンタミネーションを防ぐために注意してください。キャップは、ラベルが付いている場合は再利用することもできます。しかし、実際には、マーカーは黒いキャップで目立たず、48°Cの一晩のインキュベーション中に粘着ラベルがチューブから落ちることがわかりました。
スフィンゴ脂質は、疾患およびヒト癌の病因において重要なプレーヤーであることが実証されている。したがって、これらの疾患におけるスフィンゴ脂質代謝の変化は、治療標的を明らかにする可能性があるため、正確に定義することに大きな関心が寄せられています。しかし、研究者が容易にアクセスできる組織の多くはOCTで凍結保存されており、質量分析とは互換性がありません。したがって、ここで説明する詳細なプロトコルは、定量的スフィンゴリピドミック解析に適した組織のレパートリーを拡大し、したがって、ヒトの疾患および癌における脂質代謝変化の生物学の理解を深めるのに役立ちます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
研究プロジェクトのサービスとサポートは、VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis CoreとVCU Lipidomics and Metabolomics Coreによって提供され、NIH-NCIがんセンター支援助成金P30CA016059からの資金提供を受けて部分的に支援されています。この研究は、国立衛生研究所助成金R21CA232234(サンティアゴリマ)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
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