Summary
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om de glucoseconcentratie in het hersenvocht (CSF) van muizen te verhogen. Deze aanpak kan nuttig zijn voor het bestuderen van de effecten van hoge CSF-glucose op neurodegeneratie, cognitie en perifeer glucosemetabolisme bij muizen.
Abstract
Diabetes verhoogt het risico op cognitieve achteruitgang en schaadt de hersenfunctie. Of deze relatie tussen hoge glucose en cognitieve tekorten oorzakelijk is, blijft ongrijpbaar. Bovendien is het ook onduidelijk of deze tekorten worden gemedieerd door een toename van de glucosespiegels in hersenvocht (CSF) en / of bloed. Er zijn zeer weinig studies die de directe effecten van hoge CSF-glucosespiegels op de functie van het centrale zenuwstelsel (CZS) onderzoeken, vooral op leren en geheugen, omdat de huidige diabetesmodellen niet voldoende ontwikkeld zijn om dergelijke onderzoeksvragen aan te pakken. Dit artikel beschrijft een methode om de glucosespiegels van de liquor gedurende 4 weken chronisch te verhogen door continu glucose in de laterale ventrikel te injecteren met behulp van osmotische minipompen bij muizen. Het protocol werd gevalideerd door glucosespiegels in liquor te meten. Dit protocol verhoogde de glucosespiegels van de liquor tot ~ 328 mg / dL na infusie van een 50% glucose-oplossing met een stroomsnelheid van 0,25 μl / uur, vergeleken met een csf-glucoseconcentratie van ~ 56 mg / dL bij muizen die kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) ontvingen. Bovendien had dit protocol geen invloed op de bloedglucosespiegels. Daarom kan deze methode worden gebruikt om de directe effecten van hoge CSF-glucose op de hersenfunctie of een specifieke neurale route te bepalen, onafhankelijk van veranderingen in de bloedsuikerspiegel. Over het algemeen zal de hier beschreven aanpak de ontwikkeling van diermodellen vergemakkelijken voor het testen van de rol van hoge CSF-glucose bij het bemiddelen van kenmerken van de ziekte van Alzheimer en / of andere neurodegeneratieve aandoeningen geassocieerd met diabetes.
Introduction
Zowel type 1 als type 2 diabetes tasten de hersenfunctieaan 1,2,3. Diabetes verhoogt bijvoorbeeld het risico op cognitieve achteruitgang en neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer 3,4. Bovendien hebben mensen met diabetes een defecte glucosedetectie in de hersenen 5,6. Dit defect draagt bij aan de pathogenese van hypoglykemie geassocieerde onwetendheid en een onvoldoende contra-regulerende respons op hypoglykemie7,8, die fataal kan zijn als deze niet onmiddellijk wordt behandeld.
Gezien het feit dat diabetes de glucosespiegels in het bloed en in cerebrospinale vloeistof (CSF)9 verhoogt, is het belangrijk om te bepalen of een of beide van deze factoren bijdragen aan een verminderde hersenfunctie. Of diabetes hersenschade veroorzaakt door hoge CSF-glucose alleen of in combinatie met andere factoren zoals insulinetekort of insulineresistentie is ook een open vraag. Diermodellen van type 1 en type 2 diabetes tonen cognitieve achteruitgang en neurodegeneratie naast een aangetaste energiebalans en perifeer glucosemetabolisme10,11,12,13. Uit deze modellen is het echter niet haalbaar om de selectieve effecten van hoge CSF-glucose versus bloedglucosespiegels los te koppelen bij het bemiddelen van de complicaties van diabetes op de hersenfunctie.
Dit protocol beschrijft methoden om een muismodel van hyperglycorrhachie te ontwikkelen om de effecten van chronisch hoge CSF-glucosespiegels op de hersenfunctie, energiebalans en glucosehomeostase te testen. Het muismodel dat met deze techniek is ontwikkeld, biedt een hulpmiddel voor studies die de etiologische rol van ontregelde glucosehomeostase op de neurale en gedragsfunctie onderzoeken.
