Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

כאן פותחה מערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על ידי ננו-ברים כדי לספק קרום סינתטי עם עקמומיות מוגדרת המאפשרת אפיון של חלבונים בעלי יכולת חישת עקמומיות במבחנה.

Abstract

עקמומיות הממברנה ממלאת תפקידים חשובים בתהליכים חיוניים שונים של תאים, כגון נדידת תאים, חלוקת תאים וסחר בשלפוחית. הוא לא רק נוצר באופן פסיבי על ידי פעילויות תאיות, אלא גם מווסת באופן פעיל אינטראקציות חלבון ומעורב באיתות תוך תאי רבים. לפיכך, יש ערך רב לבחון את תפקידה של עקמומיות הממברנה בוויסות ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים. לאחרונה פותחו טכניקות רבות לחקר הקשר בין הממברנה המעוקלת לחלבון במבחנה. בהשוואה לטכניקות מסורתיות, דו-שכבת השומנים (SLB) הנתמכת על ידי ננו-ברים שפותחה לאחרונה מציעה הן תפוקה גבוהה והן דיוק טוב יותר ביצירת עקמומיות הממברנה על ידי יצירת דו-שכבה רציפה של שומנים על מערכים מעוצבים של ננו-מוטות עם עקמומיות ממברנה מוגדרת מראש ובקרה שטוחה מקומית. ניתן לאפיין הן את נזילות השומנים והן את רגישות החלבון לממברנות מעוקלות באמצעות הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית. כאן מוצג הליך מפורט כיצד ליצור SLB על משטחי זכוכית מפוברקים המכילים מערכי ננו-מוטות ואפיון חלבונים רגישים לעקמומיות על SLB כזה. בנוסף, פרוטוקולים לשימוש חוזר בננו-שבבים ועיבוד תמונה מכוסים. מעבר לננו-בר-SLB, פרוטוקול זה ישים בקלות לכל סוגי שבבי הזכוכית הננו-מובנים למחקרי חישת עקמומיות.

Introduction

עקמומיות הממברנה היא פרמטר פיזיקלי קריטי של התא המתרחש במגוון תהליכים תאיים כגון מורפוגנזה, חלוקת תאים ונדידת תאים1. כיום ידוע כי עקמומיות הממברנה היא מעבר לתוצאה פשוטה של אירועים תאיים; במקום זאת, הוא התגלה כרגולטור יעיל של אינטראקציות חלבונים ואיתות תוך-תאי. לדוגמה, מספר חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלתרין נמצאו נקשרים באופן מועדף לממברנה המעוקלת, וכתוצאה מכך נוצרה נקודה חמה לאנדוציטוזה2. ישנם גורמים רבים ושונים לדפורמציה של הממברנה כגון משיכת ממברנה על ידי כוחות השלד הציטוסקטלי, נוכחות של אסימטריה של שומנים עם קבוצות ראש בגדלים שונים, קיומם של חלבונים טרנסממברניים בעלי צורה חרוטית, הצטברות של חלבונים מעצבי ממברנה כמו חלבוני BAR-domain (הקרויים על שם חלבוני בין, אמפיפיסין ו-Rvs), והחדרת תחום הליקסים האמפיפתיים לממברנה1 . באופן מעניין, חלבונים ושומנים אלה לא רק מעוותים את הממברנה אלא יכולים גם לחוש את עקמומיות הממברנה ולהפגין הצטברות מועדפת1. לכן, חיוני לחקור אם וכיצד ממברנות עם עקמומיות שונה משנות את ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים המחוברים אליהם ואת ההשפעות הפוטנציאליות על התהליכים התוך-תאיים הקשורים אליהם.

טכניקות רבות פותחו כדי לנתח את האינטראקציה בין קרום מעוקל וחלבונים הן בתאים חיים והן במערכות חוץ גופיות. מערכת התאים החיים מספקת סביבת תאים אמיתית עם מגוון שומנים עשיר וויסות איתות חלבוני דינמי 2,3,4,5,6,7. עם זאת, מערכת מתוחכמת כזו קשה לחקור בשל אי הוודאות והתנודות בסביבה התוך תאית. לפיכך, הבדיקות במבחנה באמצעות קרום מלאכותי המורכב ממיני שומנים ידועים וחלבונים מטוהרים הפכו למערכות שחזור חזקות כדי לאפיין את הקשר בין חלבונים לממברנות מעוקלות. באופן מסורתי, ליפוזומים בקטרים שונים נוצרים על ידי שחול כדי לזהות חלבונים רגישים לעקמומיות באמצעות בדיקת שקיעה משותפת באמצעות כוח צנטריפוגלי או בדיקת ציפה משותפת עם שיפוע צפיפות כדי למנוע צבירה של חלבונים 8,9. עם זאת, העקמומיות של הליפוזומים המובלטים מוגבלת על ידי גודל הנקבוביות הזמין של מסנן הממברנה המשמש במכבש10. הוכח כי בדיקת עקמומיות ליפוזום יחיד (SLiC) מתגברת על מגבלה זו, שבה ליפוזומים בקטרים שונים מסומנים פלואורסצנטיים ומשותקים על פני השטח, כך שניתן לסמן את העקמומיות על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות11. עם זאת, שונות חזקה בהרכב השומנים נצפתה בשלפוחיות קטנות, המשפיעות על דיוק מדידת העקמומיות12. ניסויים במשיכת קשירה מספקים מדידה מדויקת יותר של העקמומיות על הקשירה החולפת הנמשכת מבועיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs) באמצעות פינצטה אופטית, שבה ניתן לשלוט היטב בעקמומיות על ידי מתח הממברנה שנוצר13,14. שיטה זו מתאימה לחקר חלבונים בעלי חישת עקמומיות חיובית או שלילית, אך היא מוגבלת על ידי התפוקה של דור10 של הצינורית. בדיקת צינורות ממברנה נתמכים (SMrT) מאפשרת יצירה בו זמנית של צינורות ממברנה מרובים המובלטים מאותו מאגר שומנים על ידי זרימות מיקרופלואידיות. אף על פי כן, עקמומיות הממברנה משתנה באופן מהותי לאורך הננו-צינורית, מה שפוגע בדיוק של מדידת עקמומיות מבוססת פלואורסצנציה15,16. לשם השוואה, שימוש בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (SUVs, קוטר <100 ננומטר17) ליצירת דו-שכבתי של שומנים נתמכים (SLB) על משטחים המכילים טופוגרפיות מתוכננות יצר קרום דו-שכבתי יחיד עם עקמומיות שנקבעה מראש על ידי ננו-פבריקציה או ננו-חומרים בדיוק גבוה18,19,20.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת SLB על משטחי ננו-שבבים מפוברקים עם מערכי ננו-ברים וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את רגישות העקמומיות של חלבונים במבחנה. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם שישה מרכיבים חיוניים של הבדיקה: א) ניקוי והרכבה של השבב עם תא מיקרופלואידי; ב) הכנת רכבי שטח עם הרכב שומנים מוגדר; C) היווצרות SLB על ננו-שבב וקשירה עם חלבונים רגישים לעקמומיות; ד) הדמיה ואפיון של SLB וחלבונים רגישים לעקמומיות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ה) ניקוי השבב לשימוש חוזר; ו) עיבוד תמונה לניתוח כמותי של יכולת חישת עקמומיות חלבון. הפרוטוקול המפורט מתואר שלב אחר שלב להלן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניקוי של ננו-שבב

  1. הניחו את הננו-שבב בכוס של 10 מ"ל כשהצד המעוצב פונה כלפי מעלה.
    הערה: ננו-שבב קוורץ זה יוצר באמצעות ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים כפי שתואר לפני21. הגיאומטריה והסידור של הננו-מבנה על השבב ניתנים לתכנון מותאם אישית. הגדלים של הננו-ברים ההדרגתיים המשמשים כאן הם 2000 ננומטר אורך, 600 ננומטר גובה, ו 100 עד 1000 ננומטר רוחב (100 ננומטר צעד להגדיר).
  2. הוסיפו בזהירות 1 מ"ל של 98% חומצה גופרתית לכוס, וודאו שהחומצה מכסה באופן מלא את החלק הקדמי והאחורי של השבב.
    הערה: 98% חומצה גופרתית היא קורוזיבית ביותר ועלולה לגרום להרס מהיר של רקמות ולכוויות כימיות חמורות במגע עם העור או העיניים. השתמש בו במכסה האדים עם הגנה מתאימה.
  3. סובבו באיטיות את הכוס והוסיפו 200 μL של 30% מי חמצן טיפה אחר טיפה עד שכל הכוס מתחממת. ודא כי חומצה גופרתית ומי חמצן מעורבבים היטב כדי ליצור תמיסת פיראנה להסרת מולקולות אורגניות מן nanochip17. ישנן טכניקות חלופיות ליצירת SLB על משטחים הידרופיליים נקיים, כגון אור UV וחשיפה לאוזון כפי שתואר קודםלכן 23.
    הערה: התגובה היא אקסותרמית ביותר ויכולה לגרום לתמיסה לרתיחה, לכן הוסיפו מי חמצן לחומצה הגופרתית טיפה אחר טיפה והמשיכו להסתובב.
  4. מניחים את הכוס במיכל זכוכית משני ושומרים על ננו-שבב שקוע בתמיסת הפיראנה למשך הלילה כדי לנקות את הזיהומים ביסודיות.
    הערה: הניחו את הכוס במכסה המנוע ללא כל כיסוי, למקרה שהתגובה עלולה לייצר גז.
  5. הוציאו את הכוס והעבירו בזהירות את תמיסת הפיראנה למיכל פסולת חומצה.
  6. העמיסו 5 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לתוך הכוס כדי לדלל את שאריות החומצה ולהשליך אותה לפסולת החומצית. חזור על שלב זה חמש פעמים והשתמש ב- 5 M NaOH כדי לנטרל את פסולת החומצה.
  7. קח את השבב עם פינצטה ושטוף עם זרם מתמשך של מים deionized כדי להסיר חומצה שיורית ביסודיות. ייבשו את השבב ב-99.9% גז חנקן להיווצרות SLB22.

2. דור של שלפוחית חד-צדדית קטנה (רכבי שטח)

  1. הוסיפו 100 μL של כלורופורם לבקבוקון ענבר.
    הערה: כלורופורם הוא נוזל נדיף מאוד וחסר צבע, והוא עלול להיות רעיל בשאיפה או בבליעה. השתמשו בו במכסה המנוע עם המסכה והכפפות.
  2. ממיסים 500 מיקרוגרם של תערובת השומנים בכלורופורם. הרכב תערובת השומנים המשמשת כאן הוא 89.5 מול% של פוספטידילכולינים מביצים (PC), 10 מול% של פוספטידיל-סרין במוח (PS), ו-0.5% מול% של Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, מלח טריאתילמוניום (Texas Red DHPE).
  3. ייבשו את תערובת השומנים בבקבוקון עם גז חנקן 99.9% עד שהכלורופורם נדיף ותערובת השומנים יבשה.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה המנוע. יש להימנע מהתזת נוזלים בעת ייבוש במכה.
  4. הניחו את תערובת השומנים הקיימת בבקבוקון הענבר ללא המכסה במייבש האבק המכוסה רדיד אלומיניום. לאחר מכן ייבשו את הדגימה בוואקום עם משאבה למשך 3 שעות כדי להנדיף לחלוטין את הכלורופורם.
  5. הוסיפו לבקבוקון 250 מיקרו-ליטר של מאגר מי מלח עם אגירת פוספט (PBS). מערבבים את התמיסה עד שהיא הומוגנית.
    הערה: מאגר PBS מורכב מ-150 mM NaCl, ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום; ה- pH מותאם ל- 7.2 כדי להפוך את המחשב ואת ה- PS ליפידים דו-שכבתיים.
  6. סוניקו את תערובת השומנים במשך 30 דקות בתדר של 50 קילוהרץ בסוניק אמבטיה. לאחר מכן מעבירים את תערובת השומנים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ואוטמים עם פרפילם.
  7. מקפיאים את תערובת השומנים בחנקן נוזלי למשך 20 שניות ואז מפשירים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמבט מים. חזרו על מחזורי ההפשרה 30 פעמים. לאחר מכן, תערובת השומנים נראית כמו נוזל צלול.
    אזהרה: לחנקן נוזלי יש נקודת רתיחה של כ-195.8 מעלות צלזיוס. זה יכול לגרום כוויות קור או כוויות קריוגניות. השתמשו בו בחלל הלא סגור עם כפפות בידוד חום.
  8. יש לשטוף שני מזרקי זכוכית אטומים לגז ואת המחבר של המיני-אקסטרודר עם אתנול, כלורופורם ומתנול בהתאמה. חזרו על רצף השטיפה חמש פעמים כדי לנקות מראש את המנגנון. השאירו אותם במכסה האדים עד שהממס האורגני נדיף לחלוטין.
  9. הרכיבו את מנגנון המיני-אקסטרודר והעבירו 500 μL של מאגר PBS דרך המחבר כדי להרטיב מראש את המנגנון, ולאחר מכן השליכו את המאגר ממזרק אחר. שלב זה מסיר זיהומים ומקל על שחול.
  10. הרכיבו את מנגנון המיני אקסטרודר עם קרום מסנן פוליקרבונט בגודל 100 ננומטר.
    הערה: גודל הנקבוביות של קרום המסנן קובע את קוטר הליפוזומים.
  11. קח 500 μL של מאגר PBS עם אחד המזרקים ודחף אותו בעדינות דרך המסנן כדי למלא את המזרק הריק השני בקצה השני. חזור על ההבלטה הלוך ושוב שלוש פעמים כדי לבדוק את דליפת המנגנון ולהשליך את החיץ מהמזרק השני.
  12. העבירו את תערובת השומנים דרך המיני אקסטרודר כדי להחליף את מאגר ה-PBS. לאחר מכן חצו הלוך ושוב 20 פעמים כדי ליצור רכבי שטח. האופי הרב-לשוני של הבועיות עשוי להישמר עם מספר לא מספיק של זמני שחול, אשר ישפיעו על היווצרות SLB23.
  13. אספו את רכבי השטח מהמזרק השני כדי להפחית את הזיהום בחלקיקים גדולים יותר והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: הסר את המזרק היישר מהמחבר למקרה שהמזרק יתנתק.
  14. יש לעטוף את הצינור ברדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנה של שומנים המסומנים בפלואורסצנט ולאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, ניתן לאחסן את רכבי השטח עד 7 ימים.

3. היווצרות SLB על ננו-שבב

  1. הוציאו בזהירות את הננו-שבב המנוקה ממים שעברו דה-יוניזציה בעזרת זוג פינצטה וייבוש עם 99.9% גז חנקן.
  2. בצע ניקוי פני השטח של nanochip עם טיפול פלזמה אוויר במשך 1 שעות.
  3. הרכיבו את הננו-שבב בתא פולידימתילסילוקסן (PDMS), המורכב משתי חתיכות של PDMS - PDMS אמצעי ו-PDMS עליון (איור 1A). ה-PDMS האמצעי דק (~0.5 מ"מ) עם פתח גדול בצורת אליפסה במרכז כדי להבטיח חשיפה מספקת לתבנית הננו-בר. ה- PDMS העליון עבה (~ 4.0 מ"מ) עם שני חורים קטנים בתוך הפתח הסגלגל הגדול ככניסה ושקע לטיפול בנוזל.
    1. מניחים את השבב על משטח נקי כשהתבנית פונה כלפי מעלה.
    2. מכסים בעדינות את ה-PDMS האמצעי עם השבב, ומוודאים שכל התבנית חשופה לאזור המרכזי של הפתח הגדול בצורת אליפסה ב-PDMS האמצעי.
    3. כסו את ה-PDMS העליון ב-PDMS האמצעי ושמרו על שני החורים הקטנים שלו באזור החור הסגלגל הגדול של ה-PDMS האמצעי. לאחר מכן תא PDMS הוא התאספו.
      הערה: PDMS הוא הפולימר האורגני הנפוץ ביותר על בסיס סיליקון. הוא תואם ביולוגית, שקוף, כמו גם מעוות כדי להיות מתוכנן כצורה מותאמת אישית להרכבת שבב והדמיה תחת המיקרוסקופ. חשוב מכך, ניתן להדביק אותו באופן קוולנטי לשכבת PDMS אחרת או לזכוכית בחוזקה לאחר טיפול בפלזמה, מה שהופך אותו למתאים כתא להכנת SLB. שלב זה מבטיח שכל שכבה של PDMS מותקנת היטב כדי למנוע פערים ודליפות.
  4. טען את רכבי השטח לתוך תא PDMS מאחד משני החורים הקטנים ב- PDMS העליון עם פיפטה ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את ה- SLB.
  5. הכניסו בעדינות את חיץ ה-PBS לתוך תא ה-PDMS מצד אחד של החור הקטן והוציאו את הפסולת עם צמר גפן מהחור השני כדי לשטוף את רכבי השטח הלא מאוגדים. לאחר מכן לרכוש את SLB שנוצר על nanochip (איכות SLB נבדקת על ידי התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching (FRAP) כפי שמוצג בשלב 4.4 ונדון בסעיף התוצאות המייצגות).
    הערה: בעת הזרמת מאגר PBS לתוך התא, קצה הפיפטה צריך להיות מלא במאגר ובמגע עם משטח הנוזל כדי למנוע הזרקת בועות.

4. הדמיית ה-SLB וחלבון חישת העקמומיות הנקשר על הננו-שבב

הערה: סעיף זה יהיה תלוי במערכת המיקרוסקופים הזמינה לניסוי. כאן תתואר הנחיה כוללת כיצד לבצע את ההדמיה. ניתן לשנות את ההגדרות המפורטות בין הגדרות המיקרוסקופ השונות.

  1. הגדר את המיקרוסקופיה הקונפוקלית לסריקת לייזר באמצעות מטרת שמן 100x (N.A.1.4). פתח את תוכנת ZEN כדי לבחור את עוצמת לייזר העירור שיכולה לעורר את הפלואורסצנציה של השומנים והחלבון. בחר מצב רכישה > הגדרה חכמה > טקסס רד DHPE / EGFP.
  2. כוונן את המיקוד באמצעות ידית המיקוד כדי לאתר את הננו-מוטות על השבב עד שקצוות הננו-מוטות יהיו חדים מתחת לתעלת השומנים.
  3. הגדר את פרמטרי הסריקה כמפורט להלן כדי לקבל תמונת בקרה של תעלת השומנים לפני הוספת חלבון: גודל מסגרת = 512 פיקסלים x 512 פיקסלים (512 פיקסלים x 512 פיקסלים, גודל פיקסל של 124 ננומטר), סיביות לפיקסל = 16 (עומק 16 סיביות ), מהירות סריקה = 5, וממוצע = 4 (מצב ממוצע של ארבע פעמים לקו).
  4. בצע את בדיקת FRAP על ידי הלבנת דו-שכבת השומנים המסומנת בפלואורסצנט על אזור ננו-בר יחיד אקראי.
    1. בחר/י בתיבות הסימון ״אזורי ניסוי ״ ו״ הלבנה״ . ציירו שטח מעגלי בקוטר 5 מיקרומטר שיכול לכלול את כל הננו-בר במרכז (גודל הננו-בר הוא 2 מיקרומטר) והוסיפו לאזורי הניסוי. הזן פרמטרי הדמיה של קיטועי זמן כדוגמה הבאה: בחר מהירות סריקה = 9 וממוצע = 1. בחר סדרת זמן > משך = 100 מחזורים ומרווח = 2 שניות. הזן פרמטרים להלבנה כדוגמה הבאה: בחר/י בתיבת הסימון ״התחל אחרי # תמונות״ ובחר/י שלוש תמונות.
    2. בחר את תיבות הסימון של הלייזר המבצעות FRAP ושנה את העוצמה ל - 100.0%. לחץ על התחל ניסוי עבור ניסוי FRAP.
      הערה: FRAP היא שיטה נפוצה לאפיון הניידות של מולקולות תאיות. אם ל-SLB יש נזילות טובה, הפלואורסצנציה באזור המולבן תתאושש בהדרגה כאשר פלואורופורים מולבנים יתפזרו החוצה ופלואורופורים לא מולבנים מאזורים אחרים יתפזרו פנימה.
  5. יש לטעון את תמיסת החלבון לתוך תא ה-PDMS ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את קשירת החלבון ב-SLB.
    הערה: החלבונים המשמשים באיור 2G,H כדי להדגים את הרכב השומנים מקלים על קשירת חלבונים ב-SLBs מעוקלים בננו-ברים הם 74 μM GFP ו-79 μM GFP-His. שני חלבונים אלה הם חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ללא או עם תג שלו. החלבונים המשמשים למחקר חישת עקמומיות באיור 4 ובאיור 5 הם 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 ו-16 μM FBAR+IDRFBP17. שלושת החלבונים האלה הם התחומים של FBP17, שהוא חלבון BAR טיפוסי שמניחים באופן אינטואיטיבי שהוא גם מחולל עקמומיות וגם כחיישנים. כל נפח חלבון הוא 20 μL.
  6. מקד מחדש את הננו-ברים וחזור על שלב 4.3 כדי לצלם תמונות של תעלות השומנים והחלבונים לצורך זיהוי חישת עקמומיות חלבונים.
  7. חזור על שלב 4.4 כדי לבצע את בדיקת FRAP הן בתעלות השומנים והן בתעלות החלבון ולבצע הדמיה בהילוך מהיר כדי לאפיין את הניידות של חלבון חישת עקמומיות.

5. שימוש חוזר בננו-שבב

  1. קחו את הננו-שבב בפינצטה ונתקו אותו בזהירות מתא ה-PDMS בכוס של 50 מ"ל מלאה במים שעברו דה-יוניזציה.
    הערה: זהו שלב קריטי. מנעו מהפינצטה לגעת בננו-מבנה, ואל תכריחו את השבב להיפרד כדי למנוע סדקים.
  2. שטפו היטב את הננו-שבב באתנול נטול מים כדי להסיר שאריות אורגניות המחוברות על פני השטח.
    הערה: השתמש בנייר טישו נקי כדי להסיר מים על פני השטח לפני שטיפה עם אתנול נטול מים.
    אזהרה: אתנול נטול מים הוא כימיקל נדיף מאוד ומעט מסוכן. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. השתמשו בו במכסה המנוע עם המסכה והכפפות.
  3. שטפו את השבב ביסודיות עם הרבה מים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר שאריות אתנול. לאחר מכן לפוצץ לייבש את השבב עם 99.9% גז חנקן.
    הערה: חשוב להסיר את כל עקבות האתנול על השבב לפני שתמשיך לשלב הבא מכיוון שחומצת הפיראנה יכולה להגיב באלימות עם ממס אורגני ועלולה לגרום לפיצוצים.
  4. מניחים את השבב בכוס נקייה של 10 מ"ל כשצד התבנית פונה כלפי מעלה ומנקים את השבב עם תמיסת פיראנה לשימוש חוזר אשר עוקב אחר אותם שלבים כמו 'ניקוי של ננו-שבב'.

6. כימות תמונה

  1. סובב את התמונות שנרכשו על ידי מיקרוסקופ כך שמערך הננו-ברים יהיה במצב אנכי לניתוח הבא בתוכנת פיג'י.
  2. השתמש בקוד MATLAB 'c_pillarmask_averaging' שנכתב בהתאמה אישית כדי לאתר את הננו-פס הבודד על ידי מסיכה מרובעת (51 פיקסלים x 51 פיקסלים) הן בערוץ השומנים והן בערוץ החלבון.
    הערה: קוד MATLAB זה תוכנן במיוחד עבור הננו-שבב. ניתן להשיג אותו ב- GitHub דרך הקישור: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. הפחת את אותות הרקע של כל תמונה באמצעות שלושת ה- ROIs (5 פיקסלים x 5 פיקסלים) בפינות התמונה על ידי פונקציית meshgrid בקוד MATLAB 'BarGra_avg'. פעולה זו נועדה לתקן רעשי רקע לא אחידים פוטנציאליים הנגרמים על ידי הגדרת המיקרוסקופ או פילוס השבב בשלב המיקרוסקופ.
  4. צור את התמונות הממוצעות של ננו-ברים בגודל זהה באמצעות קוד MATLAB 'BarGra_avg', כאשר כל נקודה היא הממוצע של הערכים באותה נקודה בכל המסכות הריבועיות של ננו-ברים בודדים. צור חלקות פני שטח תלת-ממדיות של התמונות הממוצעות בתוכנת פיג'י כדי להציג את התפלגות האות הממוצעת סביב הננו-ברים באופן אינטואיטיבי. בחרו ' נתח > משטח התוויית פני השטח > קלט 100 ' למכפיל מצולע, ובחרו תיבות הסימון 'הצללה', 'צייר ציר' ו'החלק '.
  5. פלח כל ננו-מוט לשלושה אזורים, הכוללים שני אזורים בעלי קצה ננו-בר ואזור ננו-מרכזי אחד כדי לחלץ את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם בהתאמה על-ידי קוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification'. הגדלים של ה-ROIs של הננו-ברים מותאמים בהתאם לממד של הננו-ברים באמצעות קובץ ה'מיקום'.
  6. חלקו את עוצמות החלבון בעוצמות שומנים המופקות מקוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification' באזור הבר-קצה כדי לקבל את צפיפות קצה הננו-בר שאינה כוללת את אפקט שטח הפנים.
  7. שרטט את צפיפות קצה הננו-בר עם ריכוזים שונים במנסרת GraphPad כדי לקבל את עקומת הקשירה. פתח את תפריט ניתוח . בחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) > כריכה - רוויה > קשירה ספציפית עם פונקציית שיפוע היל כדי להתאים את העקומה למשוואת היל ולאחר מכן חשב את ערך מקדם KD ו- Hill.
  8. עוצמות השומנים והחלבונים מנורמלות לעוצמות המתאימות להן במרכז הננו-ברים של 600 ננומטר הנרכש באותה תמונה באמצעות קוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  9. השתמש בתשעת הפיקסלים הבהירים ביותר של עוצמות חלבון מנורמלות באזור הקצה הננו-ברי חלקי אזור הבר-מרכז כדי לכמת את חישת עקמומיות החלבון עם ננו-ברים בגודל זהה, הערך נקרא "יחס קצה למרכז". השתמש ביחס של עוצמת חלבון מנורמל כדי לנרמל את עוצמת השומנים כדי לכמת את טווח חישת עקמומיות החלבון עם ננו-ברים בגדלים שונים, הערך נקרא "צפיפות ננובר-קצה מנורמלת". ערכים אלה מחושבים על ידי קוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  10. טען את תמונת המחסנית של FRAP בתוכנת פיג'י. בחר את אזור FRAP וצור החזר השקעה. בחר בפונקציה More > Multi measure כדי למדוד את עוצמת אזור FRAP עבור כל פעם. התווה את העוצמה בפריזמת GraphPad כדי ליצור את עקומת ההתאוששות של FRAP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תכנון ננו-בר מומלץ לבדיקת חלבונים חישת עקמומיות חיובית, המכילים חצי עיגול בכל קצה עם עקמומיות המוגדרת על ידי רוחב הננו-מוט ובקרת עקמומיות שטוחה/אפס אחת מקומית במרכז (איור 2A,B). היווצרות מוצלחת של ה-SLB על גבי ננו-מוטות גורמת לאותות סמן שומנים המפוזרים באופן שווה על פני כל משטח הננו-בר, כפי שמוצג באיור 2C. ניתן לשלב אותות מננו-ברים מרובים על-ידי חישוב ממוצע של תמונות הננו-ברים הבודדות (איור 2D), כך שניתן יהיה למזער וריאציות אקראיות בין ננו-ברים שונים. מחקר מוקדם יותר במיקרוסקופיית אלקטרונים הראה כי קרום הפלזמה התאית יצר ציפוי קונפורמי סביב כל הננו-מבנים24. לכן, מאמינים כי דו-שכבת השומנים הסינתטית נצמדת בחוזקה גם על פני השטח של ננו-מבנה, מה שנותן קווים מוגבלים לעקיפה על ננו-מוט של 200 ננומטר כפי שנצפה באיור 4E. בנוסף, ניתן לאפיין את נזילות הממברנה ב-SLB המעוקל בננו-בר גם על-ידי בדיקת FRAP, שבה ניתן להלבין את האות הפלואורסצנטי על ננו-מוט יחיד בנפרד לצורך אפיון נזילות הממברנה (איור 2E,F).

היווצרות ה-SLB על גבי ננו-מוטות דורשת ייצור של רכבי שטח בדומה לתצורת SLB על משטחים שטוחים כפי שדווח קודםלכן ב-17. הרכב השומנים של רכבי שטח קובע את הכימיה של פני השטח של SLB מעוקל ננו-בר שניתן לשנות לצורך תיוג ממברנות ומנגנוני קשירת חלבונים שונים. לדוגמה, ניתן להוסיף DHPE אדום של טקסס ב~0.5 mol% ברכבי שטח, כך שניתן יהיה לדמות בקלות את העשרת שטח הפנים של הממברנה בננו-מוטות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 2C). מלבד ויזואליזציה, ניתן גם לשנות את הרכב השומנים כדי להקל על קשירת חלבונים על SLBs מעוקלים בננו-בר. לדוגמה, כדי להקל על העיגון של חלבונים המתויגים שלו, ניתן להביא חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA) ל-SLB על גבי הננו-מוטות על ידי שילוב 1,2-דיאולאויל-sn-glycero-3-[(N-(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל) חומצה אימינודיאצטית) סוקציניל] (מלח ניקל) (18:1 DGS-NTA(Ni)) לרכבי שטח (~1 מול%)25. ללא קבוצה פונקציונלית זו על שומנים, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אינו יכול להיקשר ל-SLB עם PS טעון שלילית, וכתוצאה מכך נוצר חור כהה יותר בצורת פס בכל מיקום ננו-מוט עקב דלדול נפחי של אותות GFP בתמיסה (איור 2G). לשם השוואה, על-ידי הוספת 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) ב-SLB, התג שלו שכותרתו GFP יכול לעגן בחוזקה על הממברנה כדי לעקוב בבירור אחר צורת ה-SLB המעוגלת על-ידי ננו-מוטות (איור 2H). דיפוזיית השומנים לא הראתה הבדל הניתן לזיהוי בעת קשירת חלבונים, כפי שנחקר על-ידי בדיקת FRAP (איור משלים 1). ראוי לציין כי מדידת FRAP מבוססת רק על העוצמה של 0.5 mol% Texas Red DHPE ב- SLB, אשר עשוי שלא לייצג את 1 mol% DGS-NTA(Ni) המשמש לקשירת חלבון התג שלו. בנוסף, ליפידים טעונים כגון PS יכולים לשפר את קשירת החלבון באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית26, בעוד שליפידים מאותתים כגון פוספטידילינוזיטול (4,5)-ביספוספט (PIP2) יכולים גם להיות משולבים ברכבי שטח כדי להקל על קשירת חלבונים ספציפיים (לדוגמה, FCHo2, שעבורו PIP2 נמצא חיוני לחישת עקמומיות הממברנהשלו 27).

איכות היווצרות SLB במונחים של אחידות פני השטח ונזילות הממברנה היא קריטית לבדיקת יכולת חישת עקמומיות החלבון על ננו-מוטות. ישנן שלוש בעיות אופייניות שעלולות לפגוע באחידות ובנזילות של SLB. האחת היא קשירת רכבי שטח עודפים ב-SLB כתוצאה משטיפה לא יעילה שיוצרת פונקטה הן על הננו-מוטות והן על הממברנה השטוחה שבין הננו-מוטות (איור 3A,B). היא משפיעה באופן משמעותי על כימות קשירת חלבונים על משטחים מעוקלים או שטוחים על ננו-מוטות לצורך הערכת חישת עקמומיות. בעיה נוספת היא ההחדרה הבלתי צפויה של בועות אוויר בתוך תא ה-PDMS במהלך שלב הכביסה, מה שעלול להרוס את ה-SLB לאורך המסלול של ממשק האוויר-נוזל ולהשאיר תכונות דמויות שריטה שניתן לזהות בקלות עם אותות שומנים נמוכים במיוחד על פני השטח של הננו-מוט (איור 3C,D). יתר על כן, מצעי ננו-בר שנוקו בצורה לא נכונה משאירים על פני השטח שאריות כימיות המפוזרות באופן אקראי המונעות ספיחת שומנים להיווצרות SLB. זה מוביל ליצירת פגמים בממברנה שעשויים להיות מעל הרזולוציה האופטית עבור הדמיה מיקרוסקופית (איור 3E). עם זאת, נזילות הממברנה תושפע ברגישות מהיווצרות פגם בממברנה28, כך שניתן יהיה להשתמש בבדיקת FRAP כדי לאמת את ניקיון פני השטח (איור 3F,G).

כדי להדגים את האפיון של חלבון חישת עקמומיות באמצעות מערך ננו-מוטות, משווים את תחום ה-F-BAR הטיפוסי לאזור שזוהה לאחרונה עם הפרעה פנימית ב-FBP17 (IDRFBP17). F-BAR מסומן באופן פלואורסצנטי עם צבעי אסטר טטרה-פלואורופניל 488 של Alexa Fluor ואילוIDR FBP17 מסומן ב-Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. כפי שניתן לראות באיור 4A, שני תחומי החלבון מראים הצטברות מוגברת על ננו-ברים בודדים מצופים SLB ברוחב של 300 ננומטר. כאן, ה-SLB מכיל 10% PS כדי לשפר באופן אלקטרוסטטי את קשירת החלבון. ניתן לזהות את יכולת חישת העקמומיות של החלבון על ידי ההעשרה המועדפת בננו-בר המעוקל עם עוצמה פלואורסצנטית גבוהה יותר מאשר האותות במרכזי הננו-ברים השטוחים, המוצגת באופן ברור יותר לאחר ממוצע תמונה של יותר מ-100 ננו-ברים (איור 4B). יכולת חישת העקמומיות יכולה לבוא לידי ביטוי כמותי על ידי חישוב יחס הקצה למרכז על כל ננו-מוט (כלומר, עוצמת הפלואורסצנציה בקצה הננו-בר לעומת מרכז הננו-בר). כפי שניתן לראות באיור 4C, לשני החלבונים יש יחס גבוה יותר מקצה למרכז מאשר ליפידים, שהוא בסביבות 1. כאשר משווים את IDR FBP17 ו- F-BAR, ניתן לראות כי היחס הגבוה יותר מקצה למרכז שלIDR FBP17 (1.385 ± 0.011, ממוצע ± SEM) מצביע על חישת עקמומיות חזקה יותר מאשר F-BAR (1.144 ± 0.004, ממוצע ± SEM).

כדי לבחון את טווח העקמומיות שהחלבונים יכולים לחוש, ה-SLB נוצר על מערכי ננו-ברים עם רוחב הדרגתי מ-200 ננומטר עד 600 ננומטר (איור 4D) שבהם שומנים הראו ציפוי הומוגני על ננו-מוטות בגדלים שונים (איור 4E). שלושה חלבונים (IDR FBP17, F-BAR ו-F-BAR+IDRFBP17) מודגרים על מערך הננו-ברים ההדרגתיים, וכולם הראו הצטברות מועדפת באתרי הממברנה המעוקלת בעלת הקצה הננו-סופי כאשר העקמומיות ירדה מתחת לקוטר של 400 ננומטר (איור 4E,F). מבין שלושת תחומי החלבון האלה,IDR FBP17 נותן את הצפיפות הגבוהה ביותר של ננו-בר, מה שמעיד על יכולת חישת העקמומיות החזקה ביותר שלו, בעוד ש-F-BAR מראה את הערך הנמוך ביותר (איור 4F). יתר על כן, ניתן גם לשרטט את עקומת הקישור של החלבון הקולט עקמומיות על ידי הגדלה הדרגתית של ריכוז החלבון (איור 4G), מה שמראה כיל-IDR FBP17 יש יכולת חישת עקמומיות שיתופית חזקה. כאשר מתאימים את עקומות הקשירה שלו למשוואת היל, ה-KD נמצא בתחום ה-μM (0.6 ±-0.1 μM) ומקדם היל (H) הוא בין 2 ל-3, מה שמרמז על קשירה אולטרה-רגישה שלIDR FBP17 לעקמומיות קרום הנגרמות על-ידי ננו-בר. ככל שהעקמומיות חדה יותר, כך כושר הקשירה בשיווי משקל גבוה יותר.

דיפוזיה דינמית של הממברנה והקשר הממברנה של חלבונים קולטי עקמומיות סביב אתרי SLB בצורת ננו-בר יכולים להיחקר גם על ידי FRAP. בהשוואה להתאוששות המהירה של אותות השומנים בננו-מוטות (איור 5A,E), ה-F-BAR לא הצליח להתאושש תוך 2 דקות (איור 5B,E), מה שמרמז על כך שהדינמיקה של הממברנה הפחיתה באופן משמעותי את הניידות והשיוך של הממברנה באתרי הממברנה המעוקלים. באופן מפתיע, בשונה מההתנהגות של F-BAR, אות IDR FBP17 הראה התאוששות ברורה באותה מסגרת זמן (איור 5C,E), מה שמצביע על האופי הדינמי של IDR FBP17 שהצטבר בממברנות המעוגלות. עם זאת, לאחר שטיפת ה-IDR FBP17 הלא מאוגד בתמיסה, לא ניתן היה לראות את אותה התאוששות בערוץIDR FBP17 כמו קודם (איור 5D,E). זה מצביע על כך שההתאוששות נשלטת על ידי חילופי עם מולקולותIDR FBP17 המכילות תמיסה ופחות על ידי דיפוזיה לרוחב של המולקולות הקשורות לממברנה.

באופן כללי, תוצאות אלה מדגימות כי מערכת ננו-בר-SLB זו היא כלי רב עוצמה לאפיון חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה.

Figure 1
איור 1: איור של מערכת ננו-בר-SLB. (A) תא ה-PDMS מורכב מהשכבות העליונות והאמצעיות עם הננו-שבב המנוקה המורכב עליו. (B) טקסס רד DHPE תייג רכבי שטח עם פירוט מוגדל. (C) המודל השלם של מערכת הננו-בר-SLB ואזור הזום-אין ממחיש כי ה-SLB נוצר על גבי ננו-מוטות עם שכבה אחת אחידה של דו-שכבת השומנים. (D) תהליך הדמיה ואפיון תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר. (E) ניקוי הננו-שבב לשימוש חוזר נוסף. (F) עיבוד הדמיה לכימות חישת עקמומיות חלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: היווצרות ה-SLB המעוקל על ננו-ברים עם קשירת חלבונים . (A) תמונת SEM של ננו-מוט בודד. (B) תיאור סכמטי של מערכת הננו-בר-SLB. (C) תמונות פלואורסצנטיות של ה-SLB המסומנות ב-Texas Red DHPE על גבי הננו-שבב. (D) תמונה ממוצעת של התפלגות SLB על ננו-מוטות (למעלה) ותרשים משטח תלת-ממדי של התמונה הממוצעת (למטה). נתון זה שונה מ- Su et al.22 ושוכפל באישור. (E) הדמיית קיטועי זמן של SLB FRAP על הננו-בר. אזור ההלבנה מסומן על ידי עיגול מקווקו צהוב. (F) עלילת עוצמת ננו-בר מנורמלת על ידי מדידת FRAP. (G) תיאור סכמטי של GFP אינו יכול להיקשר ל-SLB עם PS טעון שלילי של 10% מול (משמאל) ותמונה מייצגת מקבילה מימין. (H) תיאור סכמטי של התג שלו שכותרתו GFP קשור ל-SLB עם 1 mol% DGS-NTA(Ni) (משמאל) ותמונה מייצגת תואמת מימין. סרגלי קנה מידה: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: בעיות אופייניות שפוגעות באיכות ה-SLB . (A) סכמת של הכנת SLB ללא כביסה יעילה. (B) תמונה מייצגת של ה-SLB נקשרת לרכבי שטח עודפים. החיצים הצהובים מראים את הפונקטה שהם רכבי שטח עודפים על משטח SLB. (C) סכמת הכנת SLB עם בועות אוויר מוזרקות. (D) תמונה מייצגת של SLB שנהרסה על ידי המסלול של ממשק האוויר-נוזל. החץ הצהוב מציג את ה- SLB הלא שלם על המצע. (E) סכמת הכנת SLB עם מצעי ננו-בר לא נקיים. אזור הזום-אין מראה דו-שכבת שומנים לא רציפה בגלל שאריות פני השטח שמונעות ספיחת שומנים. (F) הדמיה בהילוך מהיר של ניתוח SLB FRAP על מצעי ננו-ברים לא נקיים. אזור ההלבנה מסומן על ידי עיגול מקווקו צהוב. (G) עלילת עוצמת ננו-בר מנורמלת על ידי מדידת FRAP. סרגלי קנה מידה: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אפיון חישת עקמומיות חלבונים על-ידי מערכת ננו-בר-SLB. (A) תמונות פלואורסצנטיות של F-BAR (משמאל)ו-IDR FBP17 (מימין) מצטברות על ננו-ברים מצופים SLB (10% PS ו-90% PC). סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. (B) תמונות ממוצעות של F-BAR (למעלה משמאל) ו-IDR FBP17 (למטה משמאל) מצטברות על ננו-ברים ועל חלקות משטח תלת-ממדיות מתאימות (ימין למעלה וימין למטה, בהתאמה). סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. (C) יחס מקצה למרכז של דו-שכבת השומנים, F-BARו-IDR FBP17 בעוצמה פלואורסצנטית סביב הננו-מוט ברוחב 300 ננומטר. מבחן t של וולש בוצע לצורך ניתוח סטטיסטי. עמ' < 0.0001. (n = 3) (D) תמונת SEM של מערכי ננו-ברים הדרגתיים ברוחב של 200 ננומטר עד 600 ננומטר. סרגל קנה מידה: 5 μm. (E) ביאור של מבנה החלבון (למעלה), תמונות ממוצעות של דו-שכבתי שומנים, IDR FBP17, F-BAR והתפלגות F-BAR+IDR FBP17 על ננו-ברים הדרגתיים ברוחב שנע בין 200 ננומטר ל-600 ננומטר (באמצע) ופרופילי עוצמה לאורך הננו-ברים של כל תמונה ממוצעת (למטה). סרגל קנה מידה: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR ו- F-BAR+IDRFBP17 מנורמל צפיפות ננו-פס מכומתת עם רוחבים שונים של ננו-מוטות בהתאמה. כל נתון מוצג כממוצע ± SEM (n ≥ 60). (G) עקומת הקשירה שלIDR FBP17 מצוידת במשוואת היל. כל נתון מוצג כממוצע ± SEM (n = 3). נתון זה שונה מ- Su et al.22 ושוכפל באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הדינמיקה של קשירת הממברנה של חלבונים קולטי עקמומיות סביב הננו-מוט. (א-ד) הדמיה בהילוך מהיר של דו-שכבת השומנים (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C)ו-IDR FBP17 שטפה את ניתוחה-FRAP (D) בננו-בר. אזור ההלבנה מסומן על ידי עיגול מקווקו אדום. סרגל קנה מידה: 5 μm. (E) מתווה עוצמת ננו-בר מנורמל על ידי מדידת FRAP. נתון זה שונה מ- Su et al.22 ושוכפל באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: דיפוזיה של הממברנה לפני ואחרי הוספת חלבון. (A) הדמיה בהילוך מהיר של בדיקת FRAP על דו-שכבת השומנים POPC עם 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) ו-0.5% Texas Red DHPE סביב הננו-מוט לפני (למעלה) ואחרי (למטה) הוספת חלבון GFP-His . אזור ההלבנה מסומן על ידי עיגול מקווקו צהוב. (B) עלילת עוצמת ננו-בר מנורמלת על ידי מדידת FRAP. סרגלי קנה מידה: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת nanobar-SLB המתוארת כאן מציעה שילוב ייחודי של היתרונות במספר בדיקות קיימות במבחנה. הוא חושף ביעילות את הקשירה המועדפת של חלבונים לממברנות מעוקלות מאוד כבדיקת ציפה או שקיעה של ליפוזום, אך דורש הרבה פחות דגימות ומציע עקמומיות מוגדרת בצורה מדויקת יותר על ננו-ברים בודדים 8,29. הוא גם מציע מגוון רחב של עקמומיות מבוקרת במדויק להשוואה סימולטנית כמו בדיקת SLiC, עם פחות דאגה לשינוי בהרכב השומנים בעקמומיות שונות ושינויים מורפולוגיים או עקמומיות בלתי ניתנים לגילוי עם גדלים מתחת לגבול עקמומיות האור, מכיוון שה- SLB נייד ומכסה ברציפות את כל הגדלים של ננו-מוטות בחוזקה30 . Nanobar-SLB מאפשר גם תצפית על התנהגויות דינמיות של חלבון על הממברנה המעוקלת כמבחני משיכת הקשירה, אך לא מוגבל על ידי התפוקה של יצירת צינורות וניסיון במניפולציית לכידה אופטית13. למרות שבדיקת SMrT מייצרת צינורות ממברנה בתפוקה גבוהה, עקמומיות הממברנה משתנה לאורך הננו-צינורית מה שמקשה על חקר רגישות העקמומיות של חלבונים16. באופן מעניין יותר, בהשוואה למערכות מבוססות SLB אחרות על המצע המעוצב18,19,20,27, הננו-בר-SLB מספק מרכז מוטות שטוח ליד העקמומיות המוגדרת בקצה הבר, המשמש למעשה כבקרה מקומית על עקמומיות אפס כדי למזער את ההשפעה של וריאציות צפיפות פני השטח על ניתוח כמותי. היכולת להתאים אישית שילובי עקמומיות באמצעות ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים ברזולוציה גבוהה יכולה ליצור לא רק בקרות עקמומיות אפס מקומיות, אלא גם עקמומיות חיובית ושלילית כפי שהוכח קודם לכן במחקרי תאים חיים2.

ישנן מגבלות פוטנציאליות שראוי לציין בעת שימוש בשיטה זו. ראשית, ננו-פבריקציה על השבב היא הליך מורכב יחסית, עם מתקני חדר נקי וציוד מיוחד הדרוש (בפרט, סופר E-beam). העלות הגבוהה הזו הובילה אותנו לשימוש חוזר בשבב; התוצאה היא זמן רב יותר לניקוי משטח השבב והרכבת השבב עם PDMS בהשוואה לשימוש חד פעמי. הזמינות של הננו-שבב היא סוג אחר של מגבלה. פעולה לא נכונה בעת שימוש בשבב, כגון פנייה אל פני השטח לכיוון הספסל, עלולה לגרום להתשה של ננו-מבנים, במיוחד עבור מבנים בעלי יחס רוחב-גובה גבוה. יתר על כן, דו-שכבת השומנים שנוצרה על המצע היא קרום רציף; המתח יכול להתפשט בקלות בכל מקום. עבור מחקרים הדורשים מניפולציה של מתח הממברנה, טכניקות כגון קשירה הנשלפת מ- GUVs באמצעות מערכת המיקרופיפטה המחוברת מספקות פתרונות נוחים יותר10.

כדי להשיג תוצאות מיטביות, השלבים הבאים הם גם קריטיים. (i) גודל שלפוחית הוא קריטי עבור היווצרות SLB31,32. ספרות קודמת מראה נטייה גבוהה יותר של היתוך עבור שלפוחיות בגודל קטן יותר (< 90 ננומטר) בהשוואה לגודל גדול יותר באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם מבחן פיזור (QCM-D)32. לכן, לעומת LUVs של 300 ננומטר, הקטרים של ~ 50 ננומטר יהיה קל יותר עבור היווצרות SLB. בהתחשב בבעיה זו, יש צורך לפחות 20 פעמים הן בשלבי הפשרה בהקפאה והן בשלבי שחול כדי ליצור רכבי שטח הומוגניים להיווצרות SLB. בדיקת FRAP נחוצה גם בכל ניסוי כדי לאמת את ניידות הממברנה. (ii) במהלך הכנת רכב שטח, יש לשמור על כל הציוד נקי כדי למנוע זיהום של חלקיקים קטנים דמויי אבק. במיוחד עבור המיני אקסטרודר, המחטים נסתמות בקלות בסביבה מלוכלכת. (iii) כדי להכין רכבי שטח באיכות טובה, יש להסיר לחלוטין את הכלורופורם בתערובת השומנים כדי למנוע הרס שלפוחיות שומנים. (iv) ניקוי פלזמה של השבב צריך להתבצע טרי לפני היווצרות SLB כדי להבטיח משטח הידרופילי מאוד עבור שבירה יעילה של SUV כדי ליצור דו-שכבתי רציף. חשיפה ארוכת טווח בסביבה לאחר טיפול בפלזמה עלולה לגרום לקשירה לא ספציפית של חלקיקי אבק או שאריות אורגניות למשטח השבב, מה שפוגע בהידרופיליות של פני השטח. (v) כדי להרכיב את תא ה-PDMS להיווצרות SLB ולדגירה של חלבונים, הניקיון והשטיחות של כל פיסת PDMS חשובים כדי להבטיח אטימה טובה של תעלת הנוזלים. כל דליפה של התא עלולה לגרום ל-SLB להתייבש או לשנות את ריכוז החלבון. (vi) התאמת מיקוד ההדמיה היא קריטית כדי להבטיח מדידת עוצמה עקבית, מכיוון שגובה הננו-מוט (600 ננומטר) דומה לעומק המוקד של המיקרוסקופיה הקונפוקלית לסריקת לייזר בציר z33. יש להתאים מחדש את המיקוד בכל פעם שהמערך זז אופקית כדי לשמור על חדות קצוות הננו-ברים בתמונות.

מעל לכל, מערכת הננו-בר-SLB שהוצגה כאן מספקת שיטה רבת עוצמה לחקר חלבוני חישת עקמומיות הממברנה. ניתן לחקור פרמטרים שונים המשפיעים על אינטראקציית החלבון עם הממברנה המעוקלת באופן כמותי על פני מגוון של עקמומיות, כגון תחומים רגישים לעקמומיות (למשל, תחום BAR וסליל אמפיפילי) של החלבון 8,30, הרכב השומנים (למשל, PS ו- PIP2) של הממברנה27,34, pH, חוזק יוני וטמפרטורה של הסביבה35,36 כמו גם האינטראקציה בין חלבון לחלבון לצורך היווצרות מורכבים (לדוגמה, CHMP2B ו-CHMP2A עשויים לתרום באופן שונה לתהליכי שיפוץ הממברנה המזורזת של ESCRT-III)37,38., מחקרים דינמיים יכולים להתבצע גם באמצעות מערכת ננו-בר-SLB כדי לחקור קינטית קשירה של ממברנה11, דיפוזיה של חלבון ממברנה או הרכבה39, כמו גם תגובות אנזימטיות 40 או הפרדת פאזות 13,41,42. בנוסף, bilayer שומנים מלאכותיים נחשב בדרך כלל סימטרי עם כל מונולאייר שומנים המכיל את אותו הרכב שומנים, אשר שונה למדי מן קרום התא החי43. גרימת דו-שכבתי אסימטריה כדי לחקות טוב יותר את קרום הפלזמה יכולה להתקבל על ידי שינוי החומר של פני השטח, מצב החיץ, הרכב השומנים או הטמפרטורה44,45,46,47. יש ערך רב לוודא אם ניתן ליצור דו-שכבה אסימטרית על מערכת הננו-בר-SLB כדי לחקור את התנהגות החלבונים על הממברנה המעוקלת, הראויה למחקרים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר אינטרס כלכלי מתחרה בעבודה זו.

Acknowledgments

אנו מודים למרכז ננו-פבריקציה של נאניאנג (N2FC) ולמרכז לטכנולוגיות פוטוניות משבשות (CDPT) באוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג (NTU) על התמיכה בייצור ננו-מבנים והדמיית SEM, לפלטפורמת ייצור החלבונים (PPP) בבית הספר למדעי הביולוגיה NTU לטיהור חלבונים, ולבית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU למיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו ממומנת על ידי משרד החינוך של סינגפור (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21, ו- MOE-T2EP30220-0009), המכון לניתוח מולקולרי דיגיטלי ומדע (IDMxS) הנתמך על ידי מימון MOE במסגרת תוכנית מרכזי המחקר למצוינות (W. Zhao), קרן תוכנית המדע של הגבול האנושי (W. Zhao, RGY0088/2021), מענק הסטארט-אפ של NTU (W. Zhao), בית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU עבור מלגת המחקר (X. Miao), ומועצת המלגות של סין עבור מלגת המחקר (J. Wu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

ביוכימיה גיליון 189 מערך ננובר עקמומיות ממברנה חלבון חישת עקמומיות דו-שכבת שומנים נתמכת בדיקה במבחנה
מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה <em>במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter