Summary
该协议介绍了在基于半导体的下一代测序平台上对非整倍性进行植入前基因检测所需的整体实验室内程序。在这里，我们以具有代表性的结果介绍了全基因组扩增、DNA片段选择、文库构建、模板制备和测序工作流程的详细步骤。
Abstract
下一代测序在确定遗传变异的临床应用中变得越来越重要。在植入前基因检测中，该技术在可扩展性、通量和成本方面具有独特的优势。对于用于非整倍性分析的植入前基因测试，这里介绍的基于半导体的下一代测序（NGS）系统提供了一种全面的方法，以至少8 Mb的分辨率确定结构遗传变异。从样品采集到最终报告，工作流程需要多个步骤，并严格遵守协议。由于各种关键步骤可以决定扩增的结果、文库的质量、读取的覆盖率和数据输出，因此，除文字外，具有视觉演示的描述性信息可以为操作和操作提供更多细节，这可能会对所有关键步骤的结果产生重大影响。本文介绍的方法将显示活检滋养外胚层（TE）细胞的全基因组扩增（WGA），基因组文库构建，测序仪管理以及最终生成拷贝数变异报告所涉及的程序。
Introduction
非整倍性是指由于存在一条或多条额外染色体或缺少一条或多条染色体而导致的染色体数量异常。携带某种类型非整倍体的胚胎，例如失去一条X染色体（特纳综合征），额外的常染色体拷贝，如常染色体21（唐氏综合症），13（帕陶综合征）和18（爱德华兹综合征）的三体性，或额外的性染色体，如47，XXY（克林费尔特综合征）和47，XXX（三重X综合征），可以存活到出生缺陷1的足月。非整倍体是妊娠早期流产和 体外 受精（IVF）失败的主要原因2。据报道，在IVF实践中，通过自然周期和药物对照组的不同年龄层，非整倍率可能在25.4%-84.5%之间。
下一代测序技术在临床上基因信息的测定中得到了广泛的应用。它提供了对基因组序列的实用访问，具有高效率和高通量。特别是，下一代测序也彻底改变了遗传因素的疾病诊断和基因组异常性测试4。基于半导体的测序系统使用半导体测序技术将生物反应测序中的化学信号直接传输到数字数据中，从而在3-7小时5，6内提供直接的实时检测数据序列。
在IVF程序中，植入前基因检测（PGT）在移植到子宫之前调查胚胎的遗传特征，以改善IVF结果并降低新生儿遗传疾病的风险1，7。在PGT与NGS技术相结合的情况下，从少于10个细胞中提取的遗传物质被全基因组扩增试剂或独立开发的全基因组扩增试剂扩增。这只需要扩增阶段的一个步骤，不需要预扩增，即可获得全基因组扩增产物。在构建的文库中设计并应用用于拷贝数变异和特殊基因位点测序的引物或面板。
NGS中植入前基因检测非整倍体（PGT-A）的典型工作流程涉及连续程序，并且需要实验室人员的繁重工作量8。一些误操作导致程序回滚可能会导致实验室的时间和资源意外损失。对于PGS-NGS工作流程，简洁明了的标准操作程序（SOP）是有帮助的;但是，字格式协议无法提供有关样品处理、设备操作和仪器设置的更详细信息，这些信息可以在视频协议中可视化。在本文中，经过验证的工作流程与操作细节的可视化演示相结合，可以在半导体测序平台上的PGT实践中提供更直接，更直观的参考协议。
此处的协议描述了一种支持并行批处理多达16个胚胎活检的方法。对于较大的批次，建议使用基于商业试剂盒的半导体测序方案，例如Reproes-PGS。
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Protocol
本研究应用的所有方案和滋养外胚层（TE）活检（1.1.1.1部分）均于2017年9月18日获得第924医院人类研究伦理委员会的审查和批准（编号：PLA924-2017-59）。患者/受试者提供了参加本研究的书面知情同意书。
1. 从人胚胎活检和全基因组扩增中分离DNA
- 全基因组扩增实验方案9，10
注意：微微PLEX WGA试剂盒用于进行全基因组扩增。- 样品收集和储存
- 滋养外胚层活检：在辅助孵化后，从D5/6胚胎的突出TE中平均抽取6至9个细胞，以获得合格量的DNA用于后续扩增。
- 将样品细胞转移到PCR管中5μL PBS中。
- 如果方案不直接进行DNA提取，请立即将样品冷冻在-80°C。
- 细胞裂解
注意： 补充文件1 列出了在细胞裂解和1、8、16和32个样品批次的全基因组扩增期间制备预混液时每种组分的推荐体积，并作为推荐体积的参考（超量以适应移液错误）。当配制该协议的其他预混液时，每个组分的体积会额外增加，以适应重复移液引起的组分消耗。所有短暂的离心均在台式小型离心机上在室温（RT）下进行2-10秒，固定RPM为10，000，离心力为5，300 x g。离心力必须介于 2，000 x g 和 12，000 x g 之间。- 用每份样品4.8μL提取酶稀释缓冲液和0.2μL细胞提取酶制备细胞裂解混合物。
- 将新鲜制备的细胞裂解混合物移液到PCR管中的每个5μL细胞样品中，并在室温下短暂离心管5秒。不要涡旋管子。
- 将样品在热循环仪中孵育如下：75°C，10分钟;95 °C， 4分钟;25 °C，14 分钟孵育后短暂离心管（5秒）。
- 全基因组 DNA 的预扩增
- 用每个样品的4.8 μL前置放大器缓冲液和0.2μL前置放大器酶制备预扩增混合物。
- 将5μL预扩增混合物移液到样品管中，穿过管壁，并短暂离心3秒。避免尖端到达管子的底部，并且不要涡旋管子。
- 根据 表1中提到的热循环仪程序孵育样品。
- 全基因组扩增
- 将样品短暂离心5秒，然后将预培养产物放在冰上。
- 用25μL扩增缓冲液，0.8μL扩增酶和34.2μL无核酸酶水制备全基因组扩增混合物。
- 将60μL新鲜制备的全基因组扩增混合物与15μL前置孵育产物混合;总体积需要为75μL，短暂离心5秒。避免尖端到达管子的底部，并且不要涡旋管子。
