Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להעלאת ריכוז הגלוקוז בנוזל השדרה (CSF) של עכברים. גישה זו יכולה להיות שימושית לחקר ההשפעות של גלוקוז CSF גבוה על ניוון עצבי, קוגניציה ומטבוליזם של גלוקוז היקפי בעכברים.
Abstract
סוכרת מעלה את הסיכון לירידה קוגניטיבית ופוגעת בתפקוד המוח. השאלה אם הקשר הזה בין גלוקוז גבוה לליקויים קוגניטיביים הוא סיבתי או לא נותרה חמקמקה. יתר על כן, לא ברור אם גירעונות אלה מתווכים על ידי עלייה ברמות הגלוקוז בנוזל השדרה (CSF) ו / או בדם. ישנם מעט מאוד מחקרים החוקרים את ההשפעות הישירות של רמות גלוקוז גבוהות של CSF על תפקוד מערכת העצבים המרכזית (CNS), במיוחד על למידה וזיכרון, שכן המודלים הנוכחיים של סוכרת אינם מפותחים מספיק כדי לענות על שאלות מחקר כאלה. מאמר זה מתאר שיטה לעלייה כרונית של רמות הגלוקוז ב- CSF למשך 4 שבועות על ידי החדרת גלוקוז ברציפות לחדר הצידי באמצעות מיני-משאבות אוסמוטיות בעכברים. הפרוטוקול אומת על ידי מדידת רמות הסוכר ב- CSF. פרוטוקול זה הגביר את רמות הגלוקוז ב- CSF ל~328 מ"ג / ד"ל לאחר עירוי של תמיסת גלוקוז 50% בקצב זרימה של 0.25 מיקרוליטר / שעה, בהשוואה לריכוז גלוקוז CSF של ~ 56 מ"ג / ד"ל בעכברים שקיבלו נוזל מוחי מלאכותי (aCSF). יתר על כן, פרוטוקול זה לא השפיע על רמות הגלוקוז בדם. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעות הישירות של גלוקוז CSF גבוה על תפקוד המוח או מסלול עצבי מסוים ללא תלות בשינויים ברמות הגלוקוז בדם. בסך הכל, הגישה המתוארת כאן תקל על פיתוח מודלים של בעלי חיים לבדיקת התפקיד של גלוקוז CSF גבוה בתיווך תכונות של מחלת אלצהיימר ו / או הפרעות נוירודגנרטיביות אחרות הקשורות לסוכרת.
Introduction
גם סוכרת מסוג 1 וגם סוכרת מסוג 2 פוגעות בתפקוד המוח 1,2,3. לדוגמה, סוכרת מעלה את הסיכון לירידה קוגניטיבית והפרעות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר 3,4. יתר על כן, לאנשים עם סוכרת יש חישת גלוקוז פגומה במוח 5,6. פגם זה תורם לפתוגנזה של חוסר מודעות הקשור להיפוגליקמיה ולתגובה נגדית לא מספקת להיפוגליקמיה7,8, שיכולה להיות קטלנית אם לא תטופל מיד.
בהתחשב בכך שסוכרת מעלה את רמות הגלוקוז בדם, כמו גם בנוזל השדרה (CSF)9, חשוב לקבוע אם אחד או שני הגורמים הללו תורמים לתפקוד מוחי לקוי. האם סוכרת גורמת נזק מוחי על ידי גלוקוז CSF גבוה לבד או בשילוב עם גורמים אחרים כמו מחסור באינסולין או עמידות לאינסולין היא גם שאלה פתוחה. מודלים של בעלי חיים של סוכרת מסוג 1 וסוג 2 מראים ירידה קוגניטיבית וניוון עצבי בנוסף למאזן אנרגיה מושפע ומטבוליזם גלוקוז היקפי10,11,12,13. עם זאת, ממודלים אלה, לא ניתן לנתק את ההשפעות הסלקטיביות של גלוקוז CSF גבוה לעומת רמות גלוקוז בדם בתיווך סיבוכי סוכרת על תפקוד המוח.
פרוטוקול זה מתאר שיטות לפיתוח מודל עכברי של היפרגליצורכיה כדי לבדוק את ההשפעות של רמות גלוקוז CSF גבוהות כרוניות על תפקוד המוח, מאזן האנרגיה והומאוסטזיס גלוקוז. מודל העכבר שפותח בטכניקה זו מציג כלי למחקרים החוקרים את התפקיד האטיולוגי של הומאוסטזיס גלוקוז לא מווסת על תפקוד עצבי והתנהגותי.
