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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Preparação de tecidos humanos incorporados em composto de temperatura de corte ideal para análise de espectrometria de massa

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62552
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

Summary

Os esfingolípidos são metabólitos bioativos com papéis bem estabelecidos na doença humana. Caracterizar alterações em tecidos com espectrometria de massa pode revelar papéis na etiologia da doença ou identificar alvos terapêuticos. No entanto, o composto OCT usado para criopreservação em biorrepositórios interfere na espectrometria de massa. Delineamos métodos para analisar esfingolipídios em tecidos humanos incorporados em OCT com LC-ESI-MS/MS.

Abstract

Os esfingolípidos são componentes celulares que têm papéis bem estabelecidos no metabolismo humano e na doença. A espectrometria de massa pode ser usada para determinar se os esfingolipídios estão alterados em uma doença e investigar se os esfingolipídios podem ser direcionados clinicamente. No entanto, estudos prospectivos adequadamente alimentados que adquirem tecidos diretamente do conjunto cirúrgico podem ser demorados e técnico, logístico e administrativamente desafiadores. Em contraste, estudos retrospectivos podem tirar proveito de espécimes humanos criopreservados já disponíveis, geralmente em grande número, em biorrepositórios de tecidos. Outras vantagens de adquirir tecidos de biorrepositórios incluem o acesso a informações associadas aos espécimes de tecido, incluindo histologia, patologia e, em alguns casos, variáveis clínico-patológicas, todas as quais podem ser usadas para examinar correlações com dados lipidômicos. No entanto, limitações técnicas relacionadas à incompatibilidade do composto de temperatura de corte ideal (OCT) utilizado na criopreservação e espectrometria de massas é uma barreira técnica para a análise de lipídios. No entanto, mostramos anteriormente que a OCT pode ser facilmente removida de amostras de biorrepositório humano através de ciclos de lavagens e centrifugação sem alterar seu conteúdo de esfingolipídios. Também estabelecemos anteriormente que os esfingolípidos em tecidos humanos criopreservados em OCT são estáveis por até 16 anos. Neste relatório, descrevemos as etapas e o fluxo de trabalho para analisar esfingolipídios em amostras de tecido humano que estão incorporadas na OCT, incluindo lavagem de tecidos, pesagem de tecidos para normalização de dados, extração de lipídios, preparação de amostras para análise por cromatografia líquida eletrospray ionização em tandem espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS), integração de dados de espectrometria de massa, normalização de dados e análise de dados.

Introduction

Os esfingolípidos são metabólitos bioativos conhecidos por seus papéis no metabolismo humano e na doença 1,2. Regulam processos celulares complexos, como migração celular, sobrevivência e morte celular, movimento celular, tráfico vesicular, invasão e metástase celular, angiogênese e produção de citocinas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defeitos na regulação do metabolismo esfingolipídico contribuem para o início e progressão dos cânceres, determinam o quão agressivos são os cânceres e como os cânceres respondem e desenvolvem resistência à terapia 3,10. Portanto, devido a esses amplos impactos na etiologia da doença, métodos analíticos que possam estabelecer com precisão alterações esfingolipídicas específicas da doença são ferramentas importantes. A espectrometria de massas (EM) é o método mais preciso e confiável para analisar as alterações esfingolipídicas.

Espécimes humanos que podem ser utilizados para a análise de alterações esfingolipídicas podem ser obtidos prospectivamente do conjunto cirúrgico ou retrospectivamente de biorrepositórios teciduais. Tecidos frescos da cirurgia são vantajosos porque podem ser analisados diretamente pela EM ou outros métodos analíticos. No entanto, a aquisição de tecidos prospectivamente tem obstáculos administrativos, técnicos e logísticos, e a coleta de espécimes suficientes para alcançar o poder estatístico pode ser um desafio. A obtenção de tecidos de biorrepositórios é vantajosa porque eles podem ser adquiridos retrospectivamente, em grande número, e os biorrepositórios confirmam histologia e patologia, usam procedimentos operacionais padrão para preservar e armazenar tecidos criogenicamente e podem fornecer dados clínico-patológicos que podem ser usados para análises de correlação. No entanto, para preservar características moleculares e estruturais, os biorrepositórios podem criopreservar tecidos, incorporando-os em composto de temperatura de corte ideal (OCT), que mostramos interferir nos ensaios de normalização de dados e na quantificação de esfingolipídios por cromatografia líquida por espectrometria de massa em tandem de ionização por eletrospray por cromatografia líquida (LC-ESI-MS/MS)11 . Também foi demonstrado que o álcool polivinílico e o polietilenoglicol, os componentes primários do composto OCT, resultam em supressão iônica em outras plataformas de análise de SM12,13,14,15. Portanto, o composto OCT deve ser removido dos tecidos antes da análise esfingolipidômica pela EM.

Em um relatório anterior, validamos um protocolo para a remoção de composto OCT de espécimes humanos para análise LC-ESI-MS/MS11 e a metodologia utilizada para pesagem de tecidos para normalização de dados11. Aqui, detalhamos as etapas do protocolo de remoção de compostos OCT esfingolipidômicos (sOCTrP) e mostramos dados representativos de tumores de adenocarcinoma pulmonar humano e tecidos adjacentes normais não envolvidos.

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Protocol

Tecidos pulmonares humanos não identificados foram obtidos do Núcleo de Aquisição e Análise de Tecidos e Dados da Virginia Commonwealth University (VCU) sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Interna (IRB) (#HM2471). O uso de camundongos para pesquisa e colheita de tecidos de camundongos foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da VCU (IACUC).

1. Preparação de materiais

NOTA: Estas etapas devem ser realizadas um dia antes da lavagem do tecido.

