Summary
Her er et nanobar-støttet lipid dobbeltlagssystem utviklet for å gi en syntetisk membran med en definert krumning som muliggjør karakterisering av proteiner med krumningsfølerevne in vitro.
Abstract
Membrankrumning spiller viktige roller i ulike essensielle prosesser av celler, for eksempel cellemigrasjon, celledeling og vesikkelhandel. Det genereres ikke bare passivt av cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraksjoner og er involvert i mange intracellulære signaleringer. Dermed er det av stor verdi å undersøke rollen som membrankrumning i regulering av fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider. Nylig har mange teknikker blitt utviklet for å studere forholdet mellom den buede membranen og protein in vitro. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker tilbyr det nyutviklede nanobar-støttede lipid-dobbeltlaget (SLB) både høy gjennomstrømning og bedre nøyaktighet i membrankrumningsgenerering ved å danne et kontinuerlig lipid-dobbeltlag på mønstrede arrays av nanobarer med en forhåndsdefinert membrankrumning og lokal flat kontroll. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheten for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjelp av fluorescensmikroskopiavbildning. Her introduseres en detaljert prosedyre for hvordan man danner en SLB på fabrikkerte glassflater som inneholder nanobararrayer og karakterisering av krumningsfølsomme proteiner på slike SLB. I tillegg dekkes protokoller for gjenbruk av nanobrikker og bildebehandling. Utover nanobar-SLB, er denne protokollen lett anvendelig for alle typer nanostrukturerte glassbrikker for krumningssensorstudier.
Introduction
Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle som forekommer i en rekke cellulære prosesser som morfogenese, celledeling og cellemigrasjon1. Det er allment anerkjent nå at membrankrumning er utenfor et enkelt resultat av cellulære hendelser; I stedet har det dukket opp som en effektiv regulator av proteininteraksjoner og intracellulær signalering. For eksempel ble flere proteiner involvert i clathrin-mediert endocytose funnet å fortrinnsvis binde seg til den buede membranen, noe som resulterte i dannelsen av et hotspot for endocytose2. Det er mange forskjellige årsaker til membrandeformasjon som membrantrekking av cytoskeletale krefter, tilstedeværelsen av lipidasymmetri med forskjellige størrelseshodegrupper, eksistensen av transmembranproteiner med konisk form, akkumulering av membranformende proteiner som BAR-domeneproteiner (oppkalt etter Bin, amfifysin og Rvs-proteiner) og innsetting av amfipatiske helices-domenet i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteinene og lipidene ikke bare membranen, men kan også fornemme membrankrumningen og utvise fortrinnsrettakkumulering 1. Derfor er det avgjørende å studere om og hvordan membraner med forskjellige krumninger endrer fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider festet til dem og de potensielle effektene på de relaterte intracellulære prosessene.
Mange teknikker er utviklet for å analysere samspillet mellom buet membran og proteiner i både levende celler og in vitro-systemer. Det levende cellesystemet gir et ekte cellemiljø med rikt lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et slikt sofistikert system er imidlertid vanskelig å studere på grunn av usikkerhetene og svingningene i det intracellulære miljøet. Derfor har in vitro-analysene ved bruk av en kunstig membran sammensatt av kjente lipidarter og rensede proteiner blitt kraftige rekonstitueringssystemer for å karakterisere forholdet mellom proteiner og buede membraner. Tradisjonelt genereres liposomer med forskjellige diametre ved ekstrudering for å oppdage krumningsfølsomme proteiner via enten en ko-sedimenteringsanalyse ved bruk av sentrifugalkraft eller en samflotasjonsanalyse med en tetthetsgradient for å unngå proteinaggregering 8,9. Krumningen til de ekstruderte liposomene er imidlertid begrenset av den tilgjengelige porestørrelsen til membranfilteret som brukes i ekstruderen10. Enkelt liposomkurvatur (SLiC) -analyse har vist seg å overvinne denne begrensningen, der liposomer med forskjellige diametre er fluorescensmerket og immobilisert på overflaten slik at krumningen kan markeres med fluorescerende intensitet11. Imidlertid er det observert sterk variasjon i lipidsammensetningen i små vesikler, noe som påvirker nøyaktigheten av krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter gir en mer nøyaktig måling av krumningen på den forbigående tether trukket fra gigantiske unilamellar vesikler (GUVs) ved hjelp av en optisk pinsett, hvor krumningen kan styres godt av membranspenningen generert13,14. Denne metoden er egnet til å studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrenset av gjennomstrømningen av rørgenerering10. Støttede membranrør (SMrT) -analyse gir samtidig generering av flere membranrør som ekstruderes fra samme lipidreservoar ved mikrofluidiske strømmer. Likevel varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, noe som kompromitterer nøyaktigheten av fluorescensintensitetsbasert krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererte bruk av små unilamellære vesikler (SUVer, diameter <100 nm17) for å danne et støttet lipid dobbeltlag (SLB) på overflater som inneholder designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forhåndsbestemt av nanofabrikasjon eller nanomaterialer med høy nøyaktighet18,19,20.
Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av SLB på fabrikkerte nanochipflater med nanobararrayer og hvordan den kan brukes til å undersøke krumningsfølsomheten til proteiner in vitro. Som vist i figur 1, er det seks viktige komponenter i analysen: A) Rengjøring og montering av brikken med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling av SUVer med definert lipidsammensetning; C) Dannelse av SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Avbildning og karakterisering av SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengjøring av brikken for gjenbruk; F) Bildebehandling for kvantitativ analyse av proteinkrumningssensorevne. Den detaljerte protokollen er beskrevet trinn for trinn nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengjøring av nanochip
- Plasser nanobrikken i et 10 ml beger med den mønstrede siden vendt opp.
