Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Модель тройной культуры первичных клеток гематоэнцефалического барьера человека для изучения ишемического инсульта in vitro

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64469
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Institute of Physiotherapy and Health Sciences, The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

Summary

Здесь описан метод создания модели тройной клеточной культуры гематоэнцефалического барьера на основе первичных микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека, астроцитов и перицитов. Эта многоклеточная модель подходит для исследований дисфункции нервно-сосудистых единиц во время ишемического инсульта in vitro или для скрининга кандидатов на лекарства.

Abstract

Ишемический инсульт является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире с ограниченными терапевтическими возможностями. Невропатология ишемического инсульта характеризуется прерыванием кровоснабжения головного мозга, приводящим к гибели клеток и когнитивной дисфункции. Во время и после ишемического инсульта дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) способствует прогрессированию травмы и способствует плохому восстановлению пациента. Современные модели ГЭБ в основном включают эндотелиальные монокультуры и двойные кокультуры с астроцитами или перицитами.

Таким моделям не хватает способности полностью имитировать динамическую микросреду мозга, которая необходима для межклеточной коммуникации. Кроме того, обычно используемые модели ГЭБ часто содержат увековеченные эндотелиальные клетки человека или клеточные культуры животного происхождения (грызуны, свиньи или крупного рогатого скота), которые создают трансляционные ограничения. В этой статье описывается новая модель ГЭБ, содержащая только первичные клетки человека (микрососудистые эндотелиальные клетки мозга, астроциты и перициты сосудов головного мозга), позволяющая исследовать ишемическую черепно-мозговую травму in vitro.

Влияние кислородно-глюкозной депривации (OGD) на целостность барьера оценивали с помощью измерений пассивной проницаемости, трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) и прямой визуализации гипоксических клеток. Представленный протокол предлагает явное преимущество в проникновении межклеточной среды ГЭБ in vivo, служа более реалистичной моделью BBB in vitro для разработки новых терапевтических стратегий в условиях ишемической черепно-мозговой травмы.

Introduction

Инсульт является одной из ведущих причин смерти и длительной инвалидности во всем мире1. Частота инсульта быстро увеличивается с возрастом, удваиваясь каждые 10 лет после 55лет 2 года. Ишемический инсульт возникает в результате нарушения мозгового кровотока вследствие тромботических и эмболических событий, которое охватывает более 80% всех случаев инсульта3. Даже в настоящее время существует относительно мало вариантов лечения, доступных для минимизации гибели тканей после ишемического инсульта. Существующие методы лечения чувствительны ко времени и, следовательно, не всегда приводят к хорошим клиническим результатам. Поэтому срочно необходимы исследования сложных клеточных механизмов ишемического инсульта, влияющих на постинсультное восстановление.

ГЭБ является динамическим интерфейсом для обмена молекулами между кровью и паренхимой мозга. Структурно ГЭБ состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, соединенных между собой соединительными комплексами, окруженными базальной мембраной, перицитами и астроцитарным концом4. Перициты и астроциты играют существенную роль в поддержании целостности ГЭБ за счет секреции различных факторов, необходимых для образования сильных, плотных соединений 5,6. Распад ГЭБ является одной из отличительных черт ишемического инсульта. Острая воспалительная реакция и окислительный стресс, связанные с ишемией головного мозга, приводят к нарушению белковых комплексов плотного соединения и дисрегулируемых перекрестных помех между астроцитами, перицитами и эндотелиальными клетками, что приводит к увеличению параклеточной проницаемости растворенного вещества через ГЭБ7. Дисфункция ГЭБ дополнительно способствует образованию отека мозга и увеличивает риск геморрагической трансформации8. Учитывая все вышесказанное, существует большой интерес к пониманию молекулярных и клеточных изменений, которые происходят на уровне ГЭБ во время и после ишемического инсульта.

Хотя многие модели BBB in vitro были разработаны в течение последних десятилетий и использовались в различных исследованиях, ни одна из них не может полностью воспроизвести условия in vivo 9. В то время как некоторые модели основаны на монослоях эндотелиальных клеток, культивируемых на хорошо вставленных проницаемых опорах отдельно или в сочетании с перицитами или астроцитами, только более поздние исследования представили модели тройной клеточной культуры. Почти все существующие модели тройной культуры ГЭБ включают первичные эндотелиальные клетки мозга вместе с астроцитами и перицитами, выделенными из видов животных, или клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека 10,11,12,13.

Признавая необходимость лучшего повторения человеческого ГЭБ in vitro, мы создали модель тройной клеточной культуры in vitro BBB, состоящую из микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека (HBMEC), первичных астроцитов человека (HA) и первичных сосудистых перицитов головного мозга человека (HBVP). Эта модель BBB с тройной культурой устанавливается на 6-луночную пластину, полиэфирные мембранные вставки с размером пор 0,4 мкм. Эти колодезные вставки обеспечивают оптимальную среду для прикрепления клеток и обеспечивают легкий доступ как к апикальным (кровь), так и к базолатеральным (мозг) отсекам для отбора проб среды или применения соединений. Особенности этой предложенной модели тройной клеточной культуры BBB оцениваются путем измерения TEER и параклеточного потока после OGD, имитирующего ишемический инсульт in vitro, с дефицитом кислорода (<1%O2) и питательных веществ (с использованием безглюсодержащей среды), достигаемой с использованием увлажненной, герметичной камеры. Кроме того, индуцированные ишемоподобные состояния в этой модели точно проверяются путем прямой визуализации гипоксических клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем ячейкам, материалам, оборудованию и решениям, используемым в этом протоколе.

1. Настройка модели тройной клеточной культуры BBB

  1. Посев перицитов
    1. Культивируют HBVP в колбах для культивирования T75 с активированной поверхностью для адгезии клеток в инкубаторе 5% CO2 при 37 °C до слияния. Как только слияние достигнуто, аспирируйте старую перицитную среду и промывайте клетки 5 мл теплого фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS). Аспирировать DPBS и отделить клетки от колбы, используя комбинацию из 4 мл теплого раствора трипсина-ЭДТА и 1 мл DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования отрывков позже P7.
    2. Инкубируйте колбу в течение 5 мин при 37 °C в инкубатореCO2 . Посмотрите под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отделены от колбы. Добавьте 5 мл теплой перицитной среды (содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки [FBS]) в колбу и переложите отсоединенные клетки в центрифужную трубку объемом 50 мл.
    3. Центрифугируют клеточную суспензию в течение 3 мин при 200 × г, позволяя клеткам образовывать гранулу в нижней части трубки. Аспирируйте среду из трубки, гарантируя, что клеточная гранула останется неповрежденной.
    4. Повторное суспендирование клеточной гранулы в перицитной среде; рассчитать количество среды в зависимости от слияния ячеек и количества необходимых скважин. Возьмите 10 мкл повторно суспендированных клеток, поместите их в слайд подсчета клеток и подсчитайте количество клеток.
    5. Определить плотность клеток и засеять 300 000 клеток/вставить в 1 мл перицитной среды на аблюминальную сторону колодезных вставок (формат 6 скважин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При посеве HBVP на нижней стороне вкладышей очень важно сначала перевернуть хорошо вставленные пластины вверх дном. Пока пластина укладывается ровно на поверхность, снимите нижнюю секцию, чтобы обнажить аблюминальную сторону колодезных вставок. После добавления перицитной клеточной суспензии на аблюминальную сторону накройте хорошо вставленные пластиной, чтобы предотвратить испарение. Держите все пластины перевернутыми вверх дном в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C в течение ночи.
  2. Посев астроцитов
    1. Культивируйте ГК в колбах T75 в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Следуйте приведенным выше шагам 1.1.1-1.1.4, используя астроцитарную среду (также содержащую 2% FBS) вместо перицитной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования отрывков позже P9.
    2. Определите плотность клеток и посадите 300 000 клеток/лунку на дно ткани культуры 6-луночных пластин. Накройте пластину, чтобы предотвратить испарение, и храните все пластины в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C в течение ночи.
  3. Посев эндотелиальных клеток
    1. Культивируют HBMEC в блюдах для культивирования тканей в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C до слияния. Выполните описанные выше шаги 1.1.1-1.1.4, используя полную классическую среду (содержащую 10% FBS) вместо перицитной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования отрывков позже P12.
    2. Вынимают тканевую культуру 6-луночными пластинками, содержащими астроциты, и колодезными вставками (6-луночного формата), содержащими перициты, из инкубатора 5% CO2 при 37 °C. Аспирируют астроцитарную среду из культуры тканей 6-луночными пластинками. Добавьте в каждую лунку 1 мл перицитной среды и 1 мл астроцитарной среды.
    3. Аспирируйте перицитную среду из колодцевых вкладышей и поместите их в тканевую культуру 6-луночных пластин, содержащих засеянные астроциты. Посейте HBMEC при плотности 300 000 клеток/лунку в 2 мл полной классической среды на апикальную сторону тех же колодцевых вставок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки следует высевать на апикальной стороне колодцев-вкладышей на следующий день после посева перицитов на аблюминальной стороне колодцевых вставок и астроцитов на тканевой культуре 6-луночных пластинок. Клетки следует поддерживать в тройной культуре в течение 6 дней, чтобы индуцировать ГЭБ-подобные свойства. Клеточную культуральную среду следует менять в обоих хорошо вставленных отсеках за 24 ч до начала экспериментов.