לכן, הגישה המוצעת תהיה שימושית בהבנת ההשפעות הישירות של רמות גלוקוז גבוהות CSF בתנאים פתופיזיולוגיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר ובוצעו בהתאם להנחיות שירות בריאות הציבור האמריקאי לטיפול הומני ושימוש בחיות ניסוי. עכברים זכרים בני שישה שבועות C57BL/6J ששימשו למחקר זה התקבלו באופן מסחרי. כל בעלי החיים שוכנו בקבוצה (5 עכברים לכלוב) בחדר עם מחזור יום / לילה של 12 שעות וקיבלו גישה למזון ומים עד לליביטום. לאחר שהעכברים הושתלו עם צינורית להחדרת גלוקוז לחדר הצידי, הם שוכנו בודדים כדי למנוע נזק לשתלים מעכברים אחרים.
1. הרכבה של מיני-משאבות אוסמוטיות
- הכינו נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) בהתאם לפרוטוקול הבא. יש להמיס NaCl (8.66 גרם), KCl (0.224 גרם), CaCl 2.2H 2 O (0.206 גרם) ו-MgCl 2.6H 2 O (0.163 גרם) ב-500 מ"ל מים סטריליים להכנת תמיסה A. להמיס Na 2 HPO 4.7H 2 O (0.214 גרם) ו-NaH 2 PO4. H2O (0.027 גרם) ב 500 מ"ל של מים סטריליים להכנת תמיסה B. לאחר מכן, ערבבו תמיסה A ו-B ביחס של 1:1 כדי להכין את ה-aCSF.
הערה: נוסחה זו של aCSF אינה מכילה גלוקוז. - כדי להכין את תמיסת הגלוקוז 50%, הוסף 50 גרם גלוקוז ל -50 מ"ל של aCSF בכד. מניחים את הכד על צלחת חמה ומביאים את טמפרטורת ההשעיה ל 60 מעלות צלזיוס. מערבבים את המתלה עם מערבל מגנטי עד שהגלוקוז מומס לחלוטין.
- הוסף aCSF לכד כדי להפוך את הנפח הסופי ל -100 מ"ל. העבירו את התמיסה דרך מסנן נקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי לעקר אותה.
- הכינו תמיסת מלח 0.9% (NaCl) והעבירו את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
- מניחים את כל רכיבי המיני-משאבה וערכת העירוי במגש סטרילי וחותכים את הצינורית מערכת עירוי המוח לאורך של 1 אינץ' בעזרת מספריים סטריליים. החזיקו את הצינור עם המוסטאט סטרילי ודחפו אותו על החלק העליון של קצה אחד של הצינורית. חבר את הקצה השני של הצינור לצד העליון של אפנן הזרימה. כסו את שני קצוות הצינור בכמות קטנה של דבק לחיבור חזק יותר.
- חבר מחט 27 גרם למזרק 1 מ"ל ומלא אותו עם aCSF או תמיסת גלוקוז. הכנס את מחט 27 G לחתיכה קטנה של צינור. לאחר מכן, חבר את הצינור לקצה הפתוח של אפנן הזרימה ומלא אותו בתמיסה המתאימה עד שטיפות של התמיסה מתחילות לצאת מהצינורית. הסר בועות אוויר הכלואות בצינור.
- כדי למלא את המיני-משאבה, החזק את המשאבה זקופה והכנס את מחט המזרק למשאבה. מלאו אותו בתמיסה המתאימה עד שטיפה של התמיסה מתחילה להיווצר בפתח המיני-משאבה.
- הכניסו באיטיות את אפנן הזרימה למשאבה תוך הקפדה שלא להכניס בועות אוויר למכלול.
- לאחר התאספות המיני-משאבות האוסמוטיות, העבירו אותן לצינור חרוטי של 50 מ"ל. ממלאים את הצינור במי מלח סטריליים כך שהמשאבות יהיו שקועות לחלוטין, תוך הקפדה על כך שהצינורית תישאר מחוץ לתמיסת המלח. ארבע משאבות התאספו כאלה ניתן להציב צינור אחד 50 מ"ל.
- הניחו את הפקק באופן רופף על כל צינור ודגרו על המשאבות בטמפרטורה של 37°C למשך 48 שעות לפחות.
2. ניתוח להשתלת משאבות אוסמוטיות
- הליך טרום ניתוח
- יש לעקר את כלי הניתוח באוטוקלאבה ולתת להם להתקרר לפחות 30 דקות לפני השימוש. תנאי autoclave כרוך עיקור קיטור ב 121 ° C במשך 30 דקות.
- יש לחטא את אזור הניתוח באתנול 70%. נגבו את הידיות, מוטות האוזניים ומשטח המסגרת הסטריאוטקסית.
הערה: יש לבצע את הניתוח בסביבה אספטית, תוך התחשבות בהימנעות ממגע במשטחים לא סטריליים בעת ביצוע הניתוח. החלף כפפות אם יש חשד לזיהום. - הניחו את העכבר בתא הרדמה כדי להרדים אותו עם 3% איזופלורן מעורבב באוויר למשך 3-5 דקות. לאחר מכן, הסר את העכבר מהחדר והנח אותו על שריטה סטרילית. יש לשמור על הרדמה דרך חרוט אף בשיעור של 1.5%-2%.
- צבוט את כף העכבר האחורית כדי לצפות בכל רפלקס ולאמת את עומק ההרדמה.
- להזריק 5 מ"ג / ק"ג carprofen תת עורית עבור שיכוך כאבים.
- השתמש בקוצץ נקי כדי לחתוך את אזור הניתוח בראש העכבר. שפשפו את הקרקפת תחילה בתמיסת פובידון-יוד ולאחר מכן במקלוני אלכוהול ביסודיות למשך 2 דקות לפחות. חזור על תהליך זה לפחות שלוש פעמים.
- יש למרוח חומר סיכה לעיניים כדי למנוע התייבשות של העיניים במהלך הניתוח.
- כירורגיה
- הניחו את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית והתאימו את הראש למוט החותך. מכסים את האף בחרוט האף. יש למרוח וילונות סטריליים כדי לאבטח את אזור הניתוח.
- העבר את זרימת האיזופלורן לחרוט האף. המשך להרדמה באיזופלורן 1.5%-2%.
- הניחו כרית חימום מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
- לבשו כפפות סטריליות חדשות, ובעזרת אזמל בצעו חתך בקו האמצע (~10-15 מ"מ אורך) בקרקפת. חשוף את פני הגולגולת עם מרית תוך שימוש בקצוות כותנה כדי לנגב כל דימום.
הערה: השתמש בצורבי אם אתה מדמם בשפע, וזה נדיר. - שפשפו עם קצה כותנה טבול במי חמצן 3% כדי לחשוף את התפרים הגולגולתיים.
- שימו לב לברגמה ולמבדה כדי לנווט בקואורדינטות הגולגולת. הגדר את כל הקואורדינטות לאפס בברגמה.
הערה: קואורדינטות אלה התקבלו מאטלס מוח עכבר14. מרחק הייחוס bregma-lambda באטלס הוא 4.21 מ"מ. כדי לתקן הבדלים מבוססי גיל ומין בגודל הגולגולת, המרחק ברגמה-למדא עבור כל עכבר נמדד ולאחר מכן חולק ב -4.21 מ"מ כדי לקבל מקדם כפל. לדוגמה, אם המרחק בין ברגמה ללמדא היה 4.65 מ"מ, חלוקה ב-4.21 מ"מ נתנה מקדם כפל של 1.10. כל הקואורדינטות שהתקבלו מהאטלס הוכפלו לאחר מכן בגורם זה כדי למדוד את הקואורדינטות בפועל ששימשו לקידוח החור. בדוגמה לעיל, הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות (AP) והמדיאליות-צדדיות (ML) המתקבלות יהיו 0.55 ו-1.1 מ"מ, בהתאמה (כלומר, 1.1 x 0.5 או 1 מ"מ). - השתמש במקדחה חשמלית כדי ליצור חור בקואורדינטות הבאות: 0.5 מ"מ אחורי לברגמה ו-1 מ"מ רוחבי לקו אמצע לכיוון ימין.
הערה: בעת קידוח החור בגולגולת, היזהר לא לקרוע את הדורה מאטר. ודא שהמקדחה סטרילית. זה יכול להיות ממוקם עם מכשירים אחרים באותו נרתיק autoclave לעיקור. - הכנס המוסטאט מתחת לעור החתוך ודחוף אותו למקום שבו תושתל המיני-משאבה האוסמוטית. פתחו וסגרו בעדינות את ההמוסטאט כדי ליצור כיס למשאבה הזעירה.
- השתמש hemostat סטרילי כדי לבחור מיני-משאבה אוסמוטית דרוכה מקצה אפנן הזרימה. דחפו את המשאבה דרך העור החתוך לתוך הכיס.
הערה: היזהר לא לתת למשאבה ולצינורית לגעת במשטח שאינו סטרילי. - מרחו מעט דבק על החלק התחתון של הצינורית וקיבעו אותו במחזיק הצינורית. מורידים את הצינורית באיטיות דרך החור שנקדח 2 מ"מ גחון אל פני הגולגולת. השאירו אותו שם לפחות 5 דקות כדי לאפשר לדבק להתמצק.
- לפני החדרת הצינורית למוח, יש לוודא שהצינורית אינה סתומה ושהתמיסה זורמת כראוי.
הערה: לפעמים, גלוקוז עלול לשקוע בקצה הצינורית עקב קצב זרימה נמוך מאוד, חוסם את הזרימה. - בעזרת מספריים, חתכו את החלק העליון של הצינורית כדי לוודא שהיא לא תזוז משטח הגולגולת.
- כסו את הצינורית בשכבה של מלט דנטלי לתמיכה נוספת.
- השתמש בתפרי ניילון (בגודל 5-0 ובאורך 30 אינץ ') כדי לסגור את הפצע ומרח אנטיביוטיקה מקומית על הפצע כדי למנוע זיהום.
- כבו את האיזופלורן ותנו לבעל החיים להתאושש מההרדמה. לאחר מכן, העבירו את החיה לכלוב נקי חדש.
- טיפול לאחר הניתוח
- לאחר הניתוח, לפקח על העכבר במשך שבוע אחד לפחות.
- יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת עורית, אחת ל-24 שעות במשך שלושה ימים לאחר הניתוח.
- תן לפצע להחלים לחלוטין לפני הסרת התפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח.
הערה: נצפה כי לעכברים עם גלוקוז CSF גבוה לקח זמן רב יותר להחלים. גזיזת ציפורניים בכפותיו האחוריות של העכבר ממזערת את הסיכוי לפגיעה באתר החתך עקב התנהגות הגירוד של עכברים.
3. החלפת המיני-משאבות
הערה: מכיוון שהמיני-משאבות המשמשות במחקר זה נמשכות רק 4 שבועות, החלפת המיני-משאבות נבדקה גם כדי להאריך את משך עירוי הגלוקוז, כפי שהוא עשוי להידרש במקרה של מחקרים ארוכי טווח. זה כלל את השלבים הבאים.
- הכינו את העכברים לניתוח כמפורט לעיל.
- בצע חתך אנכי קטן של 1 ס"מ בעור מעט מעל המשאבה.
- הכניסו המוסטאט מתחת לעור החתוך ומשכו את המשאבה החוצה.
- הוציאו את המשאבה מהצינור וחברו משאבה דרוכה חדשה לצנרת.
- הכניסו את המשאבה חזרה פנימה ותפרו את העור.
- בצע את אותן הוראות טיפול לאחר הניתוח כמתואר לעיל.
4. נוהל איסוף CSF
- הכנה
- משוך נימי זכוכית בקוטר 1 מ"מ עם מכונת משיכה מיקרופיפטה לקבלת קצוות בקוטר 0.5 מ"מ. ההגדרות הן: חום = 800, משיכה = 15, מהירות = 5, וזמן = 200 יחידות. מניחים את הנימים המשוכים בקופסה סטרילית עד לשימוש.
- חבר מחט 27 גרם למזרק 1 מ"ל. הכנס את הנימים המושכים על המחט והשתמש בסרט דבק קטן כדי לאבטח את החיבור.
- לתקן בחוזקה את המזרק במחזיק נימי של micromanipulator.
- לאחר מכן, הכן את העכבר לניתוח, כמתואר בהליך שלפני הניתוח לעיל.
- הליך כירורגי
- הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית. לאחר קיבוע הראש על המסגרת, כפי שתואר קודם לכן, סובב את הידיות כדי להטות את הראש כך שהאף פונה כלפי מטה. יש למרוח וילונות סטריליים כדי לאבטח את אזור הניתוח.
