Summary
डबल राल कास्टिंग माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी, या डक्ट, ऑर्गन आर्किटेक्चर के 3 डी विश्लेषण की सुविधा के लिए एक साथ दो ट्यूबलर सिस्टम के विज़ुअलाइज़ेशन, डिजिटलीकरण और विभाजन को सक्षम बनाता है। डक्ट दो रेडियोपेक रेजिन के पूर्व विवो इंजेक्शन को जोड़ती है, जिसके बाद माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी स्कैनिंग और टोमोग्राफिक डेटा का विभाजन होता है।
Abstract
जिगर मनुष्यों और चूहों में सबसे बड़ा आंतरिक अंग है, और उच्च ऑटो-प्रतिदीप्ति पूरे अंग स्तर पर अंग के तीन आयामी (3 डी) वास्तुकला का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत करता है। लिवर आर्किटेक्चर को कई ब्रांचिंग लुमेनाइज्ड संरचनाओं की विशेषता है, जिसे राल से भरा जा सकता है, जिसमें संवहनी और पित्त के पेड़ शामिल हैं, अन्यथा हेपेटोसाइट-समृद्ध पैरेन्काइमा में एक अत्यधिक रूढ़िवादी पैटर्न स्थापित करते हैं। यह प्रोटोकॉल डबल राल कास्टिंग माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी, या "डक्ट" करने के लिए पाइपलाइन का वर्णन करता है। डक्ट दो अलग-अलग रेडियोपेक सिंथेटिक रेजिन के साथ पोर्टल शिरा और सामान्य पित्त नलिका को इंजेक्ट करने पर जोर देता है, जिसके बाद ऊतक निर्धारण होता है। एक पालि, या पूरे जिगर को साफ करके गुणवत्ता नियंत्रण, एक ऑप्टिकल समाशोधन एजेंट के साथ, उपयुक्त रूप से इंजेक्ट किए गए नमूनों की पूर्व-स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। डक्ट पाइपलाइन के दूसरे भाग में, एक लोब या पूरे जिगर का उपयोग माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) स्कैनिंग, (अर्ध-) स्वचालित विभाजन, और पोर्टल शिरापरक और पित्त नेटवर्क के 3 डी प्रतिपादन के लिए किया जा सकता है। माइक्रोसीटी के परिणामस्वरूप दो रेजिन के लिए 3 डी समन्वय डेटा होता है जो दो प्रणालियों के गुणात्मक और साथ ही मात्रात्मक विश्लेषण और उनके स्थानिक संबंधों के लिए अनुमति देता है। डक्ट को प्रसवोत्तर और वयस्क माउस जिगर पर लागू किया जा सकता है और इसे अन्य ट्यूबलर नेटवर्क तक बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फेफड़ों में संवहनी नेटवर्क और वायुमार्ग।
Introduction
ऑर्गन राल कास्टिंग एक तकनीक है जो 17 वीं शताब्दी 1 में वापस आती है। आधुनिक राल कास्टिंग के पहले उदाहरणों में से एक एक ऑटोप्सी से मानव जिगर पर किया गया था। इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं को जिलेटिन के साथ मिश्रित एक विपरीत एजेंट से भरा गया था, इसके बाद एक्स-रे सीटी स्कैन 2 के साथ इमेजिंग की गई थी। DUCT तकनीक का उद्देश्य 3 डी में, अग्रानुक्रम में, दो ट्यूबलर राल-कास्ट किए गए नेटवर्क की कल्पना, डिजिटलीकरण और विश्लेषण करना है।
DUCT एकल-प्रणाली जिगर राल कास्टिंग 3,4,5,6,7,8 के व्यापक मौजूदा ज्ञान पर आधारित है और एक साथ 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और दो systems9 के विश्लेषण के लिए विस्तारित है। डक्ट ने अलग-अलग विपरीत के दो रेडियोपेक रेजिन को मिलाकर और इन रेजिन को दो अलग-अलग नेटवर्कों में इंजेक्ट करके, विशेष रूप से आम पित्त नलिका और पोर्टल शिरा को डबल राल कास्टिंग के लिए उन्नत किया। डक्ट को प्रसवोत्तर दिन 15 (पी 15) के रूप में जल्दी के रूप में पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के साथ युवा प्रसवोत्तर चूहों पर लागू किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी-आधारित इमेजिंग तकनीकों की तुलना में, मुख्य लाभ यह है कि DUCT तेज, एंटीबॉडी-मुक्त है, और यकृत ऊतक autofluorescence इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। इसके अलावा, DUCT लुमेनाइजेशन स्थिति, आंतरिक व्यास, नेटवर्क कनेक्टिविटी और परफ्यूजन का वर्णन करने वाला मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। लुमेन बनाने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति और ट्यूबों में उनके वास्तविक मॉर्फोजेनेसिस के बीच अंतर उन अंगों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है जिनमें डक्टुलर कोशिकाएं मौजूद हैं लेकिन ट्यूब नहीं बनाती हैं, जैसा कि अलागिल सिंड्रोम 10 में हो सकता है। डक्ट का मुख्य नुकसान राल का सीमित प्रवेश है, जो चिपचिपा है और एक छोटे से कैलिबर (<5 μm) के साथ ट्यूबों में प्रवेश नहीं करता है। इंजेक्शन प्रवेश बिंदु को निर्धारित करने के बाद डक्ट को किसी भी ट्यूबलर संरचना के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि धमनी और शिरापरक संचार प्रणाली, वायुमार्ग, एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिका, या लसीका वाहिकाएं। इस प्रकार यह फेफड़ों और अग्न्याशय जैसे अन्य ऊतकों के पूरे अंग वास्तुकला विश्लेषण की सुविधा प्रदान कर सकता है।
MicroCT खंडित छवियों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है, जैसे कि ImageJ, या कस्टम-लिखित पाइपलाइन (उदाहरण के लिए, MATLAB)। राल-इंजेक्टेड जिगर का विश्लेषण नेटवर्क विस्तार और कनेक्टिविटी के लिए गुणात्मक रूप से किया जा सकता है या मात्रात्मक रूप से मात्रा, लंबाई, ब्रांचिंग, एक एकल प्रणाली की टॉर्टुओसिटी के लिए, और दो प्रणालियों के बीच की बातचीत जैसे कि दो प्रणालियों के बीच की दूरी, या ब्रांचपॉइंट निर्भरता (क्या सिस्टम 1 शाखा सिस्टम 2 ब्रांचिंग की निकटता में है?)। राल इंजेक्शन, माइक्रोसीटी स्कैनिंग, और सीटी डेटा विभाजन को शामिल करने वाली डक्ट पाइपलाइन, दो ट्यूबलर प्रणालियों के वास्तुशिल्प तंत्र के विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त, पशु मॉडल में पूरे जिगर के विश्लेषण के लिए एक मानक प्रदान कर सकती है।
Protocol
इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल को अनुमोदित किया गया था और स्टॉकहोम के पशु कल्याण नियमों और नियमों का पालन करता है Norra Djurförsöksetiska nämnd (स्टॉकहोम पशु अनुसंधान नैतिकता बोर्ड)। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जानवर जंगली प्रकार या होमोजीगस Jag1H268Q उत्परिवर्ती चूहे थे जो एक मिश्रित C3H / N और C57bl6J पृष्ठभूमि पर थे। अध्ययन में पुरुषों और महिलाओं दोनों को शामिल किया गया था। जानवरों का उपयोग प्रसवोत्तर दिन 15 में या 3 - 8 महीने के बीच वयस्कों के रूप में किया जाता था।
1. डबल राल इंजेक्शन
- तैयारी
- राल समाधान तैयार करें। डबल सिस्टम राल इंजेक्शन के लिए, दोनों पीले और हरे रेजिन तैयार के रूप में 1.1.2-1.1.4 चरणों में वर्णित है.
- माउस प्रति पतला राल के 1 मिलीलीटर ऐलीकोट तैयार करें।
- पीला राल: इंजेक्शन के लिए पीले राल तैयार करने के लिए एक 3: 1 कमजोर पड़ने में स्पष्ट diluent के साथ पीला सिलिकॉन रबर (उच्च रेडियोपेसिटी) पतला।
- ग्रीन राल: एक 1: 1 कमजोर पड़ने में स्पष्ट diluent के साथ नीले सिलिकॉन रबर (undetectable radiopacity) मिश्रण नीले राल तैयार करने के लिए. हरे रंग का राल उत्पन्न करने के लिए, पतला नीले राल को 1: 1 के अनुपात में पतला पीले राल के साथ मिलाएं। रंग सजातीय है जब तक कि अच्छी तरह से हरी राल भंवर.