- 将PCR管放在热循环仪上，然后运行 表2中提到的热循环仪程序。
- 将离心管短暂离心5秒，然后将产品转移到新的1.5 mL离心管中。
- 使用荧光计11 量化 WGA 产品浓度。如果不进行下一步，样品可以在-20°C下暂时储存不到2个月。
- 样品收集和储存
- 协议中自主研发的WGA试剂。
- 样品收集和储存
- 在辅助孵化后从D5 / 6胚胎中取出细胞以进行以下扩增。
- 将含有1.5μL PBS的样品细胞转移到含有2μL PBS的PCR管中。
注意：PBS不含镁2+ 和钙2+。 - 如果不直接进入DNA提取方案，则立即在-80°C下冷冻样品。
- 细胞裂解
- 在室温下熔化细胞裂解缓冲液（40 mM 三 （pH 8）、100 mM 氯化钠、2 mM EDTA、1 mM 乙二醇四乙酸 （EGTA）、1% （v/v） Triton X-100、5 mM 焦磷酸钠、2 mM β-甘油磷酸盐、0.1% SDS）并将其放在冰上。向每个样品中加入2μL细胞裂解缓冲液，并短暂离心（5秒）。
注意：不要涡旋管，并避免移液器尖端接触管中的液体表面，以避免将细胞或DNA带出反应系统。 - 将样品在热循环仪中孵育如下：55°C，20分钟;95 °C， 10分钟;4°C，保持。孵育后在室温下短暂离心管10秒。
- 在室温下熔化细胞裂解缓冲液（40 mM 三 （pH 8）、100 mM 氯化钠、2 mM EDTA、1 mM 乙二醇四乙酸 （EGTA）、1% （v/v） Triton X-100、5 mM 焦磷酸钠、2 mM β-甘油磷酸盐、0.1% SDS）并将其放在冰上。向每个样品中加入2μL细胞裂解缓冲液，并短暂离心（5秒）。
- 全基因组扩增
- 将细胞裂解产物短暂离心5秒，并将其放在冰上。
- 通过与16μL扩增预混合溶液，1μL扩增酶和28μL无核酸酶水混合，为每个样品制备全基因组扩增混合物。轻轻混合，短暂离心（5秒），然后将混合物放在冰上。不要涡旋管子。
- 将新鲜制备的全基因组扩增混合物中的45 μL移液到步骤1.2.2.2中制备的细胞裂解产物中;轻轻混合，离心5秒。
注意：不要涡旋管子，避免移液器吸头接触管中的液体。 - 将PCR管放在热循环仪上，然后按照 表3中的详细说明运行程序。
- 将离心管短短5秒，然后将产品转移到新的1.5 mL离心管中。
- 使用荧光计11 量化WGA产品浓度，并将结果记录在QA（质量分析）表上。具有合格浓度的产品可以在-20°C下暂时储存不到2个月，如果不进行下一步。
- 样品收集和储存
2. 扩增片段选择
注：本节中使用的材料可在库制备套件（材料表）中找到。
- 开始之前的准备工作
- 平衡磁珠（n x 100μL）以在室温下纯化30分钟。
- 将以前的WGA产物恢复到RT.在室温下涡旋30秒，然后短暂离心。
- 准备新鲜的70%乙醇。
- 片段选择程序
- 移取25μLWGA产物，并转移到1.5 mL离心管中，预装25μL无核酸酶水。
- 涡旋并充分混合DNA纯化珠。将50μL等分到每个样品管中（原始样品：珠子（体积）= 1：1），涡旋并短暂离心（5秒）。将管在室温下放置5分钟以进行DNA结合过程。
- 将1.5 mL离心管插入磁架中，等待所有磁珠被吸引到管的侧壁。小心地将上清液转移到新的1.5 mL离心管中。避免将磁珠移出。
- 根据原始样品体积，移液30μL（原始样品：磁珠（体积）=1：0.6）磁珠，涡旋和离心机短暂（5s）。将管在室温下放置5分钟以进行DNA结合过程。
- 将1.5 mL离心管插入磁体架中，等待5分钟，直到所有磁珠被吸引到管的侧壁。小心地取出并丢弃上清液。避免将磁珠移出。
- 将300μL70%乙醇移入1.5mL离心管中，以180°角轻轻旋转管两次，然后沿管壁移动珠子以进行彻底清洗。移液并丢弃上清液。避免将磁珠移出。
- 重复一次洗涤过程。
- 从磁架上取下1.5 mL离心管，然后离心不久（5秒）。将磁管插入磁架，然后等待所有磁珠被吸引到磁管的侧壁。
- 小心地移出底部的剩余液体。保持管子打开以在室温下干燥珠子3-5分钟。保持珠子上的水分。
注：如果珠粒上出现任何裂缝，请立即合上盖子。 - 从磁性架中取出试管，将25-30μL DNA洗脱缓冲液移入管中，然后关闭盖子并涡旋。短暂离心（5秒）以使浑浊的液体到达管的底部，并将管置于室温下5分钟。
- 将管子插入磁性支架，然后等待所有磁珠被吸引到管侧壁并且上清液变成透明。小心地将DNA溶液转移到新的1.5 mL离心管中。避免将磁珠移出。
- 用荧光计11定量片段选择后的DNA浓度，将其储存在-20°C。 通常，所选DNA片段的浓度范围为1.5-2.4纳克/微升。
3. DNA文库的制备12
注：本节中使用的材料可在库制备套件（材料表）中找到。
- 末端修复
- 将磁珠在室温下平衡30分钟。
- 在步骤2.2.12中平衡片段选择的DNA产物到RT.检查并记录每个含有DNA的小瓶上的标签。
- 在1.5 mL离心管中，用30 μL DNA产物，10 μL末端修复缓冲液，0.5μL末端修复酶和9.5μL无核酸酶水制备DNA末端修复系统。涡旋管30秒，并在室温下短暂离心（5秒），将所有液体送到管底。
- 在25°C下孵育30分钟，并在孵育后短暂离心（5秒）管。
- 涡旋或反向混合磁珠，并将75μL磁珠转移到含有末端修复的DNA样品的管中（原始样品：磁珠（体积）= 1：1.5）。移液器或轻轻涡旋以充分混合珠子，并短暂离心（5秒）以将所有悬浮液旋转到管的底部。将管在室温下放置5分钟以进行DNA结合过程。轻轻翻转管子以保持珠子分散。
- 将离心管插入磁架中，等待5分钟，直到所有磁珠被吸引到侧壁并且上清液变得透明。取出上清液，避免将磁珠移出，移液时将管子保持在架子上。