Daarom zal de voorgestelde aanpak nuttig zijn bij het begrijpen van de directe effecten van verhoogde CSF-glucosespiegels in verschillende pathofysiologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muisprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Rochester en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Amerikaanse volksgezondheidsdienst voor de humane verzorging en het gebruik van proefdieren. Zes weken oude C57BL/6J mannelijke muizen die voor deze studie werden gebruikt, werden commercieel verkregen. Alle dieren werden gegroepeerd (5 muizen per kooi) in een ruimte met een dag/nachtcyclus van 12 uur en kregen ad libitum toegang tot voedsel en water. Nadat de muizen waren geïmplanteerd met een canule voor het inbrengen van glucose in de laterale ventrikel, werden ze enkelvoudig gehuisvest om schade aan de implantaten door andere muizen te voorkomen.
1. Assemblage van osmotische minipompen
- Bereid kunstmatige hersenvocht (aCSF) volgens het volgende protocol. Los NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl 2,2H 2 O (0,206 g) en MgCl 2,6H 2 O (0,163 g) op in 500 ml steriel water om oplossing A te bereiden. Los Na 2 HPO 4,7H 2 O (0,214 g) en NaH 2 PO4 op. H2O (0,027 g) in 500 ml steriel water om oplossing B te bereiden. Meng vervolgens oplossing A en B in een verhouding van 1:1 om de aCSF te bereiden.
OPMERKING: Deze formulering van aCSF bevat geen glucose. - Om de 50% glucose-oplossing te bereiden, voegt u 50 g glucose toe aan 50 ml aCSF in een bekerglas. Plaats het bekerglas op een hete plaat en breng de temperatuur van de suspensie op 60 °C. Meng de suspensie met een magneetroerder totdat de glucose volledig is opgelost.
- Voeg aCSF toe aan het bekerglas om het uiteindelijke volume 100 ml te maken. Laat de oplossing door het poriënfilter van 0,22 μm lopen om het te steriliseren.
- Bereid een 0,9% zoutoplossing (NaCl) en laat de oplossing door het 0,22 μm filter lopen.
- Plaats alle componenten van de minipomp en infusiekit in een steriele lade en knip de slang van de herseninfusiekit tot 1 inch lang met een steriele schaar. Houd de slang vast met een steriele hemostat en duw deze op de bovenkant van het ene uiteinde van de canule. Sluit het andere uiteinde van de slang aan op de bovenzijde van de flowmodulator. Bedek beide uiteinden van de slang met een kleine hoeveelheid lijm voor een sterkere verbinding.
- Bevestig een naald van 27 G aan een spuit van 1 ml en vul deze met aCSF of de glucose-oplossing. Steek de naald van 27 G in een klein stukje slang. Sluit vervolgens de slang aan op het open uiteinde van de stroommodulator en vul deze met de bijbehorende oplossing totdat er druppels van de oplossing uit de canule beginnen te komen. Verwijder eventuele luchtbellen die vastzitten in de slang.
- Om de minipomp te vullen, houdt u de pomp rechtop en steekt u de naald van de spuit in de pomp. Vul het met de bijbehorende oplossing totdat zich een druppel van de oplossing begint te vormen bij de opening van de minipomp.
- Plaats de stroommodulator langzaam in de pomp en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de assemblage worden geïntroduceerd.
- Nadat de osmotische minipompen zijn geassembleerd, brengt u ze over naar een conische buis van 50 ml. Vul de buis met de steriele zoutoplossing zodat de pompen volledig ondergedompeld zijn, terwijl u ervoor zorgt dat de canule uit de zoutoplossing blijft. Vier van dergelijke geassembleerde pompen kunnen in één buis van 50 ml worden geplaatst.
- Plaats de dop losjes op elke buis en incuber de pompen op 37 °C om gedurende ten minste 48 uur te primen.
2. Operatie om osmotische pompen te implanteren
- Pre-operatieve procedure
- Steriliseer de chirurgische instrumenten in een autoclaaf en laat ze minstens 30 minuten afkoelen voor gebruik. De autoclaafcondities omvatten stoomsterilisatie bij 121 °C gedurende 30 minuten.
- Desinfecteer het operatiegebied met 70% ethanol. Veeg de knoppen, oorbalken en het stereotaxische frameoppervlak schoon.
OPMERKING: Chirurgie moet worden uitgevoerd in een aseptische omgeving, rekening houdend met het vermijden van het aanraken van niet-steriele oppervlakken tijdens het uitvoeren van een operatie. Vervang handschoenen als er een vermoeden van besmetting is. - Plaats de muis in een anesthesiekamer om hem te verdoven met 3% isofluraan gemengd in lucht gedurende 3-5 minuten. Verwijder vervolgens de muis uit de kamer en plaats deze op een steriel gordijn. Houd de anesthesie via een neuskegel op 1,5% -2%.
- Knijp in de achterpoot van de muis om een reflex te observeren en de diepte van de anesthesie te controleren.
- Injecteer 5 mg/kg carprofen subcutaan voor analgesie.
- Gebruik schone tondeuses om het operatiegebied op de muiskop te knippen. Wrijf de hoofdhuid eerst in met povidon-jodiumoplossing en vervolgens met alcoholdoekjes grondig gedurende ten minste 2 minuten. Herhaal dit proces minstens drie keer.
- Breng een oogglijmiddel aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen tijdens de operatie.
- Chirurgie
- Plaats de muis op het stereotaxische frame en plaats het hoofd op de snijtandbalk. Bedek de neus met de neuskegel. Breng steriele gordijnen aan om het operatiegebied te beveiligen.
- Verschuif de stroom van isofluraan naar de neuskegel. Blijf de anesthesie handhaven op 1,5% -2% isofluraan.
- Plaats een verwarmingskussen onder de muis om de lichaamstemperatuur te handhaven.
- Trek nieuwe steriele handschoenen aan en maak met een scalpel een middellijnincisie (~ 10-15 mm lang) op de hoofdhuid. Belicht het schedeloppervlak met een spatel terwijl u wattenstaafjes gebruikt om eventuele bloedingen af te vegen.
OPMERKING: Gebruik een cauterizer als u overvloedig bloedt, wat zeldzaam is. - Wrijf met een katoenen tip gedoopt in 3% waterstofperoxide om de schedelnaden bloot te leggen.
- Noteer bregma en lambda om door de schedelcoördinaten te navigeren. Stel alle coördinaten in op nul bij bregma.
OPMERKING: Deze coördinaten zijn verkregen uit een muizenhersenatlas14. De referentieafstand bregma-lambda in de atlas is 4,21 mm. Om te corrigeren voor leeftijds- en geslachtsverschillen in schedelgrootte, werd de bregma-lambdaafstand voor elke muis gemeten en vervolgens gedeeld door 4,21 mm om een vermenigvuldigingsfactor te verkrijgen. Als de afstand tussen bregma en lambda bijvoorbeeld 4,65 mm was, gaf deling door 4,21 mm een vermenigvuldigingsfactor van 1,10. Alle coördinaten verkregen uit de atlas werden vervolgens vermenigvuldigd met deze factor om de werkelijke coördinaten te meten die werden gebruikt om het gat te boren. In het bovenstaande voorbeeld zouden de resulterende anterieure-posterieure (AP) en mediaal-laterale (ML) coördinaten respectievelijk 0,55 en 1,1 mm zijn (d.w.z. 1,1 x 0,5 of 1 mm). - Gebruik een elektrische boor om een gat te maken op deze coördinaten: 0,5 mm achteraan naar bregma en 1 mm lateraal naar middellijn naar rechts.