2. Индукция кислородно-глюкозной депривации

  1. Промывайте ячейки 3x с помощью DPBS. Для трехклеточных культур, подвергшихся воздействию OGD, добавляют безглюковую среду (без L-глутамина и фенола красного) как к апикальному, так и к базолатеральному компартментам. Заменить питательную среду свежей средой в нормоксических контрольных клеточных культурах. Поместите контрольные тройные культуры в инкубаторс 5% CO 2 при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средние изменения до индукции OGD или сразу после OGD могут создавать механическое напряжение, которое будет дополнительно влиять на монослои эндотелиальных клеток. Таким образом, этапы с замещением среды включены для нормоксического контроля клеточных культур.
  2. Поместите чашку Петри, содержащую 20 мл стерильной воды, в камеру инкубатора гипоксии, чтобы обеспечить адекватное увлажнение культур. Откройте камеру, отпустив кольцевой зажим. Разложите клеточные культуры на полках. Запечатайте камеру, закрепив кольцевой зажим.
  3. Откройте как входное, так и выходное порты камеры. Прикрепите трубку, идущую от верхней части расходомера, к камере. Прикрепите трубку, поступающую из нижней части расходомера, к газгольде, содержащему газовую смесь 95% N2/5% CO2 , через воздушный фильтр.
  4. Откройте клапан управления потоком резервуара, повернув его против часовой стрелки, чтобы обеспечить минимальный поток газа. Медленно откройте клапан регулятора давления, повернув по часовой стрелке.
  5. Промывайте камеру газовой смесью со скоростью потока 20 л/мин в течение 5 мин. Отсоедините камеру от источника газа и плотно закройте оба белых пластиковых зажима.
  6. Выключите клапан управления потоком резервуара, повернув его по часовой стрелке. Закройте клапан регулятора давления, повернув против часовой стрелки.
  7. Поместите камеру гипоксии в обычный инкубатор при 37 °C в течение 4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для добавления последующего периода реоксигенации промыть клетки 3x DPBS, добавить свежую среду во всех тройных культурах и хранить в течение дополнительных 24 ч в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Согласно инструкции производителя, концентрация кислорода, остающаяся в камере, составляет 0% после не менее 4 мин продувки анаэробной газовой смесью при 20 л/мин.