- 将300μL新制备的70%乙醇转移到管中，以180°角轻轻旋转管两次，然后沿着管壁移动珠子以进行彻底洗涤。移液并丢弃上清液。避免将磁珠移出。
- 重复一次洗涤过程。
- 从磁架上取下1.5 mL离心管，然后短暂离心（5秒）。将磁管插入磁铁架，等待5分钟，直到所有磁珠被吸引到管的侧壁。
- 小心地移出底部的剩余液体。打开1.5mL离心管的盖子，并在室温下干燥珠子3-5分钟。保持珠子上的水分。
注：如果珠粒上出现任何裂缝，请立即合上盖子。 - 将33μL DNA洗脱缓冲液移入管中，关闭盖子，然后涡旋。短暂离心（5秒）以使浑浊的悬浮液到达管的底部，并将管在RT下放置5分钟。
- 将管子插入磁性机架，然后等待所有磁珠被吸引到侧壁上，溶液变成透明。小心地将DNA溶液转移到具有适当标签的新1.5 mL离心管中，避免将磁珠移出。
- 条形码连接
- 将步骤3.2.2中的条形码连接试剂放在冰上，以融化所有冷冻试剂。
- 在1.5mL离心管中，用32μL最终修复的DNA产物，10μL无核酸酶水，5μL连接酶缓冲液，1μL连接酶和1μLP1适应物制备连接系统。将1μL每种条形码试剂移出到管中的溶液混合物中，用于一个样品，涡旋5秒，然后短暂离心（5秒）以将所有液体放入管底部。
注意：添加条形码时，请确认条形码和样品的数量是否对应;每次只打开一个条码小瓶，避免条码的混合污染;每添加五到六个条形码，请更换手套。 - 将试管在25°C孵育30分钟。
- 移液75μL（原始样品：磁珠（体积）=1∶1.5）的磁珠放入管中，并移液或轻轻涡旋以将磁珠充分混合。短暂离心（5秒）以将所有悬浮液旋转到底部，避免磁珠聚集。将管在室温下放置5分钟以进行DNA结合过程。轻轻翻转管子以保持磁珠分散。
- 将离心管插入磁架中，等待5分钟，直到所有磁珠被吸引到侧壁并且上清液变得透明。取出上清液，避免将磁珠移出，移液时将管子保持在架子上。
- 将300μL新制备的70%乙醇转移到管中，以180°角轻轻旋转管两次，然后沿着管壁移动珠子以进行彻底洗涤。移液并丢弃上清液。避免将磁珠移出。
- 重复一次洗涤过程。
- 从磁架上取下1.5 mL离心管，然后短暂离心（5秒）。将管子插入磁铁架并等待5分钟，直到所有磁珠被吸引到管的侧壁。小心地移出底部剩余的上清液。
- 保持管盖打开，在室温下干燥珠子3-5分钟。保持珠子上的水分。
注：如果珠粒上出现任何裂缝，请立即合上盖子。 - 将15μL DNA洗脱缓冲液移液移入管中。将珠子的颗粒冲洗到管的底部，密封盖子，然后涡旋。短暂离心（5秒）以使浑浊的悬浮液到达管的底部，并使管在室温下保持稳定5分钟。
- 片段扩增
- 当冷冻试剂溶解时，将库建筑试剂放在冰上。
- 将47.5μL酶混合物和2.5μL引物混合物转移到含有洗脱的DNA和珠子的管中，涡旋5秒，并短暂离心（5秒）以将所有液体送到管底部。
- 将试管置于室温下5分钟。将管子插入磁性架中，等到所有磁珠被吸引到侧壁上，上清液变成透明。小心地将DNA溶液转移到0.2 mL PCR管中，并标记清晰的标签，并避免移出珠子。
- 用以下程序将样品在热循环仪组中孵育：72°C，20分钟;98 °C， 2分钟;98 °C， 15 秒;62 °C， 15 秒;70 °C， 1 分钟 （6 周期）;70 °C，5 分钟反应结束后短暂离心管（5秒），并将产物储存在4°C。
- 将PCR产物转移到1.5 mL离心管中（低附着物）。在反应结束时将97.5μL（原始样品体积：磁珠（体积）= 1：1.5）磁珠加入管中，移液器或轻轻涡旋以充分混合磁珠，并短暂离心（5秒）以将所有液体旋转到底部。避免磁珠聚集。将试管置于室温下5分钟。轻轻翻转管子以保持磁珠分散。
- 将离心管插入磁架中，等待5分钟，直到所有磁珠被吸引到侧壁并且上清液变得透明。取出上清液，避免将磁珠移出，并保持管子在架子上稳定。
- 将300μL新制备的70%乙醇转移到管中，以180°角轻轻旋转管两次，然后沿着管壁移动珠子以进行彻底洗涤。移液并丢弃上清液。避免将磁珠移出。
- 重复一次洗涤过程。
- 从磁架上取下1.5 mL离心管并短暂离心（5秒）。将管子插入磁铁架，等待5分钟，直到所有磁珠都吸引到管的侧壁。小心地移出底部的剩余液体。
- 保持管盖打开，在室温下干燥珠子3-5分钟。保持珠子上的水分。
注：如果珠子颗粒上出现任何裂缝，请立即合上盖子。 - 将22μL DNA洗脱缓冲液移入管中，冲洗珠子的沉淀，然后关闭盖子并涡旋。短暂离心（5秒）以使浑浊的液体到达管的底部，并将管置于室温下5分钟。
- 用荧光计11 定量构建的DNA文库的浓度，并将构建的DNA文库储存在-20°C;所选DNA片段的浓度范围为0.6-10 ng / μL.在文库数据库中重新编码文库信息并相应地存储样品。
4. 测序模板的制备13，14
注意：本节中使用的材料可在测序反应通用试剂盒（材料表）的模板制备试剂盒套件（试剂/溶液/材料）中找到。
- 库混合
- 在服务器系统中填写预运行记录表的形式，并用库浓度和条形码编号标记样品管。避免在一次运行中对不同的样品使用相同的条形码。
- 涡旋并混合库样品，并短暂离心（5秒）。用无核酸酶水将所有样品稀释至100 pM，涡旋30秒，然后短暂离心样品。
注意：假设DNA的平均长度为260 bp，1 bp为660 g / mol，请使用以下等式计算ng / μL到pM的转换：1ng / μL = 5，827.5 pM / L。 - 将10μL100 pM稀释的文库移液到1.5 mL离心管中，涡旋30秒，并短暂离心2秒。将混合库放在冰上。
- 模板准备
- 启动模板放大系统并选择清洁程序。将反应油加入管的1/2中，将乳化剂破碎液加入管的1/3中。
- 确认放大板和清洗适配器已设置为 ON 位置。清洁废液瓶，然后将针头放入新的50 mL离心管中以收集废物。在模板扩增系统的屏幕上确认已处理的步骤。按 NEXT 启动一个干净的程序，大约需要 15 分钟。
- 清洁程序后，用新的扩增板替换扩增板，将含有150μL破碎溶液II的收集管插入转子中，并将桥放在收集管上。将反应油加入管的1/2中，将乳化剂破碎液加入管的1/3中。
- 乳化PCR试剂制备：在室温下平衡乳化PCR缓冲液直至其溶解，短暂离心（5秒）所有试剂，并在使用前将其放在冰上。
- 将120μL乳化PCR酶混合物，100μL模板离子球颗粒（ISP）缓冲液，170.5μL无核酸酶水和9.5μL混合库（100 pM）移入含有2，000μL乳化PCR缓冲液的管中。将溶液与重复移液充分混合。
注意：混合溶液必须在15分钟内加载到模板扩增系统上;在RT执行所有程序。 - 将用于模板制备的新过滤器稳定地放在试管架上，样品门户向上。涡旋溶液5秒，短暂离心（5秒），并在重复移液800μL三次后将溶液转移到过滤器的样品门户中。离心管以减少最后一次注射前的气泡。避免将空气注入过滤器。在混合溶液后注入200μL反应油II。
- 将过滤器的样品入口向下转动，并用过滤器更换洗涤适应。将样品针插入转子盖的中心孔中，然后将针头按到底部。
- 按屏幕上的 RUN 按钮，根据相应的套件选择程序，然后按 ASSISTED 检查所有步骤。按 “下一步 ”，直到开始运行;大约需要4.5小时才能完成。
- 程序完成后按 下一步 ;系统将开始10分钟的离心。当离心停止时，按下“ 打开盖子 ”按钮并将收集管移动到机架上。如果该过程在15分钟内未进入下一步，请按 Final Spin 重新离心。
- 取出收集管中的上清液，在管中留下100μL溶液。通过移液混合剩余的样品，并将样品转移到标有OT（一键式2系统）的新1.5 mL离心管中。
注意：移液上清液时，避免沿侧面接触管底。 - 将100μL无核酸酶水移液到每个收集管中，并将溶液转移到OT管中，用重复移液洗涤。向OT管中加入600μL无核酸酶水，使总体积为1 mL，涡旋30秒，并以15，500× g 离心8分钟。
- 轻轻地除去OT管中的上清液，剩余100μL，并使用尖端彻底丢弃油层。加入900μL无核酸酶水，涡旋30秒，并以15，500× g 离心8分钟。
- 除去上清液直至剩余20μL，加入模板重悬溶液使体积为100μL，涡旋30秒，并短暂离心2秒。
注意：在此步骤中获得的解决方案必须在不到12小时内继续进行下一步。 - 在关闭模板放大系统电源之前，在模板放大系统上运行清洁程序。
- 模板扩充
- 用280μL吐温-80和40μL1 M NaOH制备熔融混合物。
- 清洗 C1 磁珠。涡旋 C1 磁珠溶液 30 秒。将100μL微珠转移到1.5mL离心管中，将管插入磁性架上2分钟并丢弃上清液。
- 将1 mL C1磁珠洗涤溶液转移到管中并涡旋30秒。短暂离心（5秒），将管插入磁架2分钟，然后丢弃上清液。将130μLC1磁珠重悬溶液移液到管中，并通过重复移液混合珠子。避免产生气泡。
- 将100μL稀释的文库，130μLC1微球，300μL×3模板洗涤溶液和300μL熔融溶液加载到八孔试纸条中，如图 1所示。
- 将八孔试管安装在富集模块上，加载移液吸头，并将200μL离心管设置在收集位置。按 “开始” 运行该程序;大约需要35分钟。
- 样品将自动收集在200μL离心管中;合上盖子，以15，500× g 离心5分钟。检查管底部以验证是否有任何C1磁珠仍然存在。
- 如果残留C1磁珠，则重复移取模板溶液10x并将管插入磁性架4分钟。将所有上清液转移到新的0.2mL离心管中，并以15，500× g 离心5分钟。
- 如果没有剩余的可见C1磁珠，则丢弃上清液直到剩余10μL，加入200μL无核酸酶水，并通过移液10x混合。以15，500× g 离心5分钟。
- 用剩余的10μL弃去上清液，加入90μL无核酸酶水以达到100μL的总体积。该溶液可以在2-8°C下储存少于3天。
5. 下一代测序9，15
注：本节中的所有过程均在DA8600测序平台上执行。本节中使用的材料可在测序反应通用试剂盒（材料表）的测序试剂盒套件（试剂/溶液/材料）中找到。
- 检查运行测序平台所需的所有试剂和材料。
- 测序试剂：检查测序酶溶液（6 μL）、测序引物（20 μL）、质量控制模板（5 μL）和 dGTP/dCTP/dATP/dTTP （70 μL）的可用性，储存在 -30-10 °C 之间。
- 测序溶液：检查测序液II（100 mL），测序溶液III（50mL），退火缓冲液（1，015μL），上样缓冲液（10μL），发泡剂（2μL），氯片（1片）和链霉亲和素珠（100μL）的可用性，储存在4°C。
- 材料：检查 250 mL 试剂管 （8）、250 个试剂管盖 （8）、吸管 II （8）、吸管 （1）、2 L 试剂瓶 （1） 和测序芯片 （1） 的可用性，这些试剂瓶（1）存储在室温下。
- 使用前清洗芯片。
- 将一个芯片稳定地放在工作板上，将100μL无核酸酶水注入样品孔中，在出入口中取出溶液，然后重复该过程。
- 将100μL0.1M NaOH溶液注入芯片中，并在室温下孵育1分钟。
- 将100μL异丙醇注入样品孔中，在出局门户中除去多余的溶液，然后再次重复该过程。
- 用滤纸覆盖出入口，在氮气中流动以干燥芯片流通池中剩余的异丙醇，并将即用型芯片保持在室温。
- 定序器启动
- 打开氮气阀并将压力调节至30 psi。启动定序器，按主屏幕上的 CLEAN ，然后选择水或氯化物相应地清洗机器。
注意：每次运行前用水清洗，每周用氯化物或机器待机时间用试剂清洗超过48小时。 - 氯化物洗涤：选择一个指定用于氯化物洗涤的试剂瓶，用18 MΩ水洗涤瓶子两次，并用1 L的18 MΩ水填充瓶子。将一片氯化物片放入瓶中，溶解片剂10分钟，加入1mL 1 M NaOH，然后倒置瓶子以混合溶液。在制备后3小时内使用氯化物溶液。
- 用0.45μm过滤器过滤100mL氯化物溶液，并用两个管收集。将两个氯化物管安装到 C1 和 C2 位置。 按清洁 主屏幕上的清洁，并配备用于氯化物清洗的芯片。
- 按下 “下一步” 并检查屏幕上的所有步骤以启动洗涤程序;程序将在30分钟内结束。氯化物洗涤后开始用水洗涤。
- 水洗：用C1和C2标记两个专门针对水的管子，并用18 MΩ水清洗管两次。向每个水洗管中加入100 mL 18 MΩ水，并分别将其置于C1和C2位置。
- 选择 CLEAN 程序，安装准备水洗的芯片，按 “下一步”，然后检查屏幕上的所有步骤以启动洗涤程序。
- 打开氮气阀并将压力调节至30 psi。启动定序器，按主屏幕上的 CLEAN ，然后选择水或氯化物相应地清洗机器。
- 初始化
- 用洗涤液II清洁洗涤瓶，将其标记为W2，并用18 MΩ水洗涤三次。
- 用干法纸清洁氮气管，将其插入管底，并将气流调节至0.5 L / min。排出瓶中的氧气，并在瓶中装满1，920 mL 18 MΩ水。向瓶中加入序列溶液II和10μL1 M NaOH，关闭瓶盖，并将瓶子反转几次以混合溶液。
- 将两个新管标记为 W1 和 W3。向W1中加入32μL1 M NaOH，向W3中加入40-50mL的1x序列溶液III，然后关闭盖子。
注意：首次使用时，1x序列溶液III必须在37°C水浴中浸泡30分钟。序列溶液II必须避光并储存在室温下。使用20次后，必须更换新的洗漱瓶。 - 在主屏幕上按 “初始化” ，在 W1、W2 和 W3 位置上更换吸管，将管子相应地设置到其位置，然后通过旋转将其密封。安装芯片进行初始化并检查机器的状态参数。
- 按“下一步”启动初始化程序;第一部分需要40分钟。
注意：在更换新吸管之前，必须更换手套，以免污染吸管的身体。一旦用于水洗和初始化，芯片可以应用于初始化，但不要使用用于氯化物洗涤芯片的芯片进行初始化。 - 将白钨酸甘油三酯、二次反兴奋剂、二氧化二苯丙胺和二氧化钛合金溶解在冰上，然后涡旋混合。将四个新试管标记为G，C，A和T，并根据试管的标签移液70μL溶液。
- 准备要运行的库。
- 将质量控制模板、引物和酶溶液放在冰上。
- 当初始化程序还剩下约20分钟时，准备DNA文库。将质量控制模板涡旋30秒以混合，并短暂离心2秒。将5μL质量控制模板转移到模板溶液中，涡旋5秒，并将管离心15，500× g 5分钟。通过小心移液取出上清液，避免接触沉淀，并在管中留下10μL体积。
- 向管中加入15μL退火缓冲液;溶液的总体积为25μL。
- 当序列引物完全溶解在冰上时，涡旋引物并短暂离心2秒。将20μL序列引物从前一步转移到管中，涡旋5秒，短时间离心2秒，然后在使用前在室温下储存。
- 加载样品和测序
- 移取55μL在上一步中制备的样品溶液，并将其注入芯片的样品孔中。
- 将切屑放在离心机上;将缺口朝外，将样品入口保持在内部，用另一个用过的芯片平衡，离心10分钟。
- 准备装载解决方案。
- 在1.5 mL离心管中混合0.5 mL退火缓冲液和0.5 mL无核酸酶水。将其标记为50%退火缓冲液，并在7天内使用。
- 混合0.5 mL异丙醇溶液和0.5 mL退火缓冲液。将其标记为50%洗涤缓冲液，并在24小时内使用。
- 混合6 μL序列酶和60 μL 50%退火缓冲液。将其标记为酶反应缓冲液，并在制备后将溶液放在冰上。
- 混合49μL50%退火缓冲液和1μL发泡剂，并将其标记为发泡溶液。
- 将100μL空气吹入发泡溶液中，反复移液溶液，直到气泡处于致密的发泡状态，并保持泡沫体积在250μL左右。
- 离心后将芯片放在工作台上，将100μL泡沫注入样品孔中，然后在出料口中取出挤出的溶液。将切屑放回离心机中，并短暂离心30秒。
- 重复步骤 5.6.4-5.6.5。
- 将100μL 50%洗涤缓冲液注射两次，并在每次注射后在出料口中除去挤出的溶液。
- 将100μL50%退火缓冲液注入三次，并在每次注射后在出料口中除去挤出的溶液。
- 注入65μL50%酶反应缓冲液，避免气泡，并在出局门中除去挤出的溶液。
- 将加载的芯片在RT下稳定5分钟，并将芯片安装在定序器芯片门户上。选择步骤6中编程的计划，检查信息，然后开始运行;大约需要1.5小时才能完成。
- 运行结束后72小时内执行水洗程序。当时间超过72小时时，在水洗之前进行氯化物洗涤。关闭定序器，并关闭氮气阀。
6. 在报告器服务器系统中计划一个指示的测序运行16
注：本节中的所有过程都是使用报告器服务器系统在离子质子序列器上执行的。
- 登录到服务器系统，选择“ 计划 ”选项卡，然后单击“ 计划模板运行”。选择“ 全基因组” 作为运行类型，然后从计划的运行模板列表中选择相应的模板。
- 在“ 计划 ”选项卡中，输入或进行以下选择：
- 根据样本批次输入新的运行计划名称，从参考库下拉列表中选择 hg19（智人），然后从目标区域和热点区域下拉列表中选择无。
- 输入样品集中使用的条形码数量，从每个样品的下拉列表中选择一个条形码，然后输入唯一的描述性名称，这有助于对样品进行分组和跟踪。避免使用默认 示例 1 等。
- 在离子报告器选项卡中选择无，单击下一步，然后在应用程序中选择DNA和全基因组作为靶向技术。
- 在“ 工具包 ”选项卡中，验证选择，或在适合运行时进行更改。
- 从“库试剂盒类型”下拉列表中选择 Ion Plus 片段库试剂盒。在模板套件下拉列表中选择 Ion PI HI-Q OT2 200 套件，然后选择 OneTouch 作为默认值。从测序试剂盒下拉列表中选择 Ion PI HI-Q 测序 200 试剂盒。
- 输入 300 个流，从“芯片类型”下拉列表中选择“离子 PITM 芯片”，然后从“条形码集”下拉列表中选择“IonXpress”。
- 取消选择“ 标记为 重复项读取”和选择 “启用重新对齐”。
- 在插件选项卡中选择适当的 插件 ，以在步骤 7 中执行数据分析。完成项目步骤中的选择，单击“ 下一步”，然后单击右下角的“ 计划运行 ”以列出 “计划运行”。
- 在 “计划的运行 ”选项卡中，选择新创建的运行并检查审阅窗口中的所有设置。
7. 数据分析
- 使用生物信息学工作流程分析拷贝数变异 （CNV）。
注：在生物信息学工作流程中对CNV进行了分析，并实施了基于隐马尔可夫模型（HMM）17的算法;该模型使用整个基因组的读取覆盖率来预测拷贝数或整数倍体状态（即0，1，2，3等）。整个生物信息学管道是在序列服务器系统的插件中构建的，如图 2所示。生物信息学分析步骤平均需要4小时才能完成。
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Representative Results
当序列计划在机器中运行过程完成后完成时，序列服务器系统会报告摘要，其中包含生成的数据、芯片状态、ISP 加载速率和磁带库质量的描述性信息，如图 2 所示。在结果演示中，获得了总基数中的17.6 G数据，ISP在芯片总井中的总体加载速率为88%;热图显示样品均匀地加载到芯片的总面积上（图2A）。在代表性运行中，总共获得了99，761，079次读取，其中77%可用;在所有装有ISP的孔中，100%的模板富集，其中78%是克隆的。在所有克隆模板中，97%被限定为最终库（图2B）。读取的平均长度分别为 117 bp、176 bp 和 174 bp，分别具有平均值、中位数和模式（图 2C）。在模板适应中，T、C 和 A 的峰值计数约为 76，超过了 50 的合格截止线（图 2D）。在所有具有活ISP的可寻址孔中，99.5%被鉴定为构建的文库，并且过滤掉了20%的多克隆和低质量文库。76.6%的ISP有资格进行进一步分析（图2E）。
图3演示了来自单个样品S19030109-3的拷贝数变体的结果;黑色虚线被归一化为横跨22条常染色体和性染色体的真倍体片段，红线被归一化为非整倍染色体区域，代表4号染色体上p16.3-q35.2的182.16 Mb马赛克三体性，以及22号染色体上q11.1-q13.33的33.13 Mb单体片段。
表4和表5分别显示了使用WGA试剂盒的12个样品和使用独立开发的WGA试剂的一步法方法的13个样品的代表性报告，其中包括条形码ID，样品名称，唯一读数计数，对齐读数平均长度，平均深度，GC含量百分比和染色体变体标记的摘要信息。染色体变异标记显示性染色体，重复的位置和大小以及染色体上的缺失。
图1：8孔试纸条上的样品上样位置图。 每个孔分别指示装载内容物。U代表未富集的样品，B代表珠子，W代表洗涤液;图中还注明了空井。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：运行摘要：数据大小、ISP 加载和库质量指标 （A） 整体状态，包括总基数、关键信号和 ISP 加载速率以及热图。（B） 每个反应步骤中的总读取次数、可用读取速率和 ISP 信息的摘要。（C） 阅读长度的直方图。（D）TCA的共识关键1-Mer。（E） 可寻址孔和 IPS 克隆状态。请点击此处查看此图的大图。
图 3：可视化拷贝数变体图示例：S19030109-3。 拷贝数（CN）信号在图中可视化，染色体的蓝色和绿色间隔彼此相邻。给定的例子显示，4号染色体中CN的观察增加，22号染色体中CN的观察减少，因为红色中注意到的平均CNV线从2偏移。 请点击此处查看此图的大图。
| 不。周期数 | 温度 | 时间 |
| 1 个周期 | 95 °C | 2 分钟 |
| 12周 | 95 °C | 15 秒 |
| 15 °C | 50 秒 | |
| 25 °C | 40 秒 | |
| 35 °C | 30 秒 | |
| 65 °C | 40 秒 | |
| 75 °C | 40 秒 | |
| 1 个周期 | 4 °摄氏度 | 拿 |
表 1：用于预放大的热循环程序。 图中显示了温度、时间和循环等热反应条件。
| 步 | 温度 | 时间 | 不。周期数 |
| 1 | 95 °C | 2 分钟 | 1 |
| 2 | 95 °C | 15 秒 | 14 |
| 65 °C | 1 分钟 | ||
| 75 °C | 1 分钟 | ||
| 3 | 4 °摄氏度 | 拿 | 1 |
表2：使用全基因组扩增试剂盒进行全基因组扩增的热循环程序。 图中显示了温度、时间和循环等热反应条件。
| 步 | 温度（°C） | 时间 | 不。周期数 |
| 1 | 95 °C | 2 分 30 秒 | 1 |
| 2 | 95 °C | 30 秒 | 6 |
| 25°摄氏度 | 2 分钟 | ||
| 0.3 °C/秒 至 72 °C | —— | ||
| 72 °C | 1 分 30 秒 | ||
| 3 | 95 °C | 30 秒 | 20 |
| 62 °C | 30 秒 | ||
| 72 °C | 1 分钟 | ||
| 4 | 72 °C | 2 分钟 | 1 |
| 5 | 4 °摄氏度 | 拿 | 1 |
表3：使用自主开发的试剂进行全基因组扩增的热循环程序。 图中显示了温度、时间和循环等热反应条件。
| 示例名称 | 唯一读取计数 | 对齐读取 | 平均长度 | 平均深度 | 断续器% | 标清 | 马克 | |
| S19030109-1 | 913830 | 99.86 | 177.05 | 0.114 | 46.84 | 2.501 | 断续器 | |
| S19030109-2 | 1277192 | 99.88 | 176.7 | 0.164 | 47.01 | 2.641 | 二十， +chr8 {p23.3->q24.3（139.13Mb）} |
|
| S19030109-3 | 992646 | 99.89 | 177.06 | 0.122 | 46.77 | 2.388 | XX， +chr4{p16.3->q35.2（182.16Mb）}， -chr22{q11.1->q13.33（33.13Mb）} |
|
| S19030401-5 | 1657811 | 99.93 | 176.23 | 0.193 | 45.02 | 2.649 | 断续器 | |
| S19030401-6 | 1738015 | 99.93 | 176.45 | 0.203 | 44.93 | 2.73 | 断续器 | |
| S19030401-7 | 1444375 | 99.92 | 177.01 | 0.174 | 44.9 | 2.459 | XX， +chr11{p15.5->q25（128.36Mb）}， -chr7{p22.3->q36.3（151.74兆字节）} |
|
| S19030401-8 | 1792390 | 99.92 | 176.48 | 0.214 | 44.81 | 2.283 | 断续器 | |
| S19030401-9 | 1802221 | 99.93 | 176.72 | 0.216 | 44.85 | 2.614 | 断续器 | |
| S19030401-10 | 1932425 | 99.95 | 176.5 | 0.233 | 45.41 | 3.405 | 断续器 | |
| S19030402-1 | 1916686 | 99.92 | 176.83 | 0.239 | 45.06 | 3.452 | 扎伊，+15 {第11.1->21.1（23.93兆字节）} |
|
| S19030402-2 | 1608840 | 99.94 | 176.92 | 0.191 | 44.71 | 2.65 | 二十，-22 {第11->13.1（21.19兆字节）} |
|
| S19030402-3 | 1505603 | 99.92 | 176.56 | 0.18 | 44.74 | 2.34 | 断续器 | |
表4：服务器系统报告中使用全基因组扩增试剂盒的拷贝数变异示例输出。 典型的输出表包括诸如样本名称，唯一读取计数，对齐读取，平均长度，平均深度，CG百分比，长度标准偏差等参数，并且对于大多数参数，染色体状态标记有XY的性染色体标记和结论CNV细节。检测到的CNV标有染色体位置和片段大小。
| 示例名称 | 唯一读取计数 | 对齐读取 | 平均长度 | 平均深度 | 气相色谱% | 标清 | 马克 | |
| S21032201-8 | 1046608 | 99.93 | 178.69 | 0.055 | 40.49 | 2.532 | 断续器 | |
| S21032201-9 | 1152585 | 99.95 | 178.17 | 0.051 | 40.93 | 2.437 | 断续器 | |
| S21032201-10 | 1072667 | 99.94 | 178.31 | 0.046 | 40.69 | 2.687 | 断续器，+21 {第11.2->22.3（32.03兆字节）} |
|
| S21032201-11 | 1067195 | 99.96 | 178.05 | 0.052 | 40.51 | 2.847 | 二十，-HC2 {p25.3->p11.2（80.34Mb）} |
|
| S21032203-1 | 1539227 | 99.93 | 177.96 | 0.064 | 40.84 | 2.109 | 断续器 | |
| S21032203-2 | 1577847 | 99.96 | 178.11 | 0.044 | 40.52 | 2.508 | 扎伊，+2 {p25.3->q37.3（231.59兆字节）} |
|
| S21032203-3 | 1240175 | 99.96 | 177.35 | 0.043 | 40.57 | 2.594 | 断续器 | |
| S21032203-4 | 1216749 | 99.95 | 178.49 | 0.044 | 40.71 | 2.434 | 断续器 | |
| S21032203-5 | 1191443 | 99.94 | 177.57 | 0.04 | 41.06 | 2.464 | 二十，-22 {第11.1->13.33（33.13兆字节）} |
|
| S21032203-6 | 1045673 | 99.9 | 177.86 | 0.039 | 41 | 2.418 | 断续器 | |
| S21032211-1 | 962063 | 99.94 | 177.62 | 0.041 | 40.4 | 2.729 | XX，+15 {q11.1->q13.3（12.66兆字节）}， +chr2 {p25.3->p25.1（11.19Mb）} |
|
| S21032211-2 | 915407 | 99.95 | 178.15 | 0.034 | 40.48 | 2.747 | 断续器 | |
| S21032211-3 | 911129 | 99.92 | 178.53 | 0.055 | 40.59 | 2.436 | 断续器 | |
表5：服务器系统报告中独立研发的全基因组扩增试剂一步法输出拷贝数变异示例。 典型的输出表包括诸如样本名称，唯一读取计数，对齐读取，平均长度，平均深度，CG百分比，长度标准偏差等参数，并且对于大多数参数，染色体状态标记有XY的性染色体标记和结论CNV细节。检测到的CNV标有染色体位置和片段大小。
补充文件1：制备不同批量大小的预混液时每种组分的推荐体积。请按此下载此档案。
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Discussion
胚胎的染色体非整倍体是大部分妊娠丢失的原因，无论是自然受孕还是 体外 受精（IVF）。在IVF的临床实践中，提出筛选胚胎非整倍体并转移真倍体胚胎可以改善IVF的结果。荧光 原位 杂交是最早用于性别选择和PGT-A的技术;然而，这种技术需要实验室人员更多的技术专长，并且相对劳动密集型。越来越多的使用荧光 原位 杂交的PGT-A研究显示活产率没有改善17，18。
然而，在评估植入前基因检测中的拷贝数分析的技术已经取得了迅速进展。不同的方法有其优点和缺点。新开发的综合分子技术，如荧光定量PCR，单核苷酸多态性（SNP）阵列，阵列比较基因组杂交（aCGH）和下一代测序显示出改善IVF结果的前景7。其中，NGS与阵列比较基因组杂交具有高度的一致性，尽管它具有可扩展性，更高的通量，更容易的自动化，并且更有可能降低成本19，20，21。
结合WGA技术，胚胎活检的NGS分析可以提供更准确的序列信息，并且对于更多的单核苷酸水平靶标也有可行的扩展。随着下一代测序在检测遗传异常中的应用越来越多，迫切需要在实验室和临床实践中建立样本/数据处理标准22，23，24。
在PGT-A过程从分离到非整倍体鉴定的途径中，关键步骤包括分离、全基因组扩增方法的选择、下一代测序平台的选择以及测序数据的分析。全基因组扩增过程是PGT-A中最关键的一步，它决定了测序数据的完整性和均匀性。在之前的一项研究中比较了三种全基因组扩增策略，并证明picoPLEX准随机引物方法在测序数据的完整性和均匀性方面几乎与多位移扩增（MDA）方法一样有效25。由于临床实践侧重于分辨率约为10 Mbp的拷贝数变异（CNV），而不是PGT-A中的单个核苷酸变异，因此出于经济考虑，选择了picoPLEX WGA试剂盒和独立开发的WGA试剂。在扩增阶段，后者只需要一步即可完成全基因组的扩增，无需预扩增。
目前市场上有两个主要的商业平台用于PGT：来自Illumina26 的MiSeq和来自赛默飞世尔科技27的离子质子。Miseq和质子都可以识别全染色体非整倍性，但Miseq仅用于识别整个染色体的非整倍性，而质子也可以识别大的缺失（dels）或重复（dups），包括临床上显着的dels或dups，分辨率约为800 kb至1 Mb28。宝腾平台具有成本优势和强大的本地技术支持。由于这些原因，质子平台被选为后来的临床实践。
对于临床应用中的临床医生来说，下一代测序数据的生物信息学分析既复杂又具有挑战性。随着人类遗传变异和解释（如Clinvar29，1000基因组30和在线孟德尔人类遗传（OMIM）31）的公共档案中数据的增加，已经开发了更多的CNV注释软件应用程序，可供公共和私人使用32，33。在这里，应用了本地设计的信息系统Darui-LIMS，以协助实验室工作人员和临床医生在PGT-A34的临床实践中一键完成CNV数据分析。
我们的方法专为PGT-A而设计，在分辨率，准确性和成本之间取得了良好的平衡。遗传材料处理和生物信息学管道中的标准程序可以为临床分析提供一致的数据。随着基于NGS系统的技术的新进展，可以在PGT周期35，36中测试和诊断其他染色体结构异常，例如易位。.对于这些测试，需要开发和应用更专业的方法。即便如此，作为指导PGT-A临床实践的规范，这些方法对于DA8600下一代测序平台上PGT-A实验室实践的实验室工作人员和临床医生也很有帮助。
但是，此方法具有某些限制。在协议中，磁性机架可以支持的最大样本数为16;当然，根据临床样品的实际数量，也可以选择磁性架一次支持更多样品，或者增加磁性架的数量以执行更多的样品操作。但是，这可能会增加操作错误的风险。因此，在处理 32 个或更大样品的批次时，建议使用基于半导体测序的商业试剂盒，例如赛默飞世尔科技的离子重现 PGS 试剂盒。
根据中国食品药品监督管理总院颁布的《植入前染色体非整倍体检测试剂（高通量测序）质量控制技术评价指南》，要求单个样品的有效数据量不小于1M。根据Ion PI产品概述，每个芯片有60-80M读取，并且根据实验经验，有效唯一读取次数不小于原始数据的50%。计算后，每个实验样品的有效数据体积不小于2 M。因此，为保证实验结果的准确性，我们建议最大容量为16个样品。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢张勇明博士和侯荣基先生对LIMS扩展应用的建议。本研究由解放军计划生育专项研究项目（17JS008、20JSZ08）、广西代谢性疾病研究重点实验室基金（No.20-065-76）和广州市民健康科技攻关项目（201803010034）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
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