OPMERKING: Let er tijdens het boren van het gat in de schedel op dat je de dura mater niet scheurt. Zorg ervoor dat de boor steriel is. Het kan met andere instrumenten in hetzelfde autoclaafzakje worden geplaatst voor sterilisatie. - Breng een hemostat onder de ingesneden huid en duw deze naar de plaats waar de osmotische minipomp zal worden geïmplanteerd. Open en sluit de hemostat voorzichtig om een zak voor de minipomp te maken.
- Gebruik een steriel hemostat om een geprimeerde osmotische minipomp uit de punt van de flowmodulator te kiezen. Duw de pomp door de ingesneden huid in de zak.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de pomp en de canule geen niet-steriel oppervlak raken. - Breng wat lijm aan op de onderkant van de canule en bevestig deze in de canulehouder. Laat de canule langzaam door het geboorde gat 2 mm ventraal naar het schedeloppervlak zakken. Laat het daar minstens 5 minuten staan om de lijm te laten stollen.
- Voordat u de canule in de hersenen inbrengt, moet u ervoor zorgen dat de canule niet verstopt is en dat de oplossing goed stroomt.
OPMERKING: Soms kan glucose zich afzetten aan de punt van de canule als gevolg van een zeer lage stroomsnelheid, waardoor de stroom wordt geblokkeerd. - Knip met behulp van een schaar de bovenkant van de canule vast en zorg ervoor dat deze niet loskomt van het schedeloppervlak.
- Bedek de canule met een laag tandcement voor extra ondersteuning.
- Gebruik nylon hechtingen (5-0 grootte en 30 inch lang) om de wond te sluiten en breng actueel antibioticum op de wond aan om infectie te voorkomen.
- Schakel de isofluraan uit en laat het dier herstellen van de anesthesie. Breng het dier vervolgens over naar een nieuwe schone kooi.
- Postoperatieve zorg
- Controleer de muis na de operatie gedurende ten minste 1 week.
- Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe, eenmaal per 24 uur gedurende drie dagen na de operatie.
- Laat de wond volledig genezen voordat u de hechtingen 7-10 dagen na de operatie verwijdert.
OPMERKING: Er werd waargenomen dat muizen met hoge CSF-glucose er langer over deden om te genezen. Het knippen van nagels op de achterpoten van de muis minimaliseert de kans op letsel op de plaats van de incisie als gevolg van het krabgedrag van muizen.
3. Vervanging van de minipompen
OPMERKING: Aangezien de minipompen die in deze studie worden gebruikt slechts 4 weken meegaan, werd de vervanging van minipompen ook getest om de duur van glucose-infusie te verlengen, zoals nodig kan zijn in het geval van langetermijnstudies. Dit omvatte de volgende stappen.
- Bereid de muizen voor op een operatie zoals hierboven beschreven.
- Maak een kleine verticale incisie van 1 cm in de huid iets boven de pomp.
- Plaats een hemostat onder de ingesneden huid en trek de pomp eruit.
- Verwijder de pomp uit de slang en sluit een nieuwe geprimeerde pomp aan op de slang.
- Steek de pomp terug naar binnen en naai de huid.
- Volg dezelfde instructies voor de zorg na de operatie als hierboven beschreven.
4. Procedure voor de inzameling van het CB
- Voorbereiding
- Trek glazen haarvaten met een diameter van 1 mm met een micropipettrekkermachine om tips met een diameter van 0,5 mm te verkrijgen. De instellingen zijn: warmte = 800, trek = 15, snelheid = 5 en tijd = 200 eenheden. Plaats de getrokken haarvaten in een steriele doos tot gebruik.
- Bevestig een naald van 27 G aan een spuit van 1 ml. Plaats het getrokken capillair op de naald en gebruik een klein plakbandje om de verbinding vast te zetten.
- Bevestig de spuit stevig in een capillaire houder van een micromanipulator.
- Bereid vervolgens de muis voor op een operatie, zoals beschreven in de pre-operatieve procedure hierboven.
- Chirurgische ingreep
- Plaats de muis op het stereotaxische frame. Nadat u de kop op het frame hebt bevestigd, zoals eerder beschreven, draait u de knoppen om het hoofd te kantelen zodat de neus naar beneden is gericht. Breng steriele gordijnen aan om het operatiegebied te beveiligen.
- Maak een kleine incisie op het dorsale oppervlak, beginnend bij het intra-auditieve vlak naar de caudale kant.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de slang niet beschadigt tijdens het maken van de incisie. - Verwijder de steun van het muislichaam en laat de muis verticaal rusten zodat de nek volledig dorsaal wordt uitgeschoven.
- Met behulp van een gebogen stompe tang, snijd je de achterste nekspieren voorzichtig van de middellijn om een klein venster te creëren. Gebruik vervolgens een natte wattentip-applicator om de nekspieren voorzichtig van de middellijn naar de periferie te verplaatsen.
- Observeer of de cisterna magna zichtbaar is, die verschijnt als een driehoekig venster met een transparant dura-membraan.
- Plaats de micromanipulator op het stereotaxische frame naast de muis en zorg ervoor dat de capillaire punt geen oppervlak raakt.
- Breek de capillaire punt voorzichtig zonder de opstelling te verstoren.
- Terwijl u in het vergrootglas kijkt (vergroting van 2,25x), draait u de bijbehorende knoppen op de micromanipulator om langzaam uit te lijnen en de capillaire punt naar de cisterna magna te bewegen.
- Enige weerstand wordt gevoeld zodra de capillaire punt het cisterna magna-membraan raakt. Duw heel langzaam de punt tegen het membraan met behulp van de knoppen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen bloedvaten in het membraan beschadigt. Deze stap is erg belangrijk om bloedbesmetting in de liquor te voorkomen. - Doorboor heel voorzichtig het membraan. CSF zal in één keer in het capillair beginnen te stromen als gevolg van negatieve druk in het capillair.
- Laat de opstelling enkele minuten staan totdat ~ 10 μL liquor in het capillair is verzameld.
- Trek vervolgens langzaam het capillair uit de cisterna magna en druk voorzichtig een steriele wattentipapplicator tegen de opening van de cisterna magna om csf-lekkage te stoppen.
- Verwijder het capillair voorzichtig uit de spuit en bevestig het aan een microcap-boldispenser. Druk op de bol om de liquor in een steriele microcentrifugebuis over te brengen.
- Plaats een steun onder de muis en draai de stereotaxische knoppen om het hoofd waterpas te zetten.
- Sluit de wond met nylon hechtingen.
- Injecteer 300 μL steriele zoutoplossing subcutaan voordat u de muis uit het apparaat verwijdert.
- Geef postoperatieve zorg aan de dieren zoals hierboven beschreven, totdat het tijd is om de hechtingen te verwijderen - ~ 7-10 dagen na de operatie.
5. Glucosetest
- Volg het protocol zoals beschreven in de glucose colorimetrische testkit.
- Verdun de natriumfosfaatbufferoplossing in de kit tot een concentratie van 50 mM in ultrazuiver water.
- Bereid glucosestandaarden in 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 en 50 mg / dL bereiken van de 1.000 mg / dL stockoplossing die in de kit in verdunde bufferoplossing wordt geleverd.
- Bereid een 7-voudige verdunning van CSF-monsters in de buffer. Als het totale verzamelde CSF-volume bijvoorbeeld 10 μL is, is het zevenvoudige verdunde volume 70 μL.
- Pipetteer 15 μL glucosestandaarden en verdunde liquor in duplicaten in een plaat met 96 putten.
- Pipetteer 85 μL verdunde buffer in elk van de putten met standaarden en CSF.
- Voeg 6 ml verdunde buffer toe aan de injectieflacon met glucosecalorimetrisch enzymmengsel en draai het gedurende een paar seconden om grondig te mengen.
- Voeg 100 μL van het enzymmengselpreparaat toe aan elke put om de reactie te starten.
- Sluit de plaat af met een afdekvel en tik zachtjes op de plaat om de reagentia te mengen.
- Plaats de plaat gedurende 10 minuten in een incubator bij 37 °C. Injectieflacons met een hoog glucosegehalte beginnen onmiddellijk violet te worden.
- Verwijder na 10 minuten het deksel en meet de absorptie bij 500-520 nm met behulp van een plaatlezer.
- Bereken de glucoseconcentratie in de liquormonsters door hun waarden te interpoleren uit de standaardcurve.
6. Bloedglucosetest
- Maak een kleine laterale inkeping in de muizenstaart met behulp van een scheermesje en gebruik een druppel bloed om de bloedglucose te meten met een glucometer, volgens de handmatige instructies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannelijke muizen werden geïmplanteerd met een canule geassembleerd tot een osmotische minipomp (figuur 1) om chronisch aCSF of een 50% glucose-oplossing in hun laterale ventrikels te injecteren (figuur 2). Csf werd 10 dagen na de operatie verzameld (figuur 3) om de werkzaamheid van deze procedure te valideren. De resultaten toonden een toename van de csf-glucosespiegels (gemiddeld: 327,7 mg / dL) bij muizen geïnfundeerd met 50% glucose in vergelijking met die (gemiddelde: 56,5 mg / dL) bij muizen geïnfundeerd met aCSF. Dit is ongeveer een zesvoudige toename van de CSF-glucosespiegels bij de experimentele muizen in vergelijking met hun controle-nestgenoten (figuur 4A). De bloedglucosewaarden verschilden niet tussen de groepen (figuur 4B).
Figuur 1: Samenstel van osmotische minipompen . (A) Infusieassemblage met een canule die via buizen op een minipomp is aangesloten. Deze pompen hebben minstens 48 uur nodig om te primen. (B) De aanwezigheid van luchtbellen buiten de minipompen bevestigt de priming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stereotaxische apparatuur en toebehoren. (A,B) Stereotaxische apparatuur met een aangesloten micromanipulator en andere accessoires. (C) Braamgatcoördinaten voor het inbrengen van de canule. (D) Osmotische minipompimplantatie, (E,F) Inbrengen van de canule in het geboorde gat. Handhaaf aseptische omstandigheden gedurende de hele operatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Procedure voor het verzamelen van hersenvocht (CSF). (A) De dorsale nekspieren werden voorzichtig verplaatst met een stompe tang om de cisterna magna bloot te leggen. Een capillair van 1 mm met een punt met een diameter van 0,5 mm werd gebruikt om (B) te scheuren en (C,D) CSF uit de cisterna magna te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Meting van glucose. (A) Verhoogde CSF-glucose (B) zonder invloed op niet-nuchtere bloedglucosespiegels bij muizen geïnfundeerd met 50% glucose-oplossing in de laterale ventrikel. De werkzaamheid van dit protocol werd gevalideerd door het meten van csf en bloedglucoseconcentratie 10 dagen na het starten van de glucose-infusie. Muizen geïnfundeerd met 50% glucose-oplossing hadden csf-glucosespiegels van 327,7 ± 30,1 mg / dL (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde) in vergelijking met muizen die kunstmatige CSF-infusie kregen met glucosespiegels van 56,5 ± 2,6 mg / dL. P < 0,0001, ongepaarde T-test. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol om csf-glucose bij muizen te verhogen door osmotische minipompen te gebruiken die zijn aangesloten op een canule die in de laterale ventrikel is geïmplanteerd. De chronische infusie van glucose in de muizenhersenen via deze procedure zal nuttig zijn bij het afbakenen van de effecten van langdurige hyperglycorrhachie op cognitie, systemisch glucosemetabolisme en energiebalans en voor een beter begrip van de pathogenese van diabetescomplicaties.
Chronische diabetes veroorzaakt hersenschade die de communicatie tussen de hersenen en de perifere organen onderbreekt15. Diabetes verhoogt ook het risico op neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer 3,4. Streptozotocine (STZ)-geïnduceerde type 1 diabetes is het standaard knaagdiermodel in diabetesonderzoek16; STZ beschadigt β-cellen in de alvleesklier, wat leidt tot type 1 diabetes-achtige pathologie. Verder kan in een aangepaste versie het gebruik van STZ in combinatie met nicotinamiden diabetes type 2 veroorzaken. Een andere manier om type 2 diabetes-achtige fenotypes bij dieren te ontwikkelen, is door ze een vetrijk dieet te geven16. In de context van het bestuderen van het effect van hyperglycemie op de hersenfunctie, zijn deze technieken echter beperkt in het beheersen van een groot aantal factoren (bijv. Perifere insuline / glucagonniveaus en metabole functie in het algemeen). Elk effect van STZ-geïnduceerde diabetes op de hersenfunctie kan dus alleen worden geïnterpreteerd als een geassocieerde complicatie, in plaats van een enkele etiologische factor aan te wijzen. Acute injectie of chronische infusie van stoffen in de cerebroventriculaire ruimte is een techniek die vaak wordt gebruikt om hun directe effecten op de hersenfunctie te testen. Intracerebroventriculaire (ICV) injectie van STZ is gebruikt om een knaagdiermodel van de ziekte van Alzheimer te ontwikkelen, maar het blijft onzeker of STZ-geassocieerde neurale schade te wijten is aan ontregeling in glucosedetectie / homeostase of andere onafhankelijke mechanismen, zoals STZ-geïnduceerde oxidatieve stress en DNA-schade17.
De procedures die in het huidige protocol worden beschreven, zullen nuttig zijn bij het ontwikkelen van knaagdiermodellen die onderzoeksvragen kunnen beantwoorden, zoals of een toename van de glucoseconcentratie van csf cognitieve stoornissen kan veroorzaken. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt bij het bepalen van de directe effecten van hoge CSF-glucosespiegels op de hypothalamus en hippocampus, naast andere hersengebieden die betrokken zijn bij het detecteren van voedingsstoffen, metabolisme en / of cognitie. Deze methode zou ook verduidelijken of een toename van de glucosespiegels van de liquor de insulinegevoeligheid, insulinesecretie, voedselinname en / of energiebalans bij baseline en als reactie op metabole beledigingen beïnvloedt. Bovendien zou het hier gerapporteerde protocol van toepassing zijn op het testen van hypothesen die longitudinaal onderzoek vereisen. Er kunnen bijvoorbeeld gegevens worden verzameld voor, tijdens en aan het einde van de glucose-infusies om bevindingen van dezelfde dieren op verschillende tijdstippen te vergelijken. Een dergelijke strategie zou nagaan of complicaties als gevolg van een hoge csf-glucosespiegel omkeerbaar zijn nadat de normale csf-glucosespiegel is hersteld. Daarentegen zou de methode ook kunnen worden gebruikt voor hypothese-genererende studies. Csf kan bijvoorbeeld op verschillende tijdstippen van dezelfde dieren worden verzameld en worden onderworpen aan metabolomics- of proteomics-analyse om biomarkers of metabole beledigingen te identificeren die worden geproduceerd door een hoog niveau van CSF-glucose. Evenzo kunnen verschillende hersengebieden worden geanalyseerd door ruimtelijke transcriptomica om celspecifieke informatie op te leveren die mogelijk is veranderd door hoge CSF-glucose.
De reden voor het inbrengen van glucosevrije aCSF aan een schijngroep was om de CSF-glucoseconcentratie op het basisniveau te houden, zodat elke verandering in csf-glucosespiegel veroorzaakt door implantatie van canules op natuurlijke wijze kan worden gecontroleerd. De resultaten in deze studie toonden aan dat de schijngroep een CSF-glucoseconcentratie had van ~ 60 mg / dL (~ 3 mM), wat in het normale CSF-glucosebereik ligt bij muizen18. De csf-glucosespiegels waargenomen bij personen met diabetes type 2 zijn ~ 110 mg / dL of ~ 6 mM9. In de huidige studie verhoogde ICV-infusie van 50% glucose met een snelheid van 125μg / h de csf-glucosespiegels tot ~ 300 mg / dL (16 mM), wat suprafysiologischis 19. Hoewel dit suprafysiologische niveau van CSF-glucose mogelijk niet klinisch relevant is voor de niveaus die worden waargenomen bij personen met diabetes type 2, tonen de resultaten in deze studie aan dat de infusie van glucose in CSF een chronische verhoging van de CSF-glucoseconcentratie bij muizen kan veroorzaken.
De hier gepresenteerde methode heeft enkele beperkingen. Het gaat om geavanceerde hersenchirurgie van muizen die relevante training, vaardigheden en ervaring vereist bij het uitvoeren van dergelijke geavanceerde procedures. Omdat de katheter en minipompen voor de lange termijn worden geïmplanteerd, is zorgvuldige zorg voor de muizen gedurende het hele onderzoek noodzakelijk om te controleren op gezondheidsproblemen of schade aan de katheterassemblage. Er werd gekozen voor een glucoseconcentratie van 50% omdat de viscositeit van een oplossing boven deze concentratie de infusie van glucose in de ventrikels zou kunnen hebben beïnvloed. De minipompen die in dit protocol werden gebruikt, hadden een stroomsnelheid van 0,25 μl / h, dus de groep muizen met 50% glucose-infusie ontving glucose met een snelheid van 125 μg / h, of 3 mg glucose per dag. Deze dosis glucose per tijdseenheid werd daarom beperkt door het debiet van de minipompen.
Samenvattend rapporteert dit artikel een gevalideerde methode voor de chronische toename van CSF-glucose bij muizen. De informatie verkregen uit dit model zal nuttig zijn om te bepalen of en hoe een toename van csf-glucosespiegels betrokken is bij het bemiddelen van diabetes-geassocieerde complicaties, zoals neurodegeneratieve aandoeningen, of het veroorzaken van perifere metabole beledigingen bij diabetes en obesitas.
Probleemoplossing
Als de slang loskomt van de canule in de muizen, kan een kleine hoeveelheid lijm op de canule-buisverbinding worden aangebracht tijdens het monteren van de minipomp. Als hechtingen loskomen en de canule zichtbaar wordt, kan het incisiegebied volledig worden gesloten met behulp van hechtingen of nietjes. Nagels van de achterpoten van de muis moeten worden bijgesneden, zodat er een lagere kans is om het operatiegebied door de muis te krabben. Zorg er bovendien voor dat u de hechtingen niet zo strak afbindt dat de huid zal scheuren, omdat muizen een gevoelige huid hebben.
Voor een snel herstel na csf-verzameling wordt de injectie van 300 μl steriele zoutoplossing subcutaan na de operatie aanbevolen. Verder is het ook belangrijk om het maximale volume van de csf-inzameling op 10 μl te houden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.
Acknowledgments
National Institutes of Health verleent DK124619 aan KHC.
Start-up fondsen en pilot research award, Department of Medicine, University of Rochester, NY, aan KHC.
De Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, Universiteit van Rochester, aan KHC.
University Research Award, Office of the Vice President for Research, University of Rochester, NY, aan KHC.
MUR ontwierp en voerde de methode uit, analyseerde resultaten, bereidde grafieken en figuren voor en schreef en redigeerde het manuscript. KHC bedacht en begeleidde de studie, analyseerde resultaten en schreef en redigeerde het manuscript. KHC staat garant voor dit werk. Alle auteurs keurden de definitieve versie van het manuscript goed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
- Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
- Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W.
- Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
- Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H.
- Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
- Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
- Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
- Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
- Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263 (2013).
- Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587 (2022).
- Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
- Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R.
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78 (2021).
- Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
- Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
- Dougherty, J. M., Roth, R. M.
