Summary
Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.
Abstract
Membraankromming speelt een belangrijke rol in verschillende essentiële processen van cellen, zoals celmigratie, celdeling en vesikelhandel. Het wordt niet alleen passief gegenereerd door cellulaire activiteiten, maar reguleert ook actief eiwitinteracties en is betrokken bij veel intracellulaire signalering. Het is dus van grote waarde om de rol van membraankromming bij het reguleren van de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden te onderzoeken. Onlangs zijn er veel technieken ontwikkeld om de relatie tussen het gebogen membraan en eiwit in vitro te bestuderen. In vergelijking met traditionele technieken biedt de nieuw ontwikkelde nanobar-supported lipid bilayer (SLB) zowel een hoge doorvoer als een betere nauwkeurigheid bij het genereren van membraankrommingen door een continue lipide bilayer te vormen op patroonarrays van nanobaren met een vooraf gedefinieerde membraankromming en lokale vlakke controle. Zowel de lipidefluïditeit als de eiwitgevoeligheid voor gebogen membranen kunnen kwantitatief worden gekarakteriseerd met behulp van fluorescentiemicroscopiebeeldvorming. Hier wordt een gedetailleerde procedure geïntroduceerd voor het vormen van een SLB op gefabriceerde glazen oppervlakken met nanobar arrays en de karakterisering van krommingsgevoelige eiwitten op dergelijke SLB. Daarnaast komen protocollen voor hergebruik van nanochips en beeldverwerking aan bod. Naast de nanobar-SLB is dit protocol gemakkelijk toepasbaar op alle soorten nanogestructureerde glaschips voor krommingsdetectiestudies.
Introduction
Membraankromming is een kritische fysieke parameter van een cel die voorkomt in een verscheidenheid aan cellulaire processen zoals morfogenese, celdeling en celmigratie1. Het wordt nu algemeen erkend dat membraankromming verder gaat dan een eenvoudig resultaat van cellulaire gebeurtenissen; in plaats daarvan is het naar voren gekomen als een effectieve regulator van eiwitinteracties en intracellulaire signalering. Verschillende eiwitten die betrokken zijn bij clathrin-gemedieerde endocytose bleken bijvoorbeeld bij voorkeur te binden aan het gebogen membraan, wat resulteerde in de vorming van een hotspot voor endocytose2. Er zijn veel verschillende oorzaken van membraanvervorming, zoals membraantrekking door de cytoskeletale krachten, de aanwezigheid van lipide-asymmetrie met hoofdgroepen van verschillende grootte, het bestaan van transmembraaneiwitten met conische vorm, de accumulatie van membraanvormende eiwitten zoals BAR-domeineiwitten (genoemd naar Bin-, amfifysine- en Rvs-eiwitten) en het inbrengen van amfipathische helicesdomein in het membraan1 . Interessant is dat deze eiwitten en lipiden niet alleen het membraan vervormen, maar ook de membraankromming kunnen voelen en preferentiële accumulatie vertonen1. Daarom is het cruciaal om te bestuderen of en hoe membranen met verschillende krommingen de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden die eraan vastzitten en de mogelijke effecten op de gerelateerde intracellulaire processen veranderen.
Er zijn veel technieken ontwikkeld om de interactie tussen gebogen membraan en eiwitten in zowel levende cel- als in vitrosystemen te analyseren. Het levende celsysteem biedt een echte celomgeving met een rijke lipidendiversiteit en dynamische eiwitsignaleringsregulatie 2,3,4,5,6,7. Een dergelijk geavanceerd systeem is echter moeilijk te bestuderen vanwege de onzekerheden en fluctuaties in de intracellulaire omgeving. Vandaar dat de in vitro assays met behulp van een kunstmatig membraan dat bestaat uit bekende lipidesoorten en gezuiverde eiwitten krachtige reconstitutiesystemen zijn geworden om de relatie tussen eiwitten en gebogen membranen te karakteriseren. Traditioneel worden liposomen van verschillende diameters gegenereerd door extrusie om krommingsgevoelige eiwitten te detecteren via een co-sedimentatietest met centrifugale kracht of een co-flotatietest met een dichtheidsgradiënt om eiwitaggregatie te voorkomen 8,9. De kromming van de geëxtrudeerde liposomen wordt echter beperkt door de beschikbare poriegrootte van het membraanfilter dat in de extruderwordt gebruikt 10. Het is bewezen dat single liposome curvature (SLiC) assay deze beperking overwint, waarbij liposomen met verschillende diameters fluorescentie-gelabeld en geïmmobiliseerd op het oppervlak worden geïmmobiliseerd, zodat de kromming kan worden gemarkeerd door de fluorescerende intensiteit11. Er is echter een sterke variabiliteit in lipidesamenstelling waargenomen bij kleine blaasjes, wat de nauwkeurigheid van de krommingsmeting beïnvloedt12. Tether-pulling experimenten bieden een nauwkeurigere meting van de kromming op de transiënte tether getrokken uit gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) met behulp van een optisch pincet, waarbij de kromming goed kan worden geregeld door degegenereerde membraanspanning 13,14. Deze methode is geschikt om positieve of negatieve krommingsgevoelige eiwitten te bestuderen, maar wordt beperkt door de doorvoer van buisgeneratie10. Ondersteunde membraanbuizen (SMrT) assay biedt gelijktijdige generatie van meerdere membraanbuizen die door microfluïdische stromen uit hetzelfde lipidereservoir worden geëxtrudeerd. Niettemin varieert de membraankromming intrinsiek langs de nanobuis, wat de nauwkeurigheid van op fluorescentie-intensiteit gebaseerde krommingsmeting15,16 in gevaar brengt. Ter vergelijking: het gebruik van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's, diameter <100 nm17) om een ondersteunde lipide bilayer (SLB) te vormen op oppervlakken met ontworpen topografieën genereerde een enkel dubbellaags membraan met krommingen vooraf bepaald door nanofabricage of nanomaterialen met hoge nauwkeurigheid 18,19,20.
Hier presenteren we een protocol voor de vorming van de SLB op gefabriceerde nanochipoppervlakken met nanobar arrays en hoe het kan worden gebruikt om de krommingsgevoeligheid van eiwitten in vitro te onderzoeken. Zoals te zien is in figuur 1, zijn er zes essentiële componenten van de test: A) Reiniging en assemblage van de chip met een microfluïdische kamer; B) Bereiding van SUV's met een gedefinieerde lipidesamenstelling; C) Vorming van de SLB op een nanochip en binding met krommingsgevoelige eiwitten; D) Beeldvorming en karakterisering van de SLB en krommingsgevoelige eiwitten onder fluorescentiemicroscopie; E) Het reinigen van de chip voor hergebruik; F) Beeldverwerking voor kwantitatieve analyse van het detectievermogen van eiwitkrommingen. Het gedetailleerde protocol wordt hieronder stap voor stap beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reiniging van nanochips
- Plaats de nanochip in een bekerglas van 10 ml met de patroonzijde naar boven gericht.
OPMERKING: Deze kwarts nanochip is vervaardigd via elektronenbundellithografie zoals beschreven vóór21. De geometrie en rangschikking van de nanostructuur op de chip kan op maat worden ontworpen. De maten van de gradiënt nanobars die hier worden gebruikt, zijn 2000 nm lang, 600 nm hoog en 100 tot 1000 nm breed (100 nm stappenset). - Voeg voorzichtig 1 ml 98% zwavelzuur toe aan het bekerglas en zorg ervoor dat het zuur de voor- en achterkant van de chip volledig bedekt.
OPMERKING: 98% zwavelzuur is extreem corrosief en kan snelle weefselvernietiging en ernstige chemische brandwonden veroorzaken bij contact met de huid of ogen. Gebruik het in de zuurkast met de juiste bescherming. - Draai het bekerglas langzaam rond en voeg druppel voor druppel 200 μL 30% waterstofperoxide toe totdat het hele bekerglas heet wordt. Zorg ervoor dat zwavelzuur en waterstofperoxide goed worden gemengd om piranha-oplossing te vormen voor het verwijderen van organische moleculen uit de nanochip17. Er zijn alternatieve technieken voor het genereren van de SLB op schone hydrofiele oppervlakken, zoals UV-licht en blootstelling aan ozon zoals eerder beschreven23.
OPMERKING: De reactie is extreem exotherm en kan ervoor zorgen dat de oplossing kookt, dus voeg druppelsgewijs waterstofperoxide toe aan het zwavelzuur en blijf draaien. - Plaats het bekerglas in een secundaire glazen container en houd de nanochip 's nachts ondergedompeld in de piranha-oplossing om de onzuiverheden grondig te reinigen.
OPMERKING: Plaats het bekerglas in de zuurkast zonder deksel voor het geval de reactie gas kan genereren. - Haal het bekerglas eruit en pipetteer de piranha-oplossing voorzichtig in een zure afvalcontainer.
- Laad 5 ml gedeïoniseerd water in het bekerglas om het resterende zuur te verdunnen en weg te gooien in het zure afval. Herhaal deze stap vijf keer en gebruik 5 M NaOH om het zure afval te neutraliseren.
- Pak de chip met een pincet en was met een continue stroom gedeïoniseerd water om restzuur grondig te verwijderen. Föhn de chip met 99,9% stikstofgas voorSLB-vorming 22.
2. Generatie van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's)
- Voeg 100 μL chloroform toe aan een amberkleurige injectieflacon.
OPMERKING: Chloroform is een zeer vluchtige, kleurloze vloeistof en kan giftig zijn als het wordt ingeademd of ingeslikt. Gebruik het in de zuurkast met het masker en de handschoenen op. - Los 500 μg van het lipidenmengsel op in chloroform. De samenstelling van het lipidenmengsel dat hier wordt gebruikt, is 89,5 mol% van de eierfosfatidylcholines (PC), 10 mol% van de hersenen fosfatidylserine (PS) en 0,5 mol% van Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, triethylammoniumzout (Texas Red DHPE).
- Föhn het lipidenmengsel in de injectieflacon met 99,9% stikstofgas totdat de chloroform is vervluchtigd en het lipidenmengsel droog is.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in de zuurkast. Vermijd vloeistofspatten bij het föhnen. - Plaats het lipidenmengsel dat aanwezig is in de amberkleurige injectieflacon zonder het deksel in de met aluminiumfolie bedekte vacuümdesiccator. Droog het monster vervolgens vacuüm met een pomp gedurende 3 uur om de chloroform volledig te vervluchtigen.
- Voeg 250 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer toe aan de injectieflacon. Vortex de oplossing totdat deze homogeen is.
OPMERKING: PBS-buffer bestaat uit 150 mM NaCl, zonder calcium, magnesium en fenolrood; de pH wordt aangepast naar 7,2 voor het maken van de PC en PS lipide bilayer. - Soniceer het lipidenmengsel gedurende 30 minuten met een frequentie van 50 kHz in een badsonicator. Breng vervolgens het lipidenmengsel over in een centrifugebuis van 1,5 ml en sluit af met parafilm.
- Vries het lipidenmengsel gedurende 20 s in vloeibare stikstof in en ontdooi vervolgens bij 42 °C gedurende 2 minuten in een waterbad. Herhaal de vries-dooicycli 30 keer. Daarna ziet het lipidenmengsel eruit als een heldere vloeistof.
LET OP: Vloeibare stikstof heeft een kookpunt van ongeveer −195,8 °C. Het kan bevriezing of cryogene brandwonden veroorzaken. Gebruik het in de onontgonnen ruimte met warmte-isolatiehandschoenen aan. - Spoel twee glazen gasdichte spuiten en de connector van de mini-extruder met respectievelijk ethanol, chloroform en methanol. Herhaal de spoelvolgorde vijf keer om het apparaat voor te reinigen. Laat ze in de zuurkast zitten totdat het organische oplosmiddel volledig is vervluchtigd.
- Monteer het mini-extruderapparaat en laat 500 μL PBS-buffer door de connector lopen om het apparaat voor te bevochtigen en gooi vervolgens de buffer uit een andere spuit. Deze stap verwijdert onzuiverheden en vergemakkelijkt extrusie.