  1. Pré-rotule e pese 1,5 mL de tubos de centrífuga de polipropileno com códigos identificadores concisos, mas claros, para cada amostra que será processada no dia seguinte. Use um marcador permanente quimicamente resistente (consulte Tabela de Materiais) que não desbote sob o manuseio repetido do tubo.
  2. Abra uma planilha eletrônica e rotule colunas consecutivas com os seguintes cabeçalhos de coluna: identificador de tubo (ID), tubo sozinho, tubo com tecido e tecido total. Insira os identificadores de tubo que serão processados na coluna rotulada como ID do tubo.
  3. Pré-calibrar e zerar uma escala analítica. Colocar um balão de Erlenmeyer de 10 ml limpo no centro da placa de equilíbrio (o balão actuará como um suporte de tubo). Feche a porta da câmara de pesagem e pise a balança com o balão.
  4. Pesar 1,5 mL de tubos de centrífuga. Colocar cuidadosamente o tubo no balão e fechar a porta da câmara de pesagem. Deixe o peso estabilizar e registre o peso apenas no tubo rotulado na coluna.
    NOTA: Evitar mover o balão de Erlenmeyer de 10 ml aquando da pesagem dos tubos. Se o balão for deslocado, voltar a centralizá-lo e voltar a pisar a balança. Coloque os tubos fechados em um rack e guarde até que seja necessário.
  5. Pré-rotule tubos e tampas de vidro de 13 x 100 mm com os códigos identificadores e preencha-os com 2 mL de metanol de grau LC-MS. Coloque-os em um rack de tubos, tampe os tubos e guarde-os em uma geladeira (4 °C) até o uso.
    NOTA: Use um dispensador de solvente com tampa de garrafa (consulte Tabela de materiais). Se um não estiver disponível, use pipetas de vidro para evitar o uso de plásticos ao dispensar solventes orgânicos.
  6. Pré-etiquetar tubos de ensaio de vidro de 13 x 100 mm. Cobrir e armazenar os tubos de ensaio à temperatura ambiente.
  7. Frascos para injetáveis automáticos pré-rotulados com códigos identificadores. Tampar e conservar os frascos para injetáveis automáticos à temperatura ambiente até à utilização.
  8. Prepare mechas de secagem de tecido.
    1. Comece limpando a tesoura cirúrgica imergindo-as em metanol de grau LC-MS por 5 minutos e, em seguida, limpe-as com um tecido de grau laboratorial limpo.
    2. Usando luvas sem pó, gire a extremidade de um tecido de grau laboratorial (ver Tabela de Materiais) até que um pavio finamente cônico de 30-40 mm seja formado.
    3. Usando uma tesoura limpa com metanol, corte o pavio na extremidade grossa. Coloque mechas em uma caixa de papelão limpa. Faça o dobro do número de mechas que será necessário para processar todas as amostras.
  9. Prepare pontas de pipeta encurtadas de 1 mL. Usando uma tesoura cirúrgica limpa com metanol, corte 4-5 mm da ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL e coloque a ponta de volta no suporte da ponta. Prepare o dobro de pontas do que as amostras a serem processadas.
    NOTA: Estes serão utilizados na recuperação de tecidos lavados de tubos. Não toque no final da ponta.
  10. Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-frio de grau de biologia molecular a 4 °C (0,5 L é suficiente). Isso será usado para recuperar espécimes. Para cada amostra que será processada, pré-refrigerar (4 °C) 60 mL de água deionizada ultrapura.
  11. Preparar padrões internos de espectrometria de massa. Dissolver os seguintes lípidos em etanol:metanol:água (7:2:1; v/v/v) numa concentração de 25 nmol/ml: d17:1-esfingosina, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-eno-1,3-diol; d17:1-esfingosina-1-fosfato, heptadecasphing-4-enina-1-fosfato; C12-Ceramida (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-esfing-4-enina; C12-esfingomielina (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-esfing-4-enina-1-fosfocolina; C12-glucosilceramida (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-1-β-glucosil-esfing-4-eína; C12-lactosilceramida (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-1-ß-lactosil-esfing-4-ene.

2. Lavagem de tecidos

NOTA: Completar todas as etapas da seção 1 um dia antes permite que um pesquisador qualificado processe até 40 amostras por dia e novatos ~ 10-15 amostras por dia. Comece de manhã cedo e não pare até que todas as etapas das seções 2.1-3.8 sejam concluídas.