3. Измерения TEER

  1. Поместите стерилизованный инструмент TEER в шкаф биобезопасности и подключите электроды к эпителиальному вольтомметру. Стерилизуют электроды в 30 мл 70% раствора изопропилового спирта в течение минимум 30 мин.
  2. Включите прибор TEER и установите для функции значение Ом.
  3. Извлеките электроды из 70% раствора изопропилового спирта и поместите их в 20 мл DPBS минимум на 30 мин до тех пор, пока цифровое считывание на устройстве TEER не считывает 0 Ом.
  4. Вставьте длинный зубец электрода через одно из трех отверстий в вешалке для вставки скважины заготовки, опуская ее до тех пор, пока она не коснется дна колодца. Убедитесь, что короткий зубец покоится над апикальной культурой на нижней части колодезной вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заготовка для вставки скважины состоит из 2 мл полной классической среды в апикальном отсеке и комбинации 1 мл перицитной среды и 1 мл астроцитарной среды в базолатеральном отсеке. Убедитесь, что электроды удерживаются под углом 90° к вставке колодца во время измерения TEER. Использование среднего значения двух или трех показаний, полученных в одной и той же скважине (на открытие), может помочь уменьшить изменчивость.
  5. Подождите, пока значения цифрового считывания на приборе TEER выровняются, прежде чем записывать значение. Поместите электроды обратно в DPBS, чтобы промыть их между измерениями. Продолжайте собирать все измерения TEER для еще двух пустых элементов управления вставкой скважины.
  6. Соберите результаты измерений TEER на пробных пластинах, используя этапы 3.4-3.5, сделанные для контрольных измерений. После того, как все измерения были проведены, поместите электрод обратно в 70% раствор изопропилового спирта на 30 минут. Отсоедините электроды от прибора TEER и дайте им высохнуть на воздухе.
  7. Рассчитайте значения TEER. Используйте уравнение (1) для вычитания среднего омного значения элемента управления пустой скважинной вставкой из значения Ом образца, а затем умножайте это значение сопротивления на площадь мембранной вставки (см2), чтобы получить сообщаемое значение TEER в Ω∙см2.
    Equation 1 (1)

4. Оценка параклеточной проницаемости ГЭБ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги с участием FITC-декстрана в шкафу биобезопасности клеточных культур с выключенным светом. Накройте растворы FITC-dextran алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание.

  1. Готовят растворы, содержащие FITC-декстранс 20 и 70 кДа (0,1 мг/мл) с использованием фенольной красной эндотелиальной клеточной питательной среды и дают перемешивать на качающей платформе шейкера в течение 1 ч. Фильтруйте растворы с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
  2. Аспирировать среду из базолатерального компартмента и заменить ее 2 мл фенольной среды роста эндотелиальных клеток без красного цвета в модели BBB тройной клеточной культуры. Дважды промыть клетки в апикальном отсеке сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS).
  3. Добавьте 1 мл раствора FITC-декстрана в апикальный отсек и накройте пластину алюминиевой фольгой. Поместите пластину в инкубатор с 5% CO2 при 37 °C в течение 1 ч.
  4. Возьмите 100 мкл среды из базолатеральных отсеков и переложите ее в черную 96-луночную пластину. Измерьте флуоресценцию с помощью микропластинного считывателя с длинами волн возбуждения и излучения, установленными на 480 нм и 530 нм соответственно.

5. Обнаружение гипоксии в живых клетках

  1. Семена 200 мкл HBMEC, HA и HBVP в центре покрытых поли-d-лизином стеклянных нижних тарелок толщиной 35 мм при плотности 150 000 клеток/тарелка. Перед посевом HBMEC покройте дно посуды фактором крепления. Позвольте клеткам прикрепиться к стеклянной поверхности, оставив их на ночь при 37 °C в инкубаторе CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно размещать чашки с первичными клетками человека одновременно с тройной хорошо вставленной моделью ГЭБ в гипоксической камере для OGD.
  2. Как только слияние достигнуто, отбросьте культуральную среду и добавьте 2 мл предварительной безглюсодержащей среды (для OGD) или нормальной среды (для контрольной группы), содержащей 2 мкл 1 мМ Hoechst 33342 (конечная концентрация 0,2 мкМ) и 0,5 мкл исходного раствора 5 мМ указанного реагента зеленой гипоксии Image-iT (конечная концентрация 1 мкМ). После обработки OGD замените среду на оптимизированную для визуализации среду во всех блюдах.
  3. Выполняйте флуоресцентную визуализацию живых клеток с помощью фильтра GFP и инкубатора конфокального микроскопа верхней ступени, как описано ранее14,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы изучить влияние астроцитов и перицитов на барьерную функцию HBMEC, мы построили модель тройной клеточной культуры BBB на вставках клеточной культуры (рисунок 1A) вместе с монокультурой HBMEC и двумя моделями двойной кокультуры в качестве контроля (рисунок 1B). Контроль двойной кокультуры включал бесконтактную кокультуру HBMEC с HA и контактную кокультуру HBMEC с HBVP. После 6 дней совместной культивации все экспериментальные установки подвергали ОГД в течение 4 ч. Барьерную целостность эндотелиального монослоя в указанных конфигурациях ГЭБ оценивали путем определения TEER до и после OGD, а также после 24 ч реоксигенации (рис. 1С). В течение 4 ч OGD вызывал значительное снижение значений TEER только в монокультуре HBMEC и модели кокультуры с HBMEC и HBVP. Эти сниженные уровни достигли исходных уровней после 24 ч реоксигенации. Отсутствие влияния OGD на модель кокультуры с HBMEC и HA указывало на защитную роль астроцитов против ишемических состояний in vitro.

Несмотря на отсутствие различий в исходных условиях TEER между моделями тройной и двойной кокультуры HBMEC/HBVP, значения TEER в модели тройной кокультуры были значительно выше, чем в контроле двойной кокультуры или контроле монокультуры сразу после OGD, предполагая, что интеграция HA и HBVP в модель тройного BBB играет решающую роль в поддержании функциональной целостности BBB в патологических условиях (рисунок 1C). ). Мы также исследовали проницаемость малой (20 кДа) и большой (70 кДа) молекулярной массы FITC-декстрана через эндотелиальный монослой в разработанной модели тройной культуры. Параклеточная проницаемость эндотелиальных монослоев до 20 кДа молекулярной массы FITC-декстрана была резко повышена в монокультуре HBMEC и в меньшей степени в модели кокультуры с HBMEC и HBVP по сравнению с нормоксическим контролем (рисунок 1D). Кроме того, уровни проницаемости FITC-декстрана 20 кДа были самыми низкими в модели тройного ГЭБ среди всех моделей в нормоксических условиях и условиях OGD. Ни в одной из моделей не наблюдалось никаких изменений в потоке FITC-декстрана 70 кДа через эндотелиальные монослои (рисунок 1E). Эти данные свидетельствуют о том, что ишемо-гипоксическое повреждение не было настолько серьезным, чтобы вызвать изменения параклеточной проницаемости для больших молекул, таких как белки плазмы.

