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Biochemistry

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/62949
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Summary

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Abstract

DNA-Methylierung, eine Form der epigenetischen Genregulation, ist wichtig für die normale Zellfunktion. In Zellen etablieren und erhalten Proteine, die DNA-Methyltransferasen (DNMTs) genannt werden, das DNA-Methylierungsmuster. Veränderungen des normalen DNA-Methylierungsmusters sind mit der Entwicklung und Progression von Krebs verbunden, was DNMTs zu potenziellen Zielen für Krebsmedikamente macht. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger niedermolekularer Inhibitoren dieser Enzyme von großer Bedeutung. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das verwendet werden kann, um nach DNA-Methyltransferase-Inhibitoren zu suchen. Der Test der kontinuierlichen gekoppelten Kinetik ermöglicht es, die Anfangsgeschwindigkeiten der DNA-Methylierung in Gegenwart und Abwesenheit potenzieller niedermolekularer Inhibitoren zu bestimmen. Der Assay verwendet die methylsensitive Endonuklease Gla I, um die Methylierung eines hemimethylierten DNA-Substrats an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln.

Dieser kontinuierliche Assay ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit. Die Durchführung des Assays in kleinen Volumina in Mikrotiterplatten reduziert die Kosten für Reagenzien. Mit diesem Assay wurde ein kleines Beispiel-Screening für Inhibitoren von DNMT1, dem am häufigsten vorkommenden DNMT-Isoenzym beim Menschen, durchgeführt. Das hochsubstituierte Anthrachinon-Naturprodukt Milchsäure A ist ein potenter, DNA-kompetitiver Inhibitor von DNMT1. Hier untersuchen wir drei potenzielle niedermolekulare Inhibitoren - Anthrachinone oder Anthrachinon-ähnliche Moleküle mit ein bis drei Substituenten - in zwei Konzentrationen, um das Assay-Protokoll zu beschreiben. Anfangsgeschwindigkeiten werden verwendet, um die prozentuale Aktivität zu berechnen, die in Gegenwart jedes Moleküls beobachtet wird. Eine der drei untersuchten Verbindungen weist eine konzentrationsabhängige Hemmung der DNMT1-Aktivität auf, was darauf hindeutet, dass es sich um einen potenziellen Inhibitor von DNMT1 handelt.

Introduction

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Markierung, die die Genexpression und die Chromatinstruktur reguliert. Die Methylierung erfolgt überwiegend in CpG-Dinukleotiden - Cytosin gefolgt von Guanosin; Die Methylgruppe wird zur 5-Position von Cytosin hinzugefügt. Korrekte DNA-Methylierungsmuster und damit die richtige Genexpression sind für eine angemessene zelluläre Entwicklung und Funktion erforderlich. Viele Krankheitszustände wurden mit Veränderungen des normalen Methylierungsmusters 1,2,3 in Verbindung gebracht. Zum Beispiel gibt es einen Zusammenhang zwischen Krebsentstehung und -progression und Veränderungen des DNA-Methylierungsmusters. Typischerweise weisen Krebszellen insgesamt niedrigere Methylcytosinspiegel auf, was zur Instabilität des Genoms beiträgt. Gleichzeitig konzentriert sich das im Erbgut vorhandene Methylcytosin in den Promotorregionen von Tumorsuppressorgenen, was zu einer Gen-Silencierung dieser wichtigen Proteine führt. Insbesondere epigenetische Veränderungen sind dynamisch und reversibel, im Gegensatz zu den DNA-Mutationen, die mit der Tumorgenese assoziiert sind. Dies hat die Proteine, die an der epigenetischen Genregulation beteiligt sind, zu interessantenWirkstoffzielen 2,4 gemacht.

DNA-Methyltransferasen (DNMTs) sind die Proteine, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von DNA-Methylierungsmustern verantwortlich sind. Drei katalytisch aktive Isoenzyme, DNMT1, DNMT3a und DNMT3b, existieren beim Menschen. Während der Entwicklung und Differenzierung etablieren die de novo Methyltransferasen DNMT3a und DNMT3b Methylierungsmuster. Beide Enzyme können das katalytisch inaktive DNMT3L-Protein zu Komplexen binden, die eine erhöhte Aktivitätaufweisen 1,5. Nach der Zellteilung enthalten Tochterzellen hemimethylierte DNA - DNA, die Methylcytosin in nur einem Strang des Duplex enthält -, weil die neu synthetisierte DNA frei von Methylierungsmarkierungen ist. Die Hauptfunktion von DNMT1 besteht darin, diese hemimethylierte DNA zu methylieren, wodurch das vollständige Methylierungsmuster 1,5 wiederhergestellt wird.

Zusammenhänge zwischen DNMT-Aktivität und Krebs sind gut etabliert. Die Überexpression von DNMT1, entweder durch transkriptionelle oder posttranslationale Mechanismen, ist eine Folge mehrerer gemeinsamer onkogener Signalwege 6,7,8,9. Genetische Ansätze zur Senkung der DNMT1-Aktivität unter Verwendung hypomorpher Allele führen zu einer verminderten Tumorbildung bei Apc(Min)Mäusen10. Antisense-Oligonukleotide, die DNMT1 niederschlagen, hemmen Neoplasien in Zellkultur- undMaustumormodellen 11,12. Daher scheint die Hemmung der DNMT1-Aktivität ein vielversprechender Krebstherapieansatz zu sein. Die Rollen, die die DNMT3-Isoenzyme spielen, sind jedoch nicht so einfach. DNMT3a-Mutationen finden sich bei akuter myeloischer Leukämie13 und myelodysplastischem Syndrom14. Es wurde gezeigt, dass mindestens eine der identifizierten Mutationen die DNA-Methylierungsaktivität des Enzyms15 verringert. DNMT3b ist jedoch bei Brustkrebs16 und Darmkrebs17 überexprimiert. Da die verschiedenen DNMT-Isoenzyme unterschiedliche Rollen bei der Karzinogenese spielen, wird die Identifizierung isoenzymspezifischer Inhibitoren entscheidend sein. Diese Verbindungen werden nicht nur für die Entwicklung von Therapeutika nützlich sein, sondern isoenzymspezifische Inhibitoren wären auch ein unschätzbares Werkzeug, um die Rolle jedes DNMT-Isoenzyms in der Krebsätiologie zu analysieren.

Mehrere DNMT-Inhibitoren wurden in der Literatur beschrieben. Bekannte DNMT-Inhibitoren können in zwei Klassen unterteilt werden: Nukleosid und Nicht-Nukleosid. Nukleosidinhibitoren sind typischerweise Cytidinanaloga. Diese Verbindungen werden in die DNA eingebaut und fangen DNMTs kovalent ein. 5-Azacytidin und 5-Aza-2'-Desoxycytidin sind für die Behandlung des myelodysplastischen Syndroms und der akuten myeloischen Leukämie zugelassen 4,18. Die hohe Toxizität, geringe Bioverfügbarkeit und chemische Instabilität dieser Verbindungen stellen Probleme dar. Laufende Arbeiten untersuchen die Wirksamkeit der nächsten Generation von Nukleosidinhibitoren; SGI-110, abgeleitet von 5-Aza-2'-Desoxycytidin, ist ein Beispiel19,20. Nukleosid-Inhibitoren sind nicht isoenzymspezifisch und inaktivieren jedes auftretende DNMT-Isoenzym. Daher führt die Behandlung mit einem nukleosiddemethylierenden Mittel zur Erschöpfung aller DNMT-Isoenzyme 4,18. Nicht-Nukleosid-Inhibitoren müssen nicht in die DNA eingebaut werden, um ihre hemmende Wirkung auszuüben. Stattdessen binden diese Moleküle direkt an DNMTs, was die Möglichkeit einer isoenzymspezifischen Hemmung einführt. Bisher wurden mehrere Nicht-Nukleosid-Inhibitoren entdeckt, darunter SGI-1027 21, Hydralazin-22, Procainamid23, RG108 und Derivate 24 sowie die Naturstoffe (−)-Epigallocateching-3-Gallat (EGCG)25 und Milchsäure A 26,27. Die meisten der bisher entdeckten Nicht-Nukleosid-Inhibitoren sind nicht isoenzymselektiv oder zeigen schwache Präferenzen für ein DNMT-Isoenzym. Darüber hinaus muss die Wirksamkeit dieser Moleküle verbessert werden, insbesondere in Zellen 4,18. Daher besteht die Notwendigkeit, potentere, isoenzymselektive DNMT-Inhibitoren zu entdecken oder zu entwickeln.

Eine Hürde bei der Entdeckung neuer niedermolekularer Inhibitoren von DNMTs sind die aufwendigen Assays, die traditionell zur Untersuchung der DNMT-Aktivität verwendetwerden 28. Assays sind in der Regel diskontinuierlich mit mehreren Schritten. Die enzymatische Aktivität von DNMTs wird immer noch routinemäßig mit radioaktivem S-Adenosylmethionin (SAM) 29,30,31,32,33,34 untersucht. Nicht-radioaktive Assays für die DNA-Methylierung wurden ebenfalls entwickelt. Zum Beispiel wurden Assays beschrieben, die methylsensitive Restriktionsendonukleasen und Elektrophorese zur Trennung der Verdauungsprodukte verwenden35,36. Diese Arten von diskontinuierlichen, mehrstufigen Assays sind für die Wirkstoffforschung nicht ohne weiteres zugänglich. Seit Mitte der 2000er Jahre wurden mehrere DNA-Methylierungsassays mit höherem Durchsatz entwickelt28. Ein Szintillations-Proximity-Assay wurde verwendet, um nach DNMT1-Inhibitoren zu suchen37. Ein weiterer Assay unter Verwendung einer methylsensitiven Restriktionsendonuklease wurde verwendet, um nach DNMT3a-Inhibitoren25,38 zu suchen. Während beide Assays einen höheren Durchsatz als herkömmliche DNA-Methylierungsassays ermöglichten, erfordern die Assays mehrere Schritte und erlauben nicht die Beobachtung der Methylierungsaktivität in Echtzeit. In jüngerer Zeit wurde ein kontinuierlicher Kinetik beschrieben, der die Bildung von S-Adenosylhomocystein (SAH), einem Produkt der Methylierungsreaktion, an die spektroskopische Veränderung bei 340 nm koppelt, die mit der NADPH-Oxidation39 assoziiert ist. Dieser Assay verwendet drei Kopplungsenzyme, um ein spektroskopisches Signal zu erzeugen.

Wir entwickelten einen fluoreszenzbasierten Endonuklease-gekoppelten DNA-Methylierungsassay, der ein einzelnes kommerziell verfügbares Kopplungsenzym verwendet und Daten in Echtzeit generieren kann (Abbildung 1). Als Substrat wird ein Haarnadel-Oligonukleotid verwendet, das drei Methylcytosine enthält. Die Substrat-DNA enthält einen Fluorophor am 5'-Ende und einen Quencher am 3'-Ende. Die Methylierung der hemimethylierten CpG-Stelle erzeugt die Spaltstelle für die Endonuklease Gla I - vollständig methyliertes GCGC. Die Gla-I-Spaltung des Produktoligonukleotids setzt den Fluorophor aus dem Quencher frei und erzeugt Fluoreszenz in Echtzeit. Der Assay kann verwendet werden, um die Aktivität jeder Isoform von DNMT zu untersuchen; jedoch wird eine höhere Aktivität mit DNMT1 beobachtet, da dieses Isoenzym bevorzugt hemimethylierte DNA 1,5 methyliert. Eine noch robustere Aktivität wird beobachtet, wenn die autoinhibitorische RFTS-Domäne (Replication Foci Targeting Sequence) aus DNMT1 entfernt wird. Diese Domäne, die sich in der N-terminalen regulatorischen Region befindet, bindet an die katalytische Stelle und verhindert die DNA-Bindung. Die Entfernung der ersten ~600 Aminosäuren führt zu einem verkürzten Enzym, das signifikant aktiver ist als das Enzym in voller Länge (~640-facher Anstieg in kKatze / Km)40. Diese aktivierte Form des Enzyms, die als RFTS-fehlendes DNMT1 (Aminosäuren 621–1616) bezeichnet wird, ermöglicht aufgrund ihrer erhöhten katalytischen Kraft die leichtere Identifizierung von Inhibitoren. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, um RFTS-fehlendes DNMT1 in Assays zu verwenden, um nach potenziellen niedermolekularen Inhibitoren zu suchen. Mit dem Endonuklease-gekoppelten kontinuierlichen Assay wird die Anfangsgeschwindigkeit in Gegenwart und Abwesenheit einiger kleiner Moleküle bestimmt. Jeder potenzielle Inhibitor wird bei zwei Konzentrationen untersucht, um nach konzentrationsabhängiger DNMT1-Hemmung zu suchen. Die prozentuale Aktivität, die in Gegenwart der kleinen Moleküle beobachtet wurde, wurde jeweils berechnet.

Figure 1
Abbildung 1: DNA-Methylierungstest. Als Substrat wird eine hemimethylierte Haarnadel-DNA mit einem Fluorophor am 5'-Ende und einem Quencher am 3'-Ende verwendet. DNMT1 katalysiert den Transfer der Methylgruppe von S-Adenosylmethionin zur nicht methylierten CpG-Stelle und erzeugt S-Adenosylhomocystein und vollständig methylierte DNA. Das DNA-Produkt enthält die Spaltstelle für die Endonuklease Gla I, die vollständig methylierte GCGC-Stellen spaltet. Die Spaltung der Produkt-DNA setzt den 5'-Fluorophor aus dem 3'-Quencher frei und erzeugt Fluoreszenz. Abkürzungen: Fl = Fluorophor; Q =Quencher; DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; SAM = S-Adenosylmethionin; SAH = S-Adenosylhomocystein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protocol

1. Bereiten Sie Assay-Lösungen für den Bildschirm vor

HINWEIS: Die Konzentrationen der in diesem Assay verwendeten Substrate können angepasst werden. Für RFTS-fehlendes DNMT1 betragen die experimentell ermitteltenK-m-Werte für das Haarnadel-DNA-Substrat und SAM 1–2 nM bzw. 2 μM bzw.26,40.

  1. Bereiten Sie 600 μL jeder Testbedingung vor, die in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis getestet wird.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen der benötigten Assaylösung hängt von der Anzahl der durchgeführten Replikate ab. Jede Assay-Bedingung wurde für dieses Protokoll in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
    1. Fügen Sie ddH2 O und 5x Methylierungspuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM Kaliumglutamat, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 25% Glycerin) zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 1x Puffer zu erreichen. Für Assays, die 20 μM Verbindung enthalten, fügen Sie 472 μLddH2Ound 120 μL 5x Puffer hinzu. Für Assays, die eine 50-μM-Verbindung enthalten, werden 470 μLddH2Ound 120 μL 5x-Puffer hinzugefügt.
    2. Zu jeder Probe werden 3,15 μL 20 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) gegeben.
    3. Fügen Sie jeder Probe 2 μL 3,15 μM Haarnadel-DNA-Substrat und 1,33 μL 4,75 mM SAM hinzu.
      HINWEIS: Die Konzentration der Substrate in der Assaylösungsmischung beträgt das 1,05-fache der gewünschten Endkonzentrationen.
    4. Inhibitor zu einer Endkonzentration von 21 μM (1,26 μL von 10 mM) oder 52,5 μM (3,15 μL von 10 mM) in die entsprechenden Proben geben. Geben Sie eine äquivalente Menge Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer Kontrollprobe.
      HINWEIS: Die Konzentration des im Bildschirm verwendeten Inhibitors kann variiert werden. Die maximale Endkonzentration von DMSO sollte ≤5% (v/v) betragen. DMSO-Konzentrationen bis zu 5% (v/v) haben keinen Einfluss auf die im Assay26 beobachtete Aktivität.
  2. Mischen Sie die Lösungen durch Wirbeln (3.000 U/min) für 3 s. Drehen Sie die Proben einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge (1.200 × g), um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
  3. Aliquot 95 μL jeder Assaylösung in 6 aufeinanderfolgende Vertiefungen in einer schwarzen Halbflächenplatte mit 96 Vertiefungen (Abbildung 2).
    HINWEIS: Diese Screening-Assays wurden in zwei Chargen durchgeführt. Zuerst wurden 20 μM-Inhibitorproben (4 Gesamtbedingungen) untersucht, gefolgt von den 50 μM-Inhibitorproben (4 Gesamtbedingungen).

Figure 2
Abbildung 2: Aufbau der Assay-Platte. Jede Assay-Lösung wird in sechs Vertiefungen in der schwarzen 96-Well-Platte aliquotiert: DMSO-Kontrolle (blau), Verbindung 1 (grün), Verbindung 2 (rot) und Verbindung 3 (gelb). Sowohl RFTS-fehlende DNMT1 als auch Gla I werden zu drei Bohrungen hinzugefügt. Als Kontrolle wird Gla I allein zu den anderen drei Brunnen hinzugefügt. Abkürzungen: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; DMSO = Dimethylsulfoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Bereiten Sie Enzymlösungen für das Screening vor

HINWEIS: RFTS-fehlendes DNMT1 kann in E. coli exprimiert und auf Homogenität gereinigt werden. Expressions- und Reinigungsverfahren für RFTS-fehlendes DNMT1 wurden zuvorbeschrieben 41. Das Volumen des benötigten Enzyms hängt von der Anzahl der durchgeführten Assays ab. Hier werden in jedem Set vier verschiedene Assays durchgeführt; Jeder Assay wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

  1. Bereiten Sie 75 μL jeder Enzymlösung in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vor.
    HINWEIS: Es werden zwei Enzymlösungen benötigt. Eine Lösung enthält DNMT1 und Gla I; der andere wird nur Gla I enthalten.
    1. Fügen Sie ddH2 O und 5x Methylierungspuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM Kaliumglutamat, 5 mM DTT, 25% Glycerin) zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 1x Puffer zu erreichen. Für die Gla I-Enzymlösung fügen Sie 15 μL 5x Puffer und 58,8 μLddH2Ohinzu. Für die DNMT1+Gla I-Enzymlösung werden 15 μL 5x Puffer und 58,2 μLddH2Ohinzugefügt.
    2. Zu jeder Lösung werden 1,2 μl 10 U/μL Gla I für eine Endkonzentration von 0,16 U/μL gegeben.
    3. 0,6 μL 5 μM RFTS-fehlendes DNMT1 für eine Endkonzentration von 40 nM in die DNMT1+Gla I-Lösung geben.
  2. Klopfen Sie vorsichtig, um die Lösungen zu mischen. Drehen Sie die Proben einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge (1.200 × g), um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
  3. Aliquot 12 μL jeder Enzymlösung in 6 Vertiefungen in einer konischen 96-Well-Platte (Abbildung 3).

Figure 3
Abbildung 3: Aufbau der Enzymplatte. Die Lösungen Gla I (grau) und DNMT1+Gla I (blau) sind jeweils in sechs Vertiefungen in der 96-Well-Platte aliquotiert. Mit einer Mehrkanalpipette kann das Enzym gleichzeitig zu einer Reihe von Assaylösungen hinzugefügt werden. Für jede Untersuchungsbedingung (sechs Bohrungen) erhalten drei Bohrlöcher DNMT1+Gla I und drei Bohrungen nur Gla I. Abkürzung: DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Führen Sie den Assay durch und analysieren Sie die Daten.

  1. Plattenleser auf 37 °C vorheizen. Legen Sie die schwarze Platte mit den Assaylösungen ein. Schütteln Sie die Platte (Doppelorbital bei 425 cpm für 5 s) und lesen Sie die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 528 nm ab. Die Platte bei 37 °C 5 min inkubieren.
    HINWEIS: Alternativ können Filter mit geeigneten Wellenlängengrenzwerten für die Fluoreszenzmessungen verwendet werden.
  2. Entfernen Sie die Assay-Platte. Fügen Sie 5 μL Enzymlösung in jede Vertiefung und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab.
    HINWEIS: Verwenden Sie Mehrkanalpipetten, damit eine Reihe von Proben gleichzeitig initiiert werden kann.
  3. Setzen Sie die Platte in das Plattenlesegerät ein. Fluoreszenz alle 53 s für 30 min aufzeichnen. Schütteln Sie die Platte (Doppelorbital bei 425 cpm für 4 s) vor jeder Messung.
  4. Durchschnittliche dreifache Gla I Kontrollassays für jede Bedingung. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Gla I-haltige Kontrollreaktionsspur von den dreifachen Spuren, die in Gegenwart von RFTS-fehlendem DNMT1 erhalten wurden. Bestimmen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts für die korrigierten Replikate.
  5. Zeichnen Sie die durchschnittlich korrigierte Reaktionsspur und passen Sie den anfänglichen linearen Abschnitt an eine Linie an, um die Anfangsgeschwindigkeit zu bestimmen.
  6. Bestimmen Sie die prozentuale Aktivität, indem Sie die in Gegenwart einer Verbindung beobachtete Geschwindigkeit durch die in der DMSO-haltigen Kontrollreaktion beobachtete Geschwindigkeit dividieren und mit 100 multiplizieren.

4. Zusätzliche Assay-Kontrolle — sequentielle Zugabe von Enzymen

  1. Bereiten Sie 550 μL Assaylösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vor. Fügen Sie 110 μL 5x Methylierungspuffer, 3,88 μL 3,15 μM Haarnadel-DNA-Substrat, 6,43 μL 47,5 mM SAM, 3,06 μL 20 mg/ml BSA und 426,6 μLddH2Ohinzu.
  2. Mischen Sie die Lösung durch Wirbeln (3.000 U/min) für 3 s. Drehen Sie die Proben einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge (1.200 × g), um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
  3. Aliquot 90 μL der Assaylösung in 6 aufeinanderfolgende Vertiefungen in einer schwarzen Halbflächenplatte mit 96 Vertiefungen.
  4. Bereiten Sie die DNMT1-Enzymlösungen auf Eis vor. Fügen Sie 4 μL 5x Methylierungspuffer, 0,76 μL 5 μM RFTS-fehlendes DNMT1 und 15,24 μLddH2Ozu einem Röhrchen hinzu. 4 μL 5x Methylierungspuffer und 16 μLddH2Oin ein anderes Röhrchen geben.
  5. Klopfen Sie vorsichtig, um die Lösungen zu mischen. Drehen Sie die Proben einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge (1.200 × g), um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
  6. 5 μL der DNMT1-haltigen Lösung in drei Vertiefungen in die schwarze Halbflächenplatte mit 96 Vertiefungen geben. Geben Sie 5 μL der Pufferkontrolllösung in die anderen drei Vertiefungen.
  7. Legen Sie die Mikrotiterplatte in den auf 37 °C vorgeheizten Plattenleser. Schütteln Sie die Platte (Doppelorbital bei 425 cpm für 3 s) und lesen Sie die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 528 nm. Wiederholen Sie den Shake und lesen Sie alle 60 s für 30 Minuten.
  8. Während sich die Testplatte im Plattenleser befindet, bereiten Sie die Gla I-Lösung auf Eis vor. 8 μL 5x Methylierungspuffer, 0,64 μL 10 U/μL Gla I und 31,4 μLddH2Oin ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Klopfen Sie vorsichtig, um die Lösung zu mischen. Drehen Sie die Probe einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge (1.200 × g), um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
  9. Aliquot 6 μL der Gla I-Lösung in 6 Vertiefungen in einer konischen 96-Well-Platte.
  10. Entfernen Sie nach den ersten 30 Minuten Lesezeit die schwarze Platte aus dem Plattenleser. 5 μL Gla I Lösung in alle 6 Vertiefungen geben und durch Pipettieren auf und ab mischen.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, damit alle Vertiefungen gleichzeitig eingeleitet werden können.
  11. Setzen Sie die schwarze Platte wieder in das Plattenlesegerät ein. Fluoreszenz alle 35 s für 35 min aufzeichnen. Schütteln Sie die Platte (Doppelorbital bei 425 cpm für 3 s) vor jeder Messung.

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Representative Results

Aktives DNMT1 ist Voraussetzung für diese Analyse. RFTS-fehlendes DNMT1 wurde in E. coli exprimiert und nach zuvor veröffentlichten Verfahren41 auf Homogenität gereinigt. Um sicherzustellen, dass das gereinigte Enzym aktiv war, wurde ein diskontinuierlicher Endonuklease-gekoppelter Assay verwendet, um die DNA-Methylierungsaktivität36 zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine 32-Basenpaar-Duplex-DNA mit einem einzelnen hemimethylierten CpG, das in einer Sau3A1-Spaltstelle positioniert ist. Sau3A1 kann die hemimethylierte Substrat-DNA spalten; Die Spaltung wird jedoch blockiert, wenn die DNA vollständig methyliert ist. RFTS-fehlendes DNMT1 wurde zu Assays hinzugefügt, die 1 μM DNA und 0,5 mM SAM enthielten, und Aliquots wurden entfernt und über 30 Minuten schockgefroren. Anschließend wurden die Proben mit Sau3A1 aufgeschlossen und die Produkte durch Gelelektrophorese getrennt. Wie in Abbildung 4 gezeigt, wird die DNA mit zunehmender Reaktionszeit vor Spaltung geschützt, was darauf hindeutet, dass RFTS-fehlendes DNMT1 die hemimethylierte DNA methyliert. Der größte Teil der ursprünglich im Assay vorhandenen 1-μM-Substrat-DNA wurde innerhalb von 30 Minuten in ein Produkt umgewandelt.

Der in dieser Arbeit beschriebene Endonuklease-gekoppelte Assay ermöglicht die Beobachtung der DNA-Methylierungsaktivität in Echtzeit als Erhöhung der Fluoreszenz. Der Schlüssel zum Erfolg dieses Assays ist die Methylsensitivität der Endonuklease Gla I. Gla I spaltet die hemimethylierte Substrat-DNA nicht effizient, sondern spaltet die vollständig methylierte Produkt-DNA (Abbildung 1). Eine Spaltung der Haarnadel-DNA ist erforderlich, um den Fluorophor aus dem Quencher freizusetzen und eine Erhöhung der Fluoreszenz zu erzeugen. Um zu zeigen, dass die Enzyme wie erwartet funktionieren, wurde eine Kontrollreaktion durchgeführt, bei der die Enzyme, RFTS-fehlendes DNMT1 und Gla I, nacheinander und nicht gleichzeitig hinzugefügt wurden. Wenn der gekoppelte Assay korrekt funktioniert, sollte die Zugabe von DNMT1 keinen Einfluss auf die Fluoreszenz haben, da die Methylierung des DNA-Substrats voraussichtlich keinen Einfluss auf die Hintergrundfluoreszenz der intern gelöschten Haarnadel-DNA hat. Die anschließende Zugabe von Gla I zu Assays, die die Methyltransferase enthielten, sollte jedoch zu einer Fluoreszenzerzeugung aufgrund der Spaltung der vollständig methylierten Haarnadel-DNA führen. Das hemimethylierte Haarnadel-DNA-Substrat selbst hat eine Hintergrundfluoreszenz (Abbildung 5); diese Assays enthielten 20 nM Haarnadel-DNA und 500 μM SAM. RFTS-fehlendes DNMT1 oder Puffer wurde zu den Assays hinzugefügt, und die Fluoreszenz wurde 30 Minuten lang beobachtet.

Wie in Abbildung 5 zu sehen ist, wird die Fluoreszenz in Abwesenheit des Kopplungsenzyms nicht durch RFTS-fehlendes DNMT1 beeinflusst (blaue Farbtöne enthielten 10 nM RFTS-fehlendes DNMT1, während Rottöne die Pufferkontrolle sind). Daher verändert die Methylierung der hemimethylierten CpG-Stelle durch DNMT1 das Fluoreszenzsignal nicht nennenswert. Als jedoch Gla I zu allen Vertiefungen hinzugefügt wurde, wurde eine robuste Fluoreszenzerzeugung nur in den Assays beobachtet, die RFTS-fehlendes DNMT1 enthielten (Abbildung 5). Dies zeigt, dass die Methylierung der hemimethylierten Substrat-DNA durch DNMT1 für die Gla I-Spaltung und die Erzeugung von Fluoreszenz erforderlich ist. Es sollte beachtet werden, dass der in diesem Kontrollassay beobachtete Anstieg der Fluoreszenz die Aktivität von Gla I widerspiegelt, wenn die Enzyme nacheinander hinzugefügt wurden. Alternativ könnten diese Reaktionsgemische mit Gla I verdaut werden, und die resultierenden Oligonukleotide könnten durch Elektrophorese getrennt werden, um die Spaltung sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Enzyme wie erwartet arbeiten.

Um diesen gekoppelten Assay zur direkten Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten von DNMT1 zu verwenden, müssen beide Enzyme, RFTS-fehlendes DNMT1 und Gla I, gleichzeitig hinzugefügt werden. Solange die Rate der Gla I-Spaltung der Produkt-DNA schneller ist als die Rate der DNA-Methylierung durch DNMT1, spiegelt das erzeugte Fluoreszenzsignal die DNA-Methylierungsaktivität wider. Um sicherzustellen, dass die DNMT1-Aktivität geschwindigkeitsbegrenzend ist, kann die Konzentration von DNMT1 variiert werden, während alle anderen Assay-Bedingungen konstant gehalten werden. Die Rate der Fluoreszenzerzeugung sollte proportional zur Konzentration von DNMT1 sein. Dies wurde zuvor für RFTS-fehlendes DNMT1 unter den hier verwendeten Bedingungen gezeigt40. Bei Verwendung dieses gekoppelten Assays zur Untersuchung der DNMT-Aktivität wird zusätzlich zu der Reaktion, die sowohl DNMT1 als auch Gla I enthält, eine Gla I-haltige Kontrollreaktion durchgeführt (Abbildung 6A). Die Steuerung Gla I hat mehrere Funktionen. Die Subtraktion der Gla I-Kontrollreaktionsspur von der DNMT-haltigen Reaktionsspur ermöglicht die Berücksichtigung sowohl der langsamen Spaltung des hemimethylierten DNA-Substrats als auch der Hintergrundfluoreszenz. Die erzeugten korrigierten Reaktionsspuren spiegeln die DNA-Methylierungsaktivität von DNMT1 wider. Die Anpassung des anfänglichen linearen Teils der korrigierten Reaktionsspur ermöglicht die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit (Abbildung 6B). Mit 10 nM Haarnadel-DNA-Substrat und 10 μM SAM wurde eine Anfangsgeschwindigkeit von 113 ± 2 RFU/min erreicht.

Es wurde bereits gezeigt, dass substituierte Anthrachinone die Aktivität von DNMT1 hemmen. Das Naturprodukt Milchsäure A, ein hochsubstituiertes Anthrachinon, ist ein potenter, DNA-kompetitiver Inhibitor von DNMT127. Einige Verbindungen mit einfacheren Strukturen, ein oder zwei Substituenten im Anthrachinonkern, wobei einer ein sperriger aromatischer Substituent ist, haben ebenfalls gezeigt, dass sie DNMT1 in einer DNA-kompetitiven Weise hemmen41. Hier wurde die Fähigkeit von drei substituierten Anthrachinonen oder Anthrachinon-ähnlichen Molekülen, die RFTS-fehlende DNMT1-Aktivität im Gla I-gekoppelten Assay zu hemmen, als Beispiel für die Durchführung dieser Screening-Assays untersucht. Diese Verbindungen enthielten ein bis drei Substituenten, alle auf einer Seite des Anthrachinonkerns (Tabelle 1). Die Substratkonzentrationen (10 nM DNA und 10 μM SAM), die für diese Assays verwendet werden, sind ~5x höher als die Km für jedes Substrat. Das im Assay erzeugte Signal kommt direkt von der Substrat-DNA. Aus diesem Grund ist es schwierig, Konzentrationen nahe oder unter Km zu bestimmen; Es gibt einfach nicht genug Signal, um es zu erkennen. Diese Substratkonzentrationen wurden gewählt, weil unter diesen Bedingungen eine robuste Aktivität in Abwesenheit von Inhibitoren beobachtet wird (Abbildung 6B). Andere Substratkonzentrationen könnten in Screening-Assays verwendet werden. Zum Beispiel könnte die Durchführung eines Screenings bei sättigenden SAM-Konzentrationen als Strategie verwendet werden, um die Suche gegen SAM-kompetitive Inhibitoren zu verzerren.

Jeder Assay enthielt das DNA-Substrat der Haarnadel, den methylspendenden Cofaktor SAM und einen potenziellen Inhibitor oder DMSO als Kontrolle für das Screening. Wir erzeugen routinemäßig 10 mM-Lösungen von Screening-Verbindungen in DMSO für den Einsatz in Assays. Anthrachinone wie die hier untersuchten weisen eine schlechte Löslichkeit in wässrigen Lösungen auf. Um konzentrierte Bestände zu erzeugen, wird DMSO daher als Lösungsmittel verwendet. Die Zugabe von DMSO bis zu 5% (v/v) Endkonzentration hat keinen Einfluss auf die Aktivität im Assay26. Bei Verbindungen mit geringer Löslichkeit in wässriger Lösung sollte jedoch darauf geachtet werden, dass die Verbindung bei der gewählten Endsiebkonzentration(en) löslich ist.

Für jeden im Screen untersuchten Zustand wird ein Gla I-haltiger Kontrollassay durchgeführt. Neben der Berücksichtigung der Hintergrundfluoreszenz und der langsamen Spaltung der Substrat-Haarnadel-DNA ermöglicht diese Kontrolle die Bestimmung, ob der potenzielle Inhibitor das spektroskopische Signal stört (z. B. fluoreszierend). Nach Einleitung der Reaktion durch Zugabe von Enzymen wurde die Fluoreszenz für 30 min mit einem Zeitintervall von 53 s in den Screening-Daten gemessen. Dies ist das schnellste Zeitintervall, das auf dem Plattenleser in diesem Labor beim Lesen einer gesamten 96-Well-Platte verfügbar ist. Andere Zeitintervalle könnten verwendet werden, um die Reaktionsspuren zu generieren. Ein angemessenes Zeitintervall hängt vom verwendeten Instrument und der Anzahl der abgelesenen Bohrlöcher ab. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wird jeder Assay in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die durchschnittliche Gla I-haltige Kontrollspur wird von den Reaktionsspuren subtrahiert, die in Gegenwart von RFTS-fehlendem DNMT1 beobachtet wurden. Die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion kann bestimmt werden, indem der anfängliche lineare Teil der korrigierten Reaktionsspuren angepasst wird.

Zunächst wurde der Einfluss von drei potenziellen Inhibitoren auf die Fluoreszenzerzeugung bei einer Endkonzentration von 20 μM untersucht. Höhere Konzentrationen der potenziellen Inhibitoren wurden aus zwei Gründen für das Screening ausgewählt. Erstens liegen die Substratkonzentrationen im Assay beide über ihren jeweiligenKm-Werten . Dies kann es schwieriger machen, eine Hemmung in kinetischen Assays zu erkennen, insbesondere wenn die Inhibitoren kompetitiv sind. Zweitens sind die in diesem Screen verwendeten Anthrachinon-ähnlichen Verbindungen signifikant einfacher aufgebaut als der bekannte Inhibitor Milchsäure A. Da diese Moleküle nur wenige Substituenten um die Kernstruktur enthalten, haben wir schwächere Wechselwirkungen erwartet. Im DMSO-haltigen Kontrollassay wurde eine Anfangsgeschwindigkeit von 111 ± 5 RFU/min erhalten (Abbildung 7A). Beachten Sie, dass dies der zuvor berichteten Rate in Abwesenheit von DMSO sehr ähnlich ist und bestätigt, dass die Zugabe geringer Mengen von DMSO keinen Einfluss auf die beobachtete Aktivität hat. Die Zugabe von zwei Verbindungen verringerte die beobachtete Anfangsgeschwindigkeit, während die Zugabe der dritten Verbindung keinen Einfluss auf die Aktivität hatte. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden verwendet, um die prozentuale Aktivität zu bestimmen, die in Gegenwart jeder Verbindung beobachtet wurde. Bei 20 μM führte die Zugabe der Verbindungen 1 und 2 zu einer prozentualen Aktivität von ~80%, während 100% Aktivität in Gegenwart von Verbindung 3 beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass dieses Molekül das Enzym nicht hemmt (Tabelle 1).

Es wird erwartet, dass Inhibitoren eine konzentrationsabhängige Hemmung aufweisen. Als nächstes wurden diese Moleküle bei einer noch höheren Konzentration von 50 μM erneut untersucht. Für diese Assays hatte der DMSO-haltige Kontrollassay eine Anfangsgeschwindigkeit von 125 ± 7 RFU/min (Abbildung 7B). Diese Geschwindigkeit ist etwas höher als die zuvor festgelegten Raten; Diese Geschwindigkeiten liegen jedoch alle relativ nahe am Fehler. Auch hier hatte Verbindung 3 wenig Einfluss auf die Anfangsgeschwindigkeit, während die Zugabe von Verbindungen 1 und 2 die beobachtete Anfangsgeschwindigkeit verringerte. Wie erwartet, hatte Verbindung 1 bei der höheren Konzentration einen größeren Einfluss auf die Aktivität. Bei 50 μM ergab die Zugabe von Verbindung 1 eine prozentuale Aktivität von ~60% (Tabelle 1). Die Zugabe einer höheren Konzentration von Verbindung 2 führte jedoch nicht zu einer robusteren Hemmung. Die prozentuale Aktivität, die in Gegenwart von 50 μM Verbindung 2 beobachtet wurde, lag wieder bei 80%.

Wie aus den vorgestellten Daten hervorgeht, kann der Endonuklease-gekoppelte fluoreszenzbasierte DNA-Methylierungsassay verwendet werden, um nach potenziellen DNMT-Inhibitoren zu suchen. Die Daten deuten darauf hin, dass Verbindung 1 und Verbindung 2 potenzielle Inhibitoren sind, Verbindung 3 jedoch nicht. Zusätzliche Studien sind erforderlich, um die potenziellen Inhibitoren als echte DNMT1-Inhibitoren zu validieren.

Figure 4
Abbildung 4: DNMT1-Aktivitätssteuerung. Hemimethylierte Duplex-DNA-Methylierung schützt vor Sau3A1-Spaltung. RFTS-fehlendes DNMT1 wurde zu Assay-Gemischen hinzugefügt, die 1 μM DNA und 500 μM SAM enthielten. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten während einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C entnommen, mit Sau3A1 aufgeschlossen und durch Gelelektrophorese auf 18% PAGE aufgelöst. Hier werden 5-, 10-, 15- und 30-minütige Proben gezeigt. Die erste Spur ist eine Steuerung ohne DNMT1. Abkürzungen: DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; RFTS = Replication Foci Targeting Sequence. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Fluoreszenzbasierte Assay-Kontrolle. RFTS-fehlendes DNMT1 (10 nM Endkonzentration) und Gla I (0,8 U) wurden nacheinander zu dreifachen Assays hinzugefügt, die 20 nM Haarnadel-DNA-Substrat und 500 μM SAM enthielten. Die Zugabe von DNMT1 (blaue Kreise) oder Puffer (rote Kreise) allein hatte keinen Einfluss auf die Hintergrundfluoreszenz. Die Zugabe von Gla I zu allen Assays führt zu einer Fluoreszenzerzeugung in Assays, die DNMT1 enthielten, aber nicht in Assays, die dies nicht tun. Abkürzungen: DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Spuren der Fluoreszenzreaktion. Dreifache Assays enthielten 10 nM Haarnadel-DNA-Substrat und 10 μM SAM. (A) RFTS-fehlende DNMT1 (2 nM) und Gla I (0,8 U) wurden zu drei Assays (blau) hinzugefügt, und Gla I (0,8 U) allein wurde zu drei Assays (rot) hinzugefügt. Eine robuste Fluoreszenzerzeugung wird nur in den Assays beobachtet, die beide Enzyme enthalten. (B) Die durchschnittliche Gla I-Reaktionsspur wurde von den DNMT1+Gla I-Reaktionsspuren subtrahiert. Der Mittelwert und der Standardfehler der dreifachen Daten werden angezeigt. Der Einbau des linearen Teils der Leiterbahn ergibt eine Anfangsgeschwindigkeit von 113 ± 2 RFU/min. Abkürzungen: DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten; SAM = S-Adenosylmethionin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: DNA-Methylierungsaktivität in Gegenwart potentieller Inhibitoren. Die DNA-Methylierungsaktivität von RFTS-fehlendem DNMT1 wurde in Gegenwart von DMSO (schwarz), Verbindung 1 (rot), Verbindung 2 (blau) oder Verbindung 3 (grün) untersucht. Korrigierte Reaktionsspuren bei 20 μM Verbindung (A) und 50 μM Verbindung (B) wurden angepasst, um die Anfangsgeschwindigkeit zu bestimmen. Die Zugabe von Verbindungen 1 und 2 verringerte die beobachtete Geschwindigkeit, während Verbindung 3 wenig Einfluss auf die Aktivität hatte. Der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwerts für die dreifachen Assays werden angezeigt. Abkürzungen: DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten; DMSO = Dimethylsulfoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Anfangsgeschwindigkeiten und prozentuale Aktivitäten, die in Gegenwart potenzieller niedermolekularer Inhibitoren beobachtet wurden. Die Anfangsgeschwindigkeit wurde bestimmt, indem der anfängliche lineare Teil der korrigierten Reaktionsspuren an eine Linie angepasst wurde; Der mit der Anpassung verbundene Fehler wird gemeldet. Die prozentuale Aktivität wurde bestimmt, indem die in Gegenwart der Verbindung bestimmte Rate durch die in der DMSO-Kontrollreaktion bestimmte Rate dividiert und mit 100 multipliziert wurde; Der zugehörige Fehler wurde propagiert. Abkürzungen: Cmpd = zusammengesetzt; DMSO = Dimethylsulfoxid; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Um Inhibitoren von DNA-Methyltransferasen zu identifizieren und zu charakterisieren, muss die Aktivität des Enzyms gemessen werden. Es gibt mehrere Methoden zur Untersuchung der DNA-Methyltransferase-Aktivität. Die Aktivität wird üblicherweise mit Radioaktivität überwacht; Der Transfer der markierten Methylgruppe von SAM kann quantifiziert werden 29,30,31,32,33,34. Gelbasierte Assays, die methylsensitive Endonukleasen verwenden, wurden ebenfalls beschrieben35,36. Diese Assays sind in der Regel diskontinuierlich und erfordern mehrere Schritte, um die Aktivität zu untersuchen. Hier wird ein Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay beschrieben, um nach potentiellen DNA-Methyltransferase-Inhibitoren zu suchen. Diese Technik hat mehrere Vorteile. Der Assay ist relativ einfach. Es sind keine Trenntechniken (z. B. Elektrophorese, Filterbindung) erforderlich, um ein Signal zu erhalten. Darüber hinaus ist der Assay kontinuierlich, so dass Daten in Echtzeit gesammelt werden können. Ein anderer kontinuierlicher kinetischer Assay für die Methylierungsaktivität wurde kürzlich beschrieben39. Dieser Assay erfordert jedoch drei Kopplungsenzyme, um ein spektroskopisches Signal zu erzeugen. Der hier beschriebene Assay erfordert ein einzelnes Kopplungsenzym.

Diese DNMT-Aktivitätsassays werden durchgeführt, indem zunächst eine Assay-Lösung generiert wird, die alle Assay-Komponenten mit Ausnahme der Enzyme enthält. Die Assay-Lösungen enthalten die Substrate, Haarnadel-DNA und SAM; 0,1 mg/ml BSA ist ebenfalls routinemäßig in den Assays enthalten. Mit den extrem niedrigen Konzentrationen (im nanomolaren Bereich) von DNA und DNMT1, die im Assay verwendet werden, erhöht die BSA die allgemeine Proteinkonzentration, um eine Adhäsion an Pipetspitzen, Röhrchen und Mikrotiterplatten sowie Umwelteinflüsse zu verhindern, die die Enzymaktivität beeinträchtigen könnten. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von Enzymen zu den Assaylösungen eingeleitet. Diese Verdünnungen müssen bei der Bestimmung der Endkonzentrationen aller Assay-Komponenten berücksichtigt werden. Reaktionen werden durch Zugabe von 5 μL Enzymlösung zu 95 μL Assaylösung eingeleitet. Daher betragen die Konzentrationen von DNA, SAM und BSA in den Assay-Lösungen das 1,05-fache der gewünschten Endkonzentration. Wenn beispielsweise 10 nM DNA gewünscht wird, werden Assay-Lösungen mit 10,5 nM DNA erzeugt. Die Konzentration von RFTS-fehlendem DNMT1 in der Enzymlösung beträgt das 20-fache der gewünschten Endkonzentration. Hier wurde 40 nM RFTS-fehlendes DNMT1 in der Enzymlösung verwendet, so dass die Endkonzentration von DNMT1 in jedem Assay 2 nM betrug.

Da Gla I ein kommerziell erhältliches Enzym ist, wird seine Menge in Einheiten (U) angegeben, wie vom Hersteller angegeben. Die erzeugten Enzymlösungen enthalten 0,16 U/μL Gla I, so dass insgesamt 0,8 U Gla I in jede Vertiefung gegeben werden. Um Reagenzienkosten zu sparen, werden kleine Mengen der entsprechenden Enzymlösungen hergestellt, und diese Lösungen werden dann in konische 96-Well-Platten aliquotiert. Unter Verwendung von Mehrkanalpipetten werden 5 μL Enzymlösungen von der konischen Bodenplatte zu den Assaylösungen in der schwarzen 96-Well-Halbflächenplatte überführt. Dieser Prozess ermöglicht es, eine Reihe von Assays gleichzeitig zu initiieren. Alternativ könnten mit einem anderen Assayplattenaufbau Enzymlösungen in Reagenzreservoirs gegeben werden, und dann könnten Mehrkanalpipetten verwendet werden, um den Assaylösungen Enzym hinzuzufügen. Dieser Ansatz erfordert jedoch höhere Mengen an Enzymlösung aufgrund von flüssigen Rückgewinnungsabfällen in den Lagerstätten. Wir führen die Assays in 96-Well-Halbflächenplatten durch; Die kleinere Well-Größe in diesen Platten ermöglicht ein kleineres Gesamtassay-Volumen (100 μL) als herkömmliche 96-Well-Platten, was wiederum Reagenzienkosten spart.

Der hier beschriebene DNA-Methylierungsassay erfordert aufgrund der Spezifität der Kopplungsendonuklease Gla I eine hemimethylierte Substrat-DNA. Dies macht den Assay besonders gut für die Untersuchung der Aktivität von DNMT1, da dieses Isoenzym bevorzugt hemimethylierte DNA1 methyliert. Die DNMT3-Isoenzyme zeigen keine Präferenz zwischen nichtmethylierter und hemimethylierter DNA1. Somit kann mit diesem Assay auch die Aktivität der DNMT3-Isoenzyme untersucht werden. Tatsächlich wurde die Hemmung von DNMT3a durch kleine Moleküle mit diesem Assay26,27,41 bewertet. Die Anforderung einer hemimethylierten Substrat-DNA bedeutet, dass dieser Assay nicht verwendet werden kann, um die Substratspezifität oder Präferenz zwischen nicht methylierten und hemimethylierten CpG-Stellen zu untersuchen.

Dieser Assay beruht auf einem spektroskopischen Signal: der Zunahme der Fluoreszenz, wenn Fluorophor und Quencher getrennt werden. So können kleine Moleküle, die selbst fluoreszieren oder die Fluoreszenz löschen, den Assay stören. Ein Grund, die Gla I-haltige Kontrolle für jede Assay-Bedingung durchzuführen, besteht darin, diese Möglichkeit zu prüfen. Die spektroskopischen Eigenschaften des kleinen Moleküls könnten einfach anhand der Gla I-Kontrolldaten erklärt werden (z. B. wenn das Molekül ein schwaches Fluoreszenzsignal hat). Wenn das Molekül jedoch stark fluoreszierend oder ein starker Quencher ist, kann dieser Assay nicht zum Nachweis der DNA-Methylierungsaktivität verwendet werden.

Der hier beschriebene Screen ist ein erster Assay zum Nachweis potentieller DNMT-Inhibitoren. Verbindungen, die im ersten Screening "Treffer" sind, müssen in sekundären Assays validiert werden, um sicherzustellen, dass sie echte DNMT-Inhibitoren sind. Da es sich bei diesem Assay um einen gekoppelten Kinetik handelt, bedeutet die einfache Beobachtung einer Abnahme der Fluoreszenzerzeugung in Gegenwart eines bestimmten kleinen Moleküls nicht notwendigerweise, dass die Verbindung die Methyltransferase hemmt. Ein kleines Molekül, das in der Lage ist, das Kopplungsenzym Gla I zu hemmen, würde ebenfalls zu einer beobachteten Abnahme der Fluoreszenzerzeugung führen. Ein einfaches sekundäres Screening beinhaltet die Bestimmung der Aktivität von Gla I in Gegenwart und Abwesenheit der potenziellen Inhibitoren. Für diesen Assay wird die vollständig methylierte intern abgeschreckte Haarnadel-DNA als Substrat26,41 verwendet. Zusätzliche Assays zur Untersuchung der aggregationsabhängigen Hemmung und DNA-Interkalation können auch als Sekundärassays verwendet werden, um potenzielle Inhibitoren weiter zu validieren26,41. In den hier vorgestellten Daten wurden Verbindung 1 und Verbindung 2 als potenzielle DNMT1-Inhibitoren identifiziert. Unter Verwendung einer Vielzahl von Sekundärassays wurde Verbindung 1 als direkter Inhibitor von DNMT141 validiert. Diese zuvor veröffentlichte Arbeit zeigte, dass Verbindungen, die sperrige Substituenten an der C2-Position des Anthrachinonkerns enthielten, wirksamere Inhibitoren von DNMT1 zu sein schienen. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die strukturellen Determinanten für die DNMT1-Hemmung vollständig zu verstehen.

Der hier beschriebene gekoppelte Assay hat mehrere Anwendungsmöglichkeiten. Der Assay kann für stationäre kinetische Experimente verwendet werden. Da der Assay kontinuierlich ist, ist die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten einfach. Dieser Assay wurde zuvor verwendet, um makroskopische kinetische Parameter (d. h. Km, Vmax und kcat) verschiedener verkürzter DNMT1-Proteine40 zu untersuchen. Der Assay wurde verwendet, um eine kleine Gruppe von Molekülen auf DNMT1-Hemmung 41 zu untersuchen und die Isoenzymspezifität identifizierter Inhibitoren zu bewerten, indem ihre Auswirkungen auf die DNMT3a-Aktivität26,27,41 untersucht wurden. Der Assay wurde auch zur Charakterisierung von Inhibitoren verwendet. Der Mechanismus der Hemmung und Potenz (z.B. Ki, IC50) sowohl der inhibitorischen Proteindomänen36,40 als auch der neuartigen kleinen Moleküle 27,41 wurde mit diesem gekoppelten Kinetik bestimmt. Der Assay wurde auch für den Einsatz in einer HTS-Kampagne angepasst. In diesem Fall wurde der Assay weiter auf ein 384-Well-Format miniaturisiert und als Endpunkt-Assay für den ersten Bildschirm26 verwendet. Somit ist der hier beschriebene fluoreszenzbasierte Endonuklease-gekoppelte DNA-Methylierungsassay ein vielseitiger Assay, mit dem die Aktivität von DNA-Methyltransferasen untersucht werden kann und der die Identifizierung und Charakterisierung von niedermolekularen Inhibitoren dieser wichtigen epigenetischen Modifikatoren ermöglicht.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Bucknell University und dem Department of Chemistry für ihre Unterstützung dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040

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References

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).

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