  1. No dia em que os tecidos serão processados, prepare a área de trabalho do gabinete de biossegurança, equipando-a com um vórtice, um pipetador sorológico totalmente carregado e uma bandeja de gelo. Para todas as etapas desta seção, use EPIs apropriados, incluindo um jaleco, uma camada dupla de luvas e óculos de proteção. CUIDADO: Tecidos e fluidos humanos devem ser considerados e tratados como materiais bioperigosos.
  2. Pré-arrefecer (4 °C) uma centrífuga de balde oscilante, quaisquer adaptadores necessários para segurar tubos de centrífuga cônica de 15 mL e tampas de biocontenção de centrífuga. Pré-resfriamento (4 °C) uma centrífuga de ângulo fixo capaz de conter tubos de centrífuga de 1,5 mL.
  3. Se os tecidos não forem aliquotados em tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL, use uma espátula limpa com metanol (limpa para cada nova amostra de tecido) para transferi-los para tubos de polipropileno pré-marcados de 15 mL. Rotule as tampas de 15 mL também.
    1. Coloque um rack de tubos capaz de armazenar tubos de centrífuga de 15 mL em uma bandeja de gelo e encha a bandeja com gelo. Descongele os tecidos que serão processados naquele dia, colocando-os no rack sobre gelo.
      NOTA: Um mínimo de 3-4 mg de tecido deve ser solicitado ao biorrepositório para processamento, pois foi demonstrado anteriormente que os protocolos de lavagem e pesagem de tecidos são precisos e confiáveis nesses pesos11.
  4. Mova a bandeja de gelo com as amostras para o armário de biossegurança.
  5. Execute três ciclos sOCTrP11 , conforme discutido abaixo (ou seja, execute as etapas 2.5.1-2.5.5 três vezes).
    1. Adicione 10 mL de água deionizada ultrapura gelada a cada tubo e cubra-os com força. Deixe os tubos incubarem por 10 min.
    2. Vórtice vigorosamente cada tubo por 10-20 s ou até que todo o tecido depositado nas paredes do tubo, ou um pellet de tecido, seja completamente ressuspenso.
      NOTA: Nos ciclos sOCTrP 2-3, é fundamental que o pellet seja ressuspenso para que qualquer OCT no pellet seja diluído na solução de lavagem.
    3. Transfira os tubos para a centrífuga de balde oscilante pré-refrigerada (4 °C). Amostras de centrífuga a 4.000-5.000 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Evite a geração e a exposição a aerossóis bioperigosos gerados durante a centrifugação selando os transportadores de centrífuga com uma tampa de biocontenção (ver Tabela de Materiais).
    4. Recupere amostras da centrífuga e transfira para a bandeja de gelo. Coloque a bandeja em um armário de biossegurança e destampe os tubos. Salve as tampas.
    5. Aspirar cuidadosamente a solução de lavagem. Evite aspirar o material tecidual no pellet, deixando ~0,5 mL do sobrenadante no tubo. Tampa os tubos e evita a contaminação cruzada, combinando tampas rotuladas com tubos.
      NOTA: A solução de lavagem (o sobrenadante) na etapa 2.5.5 é um material bioperigoso; manuseá-lo e eliminá-lo de acordo com as directrizes de biossegurança adequadas aos espécimes de origem humana.

3. Pesagem de tecidos (para normalização de dados)

  1. Após o último ciclo de lavagem sOCTrP, aspirar cuidadosamente a maior parte da solução de lavagem, mas evitar perturbar o pellet. Deixe ~0,5 mL da solução de lavagem no tubo.
  2. Usando as pontas da pipeta encurtadas (preparadas na etapa 1.9), pegue 500 μL de PBS gelado e adicione-o ao tubo.
    1. Usando a mesma ponta, ressuspeite suavemente a pastilha e recupere todo o tecido. Evite a pipetagem turbulenta para diminuir a perda de tecido pela sua aderência às paredes do tubo e da ponta da pipeta.
  3. Adicione o tecido ressuspenso ao tubo de centrífuga de 1,5 mL pré-marcado e pré-pesado correspondente e coloque o tubo no gelo. Repita para todos os tecidos do conjunto de dados.
  4. Colocar os tubos de 1,5 ml numa centrífuga pré-refrigerada e pellet os tecidos a 7.000 x g durante 5-7 min e 4 °C.
    1. Recupere os tubos e aspirar cuidadosamente o máximo possível do PBS sem perturbar o pellet. Coloque o tubo de volta no gelo.
  5. Tubos de centrífuga por mais 3 min a 7.000 x g para garantir que os tecidos estejam bem peletizados. Transfira os tubos para o gelo.
    NOTA: A etapa de centrifugação adicional é importante para evitar a perda de tecido ao remover toda a solução de lavagem e wicking. Se processar mais de cinco amostras, repita a etapa de centrifugação de 3 minutos e 7.000 x g após cada quinta amostra ser processada para garantir que os tecidos permaneçam peletizados.
  6. Usando as mechas preparadas na etapa 1.8, remova suavemente qualquer solução de lavagem restante. Use um pavio limpo para cada amostra. É aceitável esfregar suavemente o tecido com o pavio, o que ajudará a remover a maior parte da solução de lavagem, mas evitará a perda de qualquer tecido por aderência ao pavio. Feche o tubo e coloque-o no gelo.
  7. Pese cada tubo na balança analítica recentemente calibrada, e zerada.
    1. Colocar cada tubo no balão de vidro de Erlenmeyer e fechar a porta da câmara. Quando o peso tiver se estabilizado, registre-o na coluna da planilha eletrônica rotulada tubo com tecido.
    2. Após a pesagem, coloque o tubo de volta no gelo.
  8. Adicionar 300 μL de PBS gelado. Usando uma ponta de pipeta encurtada (etapa 1.9), recupere cuidadosamente todo o tecido e deposite em um tubo de vidro pré-rotulado com tampa de rosca (preparado na etapa 1.5) contendo 2 mL de metanol gelado de grau LC-MS (adicione o tecido ao metanol, não ao lado do tubo).
  9. Calcule a quantidade de tecido que foi lavado subtraindo o tubo sozinho do tubo com o valor do tecido. Registre esse número na coluna de tecido total. O valor tecidual total será utilizado para normalizar os dados de espectrometria de massas na etapa 6.12.
  10. Conservar as amostras a -80 °C até estarem prontas para executar os passos 4.1-4.15.
    NOTA: Este é um bom ponto de paragem, e as amostras podem ser armazenadas com segurança durante um par de semanas a -80 °C. Para outros métodos de normalização tecidual, como concentração de proteínas ou teor de fosfato lipídico, consulte Rohrbach et al.11.

4. Extração lipídica

NOTA: É importante iniciar essas etapas pela manhã, especialmente quando muitas amostras serão processadas. Antes de começar, pré-aqueça um banho-maria ou incubadora a 48 °C.