Figure 1
Рисунок 1: Влияние кислородно-глюкозной депривации на трансэндотелиальное электрическое сопротивление и эндотелиальную проницаемость в первичных моно-, ко- и тройных моделях ГЭБ человека. (A) Схематическая временная шкала для установки модели ГЭБ тройной первичной клеточной культуры. (B) Схематические представления конфигураций для статических моделей первичного ГЭБ человека in vitro . Монокультурная модель содержит HBMEC, посеянный на апикальной стороне хорошо вставленной пористой мембраны. Бесконтактная кокультура содержит HBMEC, посеянный на верхней поверхности вставной опоры скважины, и HA, посеянный в нижней части культуральной скважины. Модель контактной кокультуры включает HBVP, посеянный на нижней поверхности стойки вставки скважины с HBMEC на верхней поверхности. Для модели тройной культуры HBMEC засевают на верхнюю поверхность опоры с HBVP, посеянным на нижней поверхности, и HA, посеянным на нижней части культуральных скважин. (C) Изменения в TEER отслеживаются непосредственно перед OGD, через 4 ч после OGD и после 24 ч реоксигенации. Данные, представленные в виде среднего ± SEM (n = 5-6). P < 0,0001 по сравнению с моно- и кокультурными моделями (двусторонние ANOVA). (D) Параклеточную проницаемость до 20 кДа FITC-декстрана через эндотелиальные монослои измеряли через 4 ч OGD. (E) Параклеточную проницаемость до 70 кДа FITC-декстрана через эндотелиальные монослои измеряли после 4 ч OGD. Данные, представленные в виде среднего ± УР (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (двусторонняя ANOVA). Сокращения: OGD = кислородно-глюкозная депривация; TEER = трансэндотелиальное электрическое сопротивление; HBMEC = микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека; ГК = астроциты человека; HBVP = сосудистые перициты головного мозга человека; FITC-декстран = декстран, конъюгированный с флуоресцеином изотиоцианатом; Арб. единицы = произвольные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для проверки гипоксического повреждения, вызванного OGD, HBMEC, HA и HBVP культивировали в колодцах 35-миллиметровой стеклянной нижней посуды и нагружали реагентом гипоксии, флуоресцентный сигнал которого увеличивался со снижением уровня кислорода. Все первичные типы людей, подвергшихся воздействию OGD, демонстрировали сильную зеленую флуоресценцию, доказывая, что изображенные живые клетки были гипоксическими (рисунок 2). Оценив влияние различных периваскулярных типов клеток (астроциты и перициты) или их комбинации в модели ГЭБ на барьерные свойства в соответствии с протоколом OGD, мы пришли к выводу, что тройная модель превосходит другие протестированные модели ГЭБ.

Figure 2
Рисунок 2: Живое окрашивание гипоксических первичных микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека, астроцитов человека и сосудистых перицитов головного мозга человека после 4 ч кислородно-глюкозного голодания. Воздействие OGD проводили на все первичные клетки (HBMEC, HA и HBVP) с использованием реагента гипоксии и среды без глюкозы в течение 4 ч. Показаны результаты четырех независимых экспериментов. Культуры были изображены с 20-кратным увеличением. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: OGD = кислородно-глюкозная депривация; HBMEC = микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека; ГК = астроциты человека; HBVP = сосудистые перициты головного мозга человека; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе описан метод создания надежной тройной эндотелиальной клеточно-перицит-астроцитарной культуры модели ГЭБ для изучения дисфункции ГЭБ в условиях ишемического инсульта in vitro. Учитывая, что перициты являются ближайшими соседями эндотелиальных клеток in vivo, HBVP покрыты на нижней стороне колодезных вставок в этой модели16. Хотя в этой конфигурации отсутствует прямая межклеточная связь между астроцитами и эндотелиальными клетками, такое расположение позволяет осуществлять косвенную межклеточную связь между типами клеток с помощью секретируемых растворимых факторов. Наличие астроцитов и перицитов в этой системе значительно улучшает целостность HBMEC, ограничивая параклеточную проницаемость монослоя индикаторами небольшого размера. Кроме того, астроциты и перициты оказывают защитное действие на HBMEC в условиях OGD.

В разработанном протоколе мы оптимизировали соотношение клеток (1:1:1) и смесь питательной среды для базолатерального компартмента. Модель тройного BBB показала почти в 2,5 раза более высокие значения TEER (239 ± 9 Ω·см2), чем контрольная монокультура HBMEC (112 ± 11 Ω·см2) после 6 дней совместного культивирования, время, необходимое для правильного формирования монослоя HBMEC17,18. Значения TEER, достигнутые в этой тройной модели, сопоставимы со значениями в другой ранее описанной тройной модели, в которой HA контактировали с HBMEC, а HBVP были посеяны на дне пластинчатых скважин19. В другой модели тройной культуры первичных клеток человека с той же конфигурацией клеток и временем воздействия OGD исходные значения TEER были значительно ниже, чем в этой работе, и не достигали стандартных уровней (100 Ω·см2)20. Использование 6-луночных хорошо вставленных пластин с более крупными отсеками позволило снизить частоту изменения среды, чтобы избежать нарушения обмена веществ между клеточными популяциями.