MERK: Denne kvarts nanochip har blitt produsert via elektronstrålelitografi som beskrevet før21. Geometrien og arrangementet av nanostrukturen på brikken kan tilpasses. Størrelsene på gradient nanobarer som brukes her er 2000 nm i lengde, 600 nm i høyde og 100 til 1000 nm i bredde (100 nm trinnsett). - Tilsett forsiktig 1 ml 98% svovelsyre til begeret, og sørg for at syren dekker forsiden og baksiden av brikken helt.
MERK: 98% svovelsyre er ekstremt etsende og kan forårsake rask ødeleggelse av vev og alvorlige kjemiske forbrenninger ved kontakt med hud eller øyne. Bruk den i avtrekksviften med riktig beskyttelse. - Roter begeret sakte og tilsett 200 μL 30% hydrogenperoksid dråpe for dråpe til hele begeret blir varmt. Sørg for at svovelsyre og hydrogenperoksid blandes godt for å danne piranha-løsning for fjerning av organiske molekyler fra nanochip17. Det finnes alternative teknikker for å generere SLB på rene hydrofile overflater, for eksempel UV-lys og ozoneksponering som beskrevet tidligere23.
MERK: Reaksjonen er ekstremt eksoterm og kan føre til at løsningen koker, så tilsett hydrogenperoksid til svovelsyren dråpe for dråpe og fortsett å rotere. - Plasser begeret i en sekundær glassbeholder og hold nanochipen nedsenket i piranha-løsningen over natten for å rengjøre urenhetene grundig.
MERK: Plasser begeret i avtrekksviften uten deksel i tilfelle reaksjonen kan generere gass. - Ta begeret ut og pipetter piranha-løsningen forsiktig i en syreavfallsbeholder.
- Legg 5 ml avionisert vann inn i begeret for å fortynne restsyren og kast den i syreavfallet. Gjenta dette trinnet fem ganger og bruk 5 M NaOH for å nøytralisere syreavfallet.
- Ta tak i brikken med pinsett og vask med en kontinuerlig strøm av avionisert vann for å fjerne gjenværende syre grundig. Blås brikken med 99,9 % nitrogengass for SLB-dannelse22.
2. Generasjon av små unilamellar vesikler (SUVer)
- Tilsett 100 μL kloroform i et gult hetteglass.
MERK: Kloroform er en svært flyktig, fargeløs væske, og den kan være giftig ved innånding eller svelging. Bruk den i avtrekkshetten med masken og hanskene på. - Oppløs 500 μg av lipidblandingen i kloroform. Sammensetningen av lipidblandingen som brukes her er 89,5 mol% av eggfosfatidylkoliner (PC), 10 mol% hjernefosfatidylserin (PS) og 0,5 mol% av Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, trietylammoniumsalt (Texas Red DHPE).
- Blås lipidblandingen i hetteglasset med 99,9% nitrogengass til kloroformen er fordampet og lipidblandingen er tørr.
MERK: Dette trinnet skal utføres i avtrekkshetten. Unngå flytende sprut når du blåser. - Plasser lipidblandingen i det gule hetteglasset uten lokket i vakuumtørkeren dekket av aluminiumsfolie. Tørk deretter prøven med en pumpe i 3 timer for å fordampe kloroformen fullstendig.
- Tilsett 250 μL fosfatbufret saltvannsbuffer (PBS) til hetteglasset. Vortex løsningen til den er homogen.
MERK: PBS-buffer består av 150 mM NaCl, uten kalsium, magnesium og fenolrødt; pH er justert til 7,2 for å lage PC og PS lipid dobbeltlag. - Sonicate lipidblandingen i 30 minutter med en frekvens på 50 kHz i en badsonikator. Overfør deretter lipidblandingen til et 1,5 ml sentrifugerør og tetning med parafilm.
- Frys lipidblandingen i flytende nitrogen i 20 s og tine deretter ved 42 °C i 2 minutter i et vannbad. Gjenta fryse-tine-syklusene 30 ganger. Etter det ser lipidblandingen ut som en klar væske.
FORSIKTIG: Flytende nitrogen har et kokepunkt på ca. -195,8 °C. Det kan forårsake frostskader eller kryogene forbrenninger. Bruk den i det udefinerte rommet med varmeisolasjonshansker på. - Skyll to glassgasstette sprøyter og kontakten til miniekstruderen med henholdsvis etanol, kloroform og metanol. Gjenta skyllesekvensen fem ganger for å forrense apparatet. La dem ligge i avtrekkshetten til det organiske løsningsmidlet er fullstendig fordampet.
- Monter mini-ekstruderapparatet og pass 500 μL PBS-buffer gjennom kontakten for å forvåte apparatet, og kast deretter bufferen fra en annen sprøyte. Dette trinnet fjerner urenheter og letter ekstrudering.
- Monter mini-ekstruderapparatet med en 100 nm porestørrelse polykarbonatfiltermembran.
MERK: Porestørrelsen på filtermembranen bestemmer diameteren på liposomer. - Ta 500 μL PBS-buffer med en av sprøytene og skyv den forsiktig gjennom filteret for å fylle den andre tomme sprøyten i den andre enden. Gjenta ekstruderingen frem og tilbake tre ganger for å kontrollere apparatlekkasjen og kast bufferen fra den andre sprøyten.
- Pass lipidblandingen gjennom miniekstruderen for å erstatte PBS-bufferen. Ekstruder deretter frem og tilbake 20 ganger for å danne SUV-er. Vesiklenes multilamellære karakter kan beholdes med utilstrekkelig antall ekstruderingstider, noe som vil påvirke SLB-dannelsen23.
- Samle SUV-ene fra den andre sprøyten for å redusere forurensningen med større partikler og overfør den til et 1,5 ml sentrifugerør.
MERK: Fjern sprøyten rett ut av koblingen i tilfelle sprøyten går i stykker. - Pakk røret med aluminiumsfolie for å forhindre bleking av fluorescerende merkede lipider og oppbevar dem ved 4 °C. Vanligvis kan SUVene lagres i opptil 7 dager.
3. Dannelse av SLB på en nanochip
- Ta ut den rensede nanobrikken fra avionisert vann forsiktig med en pinsett og føn med 99,9% nitrogengass.
- Utfør overflaterengjøring av nanochipen med luftplasmabehandling i 1 time.
- Monter nanochipen i et polydimetylsiloksan (PDMS) kammer, som består av to stykker PDMS-en midtre PDMS og en topp PDMS (figur 1A). Den midterste PDMS er tynn (~ 0,5 mm) med en stor ovalformet åpning i midten for å sikre tilstrekkelig eksponering for nanobarmønsteret. Den øverste PDMS er tykk (~ 4,0 mm) med to små hull i den store ovale åpningen som et innløp og et utløp for væskehåndtering.
- Plasser brikken på en ren overflate med mønsteret vendt opp.
- Dekk forsiktig til den midterste PDMS med brikken, og sørg for at hele mønsteret blir utsatt for det sentrale området av den store ovalformede åpningen i midten av PDMS.
- Dekk den øverste PDMS med den midterste PDMS og hold de to små hullene i regionen av det store ovale hullet i midten av PDMS. Deretter monteres PDMS-kammeret.
MERK: PDMS er den mest brukte silisiumbaserte organiske polymeren. Det er biokompatibelt, gjennomsiktig, så vel som deformerbart for å bli utformet som en tilpasset form for chipmontering og avbildning under mikroskopet. Enda viktigere, det kan være kovalent fast til et annet PDMS-lag eller glass tett etter plasmabehandling, noe som gjør det egnet som kammeret for å forberede SLB. Dette trinnet sikrer at hvert lag med PDMS er tett montert for å unngå hull og lekkasje.
- Last SUV-ene inn i PDMS-kammeret fra et av de to små hullene i den øverste PDMS-en med en pipette og rug i 15 minutter ved romtemperatur for å danne SLB-en.
- Pipetter PBS-bufferen forsiktig inn i PDMS-kammeret fra den ene siden av det lille hullet og fjern avfallet med en bomullspinne fra det andre hullet for å vaske bort de ubundne SUV-ene. Skaff deg deretter SLB dannet på nanochipen (kvaliteten på SLB testes ved fluorescensgjenoppretting etter fotobleking (FRAP) som vist i trinn 4.4 og diskutert i avsnittet om representative resultater).
MERK: Ved pipettering av PBS-bufferen inn i kammeret, skal pipettespissen være full av bufferen og i kontakt med væskeoverflaten for å unngå å injisere bobler.
4. Avbildning av SLB og krumningsfølende proteinbinding på nanochipen
MERK: Denne delen vil avhenge av mikroskopsystemet som er tilgjengelig for eksperimentet. Her beskrives en overordnet retningslinje for hvordan man utfører bildebehandlingen. De detaljerte innstillingene kan endres mellom de forskjellige mikroskopoppsettene.
- Sett opp laserskanning konfokal mikroskopi ved hjelp av en 100x (N.A.1.4) olje objektiv. Åpne ZEN-programvaren for å velge eksitasjonslaserkraften som kan opphisse fluorescensen av lipid og protein. Velg anskaffelsesmodus > Smart oppsett > Texas Red DHPE / EGFP.
- Juster fokuset med fokusknappen for å finne nanobarene på brikken til nanobarkantene er skarpe under lipidkanalen.
- Angi skanneparametrene som nedenfor for å få et kontrollbilde av lipidkanalen før du legger til protein: Rammestørrelse = 512 piksler x 512 piksler (512 piksler x 512 piksler, en pikselstørrelse på 124 nm), biter per piksel = 16 (16-biters dybde), skannehastighet = 5 og gjennomsnitt = 4 (gjennomsnittsmodus på fire ganger / linje).
- Utfør FRAP-analysen ved å bleke det fluorescerende merkede lipid-dobbeltlaget på et tilfeldig enkelt nanobarområde.
- Merk av for Eksperimentregioner og Bleking . Tegn et sirkulært område på 5 μm diameter som kan inkludere hele nanobaren i midten (nanobarstørrelse er 2 μm) og legg til eksperimentregionene. Inndataparametere for time-lapse-avbildning som følgende eksempel: velg Skannehastighet = 9 og Gjennomsnitt = 1. Velg Tidsserier > Varighet = 100 sykluser og Intervall = 2 s. Skriv inn blekingsparametere som følgende eksempel: Merk av for Start etter # bilder, og velg tre bilder.
- Merk av for laseravmerkingsboksene som utfører FRAP, og endre strømmen til 100,0%. Klikk på Start eksperiment for FRAP-eksperimentet.
MERK: FRAP er en vanlig metode for å karakterisere mobiliteten til cellulære molekyler. Hvis SLB har god fluiditet, vil fluorescensen i det blekede området gradvis komme seg etter hvert som blekede fluoroforer diffunderer ut og ublekede fluoroforer fra andre områder diffunderer inn.
- Legg proteinoppløsningen inn i PDMS-kammeret og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur for å tillate binding av proteinet på SLB.
MERK: Proteinene som brukes i figur 2G, H for å demonstrere lipidsammensetning, letter proteinbinding på nanobarbuede SLBer er 74 μM GFP og 79 μM GFP-His. Disse to proteinene er grønne fluorescensproteiner uten eller med His-tag. Proteinene som brukes til krumningssensorstudie i figur 4 og figur 5 er 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 og 16 μM FBAR + IDRFBP17. Disse tre proteinene er domenene fra FBP17, som er et typisk BAR-protein som intuitivt antas som både krumningsgeneratorer og sensorer. Hvert proteinvolum er 20 μL. - Fokuser nanobarene på nytt og gjenta trinn 4.3 for å ta bilder av både lipid- og proteinkanaler for deteksjon av proteinkrumningssensor.
- Gjenta trinn 4.4 for å utføre FRAP-analysen på både lipid- og proteinkanaler og utføre time-lapse-avbildning for å karakterisere mobiliteten til krumningsfølende protein.
5. Gjenbruk av nanochip
- Ta tak i nanochipen med pinsett og løsne den forsiktig fra PDMS-kammeret i et 50 ml beger fylt med avionisert vann.
MERK: Dette er et kritisk trinn. Forhindre at pinsetten berører nanostrukturen, og ikke tving brikken til å skille seg for å unngå sprekker. - Vask nanochipen grundig med vannfri etanol for å fjerne organiske rester festet på overflaten.
MERK: Bruk rent silkepapir for å fjerne vann på overflaten før vask med vannfri etanol.
FORSIKTIG: Vannfri etanol er et svært flyktig og litt farlig kjemikalie. Unngå kontakt med hud og øyne. Bruk den i avtrekkshetten med masken og hanskene på. - Vask brikken grundig med rikelig med avionisert vann for å fjerne gjenværende etanol. Tørk deretter brikken med 99,9% nitrogengass.
MERK: Det er viktig å fjerne alle spor av etanol på brikken før du går videre til neste trinn fordi piranha-syren kan reagere voldsomt med organisk løsningsmiddel og kan forårsake eksplosjoner. - Legg brikken i et rent 10 ml beger med mønstersiden vendt opp og rengjør brikken med pirajaløsning for gjenbruk som følger de samme trinnene som "rengjøring av nanochip".
6. Kvantifisering av bilder
- Roter bildene som er oppnådd av et mikroskop, slik at nanobar-matrisen er i vertikal stilling for etterfølgende analyse i Fiji-programvare.
- Bruk en spesialskrevet MATLAB-kode 'c_pillarmask_averaging' for å finne den enkelte nanobaren med en firkantet maske (51 piksler x 51 piksler) både i lipidkanalen og proteinkanalen.
MERK: Denne MATLAB-koden er spesialdesignet for nanobrikken. Den kan fås på GitHub via lenken: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - Trekk bakgrunnssignalene til hvert bilde med de tre ROIene (5 piksler x 5 piksler) i hjørnene av bildet ved hjelp av meshgrid-funksjonen i MATLAB-koden 'BarGra_avg'. Denne operasjonen tar sikte på å korrigere potensielle ujevne bakgrunnsstøy forårsaket av mikroskopoppsettet eller chiputjevning på mikroskopstadiet.
- Generer gjennomsnittsbildene av samme størrelse nanobarer ved hjelp av MATLAB-koden 'BarGra_avg', der hvert punkt er gjennomsnittet av verdiene på det tidspunktet i alle de individuelle nanobar kvadratmaskene. Generer 3D-overflateplott av gjennomsnittsbildene i Fiji-programvaren for å vise den gjennomsnittlige signalfordelingen rundt nanobarene intuitivt. Velg Analyser > Surface Plot > Input 100 for mangekantmultiplikator, og merk av for Skygge, Tegn akse og Glatt ut.
- Segmenter hver nanobar i tre områder, som inkluderer to nanobar-endeområder og ett nanobar-senterområde for å trekke ut deres fluorescensintensiteter henholdsvis ved MATLAB-kode 'avg_nanobar_quantification'. Størrelsene på nanobar ROIene justeres i henhold til dimensjonen til nanobarene ved hjelp av "posisjonsfilen".
- Del proteinintensitetene med lipidintensiteter ekstrahert fra MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification' på bar-end-området for å få nanobar-endetettheten som utelukker overflatearealeffekten.
- Plott nanobar-endetettheten med forskjellige konsentrasjoner i GraphPad Prism for å få bindingskurven. Åpne Analyser-menyen . Velg Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) > Binding - Metning > Spesifikk binding med Hill-hellingsfunksjon for å tilpasse kurven med Hill-ligningen, og beregn deretter KD- og Hill-koeffisientverdien.
- Lipid- og proteinintensitetene normaliseres til deres tilsvarende intensiteter ved 600 nm nanobarsenteret som er oppnådd i samme bilde ved hjelp av MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification'.
- Bruk de lyseste ni pikslene av normaliserte proteinintensiteter ved nanobar-endeområdet delt på bar-senterområdet for å kvantifisere proteinkrumningssensoren med samme størrelse nanobarer, verdien er navngitt som "ende-til-senter-forhold". Bruk forholdet mellom normalisert proteinintensitet for å normalisere lipidintensiteten for å kvantifisere proteinkrumningssensorområdet med forskjellige størrelser nanobarer, verdien kalles "Normalisert nanobar-endetetthet". Disse verdiene beregnes med MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification'.
- Last FRAP-stakkbildet i Fiji-programvaren. Velg FRAP-området og generer en avkastning. Velg funksjonen Mer > flere mål for å måle intensiteten til FRAP-området for hver gang. Plott intensiteten i GraphPad Prism for å generere FRAP-gjenopprettingskurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nanobardesign anbefales for sondering av positive krumningsfølende proteiner, som inneholder en halvsirkel i hver ende med krumning definert av nanobarbredden og en flat/null krumningskontroll lokalt i midten (figur 2A, B). Vellykket dannelse av SLB på nanobarer resulterer i jevnt fordelte lipidmarkørsignaler over hele nanobaroverflaten som vist i figur 2C. Signaler fra flere nanobarer kan kombineres ved å beregne gjennomsnittet av de enkelte nanobarbildene (figur 2D) slik at tilfeldige variasjoner mellom ulike nanobarer kan minimeres. En tidligere elektronmikroskopistudie viste at celleplasmamembran dannet konform belegg rundt hele nanostrukturene24. Derfor antas det syntetiske lipid-dobbeltlaget å feste seg tett på nanostrukturoverflaten, noe som gir diffraksjonsbegrensede linjer på 200 nm nanobar som observert i figur 4E. I tillegg kan membranfluiditeten på nanobar-buet SLB også karakteriseres av FRAP-analyse, hvor fluorescerende signal på en enkelt nanobar kan blekes individuelt for membranfluiditetskarakterisering (figur 2E, F).
Dannelsen av SLB på nanobarer krever generering av SUVer på samme måte som SLB-formasjonen på flate overflater som rapportert tidligere17. Lipidsammensetningen til SUVer bestemmer overflatekjemien til den nanobarbuede SLB som kan endres for membranmerking og forskjellige proteinbindingsmekanismer. For eksempel kan Texas Red DHPE tilsettes i ~ 0,5 mol% i SUVer, slik at anrikningen av membranoverflaten på nanobarer lett kan avbildes ved fluorescensmikroskopi (figur 2C). Foruten visualisering kan lipidsammensetningen også endres for å lette proteinbindingen på nanobarbuede SLBer. For eksempel, for å lette forankringen av His-merkede proteiner, kan nikkel-nitrilotrieddiksyre (Ni-NTA) bringes til SLB på nanobarene ved å inkorporere 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-karboksypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nikkelsalt) (18: 1 DGS-NTA (Ni)) i SUVer (~ 1 mol%) 25. Uten denne funksjonelle gruppen på lipider kan ikke grønt fluorescensprotein (GFP) binde seg til SLB med negativt ladet PS, noe som resulterer i et mørkere barformet hull på hvert nanobarsted på grunn av volumetrisk uttømming av GFP-signaler i løsningen (figur 2G). Til sammenligning, ved å legge til 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) i SLB, kan His-taggen merket GFP sterkt forankre på membranen for å tydelig følge SLB-formen buet av nanobarer (figur 2H). Lipiddiffusjonen viste ingen påviselig forskjell på proteinbinding slik det ble undersøkt ved FRAP-analyse (supplerende figur 1). Det er verdt å merke seg at FRAP-målingen bare er basert på intensiteten til 0,5 mol% Texas Red DHPE i SLB, som kanskje ikke representerer 1 mol% DGS-NTA (Ni) som brukes til binding av His-tag-proteinet. I tillegg kan ladede lipider som PS forbedre proteinbindingen gjennom elektrostatisk interaksjon26, mens signallipider som fosfatidylinositol (4,5) -bisfosfat (PIP2) også kan integreres i SUVer for å lette spesifikk proteinbinding (f.eks. FCHo2, for hvilken PIP2 er funnet avgjørende for membrankrumningssensoren27).
Kvaliteten på SLB-dannelsen når det gjelder overflateuniformitet og membranfluiditet er avgjørende for å undersøke proteinkrumningssensorevnen på nanobarer. Det er tre typiske problemer som kan kompromittere SLB-ensartethet og flyt. Den ene er bindingen av overflødige SUVer på SLB på grunn av ineffektiv vask som genererer puncta både på nanobarene og på den flate membranen mellom nanobarene (figur 3A, B). Det påvirker kvantifiseringen av proteinbinding på buede eller flate overflater på nanobarer betydelig for krumningssensorvurdering. Et annet problem er den uventede introduksjonen av luftbobler inne i PDMS-kammeret under vasketrinnet, noe som kan ødelegge SLB langs banen til luft-væske-grensesnittet og etterlate ripelignende funksjoner lett identifiserbare med ekstremt lave lipidsignaler på nanobaroverflaten (figur 3C, D). Videre etterlater feil rengjorte nanobarsubstrater tilfeldig distribuerte kjemiske rester på overflaten som forhindrer lipidadsorpsjon for SLB-dannelse. Det fører til generering av membrandefekter som kanskje eller ikke er over den optiske oppløsningen for mikroskopivisualisering (figur 3E). Imidlertid vil membranfluiditeten bli følsomt påvirket av dannelse av membrandefekter28 , slik at FRAP-analysen kan brukes til å verifisere overflatens renhet (figur 3F, G).
For å demonstrere karakterisering av krumningsfølende protein ved bruk av nanobar-array, sammenlignes det typiske F-BAR-domenet med en nylig identifisert iboende uordnet region i FBP17 (IDRFBP17). F-BAR er fluorescerende merket med Alexa Fluor 488 tetrafluorfenylesterfarger mens IDRFBP17 er merket med Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Som vist i figur 4A, viser begge proteindomenene økt akkumulering på SLB-belagte individuelle nanobarer med 300 nm bredde. Her inneholder SLB 10% PS for å elektrostatisk forbedre proteinbindingen. Proteinets krumningssensorevne kan identifiseres ved fortrinnsberikelse ved de buede nanobarendene med høyere fluorescerende intensitet enn signalene ved de flate nanobarsentrene, noe som er tydeligere vist etter bilde i gjennomsnitt fra mer enn 100 nanobarer (figur 4B). Krumningssensorevnen kan reflekteres kvantitativt ved å beregne ende-til-senterforholdet på hver nanobar (dvs. fluorescensintensiteten ved nanobar-enden versus nanobarsenteret). Som vist i figur 4C har begge proteinene et høyere ende-til-senter-forhold enn lipider, som er rundt 1. Når man sammenligner IDR FBP17 og F-BAR, kan det ses at det høyere ende-til-senter-forholdet mellom IDRFBP17 (1,385 ±0,011, gjennomsnittlig ± SEM) indikerer sterkere krumningssensor enn F-BAR (1,144 ± 0,004, gjennomsnittlig ± SEM).
For å undersøke omfanget av krumninger som kan registreres av proteinene, genereres SLB på nanobararrayer med gradientbredder fra 200 nm til 600 nm (figur 4D) hvor lipider viste homogent belegg på nanobarer i forskjellige størrelser (figur 4E). Tre proteiner (IDR FBP17, F-BAR og F-BAR + IDRFBP17) inkuberes på gradient nanobar-matrisen, og alle viste fortrinnsvis akkumulering på nanobar-enden buede membransteder når krumningen ble redusert under 400 nm i diameter (figur 4E, F). Blant disse tre proteindomenene gir IDRFBP17 den høyeste nanobar-endetettheten, noe som indikerer den sterkeste krumningssensorevnen, mens F-BAR viser den laveste verdien (figur 4F). Videre kan bindingskurven til krumningssensorproteinet også plottes ved gradvis å øke proteinkonsentrasjonen (figur 4G), som viser at IDRFBP17 har en sterk kooperativ krumningssensorevne. Ved tilpasning av bindingskurvene til Hill-ligningen finnes KD i μM-området (0,6 ± 0,1 μM) og Hill-koeffisienten (H) er mellom 2 og 3, noe som tyder på en ultrasensitiv binding av IDRFBP17 til nanobar-induserte membrankrumninger. Jo skarpere krumningen er, desto høyere bindingskapasitet ved likevekt.
Den dynamiske membrandiffusjonen og membranforeningen av krumningsfølende proteiner rundt de nanobarformede SLB-stedene kan også studeres av FRAP. Sammenlignet med rask gjenoppretting av lipidsignaler på nanobarer (figur 5A, E), kunne F-BAR ikke gjenopprette innen 2 minutter (figur 5B, E), noe som tyder på dens betydelig reduserte membranmobilitet og assosiasjonsdynamikk på de buede membranstedene. Overraskende, forskjellig fra oppførselen til F-BAR, VISTE IDR FBP17-signalet åpenbar gjenoppretting innenfor samme tidsramme (figur 5C, E), noe som indikerer den dynamiske naturen til IDRFBP17 akkumulert ved de buede membranene. Etter å ha vasket bort den ubundne IDR FBP17 i løsningen, kunne imidlertid ikke den samme utvinningen i IDRFBP17-kanalen observeres som før (figur 5D, E). Det indikerer at utvinningen domineres av utvekslingen med de løsningsholdige IDRFBP17-molekylene og mindre ved lateral diffusjon av de membranbundne molekylene.
Samlet sett viser disse resultatene at dette nanobar-SLB-systemet er et kraftig verktøy for å karakterisere membrankrumningsfølende proteiner in vitro.
Figur 1: Illustrasjon av nanobar-SLB-systemet . (A) PDMS-kammeret består av topp- og mellomlagene med den rensede nanobrikken montert på den. (B) Texas Red DHPE merket SUVer med zoomet inn detaljer. (C) Den intakte modellen av nanobar-SLB-systemet og zoom-inn-området illustrerer at SLB dannes på nanobarer med et jevnt enkeltlag av lipid-dobbeltlaget. (D) Avbildnings- og karakteriseringsprosess under laserskanning konfokal mikroskopi. (E) Rengjøring av nanobrikken for videre gjenbruk. (F) Bildebehandling for kvantifisering av proteinkrumningssensor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Dannelsen av den buede SLB på nanobarer med proteinbinding . (A) SEM-bilde av en individuell nanobar. (B) Skjematisk skildring av nanobar-SLB-systemet. (C) Fluorescerende bilder av SLB merket med Texas Red DHPE på nanochip. (D) Gjennomsnittlig bilde av SLB-fordeling på nanobarer (øverst) og et 3D-overflateplott av gjennomsnittsbildet (nederst). Dette tallet er modifisert fra Su et al.22 og gjengitt med tillatelse. (E) Time-lapse-avbildning av SLB FRAP på nanobaren. Blekeområdet er indikert med en gul stiplet sirkel. (F) Normalisert nanobar intensitetsplott ved FRAP-måling. (G) Skjematisk avbildning av GFP kan ikke binde seg til SLB med 10 mol% negativt ladet PS (venstre) og et tilsvarende representativt bilde til høyre. (H) Skjematisk avbildning av Hans-tag merket GFP bundet til SLB med 1 mol% DGS-NTA (Ni) (venstre) og et tilsvarende representativt bilde til høyre. Skala barer: 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Typiske problemer som kompromitterer SLB-kvaliteten. (A) Skjematisk av SLB-forberedelse uten effektiv vask. (B) Representativt bilde av SLB-bindingen med overflødige SUV-er. De gule pilene viser puncta som er overflødige SUV-er på SLB-overflaten. (C) Skjematisk av SLB-preparat med injiserte luftbobler. (D) Representativt bilde av SLB ødelagt av banen til luft-væskegrensesnittet. Den gule pilen viser den ufullstendige SLB på underlaget. (E) Skjematisk av SLB-preparat med urensede nanobarsubstrater. Zoom-inn-området viser et diskontinuerlig lipid-dobbeltlag på grunn av overflaterester som forhindrer lipidadsorpsjon. (F) Time-lapse-avbildning av SLB FRAP-analyse på urensede nanobarsubstrater. Blekeområdet er indikert med en gul stiplet sirkel. (G) Normalisert nanobar intensitetsplott ved FRAP-måling. Skala barer: 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Proteinkurvaturfølende karakterisering av nanobar-SLB-systemet. (A) Fluorescerende bilder av F-BAR (venstre) og IDRFBP17 (høyre) akkumuleres på SLB-belagte nanobarer (10% PS og 90% PC). Skalalinje: 2 μm. (B) Gjennomsnittlige bilder av F-BAR (venstre øverst) og IDRFBP17 (venstre bunn) akkumuleres på nanobarer og tilsvarende 3D-overflateplott (henholdsvis høyre topp og høyre bunn). Skala bar: 2 μm. (C) End-to-center forholdet mellom lipid dobbeltlag, F-BAR og IDRFBP17 fluorescens intensitet rundt 300 nm bredde nanobar. En Welchs t-test ble utført for statistisk analyse. p < 0,0001. (n = 3) (D) SEM-bilde av gradient nanobararrayer med bredder fra 200 nm til 600 nm. Skala bar: 5 μm. (E) Merknad av proteinkonstruksjon (øverst), gjennomsnittlige bilder av lipid dobbeltlag, IDR FBP17, F-BAR og F-BAR + IDRFBP17-fordeling på gradient nanobarer med bredde fra 200 nm til 600 nm (midten) og intensitetsprofiler langs nanobarene til hvert gjennomsnittlig bilde (nederst). Skala bar: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR, og F-BAR + IDRFBP17 normalisert nanobar-end tetthet kvantifisert med forskjellige bredder av nanobarer henholdsvis. Hver data vises som gjennomsnittlig ± SEM (n ≥ 60). (G) Bindingskurven til IDRFBP17 passet med Hill-ligningen. Hver data vises som gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). Dette tallet er modifisert fra Su et al.22 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Membranbindingsdynamikken til krumningsfølende proteiner rundt nanobaren. (AD) Time-lapse-avbildning av lipid-dobbeltlaget (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) og IDRFBP17 vasket ut (D) FRAP-analyse på nanobaren. Blekeområdet er indikert med en rød stiplet sirkel. Skala bar: 5 μm. (E) Normalisert nanobar intensitet plott ved FRAP måling. Dette tallet er modifisert fra Su et al.22 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Membrandiffusjon før og etter tilsetning av protein. (A) Time-lapse-avbildning av FRAP-test på POPC-lipid-dobbeltlaget med 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) og 0,5 mol% Texas Red DHPE rundt nanobaren før (øverst) og etter (bunn) tilsetning av GFP-His protein. Blekeområdet er indikert med en gul stiplet sirkel. (B) Normalisert nanobar intensitetsplott ved FRAP-måling. Skala barer: 2 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanobar-SLB-systemet beskrevet her tilbyr en unik kombinasjon av fordelene i flere eksisterende in vitro-analyser. Det avslører effektivt den foretrukne bindingen av proteiner til høyt buede membraner som liposomflytning eller sedimenteringsanalyse, men krever mye færre prøver og gir mer nøyaktig definert krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyr også et bredt spekter av nøyaktig kontrollert krumning for samtidig sammenligning som SLiC-analysen, med mindre bekymring for lipidsammensetningsendring i forskjellige krumninger og uoppdagelige morfologiske eller krumningsendringer med størrelser under diffraksjonsgrensen for lys, da SLB er mobil og kontinuerlig dekker alle størrelsene på nanobarer tett30 . Nanobar-SLB tillater også observasjon av dynamisk oppførsel av protein på den buede membranen som tether-pulling analyser, men ikke begrenset av gjennomstrømningen av rørgenerering og erfaring i optisk fangst manipulasjon13. Selv om SMrT-analysen genererer membranrør i høy gjennomstrømning, varierer membrankrumningen langs nanorøret, noe som gjør det vanskeligere å studere krumningsfølsomheten til proteiner16. Mer interessant, sammenlignet med andre SLB-baserte systemer på det mønstrede substratet18,19,20,27, gir nanobar-SLB et flatt stangsenter ved siden av den definerte krumningen i stangenden, som effektivt fungerer som lokal kontroll av nullkrumning for å minimere virkningen av overflatedensitetsvariasjoner på kvantitativ analyse. Evnen til å tilpasse krumningskombinasjoner ved hjelp av høyoppløselig elektronstrålelitografi kan generere ikke bare lokale nullkrumningskontroller, men også positive og negative krumninger som vist tidligere i levende cellestudier2.
Det er potensielle begrensninger som er verdt å merke seg når du bruker denne metoden. For det første er nanofabrikasjon på brikken en relativt kompleks prosedyre, med renromsfasiliteter og spesialutstyr som trengs (spesielt en E-stråleforfatter). Denne høye kostnaden førte til at vi gjenbrukte brikken; Dette resulterer i lengre tid brukt på å rengjøre sponoverflaten og montere brikken med PDMS sammenlignet med engangsbruk. Tilgjengeligheten av nanochip er en annen type begrensning. Feil drift når du bruker brikken, for eksempel vendt mot overflaten mot benken, kan forårsake nanostrukturslitasje, spesielt for strukturene med høyt aspektforhold. Videre er lipid-dobbeltlaget dannet på substratet en kontinuerlig membran; spenningen kan lett forplante seg overalt. For studier som krever manipulering av membranspenningen, gir teknikker som tether trukket fra GUV via det vedlagte mikropipettesystemet mer praktiske løsninger10.
For å oppnå optimale resultater er følgende trinn også kritiske. (i) Vesikelstørrelse er kritisk for SLB-dannelse31,32. Tidligere litteratur viser en høyere tilbøyelighet til å smelte for mindre vesikler (< 90 nm) sammenlignet med større størrelse ved bruk av en kvartskrystallmikrobalanse med spredning (QCM-D) test32. Således, sammenlignet med LUV på 300 nm, vil diametrene på ~ 50 nm være lettere for SLB-dannelse. Tatt i betraktning dette problemet, er det nødvendig med minst 20 ganger i både fryse-tine og ekstruderingstrinn for å danne homogene SUVer for SLB-dannelse. FRAP-test er også nødvendig i hvert eksperiment for å validere membranmobiliteten. (ii) Under SUV-forberedelse bør alt utstyret holdes rent for å unngå forurensning av støvlignende små partikler. Spesielt for miniekstruderen er nålene lett tilstoppet i et skittent miljø. (iii) For å forberede SUVer med god kvalitet, må kloroformen i lipidblandingen fjernes helt for å unngå å ødelegge lipidblærer. (iv) Plasmarengjøring av brikken må utføres på nytt før SLB-dannelse for å sikre en svært hydrofil overflate for effektiv SUV-brudd for å danne et kontinuerlig dobbeltlag. Langvarig eksponering i miljøet etter plasmabehandling kan forårsake uspesifikk binding av støvpartikler eller organiske rester til sponoverflaten, noe som kompromitterer overflatens hydrofilitet. (v) For å montere PDMS-kammeret for SLB-dannelse og proteininkubasjon, er renheten og flatheten til hvert PDMS-stykke viktig for å sikre en god forsegling av fluidkanalen. Enhver lekkasje i kammeret kan føre til at SLB tørker ut eller endrer proteinkonsentrasjonen. (vi) Bildefokusjustering er avgjørende for å sikre konsistent intensitetsmåling, siden høyden på nanobaren (600 nm) er sammenlignbar med fokaldybden til den konfokale mikroskopien for laserskanning i z-aksen33. Fokuset bør justeres på nytt hver gang matrisen beveger seg horisontalt for å opprettholde skarpheten på nanobarkantene i bildene.
Fremfor alt gir nanobar-SLB-systemet introdusert her en kraftig metode for å studere membrankrumningsfølende proteiner. Ulike parametere som påvirker proteininteraksjonen med den buede membranen kan studeres kvantitativt over en rekke krumninger, for eksempel krumningsfølsomme domener (f.eks. BAR-domene og amfifil helix) av proteinet8,30, lipidsammensetning (f.eks. PS og PIP2) av membranen27,34, pH, ionstyrke og temperatur i miljøet35,36 , samt protein-protein-interaksjonen for kompleksdannelse (f.eks. CHMP2B og CHMP2A kan bidra forskjellig til ESCRT-III-katalyserte membranombyggingsprosesser)37,38. Dynamiske studier kan også utføres ved hjelp av nanobar-SLB-systemet for å undersøke membranbindende kinetisk 11, membranproteindiffusjon eller montering39, samt enzymatiske reaksjoner 40 eller faseseparasjon som oppfører seg13,41,42. I tillegg anses det kunstige lipid-dobbeltlaget generelt som symmetrisk med hvert lipidmonolag som inneholder samme lipidsammensetning, noe som er ganske forskjellig fra den levende cellemembranen43. Indusere et asymmetri dobbeltlag for bedre å etterligne plasmamembranen kan oppnås ved å endre materialet på overflaten, buffertilstanden, lipidsammensetningen eller temperaturen44,45,46,47. Det er av stor verdi å verifisere om et asymmetrisk dobbeltlag kan dannes på nanobar-SLB-systemet for å studere proteinadferd på den buede membranen, som fortjener videre studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse i dette arbeidet.
Acknowledgments
Vi takker Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) og Senter for forstyrrende fotoniske teknologier (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for å støtte nanostrukturfabrikasjon og SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) ved School of Biological Sciences NTU for proteinrensing, og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for konfokalmikroskopet. Dette arbeidet er finansiert av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendet (X. Miao), og China Scholarship Council for forskningsstipendet (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