  1. Recolher do congelador as amostras preparadas na fase 3.8 e as normas lipídicas MS (preparadas na fase 1.11). Deixe-os se equilibrar à temperatura ambiente por 20 min.
  2. Vórtice e mergulhe a solução de padrão interno em banho-maria ultra-sônico (ver Tabela de Materiais) por 2-3 min ou até que os padrões lipídicos MS sejam totalmente dissolvidos antes da distribuição em amostras. Isso evitará erros na normalização de dados.
  3. Usando uma pipeta de repetição, adicionar 250 pmol (10 μL da solução de 25 nmol/mL preparada na etapa 1.11) de padrões internos de espectrometria de massa a cada tubo. Re-tampar os tubos levemente.
  4. Para facilitar a homogeneização, ajuste o volume de metanol para 2 mL. Use apenas metanol de grau LC-MS/MS.
  5. Trabalhando um tubo de cada vez, use um homogeneizador para triturar o tecido até que nenhum aglomerado seja visível (tipicamente 5-20 s). Mova a ponta do homogeneizador em um movimento circular e pressione suavemente contra a parede do tubo para ajudar na trituração. Re-tampar o tubo.
    NOTA: Garantir que todos os tecidos estejam finamente triturados maximizará a extração lipídica. Não adicione clorofórmio às amostras antes da homogeneização, pois as pontas do homogeneizador descartáveis são feitas de plástico que se dissolverá em soluções contendo clorofórmio.
  6. Mergulhe o tubo em um ângulo de 45 ° em um banho de água ultra-sônico por 5-10 s.
    1. Se nenhum aglomerado de tecido se formar ao mergulhar no banho ultrassônico, tampa-o e passe para o próximo tubo.
    2. Se os aglomerados de tecido se formarem quando o tubo estiver imerso no banho ultrassônico, re-homogeneizar e atingir os aglomerados.
    3. Repita este processo (homogeneização / imersão em um banho ultra-sônico) iterativamente até que todos os grandes aglomerados de tecido sejam quebrados.
  7. Em um exaustor, adicione clorofórmio e metanol de grau LC-MS a cada tubo (use um dispensador de topo de garrafa) para obter uma proporção de 2:1:0,1 metanol:clorofórmio:água. Usando tampas limpas, sele bem os tubos e deixe na bancada até o final do dia.
    1. Para tecidos com peso igual ou inferior a 50 mg, utilizar um volume de extração total de 4 ml e ajustar utilizando esta proporção (solução de extração de 50 mg:4 ml) para amostras maiores.
  8. Antes de sair à noite, coloque os tubos bem tampados em banho-maria ou incubadora a 48 °C e incube-os durante a noite.
    NOTA: É fundamental que os tubos sejam firmemente tampados para que as proporções de solvente não mudem devido à evaporação.
  9. Na manhã seguinte, recolher as amostras do banho-maria a 48 °C e pellet quaisquer detritos insolúveis em solvente por centrifugação a 4.000-5.000 x g a 4 °C durante 20 min.
  10. Trabalhando em um exaustor, decante cuidadosamente o sobrenadante nos tubos de ensaio de vidro borossilicato de 13 x 100 mm pré-rotulados. Incline o tubo de 13 x 100 mm em um ângulo de 30-45° para facilitar a decantação.
    NOTA: Se processar mais de 12 amostras, não permita que os tubos centrifugados permaneçam por longos períodos de tempo, pois os pellets amolecerão e os detritos insolúveis serão transferidos ao executar a etapa 4.10. Para evitar isso, tire apenas 12 tubos da centrífuga de cada vez e continue centrifugando os outros tubos até que esteja pronto para decantá-los.
  11. Transfira os tubos para um concentrador de vácuo capaz de armazenar tubos de 13 x 100 mm. Evaporar todo o solvente com um passo de aquecimento inicial de 1 h (40 °C) e correr sob o vácuo máximo.
  12. Remova os tubos do concentrador a vácuo e adicione 500 μL de metanol de grau LC-MS (use um dispensador de tampa de garrafa) a cada tubo.
  13. Ressuspeite os extratos lipídicos secos por vórtice por 5-10 s, seguido de tubos de imersão em um ângulo de 45 ° em um banho de água ultra-sônico por 2 minutos enquanto gira o tubo. Re-vórtice por 5 s e mergulhe em banho-maria ultra-sônico por um minuto adicional.
    NOTA: Este é um passo crítico para garantir a recuperação máxima dos lipídios extraídos. Não avance até que todo o material seco na parede do tubo tenha sido ressuspenso.
  14. Colocar os tubos de 13 x 100 mm numa centrífuga pré-refrigerada (4 °C) e remover quaisquer detritos insolúveis por centrifugação a 4.000-5.000 x g a 4 °C durante 20-30 min.
  15. Decante cuidadosamente o sobrenadante clarificado num frasco para injetáveis automáticos pré-rotulado. Inclinar o frasco para injetáveis do autoinjetor em um ângulo de 30-45° facilitará a decantação. Certifique-se de que todo o conteúdo do tubo de 13 x 100 mm é decantado no frasco para injetáveis do carregador automático.
  16. Tampar bem os tubos e armazenar os tubos a -80 °C até à análise por LC-ESI-MS/MS.

5. Análise LC-ESI-MS/MS

NOTA: O procedimento a seguir usa um sistema de bomba binária acoplado a um autoinjetor, desgaseificador e sistema LC-MS/MS operando em um modo triplo-quadrupolar. A temperatura da coluna foi mantida por meio de um forno de coluna. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o equipamento utilizado.