- Monteer het mini-extruderapparaat met een polycarbonaatfiltermembraan ter grootte van 100 nm.
OPMERKING: De poriegrootte van het filtermembraan bepaalt de diameter van liposomen. - Neem 500 μL PBS-buffer met een van de spuiten en duw deze voorzichtig door het filter om de tweede lege spuit aan het andere uiteinde te vullen. Herhaal de extrusie drie keer heen en weer om de lekkage van het apparaat te controleren en gooi de buffer uit de tweede spuit weg.
- Laat het lipidenmengsel door de mini-extruder lopen om de PBS-buffer te vervangen. Extrudeer vervolgens 20 keer heen en weer om SUV's te vormen. Het multilamellaire karakter van de blaasjes kan behouden blijven met onvoldoende extrusietijden, wat de SLB-vorming23 zal beïnvloeden.
- Verzamel de SUV's van de tweede spuit om de verontreiniging met grotere deeltjes te verminderen en breng deze over in een centrifugebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Verwijder de spuit rechtstreeks uit de connector voor het geval de spuit afbreekt. - Wikkel de buis met aluminiumfolie om bleken van fluorescerende gelabelde lipiden te voorkomen en bewaar ze bij 4 °C. Meestal kunnen de SUV's maximaal 7 dagen worden bewaard.
3. Vorming van de SLB op een nanochip
- Haal de gereinigde nanochip voorzichtig uit gedeïoniseerd water met een pincet en föhn met 99,9% stikstofgas.
- Voer oppervlaktereiniging van de nanochip uit met luchtplasmabehandeling gedurende 1 uur.
- Monteer de nanochip in een polydimethylsiloxaan (PDMS) kamer, die bestaat uit twee stukken PDMS-een middelste PDMS en een bovenste PDMS (figuur 1A). Het middelste PDMS is dun (~ 0,5 mm) met een grote ovaalvormige opening in het midden om voldoende blootstelling aan het nanobarpatroon te garanderen. De bovenste PDMS is dik (~ 4,0 mm) met twee kleine gaten in de grote ovale opening als inlaat en een uitlaat voor vloeistofbehandeling.
- Plaats de chip op een schoon oppervlak met het patroon naar boven gericht.
- Bedek het middelste PDMS voorzichtig met de chip en zorg ervoor dat het hele patroon wordt blootgesteld aan het centrale deel van de grote ovaalvormige opening in het middelste PDMS.
- Bedek het bovenste PDMS met het middelste PDMS en houd de twee kleine gaten binnen het gebied van het grote ovale gat van het middelste PDMS. Vervolgens wordt de PDMS-kamer geassembleerd.
OPMERKING: PDMS is het meest gebruikte organische polymeer op basis van silicium. Het is biocompatibel, transparant en vervormbaar om te worden ontworpen als een aangepaste vorm voor chipassemblage en beeldvorming onder de microscoop. Wat nog belangrijker is, het kan na plasmabehandeling covalent op een andere PDMS-laag of glas worden geplakt, waardoor het geschikt is als kamer om de SLB te bereiden. Deze stap zorgt ervoor dat elke laag PDMS goed is gemonteerd om openingen en lekkage te voorkomen.
- Laad de SUV's in de PDMS-kamer vanuit een van de twee kleine gaatjes in het bovenste PDMS met een pipet en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de SLB te vormen.
- Pipetteer de PBS-buffer voorzichtig in de PDMS-kamer vanaf de ene kant van het kleine gat en verwijder het afval met een wattenstaafje uit het andere gat om de ongebonden SUV's weg te spoelen. Verkrijg vervolgens de SLB gevormd op de nanochip (de kwaliteit van de SLB wordt getest door fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) zoals weergegeven in stap 4.4 en besproken in de sectie met representatieve resultaten).
OPMERKING: Bij het pipetteren van de PBS-buffer in de kamer moet de pipetpunt vol zijn van de buffer en in contact komen met het vloeistofoppervlak om te voorkomen dat er bubbels worden geïnjecteerd.
4. Beeldvorming van de SLB en het krommingsgevoelige eiwit dat op de nanochip bindt
OPMERKING: Dit gedeelte is afhankelijk van het microscoopsysteem dat beschikbaar is voor het experiment. Hier zal een algemene richtlijn worden beschreven over hoe de beeldvorming moet worden uitgevoerd. De gedetailleerde instellingen kunnen worden gewijzigd tussen de verschillende microscoopopstellingen.
- Stel de laserscan confocale microscopie in met behulp van een 100x (N.A.1.4) olieobjectief. Open de ZEN-software om het excitatielaservermogen te selecteren dat de fluorescentie van het lipide en eiwit kan prikkelen. Kies acquisitiemodus > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
- Pas de scherpstelling aan met de focusknop om de nanobalken op de chip te lokaliseren totdat de randen van de nanobalk scherp zijn onder het lipidekanaal.
- Stel de scanparameters in zoals hieronder om een controleafbeelding van het lipidenkanaal te verkrijgen voordat u eiwit toevoegt: Framegrootte = 512 px x 512 px (512 pixels x 512 pixels, een pixelgrootte van 124 nm), Bits per Pixel = 16 (16-bits diepte), Scansnelheid = 5 en Gemiddeld = 4 (gemiddelde modus van vier keer /lijn).
- Voer de FRAP-test uit door de fluorescerend gelabelde lipide-bilaag op een willekeurig enkel nanobargebied te bleken.
- Schakel de selectievakjes Experimentgebieden en Bleken in. Teken een cirkelvormig gebied met een diameter van 5 μm dat de hele nanobalk in het midden kan omvatten (nanobalkgrootte is 2 μm) en voeg toe aan de experimentgebieden. Voer time-lapse imagingparameters in als volgt voorbeeld: kies Scansnelheid = 9 en Gemiddeld = 1. Kies Tijdreeks > Duur = 100 cycli en Interval = 2 s. Voer bleekparameters in als volgt: schakel het selectievakje Starten na # afbeeldingen in en kies drie afbeeldingen.
- Schakel de laser selectievakjes in die FRAP uitvoeren en wijzig het vermogen in 100,0%. Klik op Experiment starten voor het FRAP-experiment.
OPMERKING: FRAP is een veelgebruikte methode om de mobiliteit van cellulaire moleculen te karakteriseren. Als de SLB een goede vloeibaarheid heeft, zal de fluorescentie in het gebleekte gebied geleidelijk herstellen als gebleekte fluoroforen diffunderen en ongebleekte fluoroforen uit andere gebieden diffunderen.
- Laad de eiwitoplossing in de PDMS-kamer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de binding van het eiwit op de SLB mogelijk te maken.
OPMERKING: De eiwitten die in figuur 2G,H worden gebruikt om de lipidesamenstelling aan te tonen, vergemakkelijken de eiwitbinding op nanobar-gekromde SLBs zijn 74 μM GFP en 79 μM GFP-His. Deze twee eiwitten zijn groene fluorescentie-eiwitten zonder of met His-tag. De eiwitten die worden gebruikt voor krommingsdetectie in figuur 4 en figuur 5 zijn 16 μM F-BAR, 16 μM IDRFBP17 en 16 μM FBAR+IDRFBP17. Deze drie eiwitten zijn de domeinen van FBP17, een typisch BAR-eiwit dat intuïtief wordt aangenomen als zowel krommingsgeneratoren als sensoren. Elk eiwitvolume is 20 μL. - Focus de nanobaren opnieuw en herhaal stap 4.3 om beelden te maken van zowel lipide- als eiwitkanalen voor detectie van eiwitkrommingsdetectie.
- Herhaal stap 4.4 om de FRAP-test uit te voeren op zowel lipide- als eiwitkanalen en time-lapse-beeldvorming uit te voeren om de mobiliteit van krommingsgevoelige eiwitten te karakteriseren.
5. Hergebruik van nanochip
- Pak de nanochip met een pincet en maak hem voorzichtig los van de PDMS-kamer in een bekerglas van 50 ml gevuld met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Voorkom dat het pincet de nanostructuur raakt en dwing de chip niet om te scheiden om scheuren te voorkomen. - Was de nanochip grondig met watervrije ethanol om organische resten op het oppervlak te verwijderen.
OPMERKING: Gebruik schoon tissuepapier om water op het oppervlak te verwijderen voordat u het wast met watervrije ethanol.
LET OP: Watervrije ethanol is een zeer vluchtige en licht gevaarlijke chemische stof. Vermijd contact met de huid en ogen. Gebruik het in de zuurkast met het masker en de handschoenen op. - Was de chip grondig met veel gedeïoniseerd water om resterende ethanol te verwijderen. Föhn de chip vervolgens met 99,9% stikstofgas.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle sporen van ethanol op de chip te verwijderen voordat u doorgaat naar de volgende stap, omdat het piranhazuur gewelddadig kan reageren met organisch oplosmiddel en explosies kan veroorzaken. - Plaats de chip in een schoon bekerglas van 10 ml met de patroonzijde naar boven gericht en reinig de chip met piranha-oplossing voor hergebruik, die dezelfde stappen volgt als 'reiniging van nanochip'.
6. Beeldkwantificering
- Roteer de beelden die door een microscoop zijn verkregen, zodat de nanobar-array zich in een verticale positie bevindt voor latere analyse in Fiji-software.
- Gebruik een op maat geschreven MATLAB-code 'c_pillarmask_averaging' om de individuele nanobalk te lokaliseren door een vierkant masker (51 pixels x 51 pixels) zowel in het lipidekanaal als in het eiwitkanaal.
OPMERKING: Deze MATLAB-code is speciaal ontworpen voor de nanochip. Het kan worden verkregen op GitHub via de link: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - Trek de achtergrondsignalen van elke afbeelding af met de drie ROI's (5 pixels x 5 pixels) op de hoeken van de afbeelding door de meshgrid-functie in MATLAB-code 'BarGra_avg'. Deze bewerking is gericht op het corrigeren van mogelijke ongelijke achtergrondgeluiden veroorzaakt door de microscoopopstelling of chipnivellering op het microscoopstadium.
- Genereer de gemiddelde afbeeldingen van de nanobars van dezelfde grootte met behulp van MATLAB-code 'BarGra_avg', waarbij elk punt het gemiddelde is van de waarden op dat punt in alle individuele vierkante nanobarmaskers. Genereer 3D-oppervlakteplots van de gemiddelde afbeeldingen in Fiji-software om de gemiddelde signaalverdeling rond de nanobaren intuïtief weer te geven. Kies > oppervlaktediagram analyseren > invoer 100 voor polygoonvermenigvuldiging en selecteer de selectievakjes Schaduw, Tekenas en Vloeiend.
- Segmenteer elke nanobar in drie gebieden, waaronder twee nanobar-end gebieden en een nanobar-center gebied om hun fluorescentie-intensiteiten respectievelijk te extraheren met MATLAB-code 'avg_nanobar_quantification'. De afmetingen van de nanobar ROIs worden aangepast aan de afmetingen van de nanobars met behulp van het 'positie'-bestand.
- Deel de eiwitintensiteiten door lipide-intensiteiten geëxtraheerd uit de MATLAB-code 'avg_nanobar_quantification' aan het uiteinde van de bar om de nanobar-enddichtheid te krijgen die het oppervlakte-effect uitsluit.
- Plot de nanobar-end dichtheid met verschillende concentraties in GraphPad Prism om de bindingscurve te krijgen. Open het menu Analyseren . Kies Niet-lineaire regressie (curve fit) > Binding - Saturation > Specifieke binding met Hill slope-functie om de curve aan te passen aan de Hill-vergelijking en bereken vervolgens de KD- en Hill-coëfficiëntwaarde.
- De lipide- en eiwitintensiteiten worden genormaliseerd tot hun overeenkomstige intensiteiten in het 600 nm nanobarencentrum dat in hetzelfde beeld is verkregen met behulp van de MATLAB-code 'avg_nanobar_quantification'.
- Gebruik de helderste negen pixels van genormaliseerde eiwitintensiteiten op het nanobar-end gebied gedeeld door het bar-center gebied om de eiwitkromming te kwantificeren met nanobaren van dezelfde grootte, de waarde wordt genoemd als "end-to-center ratio". Gebruik de verhouding van genormaliseerde eiwitintensiteit om de lipidenintensiteit te normaliseren om het eiwitkrommingsdetectiebereik te kwantificeren met nanobaren van verschillende grootte, de waarde wordt "Genormaliseerde nanobar-einddichtheid" genoemd. Deze waarden worden berekend met de MATLAB-code 'avg_nanobar_quantification'.
- Laad de FRAP-stackafbeelding in Fiji-software. Kies het FRAP-gebied en genereer een ROI. Kies de functie Meer > Multi meten om de intensiteit van het FRAP-gebied voor elke keer te meten. Plot de intensiteit in GraphPad Prism om de FRAP-herstelcurve te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nanobar-ontwerp wordt aanbevolen voor het onderzoeken van positieve krommingsgevoelige eiwitten, die aan elk uiteinde een halve cirkel bevatten met kromming gedefinieerd door de nanobarbreedte en één vlakke / nulkrommingsregeling lokaal in het midden (figuur 2A, B). Succesvolle vorming van de SLB op nanobars resulteert in gelijkmatig verdeelde lipidemarkersignalen over het gehele nanobaroppervlak, zoals weergegeven in figuur 2C. Signalen van meerdere nanobaren kunnen worden gecombineerd door het gemiddelde van de individuele nanobarbeelden (figuur 2D), zodat willekeurige variaties tussen verschillende nanobaren kunnen worden geminimaliseerd. Een eerdere elektronenmicroscopiestudie toonde aan dat het celplasmamembraan een conformale coating vormde rond de gehele nanostructuren24. Daarom wordt aangenomen dat de synthetische lipide bilayer zich ook stevig hecht aan het nanostructuuroppervlak, wat diffractie-beperkte lijnen geeft op de 200 nm nanobar zoals waargenomen in figuur 4E. Bovendien kan de membraanfluïditeit op de nanobar-gebogen SLB ook worden gekarakteriseerd door FRAP-assay, waarbij het fluorescerende signaal op een enkele nanobar individueel kan worden gebleekt voor membraanfluïditeitskarakterisering (figuur 2E, F).
De vorming van de SLB op nanobars vereist de generatie VAN SUV's op dezelfde manier als de SLB-formatie op vlakke oppervlakken zoals eerder gemeld17. De lipidesamenstelling van SUV's bepaalt de oppervlaktechemie van de nanobar-gebogen SLB die kan worden gewijzigd voor membraanetikettering en verschillende eiwitbindingsmechanismen. Texas Red DHPE kan bijvoorbeeld worden toegevoegd in ~ 0,5 mol% in SUV's, zodat de verrijking van het membraanoppervlak op nanobaren gemakkelijk kan worden afgebeeld door fluorescentiemicroscopie (figuur 2C). Naast visualisatie kan de lipidesamenstelling ook worden gewijzigd om eiwitbinding op nanobar-gebogen SWB's te vergemakkelijken. Om bijvoorbeeld de verankering van His-tagged eiwitten te vergemakkelijken, kan nikkel-nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) naar de SLB op de nanobaren worden gebracht door 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) imodiacetisch zuur) succinyl] (nikkelzout) (18:1 DGS-NTA(Ni)) in SUV's (~1 mol%)25 te verwerken. Zonder deze functionele groep op lipiden kan groen fluorescentie-eiwit (GFP) niet binden aan de SLB met negatief geladen PS, wat resulteert in een donkerder staafvormig gat op elke nanobarlocatie als gevolg van volumetrische uitputting van GFP-signalen in de oplossing (figuur 2G). Ter vergelijking: door 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) in de SLB toe te voegen, kan de His-tag gelabelde GFP sterk verankeren op het membraan om duidelijk de SLB-vorm te volgen die door nanobaren is gebogen (figuur 2H). De lipidediffusie vertoonde geen detecteerbaar verschil bij eiwitbinding zoals onderzocht door FRAP-assay (aanvullende figuur 1). Het is vermeldenswaard dat de FRAP-meting alleen is gebaseerd op de intensiteit van de 0,5 mol% Texas Red DHPE in de SLB, die mogelijk niet de 1 mol% DGS-NTA (Ni) vertegenwoordigt die wordt gebruikt voor de binding van het His-tag-eiwit. Bovendien kunnen geladen lipiden zoals PS de eiwitbinding verbeteren door elektrostatische interactie26, terwijl signaallipiden zoals fosfatidylinositol (4,5) -bisfosfaat (PIP2) ook in SUV's kunnen worden geïntegreerd om specifieke eiwitbinding te vergemakkelijken (bijv. FCHo2, waarvoor PIP2 essentieel wordt bevonden voor zijn membraankrommingsdetectie27).
De kwaliteit van SLB-vorming in termen van oppervlakte-uniformiteit en membraanfluïditeit is van cruciaal belang voor het onderzoeken van het eiwitkrommingsdetectievermogen op nanobaren. Er zijn drie typische problemen die de uniformiteit en vloeibaarheid van SLB in gevaar kunnen brengen. Een daarvan is de binding van overtollige SUV's op de SLB als gevolg van inefficiënt wassen dat puncta genereert, zowel op de nanobaren als op het platte membraan tussen de nanobaren (figuur 3A, B). Het heeft een aanzienlijke invloed op de kwantificering van eiwitbinding op gebogen of vlakke oppervlakken op nanobaren voor krommingsdetectiebeoordeling. Een ander probleem is de onverwachte introductie van luchtbellen in de PDMS-kamer tijdens de wasstap, die de SLB langs het traject van de lucht-vloeistofinterface kunnen vernietigen en krasachtige kenmerken gemakkelijk identificeerbaar maken met extreem lage lipidesignalen op het nanobaroppervlak (figuur 3C, D). Bovendien laten onjuist gereinigde nanobarsubstraten willekeurig verdeelde chemische residuen achter op het oppervlak die lipideadsorptie voor SLB-vorming voorkomen. Het leidt tot het genereren van membraandefecten die al dan niet boven de optische resolutie voor microscopievisualisatie liggen (figuur 3E). De membraanfluïditeit zal echter gevoelig worden beïnvloed door membraandefectvorming28 , zodat FRAP-assay kan worden gebruikt om de oppervlaktezuiverheid te verifiëren (figuur 3F, G).
Om de karakterisering van krommingsgevoelige eiwitten met behulp van nanobar array aan te tonen, wordt het typische F-BAR-domein vergeleken met een recent geïdentificeerd intrinsiek ongeordend gebied in FBP17 (IDRFBP17). F-BAR is fluorescerend gelabeld met Alexa Fluor 488 tetrafluorfylesterkleurstoffen, terwijl IDRFBP17 is gelabeld met Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Zoals te zien is in figuur 4A, vertonen beide eiwitdomeinen een verhoogde accumulatie op SLB-gecoate individuele nanobaren met een breedte van 300 nm. Hier bevat de SLB 10% PS om de eiwitbinding elektrostatisch te verbeteren. Het krommingsdetectievermogen van het eiwit kan worden geïdentificeerd door de preferentiële verrijking aan de gebogen nanobareinden met een hogere fluorescerende intensiteit dan de signalen in de platte nanobarcentra, die duidelijker wordt weergegeven na een beeld van gemiddeld meer dan 100 nanobars (figuur 4B). Het detectievermogen van de kromming kan kwantitatief worden weerspiegeld door de end-to-center-verhouding op elke nanobar te berekenen (d.w.z. de fluorescentie-intensiteit aan het nanobar-uiteinde versus het nanobar-centrum). Zoals te zien is in figuur 4C, hebben beide eiwitten een hogere end-to-center ratio dan lipiden, wat ongeveer 1 is. Bij het vergelijken van de IDRFBP17 en F-BAR, kan worden gezien dat de hogere end-to-center ratio van IDRFBP17 (1,385 ± 0,011, gemiddelde ± SEM) duidt op een sterkere krommingsdetectie dan F-BAR (1,144 ± 0,004, gemiddelde ± SEM).
Om het bereik van krommingen te onderzoeken dat door de eiwitten kan worden waargenomen, wordt de SLB gegenereerd op nanobar arrays met gradiëntbreedtes van 200 nm tot 600 nm (figuur 4D) waar lipiden een homogene coating vertoonden op nanobaren van verschillende grootte (figuur 4E). Drie eiwitten (IDRFBP17, F-BAR en F-BAR + IDRFBP17) zijn geïncubeerd op de gradiënt nanobar array, en ze vertoonden allemaal preferentiële accumulatie op de nanobar-end gebogen membraanlocaties wanneer de kromming afnam tot onder 400 nm in diameter (figuur 4E, F). Van deze drie eiwitdomeinen geeft IDRFBP17 de hoogste nanobar-end dichtheid, wat wijst op het sterkste krommingsdetectievermogen, terwijl F-BAR de laagste waarde toont (figuur 4F). Bovendien kan de bindingscurve van het krommingsgevoelige eiwit ook worden uitgezet door de eiwitconcentratie geleidelijk te verhogen (figuur 4G), waaruit blijkt dat IDRFBP17 een sterk coöperatief krommingsdetectievermogen heeft. Bij het aanpassen van de bindingscurven aan de Hill-vergelijking, wordt de KD gevonden in het μM-bereik (0,6 ± 0,1 μM) en de Hill-coëfficiënt (H) ligt tussen 2 en 3, wat een ultragevoelige binding van IDRFBP17 aan nanobar-geïnduceerde membraankrommingen suggereert. Hoe scherper de kromming, hoe hoger het bindingsvermogen bij evenwicht.
De dynamische membraandiffusie en membraanassociatie van krommingsgevoelige eiwitten rond de nanobarvormige SLB-locaties kan ook door FRAP worden bestudeerd. Vergeleken met het snelle herstel van lipidesignalen op nanobaren (figuur 5A, E), kon de F-BAR niet binnen 2 minuten herstellen (figuur 5B, E), wat wijst op een significant verminderde membraanmobiliteit en associatiedynamiek op de gebogen membraanlocaties. Verrassend genoeg vertoonde het IDRFBP17-signaal , anders dan het gedrag van F-BAR, duidelijk herstel binnen hetzelfde tijdsbestek (figuur 5C, E), wat de dynamische aard van IDRFBP17 aangeeft die zich ophoopte bij de gebogen membranen. Na het wegspoelen van de ongebonden IDRFBP17 in de oplossing, kon hetzelfde herstel in het IDRFBP17-kanaal echter niet worden waargenomen als voorheen (figuur 5D, E). Het geeft aan dat het herstel wordt gedomineerd door de uitwisseling met de oplossingsbevattende IDRFBP17-moleculen en minder door laterale diffusie van de membraangebonden moleculen.
Over het algemeen tonen deze resultaten aan dat dit nanobar-SLB-systeem een krachtig hulpmiddel is om membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro te karakteriseren.
Figuur 1: Illustratie van het nanobar-SLB-systeem. (A) De PDMS-kamer bestaat uit de bovenste en middelste lagen met daarop de gereinigde nanochip gemonteerd. (B) De Texas Red DHPE labelde SUV's met ingezoomde details. (C) Het intacte model van het nanobar-SLB-systeem en het inzoomgebied illustreren dat de SLB zich vormt op nanobaren met een uniforme enkele laag van de lipide bilayer. (D) Beeldvormings- en karakteriseringsproces onder laserscanning confocale microscopie. (E) Reinigen van de nanochip voor verder hergebruik. (F) Beeldvormingsverwerking voor eiwitkrommingsdetectie kwantificering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De vorming van de gebogen SLB op nanobaren met eiwitbinding. (A) SEM-beeld van een individuele nanobar. (B) Schematische weergave van het nanobar-SLB-systeem. (C) Fluorescerende beelden van de SLB gelabeld met Texas Red DHPE op de nanochip. (D) Gemiddelde afbeelding van SLB-verdeling op nanobaren (boven) en een 3D-oppervlakteplot van het gemiddelde beeld (onder). Deze figuur is overgenomen uit Su et al.22 en met toestemming gereproduceerd. (E) Time-lapse beeldvorming van de SLB FRAP op de nanobar. Het bleekgebied wordt aangegeven door een geel onderbroken cirkel. (F) Genormaliseerde nanobar intensiteit plot door FRAP-meting. (G) Schematische weergave van GFP kan niet binden aan de SLB met 10 mol% negatief geladen PS (links) en een overeenkomstige representatieve afbeelding aan de rechterkant. (H) Schematische weergave van His-tag gelabeld GFP gebonden aan de SLB met 1 mol% DGS-NTA (Ni) (links) en een overeenkomstige representatieve afbeelding aan de rechterkant. Schaalbalken: 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Typische problemen die de SLB-kwaliteit in gevaar brengen. (A) Schematische SLB-voorbereiding zonder efficiënt wassen. (B) Representatief beeld van de SLB-binding met overtollige SUV's. De gele pijlen tonen de puncta die overtollige SUV's op het SLB-oppervlak zijn. (C) Schematische samenstelling van het SLB-preparaat met geïnjecteerde luchtbellen. (D) Representatief beeld van SLB vernietigd door de baan van de lucht-vloeistof interface. De gele pijl toont de onvolledige SLB op het substraat. (E) Schematische samenstelling van SLB-preparaat met ongereinigde nanobarsubstraten. Het zoom-in gebied toont een discontinue lipide bilayer omdat de oppervlakteresten lipide adsorptie voorkomen. (F) Time-lapse beeldvorming van SLB FRAP-analyse op ongereinigde nanobarsubstraten. Het bleekgebied wordt aangegeven door een geel onderbroken cirkel. (G) Genormaliseerde nanobar intensiteit plot door FRAP-meting. Schaalbalken: 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van eiwitkrommingsdetectie door het nanobar-SLB-systeem. (A) Fluorescerende beelden van F-BAR (links) en IDRFBP17 (rechts) hopen zich op op SLB-gecoate nanobaren (10% PS en 90% PC). Schaalbalk: 2 μm. (B) Gemiddelde beelden van F-BAR (linksboven) en IDRFBP17 (linksonder) hopen zich op op nanobaren en bijbehorende 3D-oppervlakteplots (respectievelijk rechtsboven en rechtsonder). Schaalbalk: 2 μm. (C) End-to-center ratio van de lipide bilayer, F-BAR en IDRFBP17 fluorescentie-intensiteit rond de nanobar met een breedte van 300 nm. Een Welch's t-test werd uitgevoerd voor statistische analyse. p < 0,0001. (n = 3) (D) SEM-afbeelding van gradiënt nanobar arrays met breedtes van 200 nm tot 600 nm. Schaalbalk: 5 μm. (E) Annotatie van eiwitconstruct (boven), gemiddelde afbeeldingen van lipide bilayer, IDRFBP17, F-BAR en F-BAR + IDRFBP17-verdeling op gradiënt nanobaren met breedte variërend van 200 nm tot 600 nm (midden) en intensiteitsprofielen langs de nanobars van elke gemiddelde afbeelding (onder). Schaalbalk: 2 μm. (F) IDRFBP17, F-BAR en F-BAR + IDRFBP17 genormaliseerde nanobar-einddichtheid gekwantificeerd met respectievelijk verschillende breedtes van nanobaren. Elke gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (n ≥ 60). (G) De bindingscurve van IDRFBP17 is uitgerust met de Hill-vergelijking. Elke gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (n = 3). Deze figuur is overgenomen uit Su et al.22 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De membraanbindende dynamiek van krommingsgevoelige eiwitten rond de nanobar. (A-D) Time-lapse beeldvorming van de lipide bilayer (A), F-BAR (B), IDRFBP17 (C) en IDRFBP17 washed out (D) FRAP-analyse op de nanobar. Het bleekgebied wordt aangegeven door een rode stippelcirkel. Schaalbalk: 5 μm. (E) Genormaliseerde nanobar intensiteit plot door FRAP-meting. Deze figuur is overgenomen uit Su et al.22 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Membraandiffusie voor en na toevoeging van eiwit. (A) Time-lapse beeldvorming van FRAP-test op de POPC lipide bilayer met 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) en 0,5 mol% Texas Red DHPE rond de nanobar voor (boven) en na (onder) toevoeging van GFP-His eiwit. Het bleekgebied wordt aangegeven door een geel onderbroken cirkel. (B) Genormaliseerde nanobar intensiteit plot door FRAP-meting. Schaalbalken: 2 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven nanobar-SLB-systeem biedt een unieke combinatie van de voordelen in verschillende bestaande in vitro assays. Het onthult efficiënt de preferentiële binding van eiwitten aan sterk gebogen membranen als de liposoom floatatie- of sedimentatietest, maar vereist veel minder monsters en biedt nauwkeuriger gedefinieerde kromming op individuele nanobaren 8,29. Het biedt ook een breed scala aan nauwkeurig gecontroleerde krommingen voor gelijktijdige vergelijking als de SLiC-test, met minder zorg over veranderingen in de lipidesamenstelling in verschillende krommingen en niet-detecteerbare morfologische of krommingsveranderingen met maten onder de diffractielimiet van licht, omdat de SLB mobiel is en continu alle maten nanobars strak30 dekt . Nanobar-SLB maakt ook observatie mogelijk van dynamisch gedrag van eiwit op het gebogen membraan als de tether-pulling assays, maar niet beperkt door de doorvoer van buisgeneratie en ervaring in optische vangmanipulatie13. Hoewel de SMrT-test membraanbuizen genereert met een hoge doorvoer, varieert de membraankromming langs de nanobuis, waardoor het moeilijker wordt om de krommingsgevoeligheid van eiwitten te bestuderen16. Interessanter is dat, in vergelijking met andere op SLB gebaseerde systemen op het patroonsubstraat 18,19,20,27, de nanobar-SLB een plat staafcentrum biedt naast de gedefinieerde kromming aan het staafeinde, dat effectief dient als lokale controle van nulkromming om de impact van variaties in de oppervlaktedichtheid op kwantitatieve analyse te minimaliseren. De mogelijkheid om krommingscombinaties aan te passen met behulp van hoge resolutie elektronen-bundellithografie kan niet alleen lokale nulkrommingscontroles genereren, maar ook positieve en negatieve krommingen zoals eerder aangetoond in live celstudies2.
Er zijn potentiële beperkingen die het vermelden waard zijn bij het gebruik van deze methode. Ten eerste is nanofabricage op de chip een relatief complexe procedure, waarbij cleanroomfaciliteiten en gespecialiseerde apparatuur nodig zijn (met name een E-beam writer). Deze hoge kosten hebben ertoe geleid dat we de chip hebben hergebruikt; dit resulteert in een langere tijd besteed aan het reinigen van het chipoppervlak en het assembleren van de chip met PDMS in vergelijking met eenmalig gebruik. De beschikbaarheid van de nanochip is een ander type beperking. Onjuiste bediening bij gebruik van de chip, zoals het naar het oppervlak naar de bank gericht, kan nanostructuurverloop veroorzaken, vooral voor de structuren met een hoge beeldverhouding. Bovendien is de lipide bilayer gevormd op het substraat een continu membraan; de spanning kan zich gemakkelijk overal voortplanten. Voor studies die manipulatie van de membraanspanning vereisen, bieden technieken zoals tether die uit GUVs wordt getrokken via het aangesloten micropipettesysteem handigere oplossingen10.
Om optimale resultaten te verkrijgen, zijn de volgende stappen ook van cruciaal belang. i) De grootte van de blaasjes is van cruciaal belang voor SLB-vorming31,32. Eerdere literatuur toont een hogere neiging tot fuseren voor kleinere blaasjes (< 90 nm) in vergelijking met een groter formaat met behulp van een kwartskristalmicrobalans met dissipatie (QCM-D) test32. Dus, in vergelijking met LUVs van 300 nm, zullen de diameters van ~ 50 nm gemakkelijker zijn voor SLB-vorming. Gezien dit probleem zijn minstens 20 keer in zowel vries-dooi- als extrusiestappen nodig om homogene SUV's voor SLB-vorming te vormen. FRAP-test is ook nodig in elk experiment om de membraanmobiliteit te valideren. (ii) Tijdens de suv-voorbereiding moet alle apparatuur schoon worden gehouden om verontreiniging van stofachtige kleine deeltjes te voorkomen. Vooral voor de mini-extruder zijn de naalden gemakkelijk verstopt in een vuile omgeving. (iii) Om SUV's van goede kwaliteit te bereiden, moet de chloroform in het lipidenmengsel volledig worden verwijderd om te voorkomen dat lipideblaasjes worden vernietigd. (iv) Plasmareiniging van de chip moet vers worden uitgevoerd vóór de vorming van SLB om een zeer hydrofiel oppervlak te garanderen voor efficiënte SUV-breuk om een continue dubbellaag te vormen. Langdurige blootstelling in het milieu na plasmabehandeling kan leiden tot niet-specifieke binding van stofdeeltjes of organische residuen aan het chipoppervlak, waardoor de hydrofielheid van het oppervlak in gevaar komt. (v) Om de PDMS-kamer voor SLB-vorming en eiwitincubatie samen te stellen, zijn de reinheid en vlakheid van elk PDMS-stuk belangrijk om een goede afdichting van het vloeistofkanaal te garanderen. Elke lekkage van de kamer kan ertoe leiden dat de SLB uitdroogt of de eiwitconcentratie verandert. vi) Aanpassing van de beeldfocus is van cruciaal belang om een consistente intensiteitsmeting te garanderen, aangezien de hoogte van de nanobar (600 nm) vergelijkbaar is met de scherptediepte van de laserscanconfiscerende confocale microscopie in de z-as33. De focus moet opnieuw worden aangepast telkens wanneer de array horizontaal beweegt om de scherpte van de nanobalkranden in de afbeeldingen te behouden.
Bovenal biedt het hier geïntroduceerde nanobar-SLB-systeem een krachtige methode om de membraankrommingsgevoelige eiwitten te bestuderen. Verschillende parameters die de eiwitinteractie met het gekromde membraan beïnvloeden, kunnen kwantitatief worden bestudeerd over een reeks krommingen, zoals krommingsgevoelige domeinen (bijv. BAR-domein en amfifiele helix) van het eiwit 8,30, lipidesamenstelling (bijv. PS en PIP2) van het membraan27,34, pH, ionische sterkte en temperatuur van de omgeving35,36 , evenals de eiwit-eiwitinteractie voor complexe vorming (bv. CHMP2B en CHMP2A kunnen anders bijdragen aan de ESCRT-III-gekatalyseerde membraanremodelleringsprocessen)37,38. Dynamische studies kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van het nanobar-SLB-systeem om membraanbinding kinetisch11, membraaneiwitdiffusie of assemblage39 te onderzoeken, evenals enzymatische reacties40 of fasescheiding gedragen 13,41,42. Bovendien wordt de kunstmatige lipide bilayer over het algemeen beschouwd als symmetrisch met elke lipide monolaag met dezelfde lipidesamenstelling, die heel anders is dan het levende celmembraan43. Het induceren van een asymmetrie-bilayer om het plasmamembraan beter na te bootsen, kan worden verkregen door het materiaal van het oppervlak, de bufferconditie, de lipidesamenstelling of de temperatuur 44,45,46,47 te veranderen. Het is van grote waarde om te verifiëren of een asymmetrische dubbellaag kan worden gevormd op het nanobar-SLB-systeem om eiwitgedrag op het gebogen membraan te bestuderen, wat verdere studies verdient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben bij dit werk.
Acknowledgments
We bedanken Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) en het Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) aan de Nanyang Technological University (NTU) voor het ondersteunen van nanostructuurfabricage en SEM-beeldvorming, het Protein Production Platform (PPP) aan de School of Biological Sciences NTU voor eiwitzuivering en de School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de confocale microscoop. Dit werk wordt gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs van Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 en MOE-T2EP30220-0009), het Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), ondersteund door MOE-financiering in het kader van het Research Centres of Excellence-programma (W. Zhao), de Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), de NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de onderzoeksbeurs (X. Miao) en China Scholarship Council voor de onderzoeksbeurs (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