नोट: ब्लू राल में बहुत कम रेडियोपेसिटी है जो माइक्रोसीटी के साथ पता लगाने योग्य नहीं है, इसलिए विभिन्न रेडियोपेसिटी के साथ दो रेजिन बनाने के लिए पीले राल के साथ कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है।
सावधानी: राल में सीसा क्रोमेट हो सकता है, जो एक कार्सिनोजेन है। यह आग में जहरीली गैसों का उत्पादन करता है। देखभाल के साथ संभालो और खतरनाक अपशिष्ट के रूप में राल के निपटान. - दो इंजेक्शन सेट (इंजेक्शन सेट # 1 और इंजेक्शन सेट # 2) को टयूबिंग के साथ तैयार करें जैसा कि चरणों 1.1.6-1.1.11 में वर्णित है।
नोट: वयस्क चूहों के लिए (>P30 (प्रसवोत्तर दिन 30) = P30 - 2 साल), सामान्य पित्त नलिका इंजेक्शन और इंजेक्शन सेट # 2 (0.96 मिमी बाहरी व्यास के साथ PE50 टयूबिंग) पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए इंजेक्शन सेट # 1 (0.6 मिमी बाहरी व्यास के साथ PE10 टयूबिंग) का उपयोग करें। युवा प्रसवोत्तर चूहों (P30 तक) के लिए, दो # 1 इंजेक्शन सेट तैयार करें, एक पित्त नलिका के लिए और एक पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए (कोई इंजेक्शन सेट # 2 नहीं है क्योंकि पोर्टल नस PE50 टयूबिंग को समायोजित करने के लिए बहुत संकीर्ण है)। - इंजेक्शन सेट # 1 तैयार करने के लिए, PE10 टयूबिंग के 30 सेमी को काटें और इसे खींचकर हाथ से ट्यूबिंग के एक छोर को तब तक फैलाएं जब तक कि यह जितना संभव हो उतना पतला न हो जाए (चित्रा 1 ए, बी, लगभग 0.15 मिमी व्यास, गैर-फैला हुआ पीई 10 टयूबिंग 0.6 मिमी व्यास है)।
- एक beveled टिप (चित्रा 1B) बनाने के लिए तिरछे ढंग से फैला हुआ PE10 टयूबिंग की नोक काटें।
- PE10 टयूबिंग के गैर-फैलाए गए छोर को 30 G सुई से कनेक्ट करें (चित्रा 1A, इंजेक्शन सेट # 1)।
- इंजेक्शन सेट # 2 तैयार करने के लिए, PE50 टयूबिंग के 30 सेमी काट लें और इसे खींचकर हाथ से ट्यूबिंग के एक छोर को तब तक फैलाएं जब तक कि यह पोर्टल नस में फिट होने के लिए पर्याप्त पतला न हो जाए (चित्रा 1A, B, लगभग 0.7 मिमी, गैर-फैला हुआ PE50 टयूबिंग 0.96 मिमी व्यास है)।
- एक beveled टिप (चित्रा 1B) बनाने के लिए तिरछे फैला हुआ PE50 टयूबिंग की नोक काटें।
- PE50 टयूबिंग के गैर-फैले हुए छोर को 23 G सुई से कनेक्ट करें (चित्रा 1A, इंजेक्शन सेट # 2)।
नोट: प्रत्येक इंजेक्शन सेट का उपयोग केवल एक इंजेक्शन के लिए किया जा सकता है क्योंकि राल सिरिंज और टयूबिंग में कठोर हो जाएगा। माउस की सामान्य पित्त नलिका और पोर्टल नस के आकार के आधार पर खिंचाव और बेवेल्ड टिप के आकार को समायोजित करें, जो इसकी उम्र, जीनोटाइप और फेनोटाइप पर निर्भर करता है। जब टयूबिंग के आकार और फिट के बारे में अनिश्चित हो, तो चीरा के बाद और टयूबिंग को राल से भरने से पहले उचित वाहिनी या पोत में टयूबिंग डालें। यदि टयूबिंग डक्ट / पोत में फिट होने के लिए बहुत व्यापक है, तो इसे आगे बढ़ाएं। - Isoflurane साँस लेना (प्रेरण कक्ष में पहले 4% और नाक शंकु का उपयोग करके ~ 2%) द्वारा जानवर को एनेस्थेटिकाइज़ करें।
- माउस को एक विच्छेदन पैड पर एक हवादार बेंच पर रखें, जबकि माउस नाक शंकु के माध्यम से आइसोफ्लुरेन को सांस ले रहा है। सत्यापित करें कि जानवर एक संस्थान / आईआरबी-अनुशंसित विधि से बेहोश है, उदाहरण के लिए, पंजों में से एक को चुटकी देकर।
सावधानी: आइसोफ्लुरेन साँस लेने पर उनींदापन या चक्कर आना पैदा कर सकता है और लंबे समय तक या बार-बार संपर्क के माध्यम से हृदय प्रणाली और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान पहुंचा सकता है। इसे साँस न लें। एक हवादार बेंच पर और अच्छी तरह से हवादार क्षेत्रों में पदार्थ को संभालें।
नोट: एक और एनेस्थेटाइज़िंग विधि का उपयोग करना संभव है, जब तक कि यह कार्डियक परफ्यूजन के साथ संगत है। - एक बार जब जानवर बेहोश हो जाता है, तो फर से हस्तक्षेप को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ वेंट्रल पक्ष को स्प्रे करें।
- त्वचा कैंची का उपयोग करके, पेट की गुहा की मध्य रेखा पर शुरू होने वाली त्वचा, प्रावरणी और मांसपेशियों की परत को काट लें और आंतरिक अंगों को उजागर करने के लिए वक्ष गुहा के माध्यम से काट दें।
- उरोस्थि को उठाने के लिए संदंश के साथ xiphoid प्रक्रिया को पकड़ो और दिल और फेफड़ों को उजागर करने के लिए दोनों तरफ डायाफ्राम और रिब पिंजरे को काटें।
- कैंची के साथ ribcage के बाईं और दाईं ओर पसलियों के माध्यम से काटने से रिब पिंजरे को हटा दें। जिगर को नुकसान न पहुंचाने के लिए अतिरिक्त ध्यान रखें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप राल का रिसाव होगा।
- सीधे संदंश का उपयोग करके, दिल को जिगर की ओर खींचें और दाहिने आलिंद को काट दें।
- एक तितली सुई (23 जी) डालें, जो बाएं वेंट्रिकल में एक पेरिस्टाल्टिक परफ्यूजन पंप से जुड़ा हुआ है। हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) और हेपरिन (माउस शरीर के वजन के 1 यू / जी) के साथ माउस transcardially perfuse. 5 mL / मिनट की एक छिड़काव दर के साथ 3 मिनट के लिए perfuse।
नोट: यदि माउस को सही ढंग से perfused किया जा रहा है, तो आंतरिक अंग पीला हो जाएंगे, विशेष रूप से जिगर। यदि, इसके बजाय, फेफड़े सफेद हो रहे हैं, तो सुई को सही वेंट्रिकल में डाला जाता है और इसे फिर से स्थापित किया जाना चाहिए। परफ्यूजन के बाद, माउस को एक्ससांगुइनेट किया जाता है और नाक शंकु और आइसोफ्लुरेन से हटाया जा सकता है। - Isoflurane पंप बंद कर दें।
- राल इंजेक्शन - पित्त प्रणाली राल कास्टिंग
- माउस को विच्छेदन माइक्रोस्कोप में ले जाएं, पेट ऊपर, प्रयोगकर्ता की ओर पूंछ, और प्रयोगकर्ता से दूर सिर। ब्याज के संरचनात्मक स्थलों को चित्र 2 ए में दर्शाया गया है।
- आंत को किनारे पर ले जाकर अवर वेना कावा (चित्रा 2 ए) का पता लगाएं। हेपेटिक संवहनी दबाव (चित्रा 2Bi) की रिहाई की अनुमति देने के लिए अवर वेना कावा में एक छोटा ट्रांसवर्सल चीरा बनाने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें।
- सामान्य पित्त नलिका और पोर्टल शिरा को उजागर करें जैसा कि चरण 1.2.4- 1.2.6 में वर्णित है।
- आंत और अग्न्याशय को एक फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) का उपयोग करके दाईं ओर (प्रयोगकर्ता के) में ले जाएं- गीले कपास झाड़ू।
- आंत की सतह और हिलर क्षेत्र को उजागर करने के लिए पीबीएस-गीले कपास झाड़ू का उपयोग करके दिल की ओर जिगर के वेंट्रल पक्ष को फ्लिप करें।
- सामान्य पित्त नलिका का पता लगाएं जो अग्न्याशय के पार हिलर क्षेत्र से चलता है और आंत में ओडी के स्फिंक्टर पर (चित्रा 2Bii, पीले बिंदीदार रेखा के साथ उल्लिखित आम पित्त नलिका, काले एरोहेड्स ओडी के स्फिंक्टर को इंगित करते हैं)।
नोट: सुनिश्चित करें कि जिगर पीबीएस के साथ छिड़ककर प्रक्रिया के दौरान नम है। - सीधे संदंश का उपयोग करके आम पित्त नलिका से आसपास के ऊतक (क्षेत्र ~ 5 मिमी) को साफ करें। आम पित्त नलिका (चित्रा 2Bii) के नीचे रेशम टांका धागा (आकार 4-0, 0.17 मिमी, 3 - 5 सेमी लंबा) रखें और आम पित्त नलिका (चित्रा 2Biii) के चारों ओर एक ढीली ओवरहैंड गाँठ बांधें।
नोट: हिलर क्षेत्र और Oddi के स्फिंक्टर के बीच आधे रास्ते में और पोर्टल शिरा से कुछ दूरी पर गाँठ के लिए एक क्षेत्र चुनें ताकि सिवनी को आम पित्त नलिका के चारों ओर कसने के बाद, यह पोर्टल शिरा इंजेक्शन के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा। - आम पित्त नली के खिलाफ वसंत कैंची को सपाट रखें ताकि उस स्थान पर सामान्य पित्त नलिका के लिए एक तिरछी चीरा बनाया जा सके जहां आम पित्त नलिका अग्न्याशय और आंत में प्रवेश करती है ओडी के स्फिंक्टर के बगल में। (चित्रा 2Biv), पीले बिंदीदार रेखा Oddi क्षेत्र के स्फिंक्टर की रूपरेखा, काले एरोहेड्स द्वारा जोर दिया गया है)।
नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। एक तिरछी और एक transversal कटौती नहीं, और एक चीरा बनाने के लिए बनाओ; पित्त नलिका को अलग न करें। पूरे पित्त नलिका के माध्यम से काटने से टयूबिंग का सम्मिलन बहुत चुनौतीपूर्ण हो जाता है। - उपयोग करने से ठीक पहले, इलाज एजेंट के 50 μL के साथ पीले राल के 1 मिलीलीटर मिश्रण (भरने और 1 एमएल सिरिंज को खाली करके) और राल के साथ एक 1 एमएल ल्यूर सिरिंज भरें - इलाज एजेंट मिश्रण।
- टयूबिंग के साथ भरे हुए सिरिंज को कनेक्ट करें (सेट # 1)। टयूबिंग को पूरी तरह से भरने के लिए प्लंजर दबाएं। सुनिश्चित करें कि राल / इलाज एजेंट मिश्रण टयूबिंग की नोक से drips.
नोट: से बचें और सबसे अच्छा परिणाम के लिए सिरिंज और टयूबिंग में बुलबुले निकालें। - संदंश का उपयोग करते हुए, आम पित्त नलिका चीरा के आसपास के क्षेत्र को सीधा करें और आम पित्त नलिका (चित्रा 2Bv) में उद्घाटन में टयूबिंग डालें, पित्त नलिका के पृष्ठीय पक्ष की ओर नीचे की ओर बेवेल्ड टिप के सबसे लंबे किनारे के साथ। यह अभिविन्यास यह सुनिश्चित करता है कि राल टयूबिंग उद्घाटन से बाहर निकल सकता है, जो ऊपर की ओर सामना कर रहा है, वाहिनी में (चित्रा 2Bv)।
- आम पित्त नलिका के अंदर टयूबिंग को सुरक्षित करने के लिए रेशम धागे की गाँठ को कसें (चित्रा 2Bvi)।
- सामान्य पित्त नलिका में राल इंजेक्ट करें। पित्ताशय और व्यक्तिगत जिगर लोब का निरीक्षण करें।
- राल को समान रूप से फैलाने में मदद करने के लिए पीबीएस-गीले कपास झाड़ू के साथ जिगर की मालिश करें। राल से भरे पित्त नलिकाओं की टर्मिनल शाखाएं (जंगली प्रकार के चूहों में) यकृत की सतह पर बेहोशी से दिखाई देती हैं।
नोट: जिगर को भरने के लिए अपेक्षित समय 30 -100 s है। - राल को इंजेक्ट करना बंद करें जब राल के डॉट्स जिगर की सतह पर दिखाई देते हैं (चित्रा 2Ci, नीले एरोहेड्स) या जब प्रतिरोध पूरा हो जाता है।
नोट: जितनी जल्दी हो सके काम करें क्योंकि राल इलाज एजेंट को जोड़ने के बाद राल कठोर होना शुरू हो जाता है। इलाज एजेंट को जोड़ने से काम करने का समय लगभग 15 मिनट है। - इसे आम पित्त नलिका से बाहर खींचकर टयूबिंग को हटा दें और राल को लीक होने से रोकने के लिए संदंश का उपयोग करके रेशम की गाँठ को जल्दी से कस लें। रेशम टांके के ढीले सिरों को काट लें, ताकि वे पोर्टल शिरा इंजेक्शन के साथ हस्तक्षेप न करें।
- राल युक्त टयूबिंग और शेष राल को खतरनाक अपशिष्ट में और सुई को शार्प्स अपशिष्ट में निपटाएं।
- राल इंजेक्शन - पोर्टल शिरा राल कास्टिंग
- सीधे संदंश का उपयोग करके जिगर में प्रवेश से इसके आसपास के ऊतकों से पोर्टल नस (क्षेत्र ~ 5 मिमी) को साफ करें। पोर्टल शिरा (चित्रा 2Ci) के साफ क्षेत्र के नीचे रेशम टांका धागा (आकार 4-0, 0.17 मिमी, 3 - 5 सेमी लंबा) रखें और एक ढीली ओवरहैंड गाँठ बांधें (चित्रा 2Cii)।
- जिगर और गाँठ (चित्रा 2Ciii) के लिए पोर्टल शिरा डिस्टल में एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाओ।
- इलाज एजेंट के 50 μL के साथ हरे राल के 1 मिलीलीटर मिश्रण (भरने और एक 1 एमएल सिरिंज खाली करके) और राल इलाज एजेंट मिश्रण के साथ 1 एमएल Luer सिरिंज भरें।
- टयूबिंग के साथ भरे हुए सिरिंज को कनेक्ट करें (>P30 चूहों के लिए # 2 सेट करें,
नोट: से बचें और सबसे अच्छा परिणाम के लिए सिरिंज और टयूबिंग में बुलबुले निकालें। - संदंश का उपयोग करके, प्रयोगकर्ता की ओर आसपास के ऊतकों को खींचकर पोर्टल नस को सीधा करें और पोत के पृष्ठीय पक्ष की ओर बेवेल्ड टिप के सबसे लंबे किनारे के साथ टयूबिंग डालें (चित्रा 2Ciii)।
- पोर्टल नस में टयूबिंग को सुरक्षित करने के लिए रेशम के धागे को कसें।
- पोर्टल नस में राल इंजेक्ट करें। राल के साथ भरने वाले रक्त वाहिकाओं का निरीक्षण करें। एक पीबीएस-गीले कपास झाड़ू के साथ जिगर की मालिश करने के लिए राल समान रूप से फैलाने में मदद करने के लिए (चित्रा 2Civ).
- राल को इंजेक्ट करना बंद करें जब सभी रक्त वाहिकाएं भर जाती हैं (पोर्टल नसों के सिरों को जिगर की परिधि पर दिखाई देता है) या जब प्रतिरोध पूरा हो जाता है।
नोट: तेजी से काम के बाद से राल इलाज एजेंट के अलावा के बाद कठोर करने के लिए शुरू होता है. इलाज एजेंट को जोड़ने से काम करने का समय इंजेक्शन सेट # 1 के लिए लगभग 15 मिनट और इंजेक्शन सेट # 2 के लिए 25 मिनट है। - पोर्टल नस से टयूबिंग को बाहर निकालकर टयूबिंग को हटा दें और राल को लीक होने से रोकने के लिए संदंश का उपयोग करके रेशम की गाँठ को जल्दी से कस लें।
- राल युक्त टयूबिंग और शेष राल को खतरनाक अपशिष्ट में और सुई को शार्प्स अपशिष्ट में निपटाएं।
- जिगर विच्छेदन और निर्धारण
- पूरे जिगर को आसपास के ऊतकों और डायाफ्राम से दूर करके विच्छेदन करें।
- धीरे से पूरे जिगर को एक खाली 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें, जिसमें वेंट्रल साइड का सामना करना पड़ रहा है और जिगर के विरूपण को रोकने के लिए शंक्वाकार ट्यूब की दीवार पर आराम करने वाले पृष्ठीय पक्ष को आराम दिया गया है। राल को पूरी तरह से कठोर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर शंक्वाकार ट्यूब को क्षैतिज रूप से स्टोर करें।
नोट: जिगर को फिट करने के लिए पर्याप्त बड़ा है कि किसी भी कंटेनर 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है। एक फ्लैट नीचे कंटेनर का उपयोग करने से संभावना बढ़ जाएगी कि जिगर विकृत नहीं है। - जिगर को अलग-अलग लोब में अलग करें। माइक्रोसीटी विश्लेषण (1.4.4-1.4.5) या गुणवत्ता नियंत्रण (1.4.6-1.4.8) के लिए उपयोग किए जाने वाले लोबों का चयन करें। वैकल्पिक रूप से ऑप्टिकल समाशोधन और माइक्रोसीटी दोनों के लिए पूरे जिगर का उपयोग करें, इसे व्यक्तिगत लोब में अलग किए बिना।
नोट: पित्त और संवहनी प्रणालियों की जिगर वास्तुकला प्रत्येक लोब में अलग है, और मिलान लोब विश्लेषण इसलिए आवश्यक हैं। ऑप्टिकल समाशोधन माइक्रोसीटी स्कैनिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले लोब (ओं) को बाद में माइक्रोसीटी के साथ स्कैन किया जा सकता है। इसके विपरीत, माइक्रोसीटी के साथ स्कैन किए गए नमूनों को बाद में तुलना के लिए ऑप्टिकल रूप से साफ़ किया जा सकता है। इस प्रकार पूरे जिगर का विश्लेषण संभव है। जंगली प्रकार के चूहों (C3H / C57bl6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि) में, सही औसत दर्जे का लोब पहले राल इंजेक्शन द्वारा भरा जाता है, जिससे यह उच्चतम पुनरुत्पादन के साथ माइक्रोसीटी विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त लोब बन जाता है। बाएं पार्श्व लोब सबसे बड़ा लोब है, जिसमें यह इसलिए इंजेक्शन की गुणवत्ता के लिए प्री-स्क्रीन के लिए सीधा है। गुणवत्ता नियंत्रण और माइक्रोसीटी स्कैनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लोब (या पूरे जिगर) का चयन पशु मॉडल और अनुसंधान प्रश्न पर निर्भर करता है। - एक हवादार हुड में, 4% फॉर्मेल्डिहाइड समाधान (प्रति ट्यूब 10 -20 मिलीलीटर) तैयार करें। माइक्रोसीटी के लिए उपयोग किए जाने वाले लोब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% फॉर्मेल्डिहाइड के साथ ठीक करें और बाद में पीबीएस (10 -20 एमएल प्रति ट्यूब) के साथ एक बार धोएं।