  1. Preparar a fase móvel A1 (CH 3 OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, com formato de amónio 5 mM) e a fase móvel B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, com formato de amónio 5 mM). Use apenas solventes, água e reagentes de grau LC-MS.
  2. Para cada conjunto de amostras, preparar quatro frascos para injetáveis automáticos Blank contendo 500 μL de metanol de grau LC-MS.
  3. Para cada conjunto de amostras, preparar dois frascos para injetáveis automáticos de padrão interno (rótulo como está) diluindo 10 μL (total de 250 pmol cada padrão) da solução padrão interna preparada na etapa 1.11 em 500 μL de metanol de grau LC-MS.
  4. Ajuste a temperatura do forno de coluna para 60 °C e a temperatura da fonte de iões para 500 °C.
  5. Para a análise MS/MS, utilize o modo triplo-quadrupolo do espectrômetro. Defina o primeiro quadrupolo (Q1) para passar íons precursores, enquanto define o terceiro quadrupolo (Q3) para passar íons produto molecularmente distintos (ou uma varredura através de múltiplos m / z em Q1 ou Q3) usando N2 para induzir colisionalmente dissociações no quadrupolo 2 (Q2), que é deslocado de Q1 por 30-120 eV.
  6. Defina a janela de detecção de pares de monitoramento de reações múltiplas (MRM) em 120 s com um tempo de varredura alvo de 1,0 s. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de pares de MRM, energias de ionização e energias de colisão.
  7. Use os seguintes parâmetros para resolver esfingolipídios na etapa LC: usando uma taxa de fluxo de 0,7 mL/min, equilibre uma coluna de fase reversa C18 de 2,1 (i.d) x 50 mm por 0,5 min com uma mistura de solvente de 95% de fase móvel A1 e 5% de fase móvel B1.
    1. Após a injeção da amostra, mantenha a relação A1/B1 da fase móvel em 95/5 por 2,25 min, seguida por um gradiente linear para 100% B1 durante 1,5 min, que é então mantido em 100% B1 por 5,5 min, seguido por um retorno gradiente de 0,5 min para 95/5 A1/B1.
    2. Após a corrida, reequilibrar a coluna com uma mistura de 95/5 A1/B1 durante 0,5 min.
  8. Use as seguintes configurações para o carregador automático de amostra: volume de enxágue, 500 μL; curso da agulha, 52 mm (isto deve ser ajustado dependendo do tamanho e volume do frasco para injetáveis em cada frasco para injetáveis); velocidade de enxágue, 35 μL/s; velocidade de amostragem, 5,0 μL/s; tempo de imersão de enxágue, 2 s; modo de enxágue, antes e depois da aspiração; tempo de enxágue,2 s.
  9. Coloque as amostras preparadas na etapa 4.15 em uma bandeja do carregador automático na seguinte ordem: Em branco; É; Em branco; Amostras preparadas na fase 4.15; Em branco, IS, em branco.
  10. Analisar 5-10 μL de cada amostra por LC-ESI-MS/MS. Analisar o mesmo volume para todas as amostras no conjunto de dados.

6. Processamento, integração e normalização de dados

NOTA: Embora as etapas a seguir esbocem um procedimento para software específico (consulte Tabela de Materiais), procedimentos semelhantes em instrumentos e software LC-MS equivalentes podem ser usados para integrar pares de MRM para as classes lipídicas analisadas e os padrões internos correspondentes.

  1. Abra o software de quantificação. Na guia Quantificar, clique duas vezes no Assistente de Quantificação. Na janela pop-up, na área de trabalho mais à esquerda, navegue até o conjunto de dados correto e clique com o botão esquerdo do mouse nele. Os exemplos disponíveis serão mostrados no espaço de trabalho do meio.
  2. Realce as amostras a serem analisadas e, em seguida, clique na seta para a direita para adicionar amostras ao espaço de trabalho Amostras selecionadas . Clique em Avançar para navegar até a tela de configurações e consulta onde as configurações padrão são normalmente usadas.
  3. Pressione Avançar para navegar até a tela de seleção do método de integração. Selecione um método de integração apropriado contendo pares de transição MRM para lipídios a serem analisados. Consulte a Tabela 1 para pares de transição MRM. Pressione Finish.
    NOTA: Os tempos de retenção variam dependendo da instrumentação e das configurações individuais e, portanto, devem ser verificados para cada configuração individual.
  4. Na barra de navegação, clique no painel Revisão de Pico para que os pares MRM possam ser inspecionados. Para facilitar a revisão, clique com o botão direito do mouse no painel Revisão de pico , altere o Zoom automático para 100% do pico maior e uma janela de zoom de 1,00 a 2,00 minutos.
  5. Clique com o botão direito do mouse na janela Exibição de quantificação e selecione Analyte e o esfingolipídio desejado a ser examinado. Verifique se não há picos nas amostras em branco e se o pico correto foi integrado nas amostras de SI.
  6. Comece a integrar amostras desconhecidas. Trabalhando uma classe de esfingolípidos de cada vez, inspecione o tempo de retenção para o par MRM do padrão interno (ou seja, C12:0 ceramida) e garantir que o software integrou o pico correto.
  7. Continue até os analitos na mesma classe lipídica (ou seja, C14:0 ceramida, C16:0-ceramida, etc.), começando com o lipídio de menor comprimento de cadeia da classe. Verifique para cada lipídio de comprimento de cadeia se a rotina do software integrou o pico correto do par MRM.
  8. Quando todos os analitos tiverem sido integrados, crie uma planilha eletrônica para cada espécie de esfingolipídios analisada (por exemplo, ceramidas, esfingiolinas, etc.). Rotule cabeçalhos de coluna para corresponder à ordem dos analitos e comprimentos de cadeia no software de quantificação LC-MS/MS. Inclua também um cabeçalho de coluna para ID de amostra e pesos de normalização de amostra determinados na etapa 3.9.
    NOTA: Como descrito anteriormente11, outras medidas comuns de normalização incluem o teor total de fosfato lipídico ou a quantidade de proteína.
  9. Exporte ou copie as áreas de pico de todos os analitos e normas internas para a planilha eletrônica.
  10. Normalizar os dados dividindo a área de pico integrada de cada espécie de comprimento de cadeia para uma dada classe de esfingolípidos pela área de pico do seu padrão interno correspondente. Por exemplo, C14:0 ceramida, C16:0 ceramida, ceramida C18:1, etc., devem ser divididos pelo C12:0 área de pico do padrão interno de ceramida.
  11. Converter área de pico em molas de lipídios recuperados multiplicando a área de pico normalizada (calculada na etapa 6.10) com a quantidade de padrão interno, em picomoles, que foi adicionada à amostra na etapa 4.3. Neste protocolo, essa quantidade é de 250 pmol.
  12. Para obter a quantidade relativa de lipídios em cada amostra, dividir os picomoles de cada comprimento da cadeia lipídica pelo peso tecidual determinado na etapa 3.9. Isso dará unidades de picomoles de lipídios por mg de tecido.

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Representative Results

Neste protocolo, descrevemos em detalhes um método para remover OCT de tecidos humanos criopreservados e pesar os tecidos para análise por LC-ESI-MS/MS. Os materiais necessários para este procedimento estão listados na Tabela de Materiais. Na Figura 1 são mostrados os resultados de um experimento típico em que 10 tumores de adenocarcinoma pulmonar humano e 10 tecidos adjacentes normais foram lavados para remover OCT e analisados por LC-ESI-MS/MS. Importante, como mostramos anteriormente11, existem várias espécies de ceramidas de comprimento de cadeia (Figura 1A) e monohexosil-ceramidas (Figura 1B) que são significativamente elevadas em tumores de adenocarcinoma pulmonar em comparação com tecidos adjacentes normais não envolvidos.

Em experimentos de controle para avaliar o efeito da OCT nas etapas de extração lipídica descritas na seção 4, 200 mg de fígados de camundongos (C57BL6; machos; 14-16 semanas de idade) foram ressuspensos em 2 mL de solução salina tamponada com fosfato e homogeneizados até triturar finamente. A suspensão hepática fina resultante foi então extensivamente sonicated com um sonicator de sonda (três rodadas de 1 min de sonicação no gelo, 1 min de descanso no gelo, 60% de potência; microponta). A partir desta solução, seis replicações de homogeneizado hepático de 300 μL foram preparadas. A três repetições, foram adicionados 200 mg de OCT (quantidade média encontrada em espécimes de biorrepositório11) e 200 μL de água aos outros três. As amostras foram então processadas em paralelo, seguindo as etapas descritas na seção 4. É importante ressaltar que, após a centrifugação da solução monofásica de Bligh-Dryer, as amostras contendo OCT estavam turvas, enquanto as amostras controle contendo água estavam claras (Figura 2A). A nebulosidade na solução de extração lipídica monofásica persistiu mesmo após o aumento da centrifugação e sonicação extensa (não mostrada). Após a evaporação do solvente, as amostras contendo OCT apresentavam grandes pellets (Figura 2B), que não podiam ser reconstituídos em metanol mesmo sob vigoroso vórtice e sonicação extensa. Amostras contendo OCT também apresentaram grande perda de sinal para os padrões internos de todas as espécies analisadas (Figura 3A-G). Também mostramos anteriormente que amostras contendo OCT apresentaram perda de sinal para muitos dos esfingolipídios analisados11.

Normalmente, espera-se que os padrões esfingolipídicos eluam sequencialmente, como mostrado na Figura 4, na seguinte ordem: d17:1 esfingosina, d17:1 esfingosina-1-fosfato, C12:0 lactosil-ceramida, C12:0 monohexosil-ceramida, C12:0 esfingomielina e C12:0 ceramida. Para cada uma dessas espécies de esfingolipídeos, usando as configurações de gradiente e instrumentação descritas na seção 5 e anteriormente11, haverá aproximadamente um deslocamento de +0,15 min no tempo de retenção para cada aumento de 2 carbonos no comprimento da cadeia. Por exemplo, como mostrado na Figura 5, a ceramida C14:0 (Figura 5B) eluirá aproximadamente +0,15 min mais tarde que a ceramida C12:0 (Figura 5A). Uma ligação dupla no ácido graxo geralmente resulta em uma mudança de -0,15 no tempo de retenção, de modo que a ceramida C16:0 (Figura 5C) terá um tempo de retenção semelhante à ceramida C18:1 (Figura 5D). No entanto, lipídios de maior comprimento de cadeia (ou seja, C24:0, C26:0) podem ter maiores mudanças no tempo de retenção (Figura 5I,K, respectivamente).

Figure 1
Figura 1: Perfis esfingolipídicos de adenocarcinomas pulmonares e tecidos pulmonares adjacentes não envolvidos. Os tecidos foram armazenados criogenicamente em OCT, descongelados, processados com três ciclos de sOCTrP, pesados e analisados por LC-ESI-MS/MS. Os níveis estão em pmol por mg de tecido. As espécies indicadas de ceramida (A), monohexosilceramida (B), esfingomielina (C), lactosilceramida (D) e esfingosina (E; Sph), esfingosina-1-phopshate (F; S1P), dihidro-Sph (E) e diidro-S1P (F) foram quantificados. n = 10 tumores e n = 10 tecidos adjacentes não envolvidos. Os gráficos de caixa mostram medianas (linha preta) e bigodes de min a max. ns, não significativos; , p≤0,005; , p ≤ 0,0005. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens representativas de amostras extraídas com e sem OCT. Os fígados dos ratos foram homogeneizados e sonicados, divididos em seis amostras idênticas: 200 mg de OCT foram adicionados a três amostras e água às outras três. (A) Depois que metanol e clorofórmio foram adicionados para atingir uma proporção de 2:1:0,1 metanol:clorofórmio:água (v:v:v), incubação noturna a 48 °C, seguida de centrifugação, os sobrenadantes das amostras que continham OCT estavam turvos e não podiam ser esclarecidos por sonicação, vórtice ou centrifugação. (B) Após a evaporação do solvente, um pellet grande foi recuperado de amostras contendo OCT que não puderam ser totalmente reconstituídas em 0,5 mL de metanol após extensa sonicação e vórtice. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Quantificação LC-ESI-MS/MS dos padrões esfingolipídicos na presença ou ausência de OCT. Os fígados dos ratos foram homogeneizados, sonicados e divididos em seis amostras idênticas. A três das seis amostras, foram adicionados 200 mg de OCT, enquanto às outras três, foi adicionada água. Após a adição de padrões internos, metanol e clorofórmio, as amostras foram processadas de forma idêntica e os lipídios extraídos foram analisados por LC-ESI-MS/MS. Mostrados são pares de monitoramento de reações múltiplas (MRM) dos lipídios indicados (A-F) e correspondentes áreas de pico integradas (G). Abreviaturas: Sph, esfingosina; S1P, esfingosina-1-fosfato. Setas pretas apontam para o par MRM correto para o esfingolípido indicado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Tempos relativos de retenção para pares de monitoramento de reações múltiplas LC-ESI-MS/MS de padrões esfingolipídicos. Fígados de camundongos foram homogeneizados e sonicados; padrões internos, metanol e clorofórmio adicionados; e lipídios extraídos e analisados por LC-ESI-MS/MS. São mostrados os tempos de retenção de múltiplos pares de monitoramento de reação dos lipídios indicados (A-F). Observe a ordem relativa em que os lipídios eluem durante o gradiente de cromatografia líquida. Abreviaturas: Sph, esfingosina; S1P, esfingosina-1-fosfato; SM, esfingomielina. O eixo X é o tempo de retenção do par MRM em minutos. O eixo Y é a intensidade do sinal para os pares MRM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Deslocamento dependente do comprimento da cadeia de acila no tempo de retenção dos pares LC-ESI-MS/MS MRM. Fígados de camundongos foram homogeneizados e sonicados; padrões internos, metanol e clorofórmio adicionados; e lipídios extraídos e analisados por LC-ESI-MS/MS. Mostram-se tempos de retenção e pares de MRM dos lipídios indicados. Observe a mudança no tempo de retenção com o aumento do comprimento da cadeia de acila para vários lipídios (A-K), que normalmente corresponde a um tempo de retenção de +0,15 min por aumento de 2 carbonos. Uma ligação dupla resultará em um deslocamento de tempo de retenção de -0,15 min (D,H,J). No entanto, para lipídios de cadeia mais longa, o aumento relativo no tempo de retenção pode ser maior (G-K). O eixo X é o tempo de retenção do par MRM em minutos. O eixo Y é a intensidade do sinal para os pares MRM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Pares de MRM, parâmetros de ionização e energias de colisão para análise de LC-ESI-MS/MS. DP, potencial de desclusterização; CE, energia de colisão. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

OCT é um agente de criopreservação comum a longo prazo usado em biorrepositórios. No entanto, a OCT pode resultar em supressão iônica quando os tecidos são analisados por várias plataformas de espectrometria de massa12,13,14,15, ou resultar em perda de sinal quando as amostras são analisadas por LC-ESI-MS/MS11. A OCT em tecidos criopreservados também pode interferir nos métodos de normalização tecidual, como pesagem e ensaios de quantificação de proteínas, como Bradford e BCA11. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para remover OCT de tecidos humanos e, posteriormente, ser analisado por espectrometria de massa. O protocolo pode ser modificado para utilizar outras fontes teciduais que não sejam pulmonares, ou de tecidos de camundongos, como descrevemos anteriormente11. Além disso, outras estratégias de normalização de dados por espectrometria de massa podem ser usadas, incluindo as que descrevemos anteriormente11, bem como outros métodos validados.

Uma limitação importante deste protocolo é que ele não é adequado para a análise de tecidos que foram previamente fixados com formaldeído ou outro agente fixador. É adequado apenas para tecidos que não foram fixados e foram criopreservados em OCT. Além disso, este método não é adequado para o processamento de tecidos que pesam menos de 1-2 mg, pois há sempre alguma perda de tecido durante as etapas sOCTrP e transferências entre tubos. Será difícil pesar tecidos tão pequenos usando uma balança analítica padrão, e qualquer PBS restante não removido durante o estágio de wicking contribuirá muito para o erro experimental. Abaixo estão outras considerações importantes ao lavar os tecidos para remover a OCT com este método.

Para garantir a execução suave deste protocolo, especialmente se muitas amostras forem processadas, as etapas descritas na seção 1 devem ser executadas com antecedência, incluindo a pré-rotulagem e a pré-pesagem de tubos de 1,5 mL, a pré-rotulagem de tubos e tampas de tampa de rosca de 13 x 100 mm, tubos de cultura de 13 x 100 mm e frascos para injetáveis automáticos, preparando todas as mechas, pré-encurtando as pontas de pipeta de 1 mL, e soluções de lavagem pré-refrigeração. Isso evitará que procedimentos demorados tenham que ser realizados no dia em que os tecidos serão lavados, o que pode levar a atrasos. Em geral, descobrimos que, se muitas dessas etapas forem realizadas no dia anterior, um pesquisador experiente pode lavar de 30 a 40 espécimes em um dia de trabalho normal. No entanto, como o primeiro ponto de parada sugerido é depois que todos os tecidos foram lavados, pesados e colocados em metanol e armazenados a -80 °C, não realizar 1,5 mL de pré-pesagem e rotulagem com antecedência afetará a eficiência e estenderá o período de tempo necessário para lavar 30-40 tecidos.

A pesagem de tecidos é uma das etapas mais importantes, pois erros ou descuidos afetarão a qualidade dos dados, pois serão transferidos para a normalização dos dados. É fundamental que a balança analítica usada para pesagem seja calibrada, devidamente zerada e. Assim, ao usar mechas, remover o máximo possível da solução de lavagem é importante, especialmente para tecidos com peso inferior a 5 mg. Nesses pesos de tecido, a solução de lavagem restante tornará a pesagem imprecisa em uma grande porcentagem e será transferida como um erro na normalização dos dados. Ao remover a solução de lavagem, descobrimos que os tecidos podem ser suavemente tocados com o pavio por vários segundos para remover o máximo de solução de lavagem possível sem levar a perdas significativas de tecido por adesão ao pavio. No entanto, cada tipo de tecido que está sendo lavado deve ser testado quanto à adesão às mechas, e essas etapas do protocolo ajustadas de acordo.

Para facilitar o fluxo de trabalho de lavagem de tecidos, recomenda-se que as aparas de tecido sejam solicitadas do biorrepositório em tubos de polipropileno de 15 mL. Isso reduzirá o manuseio de tecidos antes da lavagem.

Ao lavar tecidos, se um material semelhante a um gel for observado no fundo de um tubo após o terceiro ciclo de sOCTrP, isso é indicativo de que nem todos os OCT foram removidos e mais ciclos de sOCTrP são necessários. Acompanhe quantos ciclos são necessários e, para obter consistência, execute o mesmo número de ciclos sOCTrP em todas as amostras do conjunto de dados. Avaliamos previamente até 9 ciclos de sOCTrP e não encontramos efeito sobre a depleção de esfingolipídios nos tecidos11.

Ao usar mechas para remover a solução de lavagem, esfregar suavemente o tecido garantirá que toda a solução de lavagem seja removida. Isso aumenta a precisão da estimativa do peso do tecido. No entanto, muito cuidado deve ser tomado com tecidos muito pequenos, pois estes podem grudar no pavio e resultar na perda de espécime. É útil usar várias mechas para o mesmo tubo para remover o máximo de solução possível. Para evitar a contaminação por amostras cruzadas, use sempre um pavio novo e limpo para cada amostra. Ao fazer mechas, use tecido de grau laboratorial (ver Tabela de Materiais), pois os testamos anteriormente e descobrimos que contêm uma quantidade insignificante de esfingolipídios contaminantes11. Mechas de outros materiais podem ser usadas se forem testadas conforme descrito11.

Ao recuperar amostras de tubos de 1,5 mL após a pesagem, é fundamental que todo o tecido seja recuperado. Não fazer isso resultará em erros na normalização de dados. Se mais PBS for necessário para recuperar todo o tecido, adicione a quantidade equivalente de PBS usada a todos os outros tubos para evitar diferenças na eficiência de extração que possam resultar de amostras contendo diferentes quantidades de PBS. Ajuste os volumes de clorofórmio e metanol para levar em conta qualquer aumento no volume de água para manter uma relação metanol:clorofórmio:água de 2:1:0,1.

Ao descongelar espécimes, é importante que essa etapa seja feita no gelo para evitar a degradação de lipídios lábeis, como a esfingosina-1-fosfato. O descongelamento total das amostras até que o OCT esteja em estado líquido também facilitará sua remoção, pois ele será mais facilmente dissolvido na solução de lavagem a frio, em vez de permanecer como um pellet durante as etapas iniciais de lavagem.

Ocasionalmente, especialmente ao lavar os tecidos pulmonares, haverá fragmentos que não serão pellets e flutuarão em cima da solução de lavagem após a centrifugação. Com cuidado, a imersão da ponta aspirante sob os tecidos flutuantes para remover a solução de lavagem pode evitar a perda durante a aspiração.

Não adicione clorofórmio às amostras antes da homogeneização, pois as pontas do homogeneizador descartáveis são feitas de plástico e se dissolverão em soluções contendo clorofórmio. Isso pode afetar significativamente a quantificação de lipídios no LC-MS/MS nas amostras. Portanto, em geral, o uso de plásticos que não são resistentes a solventes deve ser evitado ao dispensar clorofórmio e metanol. Esses solventes também são tóxicos e devem ser manuseados em um exaustor apropriado. Use o EPI apropriado ao manusear solventes, como metanol e clorofórmio.

Os tecidos humanos devem ser processados em um gabinete de biossegurança apropriado (por exemplo, Classe II). Os utilizadores devem receber formação no manuseamento de materiais e fluidos bioperigosos de origem humana e seguir protocolos de segurança, tais como o uso de equipamento de proteção individual adequado e a descontaminação de qualquer superfície ou equipamento que entre em contacto com os espécimes. Os usuários devem desinfetar completamente (consulte Tabela de Materiais para descontaminante sugerido) qualquer superfície ou equipamento (centrífugas, transportadores e adaptadores de centrífugas, pipetadores, vórtices, superfícies de exaustor, balanças, vidros, bandejas de gelo, teclados de computador, mouse de computador, etc.) usados durante o procedimento de lavagem. Os membros do laboratório não devem usar equipamentos ou capuzes usados para lavagem de tecidos até que tenham sido completamente desinfetados. Evite o uso de água sanitária em superfícies de aço e eletrônicos.

Ao processar muitas amostras, tenha cuidado para evitar a contaminação cruzada usando tampas limpas nas etapas de reencapagem durante as etapas de extração de lipídios. As tampas também podem ser reutilizadas se forem rotuladas. No entanto, na prática, descobrimos que os marcadores se destacam mal nas tampas pretas, e as etiquetas adesivas caem dos tubos durante a incubação noturna de 48 °C.

Os esfingolípidos são atores importantes na etiologia de doenças e cânceres humanos. Portanto, há grande interesse em definir com precisão as alterações do metabolismo esfingolipídico nessas doenças, pois podem revelar alvos terapêuticos. No entanto, muitos dos tecidos que são facilmente acessíveis aos pesquisadores são criopreservados em OCT, o que não é compatível com a análise de espectrometria de massa. Assim, o protocolo detalhado aqui descrito ampliará o repertório de tecidos adequados para a análise esfingolipidômica quantitativa e, assim, ajudará a aumentar nossa compreensão da biologia das alterações do metabolismo lipídico em doenças e cânceres humanos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os serviços e o apoio ao projeto de pesquisa foram fornecidos pelo VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core e pelo VCU Lipidomics and Metabolomics Core, que são apoiados em parte com financiamento do NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13x100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 581300-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

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References

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