- בצע חתך קטן על פני השטח הגבי, החל מן המישור intra-aural לצד caudal.
הערה: יש להיזהר שלא לפגוע בצינור בעת ביצוע החתך. - הסר את התמיכה מגוף העכבר ותן לעכבר לנוח אנכית כך שהצוואר יהיה מוארך במלואו בגב.
- בעזרת מלקחיים קהים מעוקלים, חתכו בעדינות את שרירי הצוואר האחוריים מקו האמצע כדי ליצור חלון קטן. לאחר מכן, השתמשו באפליקטור קצה כותנה רטוב כדי להזיז בעדינות את שרירי הצוואר מקו האמצע לפריפריה.
- שימו לב אם ה-cisterna magna חשוף, המופיע כחלון משולש עם קרום דורה שקוף.
- הניחו את מכלול המיקרומניפולטור על המסגרת הסטריאוטקסית שליד העכבר תוך כדי שאתם מוודאים שקצה הנימים אינו נוגע בשום משטח.
- שברו בעדינות את קצה הנימים מבלי להפריע להתקנה.
- תוך כדי התבוננות לתוך זכוכית המגדלת (הגדלה של פי 2.25), סובבו את הידיות המתאימות על המיקרומניפולטור כדי ליישר באיטיות ולהזיז את קצה הנימים לכיוון מגננת הציסטרנה.
- התנגדות מסוימת מורגשת ברגע שקצה הנימים נוגע בקרום cisterna magna. לאט מאוד לדחוף את הקצה כנגד הממברנה בעזרת הידיות.
הערה: יש להיזהר שלא לפגוע בכלי דם כלשהם בקרום. שלב זה חשוב מאוד כדי למנוע כל זיהום דם ב- CSF. - חודרים בעדינות רבה את הממברנה. CSF יתחיל לזרום לתוך הנימים בבת אחת עקב לחץ שלילי בנימים.
- השאר את ההתקנה במשך כמה דקות עד ~ 10 μL של CSF נאסף נימים.
- לאחר מכן, משכו באיטיות את הנימים מתוך ה-cisterna magna ולחצו בעדינות על מוליך קצה כותנה סטרילי כנגד פתח ה-cisterna magna כדי לעצור את דליפת CSF.
- בזהירות להסיר את הנימים מן המזרק ולצרף אותו למתקן נורה microcap. לחץ על הנורה כדי להעביר את CSF לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
- מקם תמיכה מתחת לעכבר וסובב את הידיות הסטריאוטקסיות כדי ליישר את הראש.
- סוגרים את הפצע עם תפרים בניילון.
- להזריק 300 μL של מלוחים סטריליים תת עורית לפני הסרת העכבר מן המנגנון.
- תן טיפול לאחר הניתוח לבעלי החיים כמתואר לעיל, עד שהגיע הזמן להסיר את התפרים - ~ 7-10 ימים לאחר הניתוח.
5. בדיקת גלוקוז
- עקוב אחר הפרוטוקול כמתואר בערכת הבדיקה הקולורימטרית של גלוקוז.
- יש לדלל את תמיסת מאגר הנתרן פוספט המסופקת בערכה לריכוז של 50 מילימטר במים טהורים במיוחד.
- הכינו תקני סוכר בטווח של 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25 ו-50 מ"ג/ד"ל מתמיסת מלאי של 1,000 מ"ג/ד"ל המסופקת בערכה בתמיסת חיץ מדוללת.
- הכינו דילול פי 7 של דגימות CSF בחיץ. לדוגמה, אם נפח CSF הכולל שנאסף הוא 10 μL, אז נפח מדולל פי שבעה יהיה 70 μL.
- פיפטה 15 μL של תקני גלוקוז CSF מדולל בכפילויות בצלחת 96 באר.
- פיפטה 85 μL של חיץ מדולל בכל אחת הבארות עם תקנים CSF.
- הוסיפו 6 מ"ל של חיץ מדולל לבקבוקון תערובת האנזים הקלורימטרי של גלוקוז וערבבו אותו למשך מספר שניות כדי לערבב היטב.
- הוסף 100 μL של הכנת תערובת אנזימים לכל באר כדי להתחיל את התגובה.
- אטמו את הצלחת עם דף כיסוי וטפחו על הצלחת בעדינות כדי לערבב את הריאגנטים.
- מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C למשך 10 דקות. בקבוקונים עם גלוקוז גבוה מתחילים להפוך לסגולים מיד.
- לאחר 10 דקות, הסירו את הכיסוי ומדדו את הספיגה ב-500-520 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
- חשב את ריכוז הגלוקוז בדגימות CSF על ידי אינטרפולציה של הערכים שלהם מהעקומה הסטנדרטית.
6. בדיקת גלוקוז בדם
- בצע ניק רוחבי קטן לזנב העכבר באמצעות סכין גילוח והשתמש בטיפת דם כדי למדוד את רמת הגלוקוז בדם באמצעות גלוקומטר, על פי ההוראות הידניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים זכרים הושתלו עם צינורית שהורכבה למיני-משאבה אוסמוטית (איור 1) כדי להחדיר באופן כרוני aCSF או תמיסת גלוקוז של 50% לתוך החדרים הצדיים שלהם (איור 2). CSF נאסף 10 ימים לאחר הניתוח (איור 3) כדי לאמת את היעילות של הליך זה. התוצאות הראו עלייה ברמות הגלוקוז CSF (ממוצע: 327.7 מ"ג / ד"ל) בעכברים עם 50% גלוקוז בהשוואה לזה (ממוצע: 56.5 מ"ג / ד"ל) בעכברים עם aCSF. זוהי עלייה של בערך פי שישה ברמות הגלוקוז ב-CSF בעכברי הניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת שלהם (איור 4A). רמות הגלוקוז בדם לא היו שונות בין הקבוצות (איור 4B).
איור 1: הרכבה של מיני-משאבות אוסמוטיות . (A) הרכבת עירוי עם צינורית המחוברת למיני-משאבה באמצעות צינורות. משאבות אלה דורשות לפחות 48 שעות כדי להגיע לפריים. (B) הימצאותן של בועות אוויר מחוץ למשאבות הזעירות מאשרת את הפריימינג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מנגנון ואביזרים סטריאוטקסיים . (A,B) ציוד סטריאוטקסי עם מיקרומניפולטור מחובר ואביזרים אחרים. (C) קואורדינטות חור בור להחדרת הצינורית. (D) השתלת משאבת מיני אוסמוטית, (E,F) החדרת הצינורית לחור הקדוח. לשמור על תנאים אספטיים לאורך כל הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הליך איסוף נוזל מוחי שדרתי (CSF). (A) שרירי הצוואר הגבי נעקרו בעדינות בעזרת מלקחיים קהים כדי לחשוף את מגננת הסיסטרנה. נימי 1 מ"מ עם קצה בקוטר 0.5 מ"מ שימשו כדי (B) לקרוע ו-(C,D) לאסוף CSF ממגננת הציסטרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדידת גלוקוז. (A) גלוקוז CSF מוגבר (B) מבלי להשפיע על רמות הגלוקוז בדם שאינן בצום בעכברים עם תמיסת גלוקוז של 50% בחדר הצידי. יעילותו של פרוטוקול זה אומתה על ידי מדידת CSF וריכוז גלוקוז בדם 10 ימים לאחר תחילת עירוי הגלוקוז. לעכברים עם תמיסת גלוקוז 50% היו רמות גלוקוז CSF של 327.7 ± 30.1 מ"ג / ד"ל (ממוצע ± שגיאת תקן של ממוצע) בהשוואה לעכברים שקיבלו עירוי CSF מלאכותי עם רמות גלוקוז של 56.5 ± 2.6 מ"ג / ד"ל. P < 0.0001, מבחן t לא מזווג. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של ממוצע (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט להעלאת גלוקוז CSF בעכברים באמצעות מיני-משאבות אוסמוטיות המחוברות לצינורית שהושתלה בחדר הצידי. עירוי כרוני של גלוקוז במוח העכבר באמצעות הליך זה יהיה שימושי בתיאור ההשפעות של היפרגליצורכיה לטווח ארוך על קוגניציה, מטבוליזם גלוקוז מערכתי, ואיזון אנרגיה ולהבנה טובה יותר של הפתוגנזה של סיבוכי סוכרת.
סוכרת כרונית גורמת לנזק מוחי המפריע לתקשורת בין המוח לאיברי הפריפריה15. סוכרת גם מעלה את הסיכון למחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר 3,4. סטרפטוזוטוקין (STZ) - סוכרת מסוג 1 הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוקין הייתה מודל המכרסם הסטנדרטי במחקר סוכרת16; STZ פוגע בתאי β בלבלב, מה שמוביל לפתולוגיה דמוית סוכרת מסוג 1. יתר על כן, בגרסה שונה, השימוש STZ מלווה ניקוטינאמידים יכול לגרום סוכרת מסוג 2. דרך נוספת לפתח פנוטיפים דמויי סוכרת מסוג 2 בבעלי חיים היא באמצעות האכלתם בתזונה עתירת שומן16. עם זאת, בהקשר של חקר ההשפעה של היפרגליקמיה על תפקוד המוח, טכניקות אלה מוגבלות בשליטה על מספר רב של גורמים (למשל, רמות אינסולין היקפי / גלוקגון, ותפקוד מטבולי בכלל). לכן, כל השפעה של סוכרת הנגרמת על ידי STZ על תפקוד המוח יכולה להתפרש רק כסיבוך נלווה, במקום להצביע על גורם אטיולוגי יחיד. הזרקה חריפה או עירוי כרוני של חומרים בחלל המוח היא טכניקה המשמשת לעתים קרובות כדי לבדוק את ההשפעות הישירות שלהם על תפקוד המוח. הזרקה תוך-מוחית (ICV) של STZ שימשה לפיתוח מודל מכרסם של מחלת אלצהיימר, עם זאת, עדיין לא בטוח אם נזק עצבי הקשור ל-STZ נובע מחוסר ויסות בחישת גלוקוז/הומאוסטזיס או מנגנונים עצמאיים אחרים, כמו עקה חמצונית הנגרמת על ידי STZ ונזק לדנ"א17.
ההליכים המתוארים בפרוטוקול הנוכחי יהיו שימושיים בפיתוח מודלים של מכרסמים שיכולים לענות על שאלות מחקר, כמו האם עלייה בריכוז הגלוקוז CSF יכולה לגרום לפגיעה קוגניטיבית. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש לקביעת ההשפעות הישירות של רמות גלוקוז גבוהות של CSF על ההיפותלמוס וההיפוקמפוס, בין אזורי מוח אחרים המעורבים בחישה תזונתית, מטבוליזם ו / או קוגניציה. שיטה זו גם תבהיר האם עלייה ברמות הגלוקוז ב- CSF משפיעה על רגישות לאינסולין, הפרשת אינסולין, צריכת מזון ו / או מאזן אנרגיה בתחילת הדרך ובתגובה לעלבונות מטבוליים. יתר על כן, הפרוטוקול המדווח כאן יהיה ישים בבדיקת השערות הדורשות מחקרי אורך. לדוגמה, ניתן לאסוף נתונים לפני, במהלך ובסוף עירויי הגלוקוז כדי להשוות ממצאים מאותם בעלי חיים בזמנים שונים. אסטרטגיה כזו תטפל בשאלה האם סיבוכים הנובעים מרמת גלוקוז גבוהה של CSF הפיכים לאחר החזרת רמת הגלוקוז הרגילה של CSF. לעומת זאת, השיטה יכולה לשמש גם למחקרים מחוללי השערות. לדוגמה, CSF יכול להיאסף מאותם בעלי חיים בזמנים שונים ונתון לניתוח מטבולומיקה או פרוטאומיקה כדי לזהות סמנים ביולוגיים או כל עלבון מטבולי המיוצר על ידי רמה גבוהה של גלוקוז CSF. באופן דומה, אזורים שונים במוח יכולים להיות מנותחים על ידי תעתיק מרחבי כדי להניב מידע ספציפי לתא שאולי השתנה על ידי גלוקוז CSF גבוה.
הרציונל של החדרת aCSF ללא גלוקוז לקבוצת דמה היה לשמור על ריכוז הגלוקוז CSF ברמה הבסיסית, כך שכל שינוי ברמת הגלוקוז CSF המושרה על ידי השתלת צינורית יכול להיות נשלט באופן טבעי. התוצאות במחקר זה הראו כי לקבוצת הדמה היה ריכוז גלוקוז CSF של ~ 60 מ"ג / ד"ל (~ 3 mM), שהוא בטווח הגלוקוז CSF הרגיל בעכברים18. רמות הגלוקוז CSF שנצפו אצל אנשים עם סוכרת מסוג 2 הן ~ 110 מ"ג / ד"ל או ~ 6 mM9. במחקר הנוכחי, עירוי ICV של 50% גלוקוז בקצב של 125μg / h העלה את רמות הגלוקוז CSF ל~ 300 מ"ג / ד"ל (16 mM), שהוא על-פיזיולוגי19. למרות שרמה על-פיזיולוגית זו של גלוקוז CSF עשויה שלא להיות רלוונטית קלינית לרמות שנצפו אצל אנשים עם סוכרת מסוג 2, התוצאות המוצגות במחקר זה מראות כי עירוי גלוקוז ב- CSF יכול לגרום לעלייה כרונית של ריכוז גלוקוז CSF בעכברים.
לשיטה המוצגת כאן יש כמה מגבלות. מדובר בניתוח מוח עכבר מתוחכם הדורש הכשרה רלוונטית, מיומנויות וניסיון בביצוע הליכים מתקדמים כאלה. מכיוון שהקטטר והמיני-משאבות מושתלים לטווח ארוך, יש צורך בטיפול קפדני בעכברים לאורך כל המחקר כדי לעקוב אחר חששות בריאותיים או נזק למכלול הצנתר. ריכוז גלוקוז של 50% נבחר מכיוון שצמיגות התמיסה מעבר לריכוז זה עשויה הייתה להשפיע על עירוי הגלוקוז לחדרים. המיני-משאבות ששימשו בפרוטוקול זה היו בעלות קצב זרימה של 0.25 μL/h, כך שקבוצת העכברים עם עירוי גלוקוז של 50% קיבלה גלוקוז בקצב של 125 מיקרוגרם / שעה, או 3 מ"ג גלוקוז ליום. מינון זה של גלוקוז ליחידת זמן הוגבל אפוא על ידי קצב הזרימה של המיני-משאבות.
לסיכום, מאמר זה מדווח על שיטה מאומתת לעלייה כרונית של גלוקוז CSF בעכברים. המידע המתקבל ממודל זה יהיה שימושי בקביעה אם או כיצד עלייה ברמות הגלוקוז CSF מעורבת בתיווך סיבוכים הקשורים לסוכרת, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, או גרימת עלבונות מטבוליים היקפיים בסוכרת והשמנת יתר.
פתרון בעיות
אם הצינורית יורדת מהצינורית בעכברים, ניתן למרוח כמות קטנה של דבק על חיבור הצינורית-צינורית בעת הרכבת המיני-משאבה. אם התפרים יורדים והצינולית נראית לעין, ניתן לסגור לחלוטין את אזור החתך באמצעות תפרים או סיכות. יש לחתוך ציפורניים מכפותיו האחוריות של העכבר, כך שיש אפשרות נמוכה יותר לגרד את אזור הניתוח על ידי העכבר. יתר על כן, היזהר לא לקשור את התפרים כל כך חזק כי העור ייקרע, כמו עכברים יש עור עדין.
להחלמה מהירה לאחר איסוף CSF, מומלץ הזרקה של 300 μL של מי מלח סטריליים תת עורית לאחר הניתוח. יתר על כן, שמירה על נפח מקסימלי של אוסף CSF ל 10 μL הוא גם חשוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המכונים הלאומיים לבריאות מעניקים DK124619 ל- KHC.
קרנות סטארט-אפ ופרס מחקר פיילוט, המחלקה לרפואה, אוניברסיטת רוצ'סטר, ניו יורק, ל- KHC.
פרס מחקר הפיילוט של מכון דל מונטה למדעי המוח, אוניברסיטת רוצ'סטר, ל- KHC.
פרס מחקר אוניברסיטאי, משרד סגן הנשיא למחקר, אוניברסיטת רוצ'סטר, ניו יורק, ל- KHC.
MUR עיצב וביצע את השיטה, ניתח תוצאות, הכין גרפים ואיורים, וכתב וערך את כתב היד. KHC הגתה ופיקחה על המחקר, ניתחה את התוצאות וכתבה וערכה את כתב היד. KHC הוא ערב לעבודה זו. כל המחברים אישרו את הגרסה הסופית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
- Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
- Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W.
- Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
- Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H.
- Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
- Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
- Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
- Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
- Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263 (2013).
- Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587 (2022).
- Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
- Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R.
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78 (2021).
- Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
- Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
- Dougherty, J. M., Roth, R. M.