- एक अलग कंटेनर में formaldehyde अपशिष्ट इकट्ठा. पीबीएस में लिवर लोब को अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए 70% इथेनॉल पर रखें। अनुभाग 2 के साथ आगे बढ़ें: माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी।
सावधानी: फॉर्मेल्डिहाइड तीव्र विषाक्तता का कारण बनता है यदि निगल लिया जाता है, साँस लिया जाता है, या त्वचा के संपर्क में होता है। फॉर्मेल्डिहाइड एक ज्वलनशील तरल और वाष्प है। यह गंभीर त्वचा जलने और आंखों को नुकसान पहुंचाता है। एलर्जी त्वचा की प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है। घातक अगर साँस (केंद्रित या पाउडर में)। सांस की जलन हो सकती है। आनुवांशिक दोष पैदा करने का संदेह है। कैंसर का कारण बन सकता है। अंगों (आंखें, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र) को नुकसान पहुंचाता है। एहतियाती बयान - गर्मी, गर्म सतहों, स्पार्क्स, खुली लपटों और अन्य इग्निशन स्रोतों से दूर रहें। धूम्रपान नहीं। सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़े पहनें। स्पिलेज के मामले में, तुरंत उन सभी कपड़ों को उतार दें जो दूषित थे। यदि त्वचा के संपर्क में है: दूषित क्षेत्र को पानी से कुल्ला करें। यदि साँस ली जाती है: व्यक्ति को ताजी हवा में निकालें और आरामदायक होने पर सांस लेने की निगरानी करें। तुरंत एक जहर केंद्र / डॉक्टर को कॉल करें। यदि आंखों में: कई मिनटों के लिए आंखों को पानी से कुल्ला करें। यदि मौजूद और संभव हो, तो संपर्क लेंस को हटा दें। - गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, शेष लोब (कम से कम एक) को 50% मेथनॉल (विआयनीकृत पानी के साथ मिश्रित) के साथ न्यूनतम 4 घंटे के लिए ठीक करें, कमरे के तापमान पर रॉकिंग करें, इसके बाद कमरे के तापमान पर रात भर 100% मेथनॉल रॉकिंग करें। एक अलग कंटेनर में मेथनॉल अपशिष्ट इकट्ठा करें।
सावधानी: मेथनॉल तीव्र विषाक्तता का कारण बनता है यदि निगल लिया जाता है, साँस लिया जाता है, या त्वचा के संपर्क में होता है। मेथनॉल एक ज्वलनशील तरल और वाष्प है। सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें। हैंडलिंग करते समय सांस लेने से बचें और आग और गर्मी से दूर रहें। उपयोग करने के बाद त्वचा को अच्छी तरह से धो लें। स्पिलेज के मामले में, तुरंत सभी दूषित कपड़ों को उतार दें। त्वचा को पानी से धो लें। यदि साँस ली जाती है: व्यक्ति को ताजी हवा में निकालें और सांस लेने के लिए आरामदायक रखें। यदि साँस लेना, निगलना, या उजागर किया जाता है, तो एक जहर केंद्र / डॉक्टर को कॉल करें। - एक हवादार हुड में, benzyl अल्कोहल और benzyl benzoate (बीए: बीबी, 1: 2) (5 -10 मिलीलीटर प्रति लोब) समाधान तैयार करें।
- जिगर लोब को 15- या 50- एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब (लोब के आकार के आधार पर) में रखें जिसमें बीएबीबी समाधान होता है। इसे पारदर्शी होने तक कमरे के तापमान पर रॉकिंग छोड़ दें। यह चरण लोब के आकार के आधार पर 2-16 घंटे के बीच ले जा सकता है।
नोट: BABB समाधान प्लास्टिक के कुछ प्रकार को भंग कर देता है। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब या कांच के कंटेनरों में नमूनों को संग्रहीत करना सुरक्षित है।
सावधानी: Benzyl benzoate निगलने पर तीव्र विषाक्तता का कारण बन सकता है। यह लंबे समय तक चलने वाले प्रभावों के साथ जलीय जीवन के लिए विषाक्त है। एहतियाती बयान: हैंडलिंग के बाद त्वचा को अच्छी तरह से धोएं। यह निगलने पर, त्वचा के संपर्क में आने पर, या साँस लेने पर हानिकारक होता है। धुएं / वाष्प साँस लेने से बचें। हैंडलिंग करने के बाद हाथों को अच्छी तरह से धो लें। इस उत्पाद का उपयोग करते समय न खाएं, न पीएं या धूम्रपान न करें। यदि निगल लिया जाता है - एक जहर केंद्र / डॉक्टर को कॉल करें यदि अस्वस्थ हो तो हवादार क्षेत्रों में उपयोग करें। spillage ले लीजिए. अनुमोदित अपशिष्ट निपटान संयंत्र को सामग्री/कंटेनर का निपटान करें। - इंजेक्शन की गुणवत्ता का निरीक्षण करें। केवल अच्छी तरह से इंजेक्ट किए गए जिगर को माइक्रोसीटी के साथ स्कैन किया जाना चाहिए।
2. माइक्रो गणना टोमोग्राफी
- नमूना तैयारी
- 100 मिली लीटर आसुत पानी और 1 ग्राम एगारोज़ पाउडर मिलाकर 1% एगारोज़ जेल तैयार करें। मिश्रण को माइक्रोवेव में रखें और घोल को तब तक उबालें जब तक कि एगरोज पाउडर घुल न जाए।
- जिगर के नमूने को थर्मल क्षति से बचने के लिए ~ 40 डिग्री सेल्सियस के लिए 1% agarose जेल टेम्पर।
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ब्याज के लोब (ओं) को रखें और इसे ट्यूब की कुल मात्रा के लगभग 2/3 तक 1% एगारोज़ जेल से भरें। यह चरण सीटी माप के दौरान अवांछित नमूना गति को कम करता है।
- CT मापन
नोट:: निम्न चरण ों CT डिवाइस-निर्भर हैं, और विशिष्ट सेटिंग्स और क्रियाएँ विभिन्न CT डिवाइस और निर्माताओं के लिए भिन्न हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, उपयोग किए जाने वाले माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी स्कैनर को सीटी माप के लिए एक नैनोफोकस एक्स-रे ट्यूब (180 केवी / 15 डब्ल्यू) और फ्लैट-पैनल गतिशील 41|100 (4048 पिक्सल एक्स 4048 पिक्सल, पिक्सेल आकार 100 मिमी के साथ बिनिंग 2) से सुसज्जित किया गया था।- सीटी डिवाइस के घूर्णी चरण पर नमूने के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को माउंट करें और इसे कम से कम 1 घंटे के लिए माप कक्ष के लिए थर्मल रूप से अनुकूलित करने की अनुमति दें।
- जब नमूना थर्मल रूप से अनुकूलित होता है, तो इसे फील्ड ऑफ व्यू (एफओवी) में केंद्रित करें।
- स्रोत-नमूना और नमूना डिटेक्टर दूरी (SSD, SDD) को अनुकूलित करने के लिए पर्याप्त voxel संकल्प तक पहुँचने के लिए, उदाहरण के लिए, एक वयस्क murine जिगर के नमूने के लिए 12 μm या
- सीटी डिवाइस निर्माता की सिफारिशों का पता लगाने वाले सिग्नल के पर्याप्त स्तर तक पहुंचने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर (यानी, वोल्टेज और वर्तमान, एक्सपोजर, बिनिंग, औसत को तेज करना) सेट करें। ये पैरामीटर न केवल सीटी डिवाइस-निर्भर हैं, बल्कि नमूना-निर्भर भी हैं और प्रत्येक नमूने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। Hankeova et al.9 में, सेटिंग्स थे: 80 kV त्वरित वोल्टेज, 160 μA त्वरित वर्तमान, 400 एमएस एक्सपोजर समय, और 2000 छवियों।
- कोई CT माप प्रारंभ करें. सीटी डेटा के पुनर्निर्माण के लिए एक समर्पित टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
3. विश्लेषण और डेटा विभाजन
नोट:: निम्न चरणों छवि-संसाधन सॉफ़्टवेयर-निर्भर हैं; विशिष्ट सेटिंग्स और क्रियाएँ उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के आधार पर भिन्न हो सकती हैं.
- CT डेटा लोड करें: फ़ाइल का चयन करें > आयात > आदेश. आगे का चयन संसाधित किए जाने वाले CT डेटा के विशिष्ट स्वरूप पर निर्भर करता है.
- वैश्विक थ्रेशोल्डिंग का उपयोग कर डेटा में राल खंड करने के लिए शीर्ष पैनल पर फ़ंक्शन सतह निर्धारण का उपयोग करें। संवाद विंडो में, केवल राल से भरे जहाजों को विभाजित करने के लिए लाल "आइसोवैल्यू" लाइन की स्थिति निर्धारित करके हिस्टोग्राम मूल्यांकन के साथ थ्रेशोल्ड मान निर्धारित करें (यानी, प्रस्तुत "पूर्वावलोकन पैनल" में पीली रेखा द्वारा शामिल) (चित्रा 3 ए)।
- बाएं पैनल पर, मॉड्यूल का चयन करें मात्रा / सीएडी / मेष से आरओआई बनाएँ राल से भरे जहाजों के ब्याज का एक क्षेत्र (आरओआई) बनाने के लिए। संवाद विंडो में, ठोस से ROI (s) बनाएँ विकल्प का उपयोग करें, संसाधित वॉल्यूम का नाम चुनें और पुष्टि करें।
- इस ROI की पृष्ठभूमि क्षेत्र में शोर क्लस्टर के गलत विभाजन को समाप्त करें। सही पैनल पर इस ROI चिह्नित करें, उस पर राइट-क्लिक करें और मॉड्यूल स्प्लिट ROI का चयन करें।
- संवाद विंडो में, सभी शोर कणों को बाहर करने के लिए न्यूनतम वॉल्यूम [voxel] पैरामीटर सेट करें - यह मान प्रयोग- और डेटा-निर्भर है और प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए (चित्रा 3 बी)।
- राल-कास्ट आरओआई में कलाकृतियों के बिना चिकनी, निरंतर और ठोस नहर मास्क बनाएं - उदाहरण के लिए, हवा के बुलबुले या राल रिसाव की उपस्थिति।
- बाएँ पैनल पर, मॉड्यूल स्मूथिंग का उपयोग करें, 1 या 2 पर स्मूथिंग स्ट्रेंथ पैरामीटर सेट करें (व्यक्तिगत डेटा के आधार पर, जब उच्च मान मॉडल विरूपण का कारण बन सकते हैं, खासकर जब ठीक संरचनाओं से निपटते हैं)। यदि आवश्यक हो, तो इस प्रक्रिया को दो बार चलाएं (चित्रा 3 सी)।
- खंडित राल मुखौटा में अलग-अलग ट्यूबलर सिस्टम की पहचान करें और अलग करें।
- सीटी डेटा में उच्च तीव्रता मूल्यों के साथ अधिक अवशोषक राल (आम पित्त नलिका इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाने वाला पीला राल) से भरे सिस्टम के लिए एक अलग आरओआई बनाएं। चरण 3.2 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें। (चित्रा 3Di)।
- नए ROI और राल मुखौटा ROI चिह्नित करें, राइट-क्लिक करें और ROI (S) घटाएं और शेष ट्यूबलर सिस्टम (चित्रा 3Dii, iii) के लिए एक नया ROI बनाने के लिए राल मुखौटा ROI से नए ROI घटाने का चयन करें।
- विभिन्न सॉफ़्टवेयर में बाद के प्रसंस्करण के लिए ऑपरेटर प्राथमिकताओं के आधार पर, विभिन्न स्वरूपों में दोनों ट्यूबलर सिस्टम के लिए परिणामी ROIs निर्यात करें। इसके अलावा, एक छवि या एक वीडियो के रूप में अंतिम विज़ुअलाइज़ेशन निर्यात करने के लिए एक वॉल्यूम ग्राफिक्स सॉफ़्टवेयर में परिणामी ROIs को संसाधित करें।
Representative Results
क्या करना है
सफल डबल राल इंजेक्शन प्राप्त किया जाता है जब दोनों intrahepatic पित्त नलिकाओं और पोर्टल शिरा वास्कुलचर अच्छी तरह से भर रहे हैं. एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में, एक लोब को साफ़ करना (उदाहरण के लिए, बाएं पार्श्व लोब) एक सफल इंजेक्शन के सत्यापन के लिए अनुमति देता है, इसके बाद ब्याज के लोब की इमेजिंग होती है। ऑप्टिकल रूप से साफ किए गए लोब को बाद में माइक्रोसीटी का उपयोग करके स्कैन किया जा सकता है; इसलिए पूरे जिगर को ऑप्टिकल रूप से साफ करना संभव है। अच्छी तरह से इंजेक्ट किए गए माउस जिगर में, पोर्टल शिरा वास्कुलचर को राल से भरा जाना चाहिए जब तक कि जिगर की परिधि और राल को साइड-शाखाओं (चित्रा 4) में दिखाई नहीं देना चाहिए, और इस वास्तुकला को माइक्रोसीटी स्कैन और खंडित डेटा में ईमानदारी से पुनः प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, अच्छी तरह से इंजेक्ट किए गए इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं को मुख्य पोर्टल शिरा शाखाओं के बगल में दिखाई देना चाहिए जो लगभग परिधि तक फैली हुई हैं, और राल प्रमुख पक्ष शाखाओं में दिखाई देना चाहिए। यदि नियंत्रण लोब गुणवत्ता नियंत्रण चरण से गुजरता है, तो ब्याज के लोब (ऑप्टिकल रूप से साफ़ किए गए एक शामिल हैं) को माइक्रोसीटी के साथ स्कैन किया जा सकता है। एक अच्छी तरह से इंजेक्ट किए गए जिगर से खंडित डेटा का परिणाम P15 माउस (चित्रा 4A, B) और एक वयस्क माउस (चित्रा 4C, D) के लिए दिखाया गया है।
क्या न करें
बरकरार जिगर ऊतक सफल इंजेक्शन के लिए एक शर्त है। पेट की गुहा और डायाफ्राम को काटते समय अतिरिक्त देखभाल करें कि गलती से जिगर के ऊतकों को निक न करें। यदि इस प्रक्रिया के दौरान जिगर को शारीरिक क्षति होती है, तो राल पोर्टल शिरा इंजेक्शन (चित्रा 5 ए) के दौरान रिसाव होने की बहुत संभावना है। जिगर शारीरिक रूप से क्षतिग्रस्त होने पर संवहनी प्रणाली का एक अच्छा इंजेक्शन प्राप्त करना संभव नहीं है।
आम गलतियों में से एक राल के साथ जिगर को कम कर रहा है जो विज़ुअलाइज़ेशन या विश्लेषण के लिए चुनौतियों का कारण बन सकता है। सिस्टम अंडरफिलिंग के कारणों में से एक इंजेक्शन पूरा होने से पहले सुई या टयूबिंग की नोक में समय से पहले कठोर राल है (चित्रा 5 बी, नीले एरोहेड्स, कोष्ठक बड़े बुलबुले को दर्शाते हैं)। एक अच्छा अभ्यास प्रति जानवर एक इंजेक्शन सेट का उपयोग करना है और इलाज एजेंट को राल में जोड़ने के बाद तेजी से काम करना है। यदि राल इंजेक्शन के दौरान कठोर हो जाता है (जिसे आधे भरे हुए सिस्टम द्वारा देखा जा सकता है, तो यहां आधे भरे हुए पोर्टल शिरा वास्कुलचर के साथ उदाहरण दिया गया है) टयूबिंग को हटा दें, टयूबिंग की नोक को काट दें (हमेशा तिरछे सिरे से एक बेवेल्ड टिप बनाने के लिए), और प्लंजर को धक्का दें। यदि राल फिर से ड्रिप करना शुरू कर देता है, तो ध्यान से टयूबिंग को फिर से डालें और इसे टांके के साथ सुरक्षित करें। यदि राल सुई में कठोर हो गया है, तो टयूबिंग को पूरी तरह से बदल दें, इसे राल से भरें (बुलबुले से बचें), ध्यान से टयूबिंग को फिर से डालें, और इसे सिवनी के साथ सुरक्षित करें। टयूबिंग को बदलना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से युवा प्रसवोत्तर चूहों <पी 30 में, क्योंकि ऊतक अधिक नाजुक है। पोर्टल शिरा वास्कुलचर के खराब राल भरने का एक और कारण अपर्याप्त ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन हो सकता है (चित्रा 5 सी, नीले एरोहेड टर्मिनल शाखाओं में दिखाई देने वाले रक्त को दर्शाते हैं)। यह तब देखा जा सकता है जब वाहिकाओं की युक्तियों को राल के बजाय रक्त से भरा जाता है। इससे बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि पोर्टल नस (जिगर के बाहर) में इंजेक्शन से पहले कोई रक्त नहीं है। अंडरफिल्ड लिवर का तीसरा कारण तब होता है जब टयूबिंग को जिगर में बहुत गहराई से डाला जाता है और लोब में से एक की ओर एक शाखा में प्रवेश करता है। इसे रोकने के लिए, जिगर में प्रवेश से कम से कम 0.5 सेमी पर टयूबिंग डालें।
इसके विपरीत, सिस्टम के एक, या दोनों, राल (चित्रा 5 डी) के साथ ओवरफिल हो जाते हैं। पूरे इंजेक्शन में जिगर की नेत्रहीन निगरानी करना आवश्यक है। राल के साथ पित्त प्रणाली कास्टिंग पोर्टल शिरा राल कास्टिंग की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि राल से भरी नलिकाएं केवल यकृत की सतह पर दिखाई देती हैं, और यह आकलन करना मुश्किल है कि सिस्टम लगभग भरा हुआ है और कब रोकना है। जब जिगर की सतह पर छोटे पीले राल डॉट्स दिखाई देते हैं (चित्रा 2Ci, नीला एरोहेड), तो यह एक संकेत है कि पित्त प्रणाली पूरी तरह से भर गई है, और राल नलिकाओं से बाहर निकलना शुरू कर रहा है। माइक्रोसीटी डेटा विभाजन (चित्रा 5 डी, सही पैनल) के दौरान मामूली राल रिसाव को मैन्युअल रूप से ठीक किया जा सकता है।
यदि इंजेक्शन का दबाव बहुत अधिक है, तो यह जहाजों या नलिकाओं को टूटने का कारण बन सकता है (चित्रा 5 ई), अपरिवर्तनीय रूप से हानिकारक पोत या डक्ट आर्किटेक्चर। जिगर माइक्रोसीटी स्कैनिंग या विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं होगा। राल overfilling से बचने के लिए, सही मात्रा और प्रत्येक माउस मॉडल में इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल दबाव का अनुकूलन. चूहों के साथ काम करते समय जिन्हें विषाक्त आहार, आनुवंशिक संशोधन, या जिगर की चोट के साथ चुनौती दी गई है जो पित्त या शिरापरक प्रणालियों, या जिगर की कठोरता को प्रभावित करती है, इंजेक्शन के दबाव और मात्रा को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि मात्रा और दबाव सहन जंगली प्रकार के चूहों से अलग हो सकता है। यह प्रोटोकॉल दो प्रणालियों के मैनुअल इंजेक्शन का वर्णन करता है, लेकिन इंजेक्शन दबाव को मानकीकृत करने के लिए सिरिंज को पंप से जोड़ना संभव है। बुलबुले एक और बहुत ही आम इंजेक्शन विरूपण साक्ष्य है कि ट्यूबलर नेटवर्क के विरल भरने की ओर जाता है (चित्रा 5F-H, नीले एरोहेड्स) हैं। बुलबुला गठन से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि सिरिंज और टयूबिंग में कोई बुलबुले नहीं होते हैं, पूरी तरह से राल से भरे होते हैं, और राल इंजेक्शन से पहले टयूबिंग की नोक से टपक रहा है। माइक्रोसीटी डेटा पर नकारात्मक क्षेत्रों के रूप में दिखाई देने वाले छोटे बुलबुले को पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों के दौरान मैन्युअल रूप से सही किया जा सकता है, हालांकि यह श्रमसाध्य है।
ताजा सबसे अच्छा है
ताजा पीले राल का उपयोग करना एक महत्वपूर्ण कारक है, जो दो रेजिन और माइक्रोसीटी डेटा विभाजन के विपरीत को काफी प्रभावित करता है। जब ताजा खोले गए राल का उपयोग किया जाता है (चित्रा 6 ए) तो पीले राल-इंजेक्ट किए गए पित्त नलिकाओं (उज्ज्वल सफेद) और हरे राल-इंजेक्टेड पोर्टल नसों (उज्ज्वल ग्रे) के बीच इसके विपरीत एक स्पष्ट अंतर होता है। ताजा राल के साथ इंजेक्ट किया जाता है कि जिगर आसानी से स्वचालित वैश्विक थ्रेशोल्डिंग का उपयोग कर संसाधित किया जाता है। लंबे समय तक भंडारण के साथ, राल अवक्षेपित होता है, और इसके विपरीत कम हो जाता है। भंडारण के 3 महीने के बाद, इसके विपरीत अभी भी पित्त नलिका (चित्रा 6 बी) से पोर्टल नस को अलग करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन वर्षा दो रेजिन के मिश्रण को प्रभावित करती है, जो भरे हुए पोर्टल शिरा में एक विषम अस्पष्टता के रूप में दिखाई देती है (चित्र 6 बी, नीले एरोहेड्स)। विषम कंट्रास्ट नकारात्मक रूप से स्वचालित थ्रेशोल्डिंग को प्रभावित करता है और मैनुअल सुधार की आवश्यकता होती है, जो प्रसंस्करण समय को बढ़ाता है। यदि राल छह महीने से अधिक पुराना है, तो इसके विपरीत एक बिंदु पर अवक्रमित हो गया है जिस पर अकेले उनके विपरीत के आधार पर हरे-इंजेक्टेड पोर्टल शिरा से पीले-इंजेक्ट किए गए पित्त नली को अलग करना संभव नहीं है (चित्रा 6 सी)। इस मामले में, पित्त नलिका और पोर्टल शिरा को हिलर क्षेत्र में उनके व्यास और स्थिति के आधार पर मैन्युअल रूप से विभाजित किया जाना चाहिए और पूरे माइक्रोसीटी डेटा में मैन्युअल रूप से पालन किया जाना चाहिए। यह प्रक्रिया बेहद समय लेने वाली है और सबसे अच्छी तरह से टाली जाती है।
चित्रा 1: इंजेक्शन राल कास्टिंग के लिए सेट. (ए) इंजेक्शन सेट # 1 में एक 30 जी सुई और पीई 10 ट्यूबिंग शामिल है जो ~ 30 सेमी लंबा है। इंजेक्शन सेट # 2 एक 23 जी सुई और PE50 टयूबिंग ~ 30 सेमी लंबा से बना है। (बी) टयूबिंग की नोक को फैलाया जाता है और एक कोण पर काटा जाता है ताकि एक बेवेल्ड टिप बनाई जा सके। A और B में शासक एक सेंटीमीटर शासक है, जिसमें 1 सेमी की प्रमुख वृद्धि, 5 मिमी की मध्यवर्ती वृद्धि और 1 मिमी की मामूली वृद्धि होती है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: डबल राल कास्टिंग प्रवाह चार्ट. (ए) मुरीन शिरापरक परिसंचरण प्रणाली और हाइलाइट किए गए दाहिने आलिंद के साथ हृदय को दिखाने वाली योजनाबद्ध, जिसे परफ्यूजन से पहले काट दिया जाना चाहिए, और बाएं वेंट्रिकल जिसमें सुई को परफ्यूजन के लिए डाला जाना चाहिए ताकि परिसंचरण प्रणाली से रक्त को धोया जा सके। अवर वेना कावा को संवहनी दबाव से राहत देने के लिए गुर्दे के नीचे काट दिया जाना चाहिए। (बी) पित्त नलिका राल इंजेक्शन प्रवाह चार्ट। (i) (ए) की ज़ूम छवि दर्शाती है कि आईवीसी को कहां तोड़ना है। (ii) सामान्य पित्त नलिका (पीली बिंदीदार रेखा) को दर्शाने वाली छवि जिगर हिलर क्षेत्र से ओडी (काले एरोहेड्स) के स्फिंक्टर तक, साफ किए गए सामान्य पित्त नलिका के नीचे सिवनी धागे के साथ। (iii) सामान्य पित्त नलिका के चारों ओर ढीले ओवरहैंड गाँठ के लिए उपयुक्त स्थिति। (iv) पीली बिंदीदार रेखा और काले एरोहेड्स ओडि के स्फिंक्टर को लेबल करते हैं, जो चीरा के लिए तिरछे कोण का प्रदर्शन करते हैं और तिरछे कोण चीरे के बाद उद्घाटन कैसे दिखाई देना चाहिए। (v) सम्मिलन पर पीई10 टयूबिंग बेवल खोलने (ऊपर की ओर) के अभिविन्यास का प्रदर्शन करना। (vi) इंजेक्ट किए जा रहे पीले राल की उपस्थिति; राल आसानी से ढीले बंधे गाँठ पारित करना चाहिए. IVC, अवर वेना कावा; CBD, सामान्य पित्त नलिका. (सी) पोर्टल शिरा राल इंजेक्शन प्रवाह चार्ट। (i) हरी बिंदीदार रेखा हिलर क्षेत्र से पोर्टल नस को चिह्नित करती है। नीले एरोहेड्स ओवरफिल्ड बिलियरी सिस्टम को लेबल करते हैं। (ii) पोर्टल शिरा के चारों ओर ढीले ओवरहैंड गाँठ के लिए उपयुक्त स्थान। (iii) सम्मिलन पर बेवल खोलने (ऊपर की ओर) का प्रदर्शन करने वाली योजनाबद्ध। (iv) हरे राल और पीले राल के इंजेक्शन पर जिगर की उपस्थिति; जिगर परिधि में राल से भरे रक्त वाहिका पर ध्यान दें। पीवी, पोर्टल नस. चित्रा 2A Biorender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: वॉल्यूम ग्राफिक्स सॉफ़्टवेयर में माइक्रो सीटी डेटा प्रोसेसिंग। (A) सतह निर्धारण, (i) अतिरंजित आइसोवैल्यू (चयन का वर्तमान पूर्वावलोकन पीले रंग में दिखाया गया है), (ii) कम करके आंका गया आइसोवैल्यू, (iii) पोर्टल शिरा और पित्त नलिकाओं की उचित सतह निर्धारण के लिए आइसोवैल्यू का इष्टतम चयन। (बी) सतह निर्धारण द्वारा बनाए गए ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को विभाजित करना, (i) संवाद विंडो में मूल्य को इतना उच्च सेट करना कि केवल एक खंड (सबसे बड़ा एक) रहेगा, (ii) पीले फ्रेम में छोटे (बहिष्कृत) कण दिखाए जाते हैं। (c) डेटा की सतह चिकनाई, (i) स्मूथिंग फ़ंक्शन बाएं पैनल पर है, (ii) 1 (अधिकतम 2) पर स्मूथिंग ताकत सेट करें और नए स्मूद किए गए ROI, (iii) स्मूद किए गए डेटा का निर्माण करें। (डी) अलग-अलग ट्यूबलर प्रणालियों का पृथक्करण, (i) सतह निर्धारण फ़ंक्शन में आइसोवैल्यू सेट करें ताकि केवल पित्त प्रणाली को चयन में शामिल किया जा सके (चयन का वर्तमान पूर्वावलोकन पीले रंग में दिखाया गया है), (ii) दोनों प्रणालियों के आरओआई और केवल पित्त प्रणाली के आरओआई को चिह्नित करें और दोनों प्रणालियों के आरओआई से पित्त प्रणाली आरओआई को घटाएं, (iii) ग्रे रंग में दिखाया गया पोर्टल शिरा, हरे रंग में दिखाया गया पित्त प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र4: अच्छी तरह से इंजेक्ट किए गए पित्त नलिका (BD) और पोर्टल शिरा (PV) सिस्टम। (A) ऑप्टिकल रूप से प्रसवोत्तर दिन 15 (P15) जिगर के दाएं औसत दर्जे का लोब (RML) को दो प्रणालियों में दो रेजिन के साथ इंजेक्ट किया गया। स्केल बार 1 मिमी (बी) P15 RML के 3 डी प्रतिपादन (ए) में दिखाया गया है जो सफेद और हरे रंग में पित्त प्रणाली में पोर्टल शिरा वास्कुलचर को दर्शाता है। स्केल बार 1 मिमी (सी) ऑप्टिकल रूप से दो प्रणालियों में दो रेजिन के साथ इंजेक्ट किए गए वयस्क जिगर के आरएमएल को साफ कर दिया गया। स्केल बार 1 मिमी (डी) वयस्क आरएमएल के 3 डी प्रतिपादन (सी) में दिखाया गया है जो सफेद और हरे रंग में पित्त प्रणाली में पोर्टल शिरा वास्कुलचर को दर्शाता है। H = hilar, P = परिधीय। स्केल बार 1 मिमी पैनलों A, B, D Hankeova et al.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र5: डबल राल जिगर इंजेक्शन की सामान्य चुनौतियां। (ए) छवि एक जिगर को दर्शाती है जो पेट की गुहा के प्रारंभिक उद्घाटन के दौरान गलती से निक किया गया था, और राल कट (नीले एरोहेड) के माध्यम से लीक हो रहा है। (बी) राल सख्त होने के कारण खराब इंजेक्ट किए गए पोर्टल शिरा प्रणाली। नीले एरोहेड्स खाली टर्मिनल शाखाओं को लेबल करते हैं, और लाल कोष्ठक बड़े बुलबुले लेबल करते हैं। स्केल बार 1 मिमी (सी) खराब ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन के कारण खराब इंजेक्ट किए गए पोर्टल शिरा प्रणाली। नीले एरोहेड टर्मिनल शाखाओं में दिखाई देने वाले रक्त को लेबल करते हैं। स्केल बार 1 मिमी (डी) ओवरफिल्ड बिलियरी सिस्टम राल की अलग-अलग गेंदों द्वारा प्रकट होता है। बाएं पैनल ऑप्टिकल रूप से साफ किए गए जिगर को दिखाते हैं, और दाएं पैनल 3 डी माइक्रोसीटी रेंडर की गई छवि दिखाते हैं। नीले बिंदीदार रूपरेखा ज़ूम-इन क्षेत्रों को दर्शाते हैं। काले एरोहेड्स जिगर के एक हिस्से को लेबल करते हैं जो माइक्रोसीटी स्कैनिंग के बाद ऑप्टिकल समाशोधन के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया था। स्केल बार 1 मिमी (ई) राल इंजेक्शन के दौरान उच्च दबाव पोर्टल नस के टूटने का कारण बन सकता है (इस पैनल में जानवर एक Jag1H268Q उत्परिवर्तन करता है), नीले एरोहेड्स द्वारा चिह्नित। स्केल बार 1 मिमी (एफ) पोर्टल शिरा इंजेक्शन (नीले एरोहेड्स) और (जी) पित्त प्रणाली इंजेक्शन (नीले एरोहेड), स्केल बार 1 मिमी के दौरान राल में बुलबुले, स्केल बार 1 मिमी (एच) बुलबुले का माइक्रोसीटी स्कैन (नीला एरोहेड), खराब रूप से भरे हुए टर्मिनल शाखाएं (लाल कोष्ठक) और राल रिसाव (पीला एरोहेड), स्केल बार 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: विभेदक राल कंट्रास्ट( ए) ताजा खोला गया पीला राल राल इंजेक्टेड पोर्टल शिरा (ग्रे) और पित्त नलिकाओं (सफेद) को अलग करने के लिए पर्याप्त विपरीत उत्पन्न करता है। (बी) पीले राल के तीन महीने के भंडारण से राल की वर्षा होती है जिसके परिणामस्वरूप विषम अस्पष्टता (ग्रे-व्हाइट पोर्टल शिरा, नीली एरोहेड) होती है। (सी) पीले राल के लंबे समय तक भंडारण (>6 महीने) पोर्टल शिरा (ग्रे) और पित्त नलिकाओं (ग्रे) के बीच के अंतर को कम करता है। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
Discussion
कई महत्वपूर्ण कदम DUCT सफलता का निर्धारण, नमूना तैयारी से लेकर सीटी डिवाइस के मापदंडों तक। सर्वोत्तम परिणामों को प्राप्त करने के लिए, 3 डी डेटा, छवियों और फिल्मों को प्राप्त करने के लिए स्वचालित थ्रेशोल्डिंग के साथ सीधे डिजिटल प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए अच्छी तरह से विपरीत, अच्छी तरह से इंजेक्ट किया गया, और बुलबुला-मुक्त राल का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रशिक्षण के साथ और इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, 90% इंजेक्शन सफल होते हैं और इसके परिणामस्वरूप पुन: प्रस्तुत करने योग्य डेटा होता है। दो इंजेक्टेड सिस्टम के बीच सबसे अच्छा विपरीत प्राप्त करने के लिए ताजा पीले राल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। पीले राल में एक बहुत मजबूत रेडियोपेसिटी होती है, जबकि नीले राल में अनिर्धारित रेडियोपेसिटी होती है। शीर्ष परिणाम एक नई पीली राल की बोतल खोलने के बाद पहले तीन महीनों के भीतर प्राप्त किए जाते हैं। समय के साथ, राल अवक्षेप, और लंबे समय तक भंडारण (>6 महीने) के बाद, पीले और हरे रंग के रेजिन अब सीटी स्कैन में अलग-अलग नहीं होंगे। खराब विपरीत के साथ छवियों को व्यापक और समय लेने वाली मैनुअल ट्रेसिंग और दो प्रणालियों के विभाजन की आवश्यकता होती है। इसके बाद, अच्छी तरह से फैला हुआ ट्यूबिंग वयस्क चूहों और सामान्य पित्त नलिका और प्रसवोत्तर चूहों की पोर्टल नस के सामान्य पित्त नलिका में फिट होने के लिए अपरिहार्य है। इंजेक्शन के लिए प्रवेश बिंदु को देखभाल के साथ बनाया जाना चाहिए। यदि आम पित्त नलिका को पार करने के लिए खुला काट दिया जाता है, तो यह आसपास के ऊतकों से अलग होने की संभावना है, जिससे टयूबिंग के सफल प्रवेश को रोका जा सकता है। यह कदम प्रसवोत्तर चूहों के लिए विशेष रूप से नाजुक है जिसमें आम पित्त नलिका वापस ले लेती है और "कर्ल अप" करती है यदि यह अपने आसपास के ऊतकों से अलग हो गई है, जिससे टयूबिंग का सम्मिलन बेहद चुनौतीपूर्ण हो जाता है। सामान्य पित्त नलिका प्रविष्टि और इंजेक्शन को कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। राल के साथ टयूबिंग तैयार करते समय और पूरे इंजेक्शन में, बुलबुले के गठन से बचें क्योंकि बुलबुले सीटी छवियों में नकारात्मक स्थान पैदा करेंगे और समय लेने वाले मैनुअल सुधार की आवश्यकता होगी। इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान और बाद में एक गीले कपास झाड़ू के साथ अपनी सतह पर रोलिंग करके धीरे से जिगर की मालिश करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह राल फैलाने की भी सुविधा प्रदान करता है। इंजेक्शन के पूरा होने और टयूबिंग को हटाने के बाद, रेशम सीवन गाँठ को जल्दी और सावधानी से कसना चाहिए, इसलिए राल पूरी तरह से पॉलिमराइज़ होने से पहले जिगर से बाहर नहीं निकलता है। सफल माइक्रोसीटी इमेजिंग के लिए, नमूने को सीटी डेटा में आंदोलन कलाकृतियों को खत्म करने के लिए एगारोज़ और थर्मल रूप से अनुकूलित के साथ ठीक से तय किया जाना चाहिए। अधिग्रहण सेटिंग्स भी महत्वपूर्ण महत्व की हैं, जिन्हें ठीक संरचनाओं को हल करने के लिए पर्याप्त स्थानिक संकल्प तक पहुंचने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
छोटे चूहों में इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया में तकनीकी संशोधन किए जा सकते हैं। वर्तमान में, युवा माउस लिवर की राल कास्टिंग पर्याप्त रूप से पतली टयूबिंग की उपलब्धता से सीमित है, जिसमें PE10 सबसे छोटा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टयूबिंग है। Tanimizu et al. सफलतापूर्वक भ्रूण दिवस 17 (E17) आम पित्त नलिका में कार्बन स्याही इंजेक्ट कांच केशिकाओं 11 का उपयोग कर. भविष्य का परीक्षण कि क्या राल को ग्लास केशिका के माध्यम से वितरित किया जा सकता है, इसलिए ब्याज का होगा। डक्ट को अन्य ट्यूबलर प्रणालियों जैसे वायुमार्ग और फेफड़ों के फुफ्फुसीय धमनी वास्कुलचर को इंजेक्ट करने के लिए आगे अनुकूलित किया गया था9। डबल राल इंजेक्शन को अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेजिन के साथ उपयोग करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, या इस प्रोटोकॉल का उपयोग कार्बन स्याही वाले इंजेक्शन के लिए किया जा सकता है।
डक्ट पाइपलाइन के मुख्य सीमित कारकों में से एक राल चिपचिपाहट है। डक्ट का उपयोग केवल 5 μm के व्यास से ऊपर ट्यूबलर संरचनाओं के राल कास्टिंग के लिए किया जा सकता है। इस डेटा सेट में, राल 5 μm9 के सबसे छोटे व्यास के साथ ट्यूबों में प्रवेश कर सकता है। यह आकार सीमा ठीक ductules और छोटे केशिकाओं के विश्लेषण को रोकती है। छोटे कैलिबर जहाजों के लिए डक्ट पाइपलाइन को आगे बढ़ाने के लिए, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेजिन का परीक्षण किया जाना चाहिए, या नए कम चिपचिपाहट वाले रेडियोपेक एजेंटों के विकास से लुमेन प्रवेश में सुधार हो सकता है।
Hankeova et al.9 में, DUCT की तुलना दो अन्य आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीकों से की गई थी, डबल कार्बन स्याही इंजेक्शन के बाद ऊतक समाशोधन और मानक फोटोग्राफी, और अल्फा-चिकनी मांसपेशी कोशिका एक्टिन के साथ रक्त वाहिकाओं के धुंधला होने के साथ iDISCO + और साइटोकेराटिन 7 के साथ पित्त नलिकाएं, इसके बाद 3 डी इमेजिंग 9। डक्ट ने दोहरे विश्लेषण के संदर्भ में अन्य दो तरीकों को पछाड़ दिया (जो उच्च यकृत ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण iDISCO + के लिए चुनौतीपूर्ण था), 3 डी इमेजिंग, और परिमाणीकरण (कार्बन स्याही इंजेक्शन के साथ संभव नहीं), और लुमेनाइजेशन (डक्ट आंतरिक लुमेन आर्किटेक्चर और सिस्टम परफ्यूजन के लिए डेटा प्रदान करता है)। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, DUCT की मुख्य सीमा न्यूनतम लुमेन आकार है जिसे इंजेक्ट किया जा सकता है और विश्लेषण किया जा सकता है (5 μm सीमा), एक पैरामीटर जिसमें कार्बन स्याही इंजेक्शन और iDISCO + दोनों ने बेहतर प्रदर्शन किया। डक्ट एकल सिस्टम राल कास्टिंग 3,5,6 से बेहतर है क्योंकि यह प्रत्येक इंजेक्ट किए गए सिस्टम के विश्लेषण की अनुमति देता है और दो प्रणालियों के बीच वास्तुशिल्प संबंध का अध्ययन करने के लिए दोहरी 3 डी जांच की सुविधा भी देता है।
डक्ट को 3 डी में किसी भी दो ट्यूबलर नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, DUCT का उपयोग जिगर पित्त और पोर्टल शिरा प्रणालियों और फेफड़े में फुफ्फुसीय धमनी वास्कुलचर और वायुमार्ग की कल्पना करने के लिए किया गया था। इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं पोर्टल शिरा के बगल में विकसित होती हैं, और पोर्टल शिरा एक संरचनात्मक टेम्पलेट और सिग्नलिंग केंद्र प्रदान करती है जो पित्त ट्री 12 के विकास और भेदभाव को नियंत्रित करती है। Hankeova et al.9 में, DUCT ने मानव बाल रोग Alagille सिंड्रोम के लिए माउस मॉडल में पित्त पुनर्जनन का पता लगाया। डक्ट ने पहले से अप्रकाशित वास्तुशिल्प तंत्र का खुलासा किया कि पित्त प्रणाली ने जंगली-प्रकार-जैसे वॉल्यूम 9 को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया था। अलागिल सिंड्रोम चूहों ने दो अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग किया: (1) जिगर के हिलर और केंद्रीय क्षेत्रों में, पित्त प्रणाली ने अपनी शाखाओं में वृद्धि की, और (2) जिगर की परिधि में, डे नोवो-जनित पित्त नलिकाएं अत्यधिक टॉर्चर थीं। इन दो कारकों को असामान्य वास्तुकला के बावजूद, एक निकट-सामान्य पित्त प्रणाली की मात्रा उत्पन्न करने के लिए संयुक्त किया जाता है। इसके अलावा, DUCT ने असामान्य पित्त नलिका ब्रांचिंग का पता लगाया जो पोर्टल शिरा ब्रांचिंग और पित्त नलिकाओं से स्वतंत्र होकर दो पोर्टल नसों के बीच कनेक्टिंग पुल ों का निर्माण करता है। इन फेनोटाइप्स को एकल राल कास्टिंग में पता लगाना असंभव होगा और पित्त नलिका प्रसार के रूप में 2 डी हिस्टोलॉजिकल वर्गों में गलत व्याख्या की जा सकती है। DUCT इस प्रकार गुणात्मक और गहराई से मात्रात्मक विश्लेषण की संभावना के साथ पूरे अंग या लोब स्तर पर दो ट्यूबलर नेटवर्क के 3 डी आर्किटेक्चर का वर्णन करने वाला डेटा प्रदान करता है। डक्ट विभिन्न पशु मॉडलों में प्रसवोत्तर जिगर के विकास और यकृत पुनर्जनन विश्लेषण के लिए एक नया मानक हो सकता है।
Disclosures
ईआरए प्रयोगशाला में एक अलग परियोजना ModeRNA द्वारा वित्त पोषित है। यहां वर्णित परियोजना/प्रोटोकॉल में मोडआरएनए की कोई भूमिका नहीं थी।
Acknowledgments
हम अपनी विशेषज्ञता के लिए कारी Huppert और स्टेसी Huppert धन्यवाद और पित्त नलिका cannulation और उनके प्रयोगशाला आतिथ्य के बारे में मदद. हम आम पित्त नलिका कैनुलेशन के साथ उनकी मदद के लिए नदजा शुल्ज़ और चार्लोट एल मैटसन को भी धन्यवाद देते हैं।
हम उनके समर्थन के लिए निम्नलिखित अनुदान एजेंसियों को धन्यवाद देते हैं:
ईआरए लैब में काम के लिए: कैरोलिंस्का इंस्टीट्यूट (2-560/2015-280), स्टॉकहोम्स लांस लैंडस्टिंग (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (स्वीडिश फाउंडेशन 'स्टार्टिंग ग्रांट), यूरोपीय एसोसिएशन फॉर द स्टडी ऑफ द लिवर (डैनियल अलागिल अवार्ड), स्वीडिश हार्ट-लंग फाउंडेशन (20170723), और वेटेन्सकाप्स्राडेट (2019-019)।
जेके लैब में काम के लिए: हम MEYS CR (LM2018110) द्वारा समर्थित चेकनानोलैब रिसर्च इन्फ्रास्ट्रक्चर को स्वीकार करते हैं। जे.के. अनुदान FSI-S-20-6353 के समर्थन के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
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- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
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- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
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- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
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- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
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