Summary
Här utvecklas ett nanobarstödt lipid-dubbelskiktssystem för att tillhandahålla ett syntetiskt membran med en definierad krökning som möjliggör karakterisering av proteiner med krökningsavkänningsförmåga in vitro.
Abstract
Membrankrökning spelar viktiga roller i olika väsentliga processer av celler, såsom cellmigration, celldelning och vesikelhandel. Det genereras inte bara passivt av cellulära aktiviteter, utan reglerar också aktivt proteininteraktioner och är involverat i många intracellulära signaleringar. Således är det av stort värde att undersöka membrankrökningens roll för att reglera fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider. Nyligen har många tekniker utvecklats för att studera förhållandet mellan det krökta membranet och proteinet in vitro. Jämfört med traditionella tekniker erbjuder det nyutvecklade nanobarstödda lipid-dubbelskiktet (SLB) både hög genomströmning och bättre noggrannhet i membrankrökningsgenerering genom att bilda ett kontinuerligt lipid-dubbelskikt på mönstrade arrays av nanobarer med en fördefinierad membrankrökning och lokal platt kontroll. Både lipidfluiditeten och proteinkänsligheten för krökta membran kan karakteriseras kvantitativt med hjälp av fluorescensmikroskopiavbildning. Här introduceras en detaljerad procedur för hur man bildar en SLB på tillverkade glasytor som innehåller nanobarmatriser och karakteriseringen av krökningskänsliga proteiner på sådan SLB. Dessutom omfattas protokoll för återanvändning av nanochip och bildbehandling. Utöver nanobar-SLB är detta protokoll lätt tillämpligt på alla typer av nanostrukturerade glasflisor för krökningsavkänningsstudier.
Introduction
Membrankrökning är en kritisk fysisk parameter för en cell som förekommer i en mängd olika cellulära processer såsom morfogenes, celldelning och cellmigration1. Det är allmänt erkänt nu att membrankrökningen är bortom ett enkelt resultat av cellulära händelser; Istället har det framstått som en effektiv regulator för proteininteraktioner och intracellulär signalering. Till exempel visade sig flera proteiner som är involverade i clathrinmedierad endocytos företrädesvis binda till det krökta membranet, vilket resulterade i bildandet av en hotspot för endocytos2. Det finns många olika orsaker till membrandeformation såsom membrandragning av cytoskelettkrafterna, närvaron av lipidasymmetri med olika stora huvudgrupper, förekomsten av transmembranproteiner med konisk form, ackumulering av membranformande proteiner som BAR-domänproteiner (uppkallad efter Bin-, amfifysin- och Rvs-proteiner) och införandet av amfipatiska helicesdomän i membranet1 . Intressant nog deformerar dessa proteiner och lipider inte bara membranet utan kan också känna av membrankrökningen och uppvisa preferensackumulering1. Därför är det viktigt att studera om och hur membran med olika krökningar förändrar fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider som är fästa vid dem och de potentiella effekterna på de relaterade intracellulära processerna.
Många tekniker har utvecklats för att analysera interaktionen mellan krökt membran och proteiner i både levande celler och in vitro-system. Det levande cellsystemet ger en verklig cellmiljö med rik lipiddiversitet och dynamisk proteinsignalreglering 2,3,4,5,6,7. Ett sådant sofistikerat system är emellertid svårt att studera på grund av osäkerheter och fluktuationer i den intracellulära miljön. Därför har in vitro-analyserna med hjälp av ett artificiellt membran bestående av kända lipidarter och renade proteiner blivit kraftfulla rekonstitueringssystem för att karakterisera förhållandet mellan proteiner och krökta membran. Traditionellt genereras liposomer med olika diametrar genom extrudering för att detektera krökningskänsliga proteiner via antingen en samsedimenteringsanalys med användning av centrifugalkraft eller en samflotationsanalys med en densitetsgradient för att undvika proteinaggregering 8,9. Krökningen hos de extruderade liposomerna begränsas emellertid av den tillgängliga porstorleken hos membranfiltret som används i extrudern10. SLiC-analys (Single liposome curvatur) har visat sig övervinna denna begränsning, där liposomer med olika diametrar fluorescensmärks och immobiliseras på ytan så att krökningen kan markeras av den fluorescerande intensiteten11. Emellertid har stark variation i lipidkompositionen observerats i små vesiklar, vilket påverkar noggrannheten hos krökningsmätningen12. Tether-pulling-experiment ger en mer exakt mätning av krökningen på den övergående tjudern som dras från gigantiska unilamellära vesiklar (GUV) med hjälp av en optisk pincett, där krökningen kan kontrolleras väl av membranspänningen som genereras13,14. Denna metod är lämplig för att studera antingen positiva eller negativa krökningsavkänningsproteiner, men begränsas av genomströmningen av rörgenerering10. SMrT-analys (Supported Membrane Tubes) ger samtidig generering av flera membranrör som strängsprutas från samma lipidreservoar genom mikrofluidiska flöden. Ändå varierar membrankrökningen i sig längs nanoröret, vilket äventyrar noggrannheten hos fluorescensintensitetsbaserad krökningsmätning15,16. Som jämförelse genererade användning av små unilamellära vesiklar (SUV, diameter <100 nm17) för att bilda ett stödd lipid-dubbelskikt (SLB) på ytor som innehåller designade topografier ett enda dubbelskiktsmembran med krökningar förutbestämda av nanofabrikation eller nanomaterial med hög noggrannhet18,19,20.
Här presenterar vi ett protokoll för bildandet av SLB på tillverkade nanochipytor med nanobarmatriser och hur det kan användas för att undersöka krökningskänsligheten hos proteiner in vitro. Som visas i figur 1 finns det sex väsentliga komponenter i analysen: A) Rengöring och montering av chipet med en mikrofluidisk kammare; B) Framställning av stadsjeepar med definierad lipidsammansättning; C) Bildning av SLB på ett nanochip och bindning med krökningskänsliga proteiner; D) Avbildning och karakterisering av SLB- och krökningskänsliga proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengöring av chipet för återanvändning; F) Bildbehandling för kvantitativ analys av proteinkrökningsavkänningsförmåga. Det detaljerade protokollet beskrivs steg för steg nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengöring av nanochip
- Placera nanochipet i en 10 ml bägare med den mönstrade sidan uppåt.
OBS: Detta kvartsnanochip har tillverkats via elektronstrålelitografi som beskrivits före21. Geometrin och arrangemanget av nanostrukturen på chipet kan specialdesignas. Storleken på de gradientnanobarer som används här är 2000 nm långa, 600 nm höga och 100 till 1000 nm breda (100 nm steguppsättning). - Tillsätt försiktigt 1 ml 98% svavelsyra till bägaren och se till att syran helt täcker framsidan och baksidan av chipet.
OBS: 98% svavelsyra är extremt frätande och kan orsaka snabb vävnadsförstöring och allvarliga kemiska brännskador vid kontakt med huden eller ögonen. Använd den i dragskåpet med ordentligt skydd. - Rotera långsamt bägaren och tillsätt 200 μl 30% väteperoxid droppe för droppe tills hela bägaren blir varm. Se till att svavelsyra och väteperoxid blandas väl för att bilda piranha-lösning för avlägsnande av organiska molekyler från nanochipet17. Det finns alternativa tekniker för att generera SLB på rena hydrofila ytor, såsom UV-ljus och ozonexponering som beskrivits tidigare23.
OBS: Reaktionen är extremt exoterm och kan få lösningen att koka, så tillsätt väteperoxid till svavelsyran droppe för droppe och fortsätt rotera. - Placera bägaren i en sekundär glasbehållare och håll nanochipet nedsänkt i piranha-lösningen över natten för att rengöra föroreningarna noggrant.
OBS: Placera bägaren i dragskåpet utan lock om reaktionen kan generera gas. - Ta ut bägaren och pipettera försiktigt piranha-lösningen i en syraavfallsbehållare.
- Ladda 5 ml avjoniserat vatten i bägaren för att späda ut restsyran och kasta den i syraavfallet. Upprepa detta steg fem gånger och använd 5 M NaOH för att neutralisera syraavfallet.
- Ta tag i chipet med pincett och tvätta med en kontinuerlig ström av avjoniserat vatten för att avlägsna kvarvarande syra noggrant. Föna chipet med 99,9% kvävgas för SLB-bildning22.
2. Generering av små unilamellära vesiklar (SUV)
- Tillsätt 100 μl kloroform i en bärnstensfärgad injektionsflaska.
OBS: Kloroform är en mycket flyktig, färglös vätska, och den kan vara giftig vid inandning eller förtäring. Använd den i dragskåpet med masken och handskarna på. - Lös upp 500 μg lipidblandningen i kloroform. Sammansättningen av lipidblandningen som används här är 89,5 mol% äggfosfatidylkoliner (PC), 10 mol% hjärnfosfatidylserin (PS) och 0,5 mol% Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, trietylammoniumsalt (Texas Red DHPE).
- Föna lipidblandningen i injektionsflaskan med 99,9% kvävgas tills kloroformen är förångad och lipidblandningen är torr.
OBS: Detta steg ska utföras i dragskåpet. Undvik vätskestänk vid föning. - Placera lipidblandningen i den bärnstensfärgade injektionsflaskan utan locket i den aluminiumfolietäckta vakuumuttorkaren. Vakuumtorka sedan provet med en pump i 3 timmar för att helt förånga kloroformen.
- Tillsätt 250 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert till injektionsflaskan. Vortex lösningen tills den är homogen.
OBS: PBS-buffert består av 150 mM NaCl, utan kalcium, magnesium och fenolrött; pH justeras till 7,2 för att göra PC och PS lipid dubbelskikt. - Sonicate lipidblandningen i 30 min vid en frekvens av 50 kHz i en bad sonicator. Överför sedan lipidblandningen till ett 1,5 ml centrifugrör och försegla med parafilm.
- Frys lipidblandningen i flytande kväve i 20 s och tina sedan vid 42 °C i 2 minuter i ett vattenbad. Upprepa frys-tina cyklerna 30 gånger. Därefter ser lipidblandningen ut som en klar vätska.
VARNING: Flytande kväve har en kokpunkt på cirka −195,8 °C. Det kan orsaka frostskador eller kryogena brännskador. Använd den i det obegränsade utrymmet med värmeisoleringshandskar på. - Skölj två glasgastäta sprutor och mini-extruderns kontakt med etanol, kloroform respektive metanol. Upprepa sköljsekvensen fem gånger för att förrensa apparaten. Lämna dem i dragskåpet tills det organiska lösningsmedlet är helt förångat.
- Montera mini-extruderapparaten och passera 500 μL PBS-buffert genom kontakten för att förväta apparaten och kassera sedan bufferten från en annan spruta. Detta steg tar bort föroreningar och underlättar extrudering.
- Montera mini-extruderapparaten med ett 100 nm porstort polykarbonatfiltermembran.
OBS: Filtermembranets porstorlek bestämmer liposomernas diameter. - Ta 500 μL PBS-buffert med en av sprutorna och tryck den försiktigt genom filtret för att fylla den andra tomma sprutan i andra änden. Upprepa extruderingen fram och tillbaka tre gånger för att kontrollera apparatläckaget och kassera bufferten från den andra sprutan.
- För lipidblandningen genom miniextrudern för att ersätta PBS-bufferten. Extrudera sedan fram och tillbaka 20 gånger för att bilda stadsjeepar. Vesiklarnas multilamellära karaktär kan bibehållas med otillräckligt antal extruderingstider, vilket kommer att påverka SLB-bildning23.
- Samla SUV: erna från den andra sprutan för att minska föroreningen med större partiklar och överför den till ett 1,5 ml centrifugrör.
OBS: Ta bort sprutan direkt ur kontakten om sprutan går av. - Vik in röret med aluminiumfolie för att förhindra blekning av fluorescerande märkta lipider och förvara dem vid 4 °C. Vanligtvis kan SUV: erna lagras i upp till 7 dagar.
3. Bildandet av SLB på ett nanochip
- Ta ut det rengjorda nanochipet från avjoniserat vatten försiktigt med en pincett och föna med 99,9% kvävgas.
- Utför ytrengöring av nanochipet med luftplasmabehandling i 1 h.
- Montera nanochipet i en polydimetylsiloxan (PDMS) kammare, som består av två delar av PDMS-a mellersta PDMS och en övre PDMS (figur 1A). Det mellersta PDMS är tunt (~ 0,5 mm) med en stor ovalformad öppning i mitten för att säkerställa tillräcklig exponering för nanobarmönstret. Det övre PDMS är tjockt (~ 4,0 mm) med två små hål i den stora ovala öppningen som ett inlopp och ett utlopp för vätskehantering.
- Placera chipet på en ren yta med mönstret uppåt.
- Täck försiktigt det mellersta PDMS med chipet och se till att hela mönstret utsätts för det centrala området av den stora ovalformade öppningen i mitten av PDMS.
- Täck det övre PDMS med det mellersta PDMS och håll dess två små hål inom området för det stora ovala hålet i det mellersta PDMS. Sedan monteras PDMS-kammaren.
OBS: PDMS är den mest använda kiselbaserade organiska polymeren. Det är biokompatibelt, transparent och deformerbart för att utformas som en anpassad form för chipmontering och avbildning under mikroskopet. Ännu viktigare är att det kovalent kan fastna på ett annat PDMS-lager eller glas tätt efter plasmabehandling, vilket gör det lämpligt som kammaren för att förbereda SLB. Detta steg säkerställer att varje lager av PDMS är tätt monterat för att undvika luckor och läckage.
- Ladda SUV: erna i PDMS-kammaren från ett av de två små hålen i det övre PDMS med en pipett och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur för att bilda SLB.
- Pipettera försiktigt PBS-bufferten in i PDMS-kammaren från ena sidan av det lilla hålet och ta bort avfallet med en bomullsknopp från det andra hålet för att tvätta bort de obundna SUV: erna. Skaffa sedan SLB som bildas på nanochipet (kvaliteten på SLB testas genom fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP) som visas i steg 4.4 och diskuteras i avsnittet om representativa resultat).
OBS: När PBS-bufferten pipetteras in i kammaren ska pipettspetsen vara full av bufferten och i kontakt med vätskeytan för att undvika att injicera bubblor.
4. Avbilda SLB och krökningsavkänningsproteinbindningen på nanochipet
OBS: Detta avsnitt beror på det mikroskopsystem som är tillgängligt för experimentet. Här beskrivs en övergripande riktlinje för hur avbildningen ska utföras. De detaljerade inställningarna kan ändras mellan de olika mikroskopinställningarna.
- Ställ in den konfokalmikroskopiska laserskanningsmikroskopin med ett 100x (N.A.1.4) oljemål. Öppna ZEN-programvaran för att välja excitationslaserkraften som kan excitera fluorescensen hos lipiden och proteinet. Välj förvärvsläge > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
- Justera fokus med fokusvredet för att hitta nanobarerna på chipet tills nanobarkanterna är skarpa under lipidkanalen.
- Ställ in skanningsparametrarna enligt nedan för att få en kontrollbild av lipidkanalen innan du lägger till protein: Ramstorlek = 512 px x 512 px (512 pixlar x 512 pixlar, en pixelstorlek på 124 nm), bitar per pixel = 16 (16-bitars djup), skanningshastighet = 5 och medelvärde = 4 (medelvärdesläge för fyra gånger / linje).
- Utför FRAP-analysen genom att bleka det fluorescerande märkta lipid-dubbelskiktet på ett slumpmässigt enda nanobarområde.
- Markera kryssrutorna Experimentregioner och Blekning . Rita en cirkulär yta med en diameter på 5 μm som kan inkludera hela nanobaren i mitten (nanobarstorleken är 2 μm) och lägg till experimentregionerna. Mata in time-lapse-avbildningsparametrar som följande exempel: välj Skanningshastighet = 9 och Medelvärde = 1. Välj Tidsserie > Varaktighet = 100 cykler och Intervall = 2 s. Ange blekningsparametrar som följande exempel: markera kryssrutan Starta efter # bilder och välj tre bilder.
- Markera laserkryssrutorna som utför FRAP och ändra effekten till 100,0 %. Klicka på Starta experiment för FRAP-experimentet.
OBS: FRAP är en vanlig metod för att karakterisera rörligheten hos cellulära molekyler. Om SLB har god fluiditet kommer fluorescensen i det blekta området gradvis att återhämta sig när blekta fluoroforer diffunderar ut och oblekta fluoroforer från andra områden diffunderar in.
- Ladda proteinlösningen i PDMS-kammaren och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att möjliggöra bindning av proteinet på SLB.
OBS: De proteiner som används i figur 2G,H för att demonstrera lipidsammansättning underlättar proteinbindning på nanobar-böjda SLB är 74 μM GFP och 79 μM GFP-His. Dessa två proteiner är gröna fluorescensproteiner utan eller med His-tag. Proteinerna som används för krökningsavkänningsstudie i figur 4 och figur 5 är 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 och 16 μM FBAR + IDRFBP17. Dessa tre proteiner är domänerna från FBP17, vilket är ett typiskt BAR-protein som intuitivt antas vara både krökningsgeneratorer och sensorer. Varje proteinvolym är 20 μl. - Fokusera om nanobarerna och upprepa steg 4.3 för att ta bilder av både lipid- och proteinkanaler för detektering av proteinkrökningsavkänning.
- Upprepa steg 4.4 för att genomföra FRAP-analysen på både lipid- och proteinkanaler och utför time-lapse-avbildning för att karakterisera rörligheten hos krökningsavkännande protein.
5. Återanvändning av nanochip
- Ta tag i nanochipet med pincett och lossa det försiktigt från PDMS-kammaren i en 50 ml bägare fylld med avjoniserat vatten.
OBS: Detta är ett kritiskt steg. Förhindra att pincetten vidrör nanostrukturen och tvinga inte chipet att separera för att undvika sprickor. - Tvätta nanochipet noggrant med vattenfri etanol för att avlägsna organiska rester fästa på ytan.
OBS: Använd rent silkespapper för att ta bort vatten på ytan innan du tvättar med vattenfri etanol.
VARNING: Vattenfri etanol är en mycket flyktig och något farlig kemikalie. Undvik kontakt med hud och ögon. Använd den i dragskåpet med masken och handskarna på. - Tvätta chipet noggrant med mycket avjoniserat vatten för att ta bort kvarvarande etanol. Föna sedan chipet med 99,9% kvävgas.
OBS: Det är viktigt att ta bort alla spår av etanol på chipet innan du går vidare till nästa steg eftersom piranhasyran kan reagera våldsamt med organiskt lösningsmedel och kan orsaka explosioner. - Placera chipet i en ren 10 ml bägare med mönstersidan uppåt och rengör chipet med piranha-lösning för återanvändning som följer samma steg som "rengöring av nanochip".
6. Bildkvantifiering
- Rotera bilderna som förvärvats av ett mikroskop så att nanobarmatrisen är i vertikalt läge för efterföljande analys i Fiji-programvaran.
- Använd en specialskriven MATLAB-kod 'c_pillarmask_averaging' för att lokalisera den enskilda nanobaren med en fyrkantig mask (51 pixlar x 51 pixlar) både i lipidkanalen och proteinkanalen.
OBS: Denna MATLAB-kod är speciellt utformad för nanochipet. Den kan erhållas på GitHub via länken: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - Subtrahera bakgrundssignalerna för varje bild med de tre ROI: erna (5 pixlar x 5 pixlar) i bildens hörn med meshgrid-funktionen i MATLAB-kod 'BarGra_avg'. Denna operation syftar till att korrigera potentiella ojämna bakgrundsljud orsakade av mikroskopinställningen eller chiputjämning på mikroskopstadiet.
- Generera de genomsnittliga bilderna av nanobarer av samma storlek med MATLAB-koden 'BarGra_avg', där varje punkt är medelvärdet av värdena vid den punkten i alla enskilda nanobar-fyrkantiga masker. Generera 3D-ytdiagram av de genomsnittliga bilderna i Fiji-programvaran för att intuitivt visa den genomsnittliga signalfördelningen runt nanobarerna. Välj Analysera > ytdiagram > indata 100 för Polygonmultiplikator och markera kryssrutorna Skugga, Rita axel och Utjämna.
- Segmentera varje nanobar i tre områden, som inkluderar två nanobar-ändområden och ett nanobar-centerområde för att extrahera deras fluorescensintensiteter respektive med MATLAB-kod "avg_nanobar_quantification". Storleken på nanobarens ROI justeras efter nanobarens dimension med hjälp av "position" -filen.
- Dela proteinintensiteterna med lipidintensiteter extraherade från MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification' vid bar-ändområdet för att få nanobar-änddensiteten som utesluter ytareaeffekten.
- Plotta nanobar-änddensiteten med olika koncentrationer i GraphPad Prism för att få bindningskurvan. Öppna menyn Analysera . Välj Ickelinjär regression (kurvpassning) > Bindning - Mättnad > Specifik bindning med Hill slope-funktionen för att passa kurvan med Hill-ekvationen och beräkna sedan KD- och Hill-koefficientvärdet.
- Lipid- och proteinintensiteterna normaliseras till motsvarande intensiteter vid 600 nm nanobarscentret som förvärvats i samma bild med MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification'.
- Använd de ljusaste nio pixlarna av normaliserade proteinintensiteter vid nanobar-ändområdet dividerat med bar-mittområdet för att kvantifiera proteinkrökningsavkänningen med nanobarer av samma storlek, värdet heter "end-to-center-förhållande". Använd förhållandet mellan normaliserad proteinintensitet för att normalisera lipidintensiteten för att kvantifiera proteinkrökningsavkänningsområdet med nanobarer av olika storlek, värdet heter "Normaliserad nanobar-slutdensitet". Dessa värden beräknas med MATLAB-koden "avg_nanobar_quantification".
- Läs in FRAP-stackavbildningen i Fiji-programvaran. Välj FRAP-området och generera en ROI. Välj funktionen Mer > flera mått för att mäta intensiteten i FRAP-området för varje gång. Rita intensiteten i GraphPad-prisma för att generera FRAP-återhämtningskurvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nanobar-design rekommenderas för att undersöka proteiner med positiv krökningsavkänning, som innehåller en halvcirkel i varje ände med krökning definierad av nanobarbredden och en platt/noll krökningskontroll lokalt i mitten (figur 2A,B). Framgångsrik bildning av SLB på nanobarer resulterar i jämnt fördelade lipidmarkörsignaler över hela nanobarytan som visas i figur 2C. Signaler från flera nanobarer kan kombineras genom att medelvärdet av de enskilda nanobarbilderna (figur 2D) så att slumpmässiga variationer mellan olika nanobarer kan minimeras. En tidigare elektronmikroskopistudie visade att cellplasmamembran bildade konform beläggning runt hela nanostrukturerna24. Därför antas det syntetiska lipid-dubbelskiktet fästa tätt på nanostrukturytan, vilket ger diffraktionsbegränsade linjer på 200 nm nanobar som observerats i figur 4E. Dessutom kan membranfluiditeten på den nanobarböjda SLB också karakteriseras av FRAP-analys, där den fluorescerande signalen på en enda nanobar kan blekas individuellt för membranfluiditetskarakterisering (figur 2E, F).
Bildandet av SLB på nanobarer kräver generering av stadsjeepar på samma sätt som SLB-formationen på plana ytor som rapporterats tidigare17. Lipidsammansättningen av SUV: er bestämmer ytkemin hos den nanobarböjda SLB som kan ändras för membranmärkning och olika proteinbindningsmekanismer. Till exempel kan Texas Red DHPE läggas till i ~ 0,5 mol% i stadsjeepar så att anrikningen av membranytan på nanobarer lätt kan avbildas med fluorescensmikroskopi (figur 2C). Förutom visualisering kan lipidkompositionen också ändras för att underlätta proteinbindning på nanobarböjda SLB. Till exempel, för att underlätta förankringen av His-märkta proteiner, kan nickel-nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) föras till SLB på nanobarerna genom att införliva 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-karboxypentyl) iminodiättiksyra) succinyl] (nickelsalt) (18: 1 DGS-NTA (Ni)) i SUV (~ 1 mol%)25. Utan denna funktionella grupp på lipider kan grönt fluorescensprotein (GFP) inte binda till SLB med negativt laddad PS, vilket resulterar i ett mörkare barformat hål vid varje nanobarplats på grund av volymetrisk utarmning av GFP-signaler i lösningen (Figur 2G). Som jämförelse, genom att lägga till 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) i SLB, kan His-taggen märkt GFP starkt förankra på membranet för att tydligt följa SLB-formen böjd av nanobarer (Figur 2H). Lipiddiffusionen visade ingen detekterbar skillnad vid proteinbindning som undersökts genom FRAP-analys (kompletterande figur 1). Det är värt att notera att FRAP-mätningen endast baseras på intensiteten hos 0,5 mol% Texas Red DHPE i SLB, vilket kanske inte representerar 1 mol% DGS-NTA (Ni) som används för bindning av His-tag-proteinet. Dessutom kan laddade lipider som PS förbättra proteinbindningen genom elektrostatisk interaktion26, medan signaleringslipider såsom fosfatidylinositol (4,5) -bisfosfat (PIP2) också kan integreras i stadsjeepar för att underlätta specifik proteinbindning (t.ex. FCHo2, för vilken PIP2 finns avgörande för dess membrankrökningsavkänning27).
Kvaliteten på SLB-bildning när det gäller ytjämnhet och membranfluiditet är avgörande för att undersöka proteinkrökningsavkänningsförmågan på nanobarer. Det finns tre typiska problem som kan äventyra SLB-enhetlighet och flytbarhet. Den ena är bindningen av överflödiga stadsjeepar på SLB på grund av ineffektiv tvätt som genererar puncta både på nanobarerna och på det platta membranet mellan nanobarerna (figur 3A, B). Det påverkar signifikant kvantifieringen av proteinbindning på böjda eller plana ytor på nanobarer för krökningsavkänningsbedömning. En annan fråga är den oväntade introduktionen av luftbubblor inuti PDMS-kammaren under tvättsteget, vilket kan förstöra SLB längs banan för luft-vätskegränssnittet och lämna repliknande funktioner lätt identifierbara med extremt låga lipidsignaler på nanobarytan (figur 3C, D). Dessutom lämnar felaktigt rengjorda nanobarsubstrat slumpmässigt fördelade kemiska rester på ytan som förhindrar lipidadsorption för SLB-bildning. Det leder till generering av membrandefekter som kan eller inte kan vara över den optiska upplösningen för mikroskopivisualisering (figur 3E). Membranfluiditeten kommer dock att påverkas känsligt av membrandefektbildning28 så att FRAP-analys kan användas för att verifiera ytrenheten (figur 3F,G).
För att demonstrera karakteriseringen av krökningsavkännande protein med hjälp av nanobar array jämförs den typiska F-BAR-domänen med en nyligen identifierad inneboende oordnad region i FBP17 (IDR FBP17). F-BAR är fluorescerande märkt med Alexa Fluor 488 tetrafluorfenylesterfärgämnen medan IDRFBP17 är märkt med Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Som visas i figur 4A visar båda proteindomänerna ökad ackumulering på SLB-belagda enskilda nanobarer med 300 nm bredd. Här innehåller SLB 10% PS för att elektrostatiskt förbättra proteinbindningen. Proteinets krökningsavkänningsförmåga kan identifieras genom den förmånliga anrikningen vid de böjda nanobarändarna med högre fluorescerande intensitet än signalerna vid de platta nanobarcentren, vilket tydligare visas efter bildmedelvärde från mer än 100 nanobarer (Figur 4B). Krökningsavkänningsförmågan kan reflekteras kvantitativt genom att beräkna förhållandet mellan ände och centrum på varje nanobar (dvs. fluorescensintensiteten vid nanobaränden kontra nanobarcentret). Som visas i figur 4C har båda proteinerna ett högre förhållande mellan ände och centrum än lipider, vilket är cirka 1. När man jämför IDR FBP17 och F-BAR kan man se att det högre förhållandet mellan ändar och centrum förIDR FBP17 (1,385 ±0,011, medelvärde ± SEM) indikerar starkare krökningsavkänning än F-BAR (1,144 ± 0,004, medelvärde ± SEM).
För att undersöka det krökningsintervall som kan kännas av proteinerna genereras SLB på nanobarmatriser med gradientbredder från 200 nm till 600 nm (figur 4D) där lipider visade homogen beläggning på nanobarer av olika storlek (figur 4E). Tre proteiner (IDR FBP17, F-BAR och F-BAR+IDRFBP17) inkuberas på gradient nanobar-arrayen, och alla visade preferensackumulering vid nanobar-ändens krökta membranställen när krökningen minskade under 400 nm i diameter (figur 4E,F). Bland dessa tre proteindomäner ger IDRFBP17 den högsta nanobar-end-densiteten, vilket indikerar dess starkaste krökningsavkänningsförmåga, medan F-BAR visar det lägsta värdet (Figur 4F). Dessutom kan bindningskurvan för det krökningsavkännande proteinet också plottas genom att gradvis öka proteinkoncentrationen (figur 4G), vilket visar att IDRFBP17 har en stark kooperativ krökningsförmåga. Vid anpassning av dess bindningskurvor till Hill-ekvationen finns KD i μM-intervallet (0,6 ± 0,1 μM) och Hill-koefficienten (H) är mellan 2 och 3, vilket tyder på en ultrakänslig bindning av IDRFBP17 till nanobarinducerade membrankrökningar. Ju skarpare krökning, desto högre bindningskapacitet vid jämvikt.
Den dynamiska membrandiffusionen och membranassociationen av krökningsavkännande proteiner runt de nanobarformade SLB-platserna kan också studeras av FRAP. Jämfört med den snabba återhämtningen av lipidsignaler på nanobarer (figur 5A,E) kunde F-BAR inte återhämta sig inom 2 minuter (figur 5B,E), vilket tyder på dess signifikant minskade membranrörlighet och associationsdynamik vid de böjda membranställena. Överraskande nog, till skillnad från beteendet hos F-BAR, VISADE IDR FBP17-signalen uppenbar återhämtning inom samma tidsram (figur 5C,E), vilket indikerar den dynamiska karaktären hos IDRFBP17 som ackumuleras vid de böjda membranen. Men efter att ha tvättat bort den obundna IDR FBP17 i lösningen kunde samma återhämtning i IDRFBP17-kanalen inte observeras som tidigare (figur 5D,E). Det indikerar att återhämtningen domineras av utbytet med de lösningsinnehållande IDRFBP17-molekylerna och mindre av lateral diffusion av de membranbundna molekylerna.
Sammantaget visar dessa resultat att detta nanobar-SLB-system är ett kraftfullt verktyg för att karakterisera membrankrökningsavkännande proteiner in vitro.
Figur 1: Illustration av nanobar-SLB-systemet . (A) PDMS-kammaren består av de övre och mellersta skikten med det rengjorda nanochipet monterat på det. (B) Texas Red DHPE-märkta stadsjeepar med inzoomad detalj. (C) Den intakta modellen av nanobar-SLB-systemet och inzoomningsområdet illustrerar att SLB bildas på nanobarer med ett enhetligt enda lager av lipid-dubbelskiktet. (D) Bild- och karakteriseringsprocess under konfokalmikroskopi för laserskanning. (E) Rengöring av nanochipet för vidare återanvändning. (F) Bildbehandling för kvantifiering av proteinkrökningsavkänning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bildandet av den krökta SLB på nanobarer med proteinbindning . (A) SEM-bild av en enskild nanobar. (B) Schematisk avbildning av nanobar-SLB-systemet. (C) Fluorescerande bilder av SLB märkta med Texas Red DHPE på nanochipet. (D) Genomsnittlig bild av SLB-fördelning på nanobarer (överst) och ett 3D-ytdiagram av den genomsnittliga bilden (nederst). Denna siffra har modifierats från Su et al.22 och reproducerats med tillstånd. (E) Time-lapse-avbildning av SLB FRAP på nanobaren. Blekningsområdet indikeras av en gul streckad cirkel. (F) Normaliserat nanobarintensitetsdiagram genom FRAP-mätning. (G) Schematisk avbildning av GFP kan inte binda till SLB med 10 mol% negativt laddad PS (vänster) och en motsvarande representativ bild till höger. (H) Schematisk avbildning av His-tag märkt GFP bunden till SLB med 1 mol% DGS-NTA (Ni) (vänster) och en motsvarande representativ bild till höger. Skalstreck: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Typiska problem som äventyrar SLB-kvaliteten . (A) Schematisk för SLB-förberedelse utan effektiv tvätt. (B) Representativ bild av SLB-bindningen med överflödiga stadsjeepar. De gula pilarna visar puncta som är överflödiga stadsjeepar på SLB-ytan. (C) Schematisk beskrivning av SLB-beredning med injicerade luftbubblor. (D) Representativ bild av SLB som förstörts av banan för luft-vätskegränssnittet. Den gula pilen visar den ofullständiga SLB på substratet. (E) Schematisk för SLB-beredning med orenade nanobarsubstrat. Inzoomningsområdet visar ett diskontinuerligt lipid-dubbelskikt på grund av att ytresterna förhindrar lipidadsorption. (F) Time-lapse-avbildning av SLB FRAP-analys på orenade nanobarsubstrat. Blekningsområdet indikeras av en gul streckad cirkel. (G) Normaliserat nanobarintensitetsdiagram genom FRAP-mätning. Skalstreck: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Karakterisering av proteinkrökningsavkänning av nanobar-SLB-systemet. (A) Fluorescerande bilder av F-BAR (vänster) ochIDR FBP17 (höger) ackumuleras på SLB-belagda nanobarer (10% PS och 90% PC). Skalstreck: 2 μm. (B) Genomsnittliga bilder av F-BAR (vänster överst) och IDRFBP17 (vänster botten) ackumuleras på nanobarer och motsvarande 3D-ytdiagram (höger topp respektive höger botten). Skalstång: 2 μm. (C) End-to-center-förhållande mellan lipid-dubbelskiktet, F-BAR och IDR FBP17-fluorescensintensiteten runt nanobaren på 300 nm. Ett Welchs t-test utfördes för statistisk analys. p < 0,0001. (n = 3) (D) SEM-bild av gradientnanobarmatriser med bredder från 200 nm till 600 nm. Skalstreck: 5 μm. (E) Annotering av proteinkonstruktion (överst), genomsnittliga bilder av lipid-dubbelskikt, IDR FBP17, F-BAR och F-BAR + IDRFBP17-fördelning på gradientnanobarer med bredd från 200 nm till 600 nm (mitten) och intensitetsprofiler längs nanofälten för varje genomsnittlig bild (botten). Skalstreck: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR och F-BAR + IDRFBP17 normaliserad nanobar-änddensitet kvantifierad med olika bredder av nanobarer respektive. Varje data visas som medelvärdet ± SEM (n ≥ 60). (G) Bindningskurvan förIDR FBP17 utrustad med Hill-ekvationen. Varje data visas som medelvärdet ± SEM (n = 3). Denna siffra har modifierats från Su et al.22 och reproducerats med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Den membranbindande dynamiken hos krökningsavkännande proteiner runt nanobaren. (A-D) Time-lapse-avbildning av lipid-dubbelskiktet (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) och IDRFBP17 tvättas ut (D) FRAP-analys på nanobaren. Blekningsområdet indikeras av en röd streckad cirkel. Skalstreck: 5 μm. (E) Normaliserat nanobarintensitetsdiagram genom FRAP-mätning. Denna siffra har modifierats från Su et al.22 och reproducerats med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Membrandiffusion före och efter tillsats av protein. (A) Time-lapse-avbildning av FRAP-test på POPC-lipid-dubbelskiktet med 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) och 0,5 mol% Texas Red DHPE runt nanobaren före (överst) och efter (botten) tillsats av GFP-His-protein. Blekningsområdet indikeras av en gul streckad cirkel. (B) Normaliserat nanobarintensitetsdiagram genom FRAP-mätning. Skalstreck: 2 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanobar-SLB-systemet som beskrivs här erbjuder en unik kombination av fördelarna i flera befintliga in vitro-analyser. Det avslöjar effektivt den föredragna bindningen av proteiner till mycket krökta membran som liposomflytning eller sedimenteringsanalys men kräver mycket färre prover och erbjuder mer exakt definierad krökning på enskilda nanobarer 8,29. Det erbjuder också ett brett utbud av exakt kontrollerad krökning för samtidig jämförelse som SLiC-analysen, med mindre oro för lipidkompositionsförändring i olika krökningar och omätbara morfologiska eller krökningsförändringar med storlekar under diffraktionsgränsen för ljus, eftersom SLB är mobil och kontinuerligt täcker alla storlekar på nanobars tätt30 . Nanobar-SLB möjliggör också observation av dynamiska beteenden hos protein på det böjda membranet som de tjudrande analyserna, men inte begränsat av genomströmningen av rörgenerering och erfarenhet av optisk fångstmanipulation13. Även om SMrT-analysen genererar membranrör med hög genomströmning, varierar membrankrökningen längs nanoröret vilket gör det svårare att studera krökningskänsligheten hos proteiner16. Mer intressant, jämfört med andra SLB-baserade system på det mönstrade substratet18,19,20,27, ger nanobar-SLB ett platt stångcentrum bredvid den definierade krökningen vid stångänden, som effektivt fungerar som lokal kontroll av nollkrökning för att minimera effekten av ytdensitetsvariationer på kvantitativ analys. Möjligheten att anpassa krökningskombinationer med högupplöst elektronstrålelitografi kan generera inte bara lokala nollkrökningskontroller utan också positiva och negativa krökningar som visats tidigare i levande cellstudier2.
Det finns potentiella begränsningar som är värda att notera när du använder den här metoden. För det första är nanofabrikation på chipet ett relativt komplext förfarande, med renrumsanläggningar och specialutrustning som behövs (i synnerhet en E-strålskrivare). Denna höga kostnad ledde till att vi återanvände chipet; detta resulterar i en längre tid att rengöra spånytan och montera chipet med PDMS jämfört med engångsanvändning. Tillgängligheten av nanochipet är en annan typ av begränsning. Felaktig användning vid användning av chipet, t.ex. vänd mot ytan mot bänken, kan orsaka nanostrukturutmattning, särskilt för strukturerna med högt aspektförhållande. Dessutom är lipid-dubbelskiktet som bildas på substratet ett kontinuerligt membran; spänningen kan lätt spridas överallt. För studier som kräver manipulering av membranspänningen ger tekniker som tether som dras från GUVs via det bifogade mikropipettsystemet mer praktiska lösningar10.
För att uppnå optimala resultat är följande steg också kritiska. i) Vesikelstorleken är avgörande för SLB-bildning31,32. Tidigare litteratur visar en högre benägenhet att smälta samman för mindre vesiklar (< 90 nm) jämfört med större storlek med hjälp av en kvartskristallmikrobalans med dissipation (QCM-D) test32. Således, jämfört med LUVs på 300 nm, kommer diametrarna på ~ 50 nm att vara lättare för SLB-bildning. Med tanke på detta problem behövs minst 20 gånger i både frys-tina och extruderingssteg för att bilda homogena SUV: er för SLB-bildning. FRAP-test är också nödvändigt i varje experiment för att validera membranmobiliteten. ii) Under SUV-förberedelser bör all utrustning hållas ren för att undvika kontaminering av dammliknande små partiklar. Speciellt för mini-extrudern är nålarna lätt igensatta i en smutsig miljö. (iii) För att förbereda stadsjeepar med god kvalitet måste kloroformen i lipidblandningen avlägsnas helt för att undvika att förstöra lipidblåsor. (iv) Plasmarengöring av chipet måste utföras nyligen före SLB-bildning för att säkerställa en mycket hydrofil yta för effektiv SUV-brott för att bilda ett kontinuerligt dubbelskikt. Långvarig exponering i miljön efter plasmabehandling kan orsaka ospecifik bindning av dammpartiklar eller organiska rester till spånytan, vilket äventyrar ytans hydrofilicitet. v) För att montera PDMS-kammaren för SLB-bildning och proteininkubation är renheten och planheten hos varje PDMS-bit viktig för att säkerställa en god tätning av fluidkanalen. Eventuellt läckage av kammaren kan orsaka att SLB torkar ut eller ändrar proteinkoncentrationen. (vi) Bildfokusjustering är avgörande för att säkerställa konsekvent intensitetsmätning, eftersom nanobarens höjd (600 nm) är jämförbar med brännvidden för laserskanningskonfokalmikroskopin i z-axeln33. Fokus bör justeras varje gång matrisen rör sig horisontellt för att bibehålla skärpan på nanobarkanterna i bilderna.
Framför allt ger nanobar-SLB-systemet som introduceras här en kraftfull metod för att studera membrankrökningsavkänningsproteinerna. Olika parametrar som påverkar proteininteraktionen med det krökta membranet kan studeras kvantitativt över ett intervall av krökningar, såsom krökningskänsliga domäner (t.ex. BAR-domän och amfifil helix) av proteinet8,30, lipidsammansättning (t.ex. PS och PIP2) av membranet27,34, pH, jonstyrka och temperatur i miljön35,36 , samt protein-proteininteraktionen för komplex bildning (t.ex. CHMP2B och CHMP2A kan bidra på olika sätt till ESCRT-III-katalyserade membranombyggnadsprocesser)37,38. Dynamiska studier kan också utföras med hjälp av nanobar-SLB-systemet för att undersöka membranbindande kinetisk 11, membranproteindiffusion eller sammansättning39, samt enzymatiska reaktioner 40 eller fasseparation betedande13,41,42. Dessutom betraktas det artificiella lipid-dubbelskiktet i allmänhet som symmetriskt med varje lipidmonolager innehållande samma lipidkomposition, vilket är helt annorlunda än det levande cellmembranet43. Inducering av ett asymmetri dubbelskikt för att bättre efterlikna plasmamembranet kan erhållas genom att ändra materialet på ytan, bufferttillståndet, lipidkompositionen eller temperaturen44,45,46,47. Det är av stort värde att verifiera om ett asymmetriskt dubbelskikt kan bildas på nanobar-SLB-systemet för att studera proteinbeteende på det krökta membranet, vilket förtjänar ytterligare studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiskt intresse i detta arbete.
Acknowledgments
Vi tackar Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) och Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) vid Nanyang Technological University (NTU) för att stödja nanostrukturtillverkning och SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) vid School of Biological Sciences NTU för proteinrening och School of Chemical and Biomedical Engineering NTU för konfokalmikroskopet. Detta arbete finansieras av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 och MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) som stöds av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-systemet (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), Skolan för kemisk och biomedicinsk teknik NTU för forskningsstipendiet (X. Miao) och China Scholarship Council för forskningsstipendiet (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