Эксперименты OGD проводились с использованием герметичной камеры инкубатора гипоксии, содержащей анаэробную газовую смесь (95% азота и 5% углекислого газа). Одним из основных преимуществ этого протокола является то, что тяжесть ишемического повреждения может быть легко скорректирована в соответствии с конкретными потребностями путем изменения продолжительности периода OGD. После оценки проницаемости TEER и декстрана 4 ч OGD не поставили под угрозу целостность BBB в построенной тройной модели. Поэтому для изучения ишемического инсульта in vitro необходимо применять более длительное воздействие OGD, чтобы вызвать распад ГЭБ. Визуализация живых клеток, предусмотренная протоколом, позволяет в режиме реального времени контролировать различные типы клеток и проверять повреждение OGD, что представляет собой преимущество во многих исследованиях.

В этом протоколе в качестве основы для этой модели тройного ГЭБ были выбраны полиэфирные скважинные вставки размером 0,4 мкм. Полиэфирная мембрана считается лучшим типом вставки для визуализации клеток в приложениях флуоресцентной визуализации, что дает прекрасную возможность визуализировать модификации белков плотного соединения и транспортеров при необходимости. В то время как выбранный малый диаметр пор создает низкую проницаемость для малых гидрофильных молекул через эндотелиальные монослои, он также ограничивает потенциальное применение нынешней модели тройного ГЭБ для анализов трансэндотелиальной миграции, в которых требуются размеры пор 3 мкм или 8 мкм.

Наконец, еще одно ограничение этой модели может быть связано с отсутствием напряжения сдвига, которое, как было показано, способствует образованию плотных соединений в динамических тройных системах BBB in vitro 21. В заключение, установленная надежная и физиологически значимая модель тройной культуры ГЭБ, состоящая из первичных клеток человека, представляет собой ценный инструмент для скрининга лекарств и изучения дисфункции ГЭБ, связанной с ишемическим инсультом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы раскрыли, что конфликта интересов нет.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 и DA047157.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3450
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Life Sciences (FISHERSCI) P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium Science Cell 1801
Attachment Factor Cell Systems (Fisher Scientific) 4Z0-201
BD 60 mL Syringe BD 309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium STEMCELL Technologies 5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost 4Z0-500 Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap VWR 430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask  Corning 431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3340
Countes Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution  Fisher Scientific  04-355-71
Disposable Petri Dishes VWR 25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) ThermoFisher A14430-01 Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium) ThermoFisher 14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL Lonza CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes World Precison Instruments NC9792051 Epithelial voltohmmeter 
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) Millipore Sigma FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) Millipore Sigma FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope Olympus FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) Airgas X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) Thermofisher 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570
Human Astrocytes Science Cell 1800
Human Brain Vascular Pericytes Science Cell 1200
Hypoxia Incubator Chamber STEMCELL Technologies 27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent ThermoFisher I14834
Pericyte Medium Science Cell 1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells ACBRI 376 Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double VWR 10860-658
Single Flow Meter STEMCELL Technologies 27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader Molecular Devices 75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile NEST Scientific 380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells) MidSci TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks MidSci TP90075 Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056
UltraPure Distilled Water Invitrogen (Life Technologies) 10977-015
Uno Stage Top Incubator- Oko Lab UNO-T-H-CO2-TTL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
  2. Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
  3. Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
  4. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
  5. Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
  6. Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
  7. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
  8. Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
  9. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  10. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
  11. Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
  12. Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
  13. Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
  15. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
  16. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
  17. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  18. Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  19. Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
  20. Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  21. Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).

Tags

Биохимия выпуск 188
Модель тройной культуры первичных клеток гематоэнцефалического барьера человека для изучения ишемического инсульта <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fattakhov, N., Torices, S., Becker,… More

Fattakhov, N., Torices, S., Becker, S., Teglas, T., Naranjo, O., Toborek, M. A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e64469, doi:10.3791/64469 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter