Summary
यह लेख चूहों के मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में ग्लूकोज एकाग्रता बढ़ाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण चूहों में न्यूरोडीजेनेरेशन, अनुभूति और परिधीय ग्लूकोज चयापचय पर उच्च सीएसएफ ग्लूकोज के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
Abstract
मधुमेह संज्ञानात्मक गिरावट के जोखिम को बढ़ाता है और मस्तिष्क समारोह को बाधित करता है। उच्च ग्लूकोज और संज्ञानात्मक घाटे के बीच यह संबंध कारण है या नहीं, यह अभी भी अस्पष्ट है। इसके अलावा, क्या ये घाटे मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और / या रक्त में ग्लूकोज के स्तर में वृद्धि से मध्यस्थ हैं, यह भी स्पष्ट नहीं है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) समारोह पर उच्च सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर के प्रत्यक्ष प्रभावों की जांच करने वाले बहुत कम अध्ययन हैं, विशेष रूप से सीखने और स्मृति पर, क्योंकि वर्तमान मधुमेह मॉडल ऐसे शोध प्रश्नों को संबोधित करने के लिए पर्याप्त रूप से विकसित नहीं हैं। यह लेख चूहों में आसमाटिक मिनीपंप का उपयोग करके पार्श्व वेंट्रिकल में ग्लूकोज को लगातार इंजेक्ट करके 4 सप्ताह के लिए सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर को क्रोनिक रूप से बढ़ाने की एक विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल सीएसएफ में ग्लूकोज के स्तर को मापकर मान्य किया गया था। कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) प्राप्त करने वाले चूहों में ~ 56 मिलीग्राम / डीएल की सीएसएफ ग्लूकोज एकाग्रता की तुलना में इस प्रोटोकॉल ने 0.25 μL / h प्रवाह दर पर 50% ग्लूकोज समाधान के जलसेक के बाद सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर को ~ 328 मिलीग्राम / डीएल तक बढ़ा दिया। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ने रक्त शर्करा के स्तर को प्रभावित नहीं किया। इसलिए, इस विधि का उपयोग मस्तिष्क समारोह या रक्त शर्करा के स्तर में परिवर्तन से स्वतंत्र रूप से एक विशिष्ट तंत्रिका मार्ग पर उच्च सीएसएफ ग्लूकोज के प्रत्यक्ष प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित दृष्टिकोण अल्जाइमर रोग और / या मधुमेह से जुड़े अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों की मध्यस्थता सुविधाओं में उच्च सीएसएफ ग्लूकोज की भूमिका का परीक्षण करने के लिए पशु मॉडल के विकास की सुविधा प्रदान करेगा।
Introduction
टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह दोनों मस्तिष्क समारोह 1,2,3 को खराब करते हैं। उदाहरण के लिए, मधुमेह संज्ञानात्मक गिरावट और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के जोखिम को बढ़ाता है, जिसमें अल्जाइमर रोग 3,4 शामिल है। इसके अलावा, मधुमेह वाले लोगों के मस्तिष्क में दोषपूर्ण ग्लूकोज सेंसिंग 5,6 है। यह दोष हाइपोग्लाइसीमिया से जुड़े अजागरूकता के रोगजनन में योगदान देता है और हाइपोग्लाइसीमिया7,8 के लिए अपर्याप्त काउंटर-नियामक प्रतिक्रिया है, जो तुरंत इलाज नहीं होने पर घातक हो सकता है।
यह देखते हुए कि मधुमेह रक्त में ग्लूकोज के स्तर के साथ-साथ मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) 9 में बढ़ता है, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि क्या इनमें से एक या दोनों कारक बिगड़ा हुआ मस्तिष्क समारोह में योगदान करते हैं। क्या मधुमेह अकेले उच्च सीएसएफ ग्लूकोज द्वारा मस्तिष्क क्षति का कारण बनता है या इंसुलिन की कमी या इंसुलिन प्रतिरोध जैसे अन्य कारकों के साथ संयोजन में यह भी एक खुला सवाल है। टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह के पशु मॉडल एक प्रभावित ऊर्जा संतुलन और परिधीय ग्लूकोज चयापचय10,11,12,13 के अलावा संज्ञानात्मक गिरावट और न्यूरोडीजेनेरेशन दिखाते हैं। हालांकि, इन मॉडलों से, मस्तिष्क समारोह पर मधुमेह की जटिलताओं की मध्यस्थता में उच्च सीएसएफ ग्लूकोज बनाम रक्त शर्करा के स्तर के चयनात्मक प्रभावों को पूर्ववत करना संभव नहीं है।
यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क समारोह, ऊर्जा संतुलन और ग्लूकोज होमियोस्टैसिस पर क्रोनिक रूप से उच्च सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए हाइपरग्लाइकोराचिया के माउस मॉडल को विकसित करने के तरीकों का वर्णन करता है। इस तकनीक के माध्यम से विकसित माउस मॉडल तंत्रिका और व्यवहार समारोह पर अनियमित ग्लूकोज होमियोस्टैसिस की एटियलॉजिकल भूमिका की जांच के लिए एक उपकरण प्रस्तुत करता है।
इसलिए, प्रस्तावित दृष्टिकोण विभिन्न पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों में ऊंचा सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर के प्रत्यक्ष प्रभावों को समझने में उपयोगी होगा।
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Protocol
सभी माउस प्रक्रियाओं को रोचेस्टर विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगात्मक जानवरों की मानवीय देखभाल और उपयोग के लिए अमेरिकी सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए गए छह सप्ताह पुराने C57BL / 6J पुरुष चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था। सभी जानवरों को 12 घंटे के दिन / रात चक्र के साथ एक कमरे में रखा गया था (प्रति पिंजरे 5 चूहे) और भोजन और पानी तक पहुंच प्रदान की गई थी। चूहों को पार्श्व वेंट्रिकल में ग्लूकोज डालने के लिए एक प्रवेशनी के साथ प्रत्यारोपित किए जाने के बाद, उन्हें अन्य चूहों से प्रत्यारोपण को किसी भी नुकसान को रोकने के लिए एकल रखा गया था।
1. आसमाटिक मिनीपंप की असेंबली
- निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) तैयार करें। समाधान A तैयार करने के लिए 500 मिलीलीटर बाँझ पानी में NaCl (8.66 ग्राम), KCl (0.224 ग्राम), CaCl 2.2H 2 O (0.206ग्राम), और MgCl 2.6H2O(0.163 ग्राम) घोलें। घोल बी तैयार करने के लिए 500 मिलीलीटर बाँझ पानी में एच2ओ (0.027 ग्राम)। फिर, एसीएसएफ तैयार करने के लिए समाधान ए और बी को 1: 1 अनुपात में मिलाएं।
नोट: एसीएसएफ के इस फॉर्मूलेशन में कोई ग्लूकोज नहीं होता है। - 50% ग्लूकोज समाधान तैयार करने के लिए, एक बीकर में एसीएसएफ के 50 एमएल में 50 ग्राम ग्लूकोज जोड़ें। बीकर को गर्म प्लेट पर रखें और निलंबन का तापमान 60 डिग्री सेल्सियस तक लाएं। निलंबन को चुंबकीय हलचल के साथ मिलाएं जब तक कि ग्लूकोज पूरी तरह से घुल न जाए।
- अंतिम मात्रा 100 एमएल बनाने के लिए बीकर में एसीएसएफ जोड़ें। इसे निष्फल करने के लिए 0.22 μm पोर फ़िल्टर के माध्यम से घोल को पास करें।
- 0.9% खारा (NaCl) घोल तैयार करें और घोल को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें।
- मिनीपंप और इन्फ्यूजन किट के सभी घटकों को एक बाँझ ट्रे में रखें और एक बाँझ कैंची के साथ मस्तिष्क जलसेक किट से टयूबिंग को लंबाई में 1 इंच तक काट लें। ट्यूबिंग को बाँझ हेमोस्टैट के साथ पकड़ें और इसे कैनुला के एक छोर के शीर्ष पर धक्का दें। ट्यूबिंग के दूसरे छोर को फ्लो मॉड्यूलेटर के शीर्ष पक्ष से कनेक्ट करें। एक मजबूत कनेक्शन के लिए थोड़ी मात्रा में गोंद के साथ टयूबिंग के दोनों सिरों को कवर करें।
- 1 एमएल सिरिंज में 27 ग्राम सुई संलग्न करें और इसे एसीएसएफ या ग्लूकोज समाधान से भरें। 27 ग्राम सुई को टयूबिंग के एक छोटे से टुकड़े में डालें। फिर, ट्यूबिंग को फ्लो मॉड्यूलेटर के खुले छोर से कनेक्ट करें और इसे संबंधित समाधान से भरें जब तक कि समाधान की बूंदें प्रवेशनी से बाहर न आने लगें। टयूबिंग में फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
- मिनीपंप को भरने के लिए, पंप को सीधा रखें और सिरिंज सुई को पंप में डालें। इसे संबंधित समाधान के साथ भरें जब तक कि मिनीपंप के खुलने पर समाधान की एक बूंद बनने न लगे।
- धीरे-धीरे प्रवाह मॉड्यूलेटर को पंप में डालें, जबकि यह सुनिश्चित करें कि असेंबली में किसी भी हवा के बुलबुले को पेश न करें।
- आसमाटिक मिनीपंप इकट्ठा होने के बाद, उन्हें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को बाँझ खारा के साथ भरें ताकि पंप पूरी तरह से जलमग्न हो जाएं, जबकि यह सुनिश्चित करें कि कैनुला खारा घोल से बाहर रहे। ऐसे चार इकट्ठे पंपों को एक 50 एमएल ट्यूब में रखा जा सकता है।
- प्रत्येक ट्यूब पर टोपी रखें और पंपों को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 48 घंटे के लिए प्राइम पर इनक्यूबेट करें।
2. आसमाटिक पंप ों को प्रत्यारोपित करने के लिए सर्जरी
- सर्जरी से पहले की प्रक्रिया
- एक आटोक्लेव में सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज़ करें और उपयोग करने से पहले उन्हें कम से कम 30 मिनट तक ठंडा होने दें। आटोक्लेव स्थितियों में 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर भाप नसबंदी शामिल है।
- 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी क्षेत्र कीटाणुरहित करें। नॉब्स, कान सलाखों और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम सतह को पोंछें।
नोट: सर्जरी करते समय गैर-बाँझ सतहों को छूने से बचने के लिए, सर्जरी को एक सड़न रोकनेवाला वातावरण में किया जाना चाहिए। संदूषण का संदेह होने पर दस्ताने बदलें। - माउस को एनेस्थीसिया कक्ष में रखें ताकि इसे 3-5 मिनट के लिए हवा में मिश्रित 3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज किया जा सके। फिर, माउस को कक्ष से निकालें और इसे बाँझ ड्रेप पर रखें। नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण को 1.5% -2% पर बनाए रखें।
- किसी भी रिफ्लेक्स का निरीक्षण करने और संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करने के लिए माउस हिंद पंजे को पिंच करें।
- एनाल्जेसिया के लिए चमड़े के नीचे 5 मिलीग्राम / किग्रा कार्प्रोफेन इंजेक्ट करें।
- माउस सिर पर सर्जरी क्षेत्र को क्लिप करने के लिए साफ क्लिपर का उपयोग करें। पहले खोपड़ी को पोविडोन-आयोडीन के घोल के साथ रगड़ें और फिर कम से कम 2 मिनट के लिए अल्कोहल स्वैब के साथ अच्छी तरह से रगड़ें। इस प्रक्रिया को कम से कम तीन बार दोहराएं।
- सर्जरी के दौरान आंखों को सूखने से बचाने के लिए आई लुब्रिकेंट लगाएं।
- शल्यचिकित्सा
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर माउस रखें और सिर को छेदक बार पर फिट करें। नाक को शंकु से ढक ें। सर्जिकल क्षेत्र को सुरक्षित करने के लिए बाँझ ड्रेप लागू करें।
- आइसोफ्लुरेन के प्रवाह को नाक शंकु में स्थानांतरित करें। एनेस्थीसिया को 1.5% -2% आइसोफ्लुरेन पर बनाए रखना जारी रखें।
- शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए माउस के नीचे एक हीटिंग पैड रखें।
- नए बाँझ दस्ताने पहनें और, स्केलपेल के साथ, खोपड़ी पर एक मध्य रेखा चीरा (~ 10-15 मिमी लंबा) बनाएं। किसी भी रक्तस्राव को मिटाने के लिए कपास युक्तियों का उपयोग करते समय खोपड़ी की सतह को स्पैटुला के साथ उजागर करें।
नोट: अत्यधिक रक्तस्राव होने पर कॉटराइजर का उपयोग करें, जो दुर्लभ है। - कपाल सीवन को उजागर करने के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में डुबोए गए कपास की नोक के साथ रगड़ें।
- खोपड़ी निर्देशांक को नेविगेट करने के लिए ब्रेग्मा और लैम्ब्डा पर ध्यान दें। ब्रेग्मा पर सभी निर्देशांक शून्य पर सेट करें।
नोट: ये निर्देशांक एक माउस मस्तिष्क एटलस14 से प्राप्त किए गए थे। एटलस में संदर्भ ब्रेग्मा-लैम्ब्डा दूरी 4.21 मिमी है। खोपड़ी के आकार में उम्र और लिंग-आधारित अंतर को ठीक करने के लिए, प्रत्येक माउस के लिए ब्रेग्मा-लैम्ब्डा दूरी को मापा गया और फिर गुणन कारक प्राप्त करने के लिए 4.21 मिमी से विभाजित किया गया। उदाहरण के लिए, यदि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के बीच की दूरी 4.65 मिमी थी, तो 4.21 मिमी से विभाजन ने 1.10 का गुणन कारक दिया। एटलस से प्राप्त सभी निर्देशांकों को तब इस कारक के साथ गुणा किया गया था ताकि छेद को ड्रिल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वास्तविक निर्देशांक को मापा जा सके। उपरोक्त उदाहरण में, परिणामी पूर्वकाल-पश्चवर्ती (एपी), और मध्यम-पार्श्व (एमएल) निर्देशांक क्रमशः 0.55 और 1.1 मिमी (यानी, 1.1 x 0.5 या 1 मिमी) होंगे। - इन निर्देशांकों पर एक छेद बनाने के लिए एक इलेक्ट्रिक ड्रिल का उपयोग करें: 0.5 मिमी पीछे से ब्रेग्मा और 1 मिमी पार्श्व से दाईं ओर मध्य रेखा।
नोट: खोपड़ी में छेद ड्रिल करते समय, सावधान रहें कि ड्यूरा मैटर को न तोड़ें। सुनिश्चित करें कि ड्रिल बिट बाँझ है। इसे नसबंदी के लिए एक ही आटोक्लेव थैली में अन्य उपकरणों के साथ रखा जा सकता है। - संक्रमित त्वचा के नीचे एक हेमोस्टैट डालें और इसे उस स्थान पर धक्का दें जहां आसमाटिक मिनीपंप प्रत्यारोपित किया जाएगा। मिनीपंप के लिए जेब बनाने के लिए हेमोस्टैट को धीरे से खोलें और बंद करें।
- प्रवाह मॉड्यूलेटर की नोक से एक प्रमुख आसमाटिक मिनीपंप चुनने के लिए एक बाँझ हेमोस्टैट का उपयोग करें। पंप को इंजेक्शन वाली त्वचा के माध्यम से जेब में धक्का दें।
नोट: सावधान रहें कि पंप और कैनुला को किसी भी गैर-बाँझ सतह को छूने न दें। - कैनुला के नीचे की तरफ कुछ गोंद लगाएं और इसे कैनुला धारक में ठीक करें। खोपड़ी की सतह पर ड्रिल किए गए छेद के माध्यम से कैनुला को धीरे-धीरे कम करें। गोंद को जमने देने के लिए इसे कम से कम 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
- मस्तिष्क में कैनुला डालने से पहले, सुनिश्चित करें कि कैनुला भरा नहीं है और समाधान ठीक से बह रहा है।
नोट: कभी-कभी, ग्लूकोज बहुत कम प्रवाह दर के कारण प्रवेशनी की नोक पर जमा हो सकता है, जिससे प्रवाह अवरुद्ध हो सकता है। - कैंची की मदद से, कैनुला के शीर्ष को क्लिप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह खोपड़ी की सतह से हट न जाए।
- अतिरिक्त समर्थन के लिए डेंटल सीमेंट की एक परत के साथ कैनुला को कवर करें।
- घाव को बंद करने के लिए नायलॉन सीवन (5-0 आकार और 30 इंच लंबाई) का उपयोग करें और संक्रमण को रोकने के लिए घाव पर सामयिक एंटीबायोटिक लागू करें।
- आइसोफ्लुरेन को बंद करें और जानवर को संज्ञाहरण से ठीक होने दें। फिर, जानवर को एक नए साफ पिंजरे में स्थानांतरित करें।
- सर्जरी के बाद की देखभाल
- सर्जरी के बाद, कम से कम 1 सप्ताह के लिए माउस की निगरानी करें।
- सर्जरी के बाद तीन दिनों के लिए हर 24 घंटे में एक बार 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन का उपयोग करें।
- सर्जरी के 7-10 दिन बाद सीवन को हटाने से पहले घाव को पूरी तरह से ठीक होने दें।
नोट: यह देखा गया कि उच्च सीएसएफ ग्लूकोज वाले चूहों को ठीक होने में अधिक समय लगा। माउस के पिछले पंजे पर नाखूनों को ट्रिम करने से चूहों के खरोंच व्यवहार के कारण चीरा की साइट पर चोट लगने की संभावना कम हो जाती है।
3. मिनीपंप का प्रतिस्थापन
नोट: चूंकि, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मिनीपंप केवल 4 सप्ताह तक चलते हैं, इसलिए ग्लूकोज जलसेक की अवधि बढ़ाने के लिए मिनीपंप के प्रतिस्थापन का भी परीक्षण किया गया था, क्योंकि दीर्घकालिक अध्ययनों के मामले में इसकी आवश्यकता हो सकती है। इसमें निम्नलिखित चरण शामिल थे।
- चूहों को सर्जरी के लिए तैयार करें जैसा कि ऊपर बताया गया है।
- पंप से थोड़ा ऊपर त्वचा में एक छोटा 1 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा लगाएं।
- संक्रमित त्वचा के नीचे एक हेमोस्टैट डालें और पंप को बाहर खींचें।
- टयूबिंग से पंप निकालें और टयूबिंग से एक नया प्राइमेड पंप कनेक्ट करें।
- पंप को वापस अंदर डालें और त्वचा को सिलाई करें।
- ऊपर वर्णित सर्जरी के बाद के निर्देशों का पालन करें।
4. सीएसएफ संग्रह प्रक्रिया
- तैयारी
- 0.5 मिमी व्यास युक्तियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर मशीन के साथ 1 मिमी व्यास ग्लास केशिकाओं को खींचें। सेटिंग्स हैं: गर्मी = 800, खिंचाव = 15, वेग = 5, और समय = 200 इकाइयाँ। खींची गई केशिकाओं को उपयोग तक बाँझ बॉक्स में रखें।
- 1 एमएल सिरिंज में 27 ग्राम सुई संलग्न करें। खींची गई केशिका को सुई पर डालें और कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए एक छोटे चिपकने वाले टेप का उपयोग करें।
- माइक्रोमैनिपुलेटर के केशिका धारक में सिरिंज को मजबूती से ठीक करें।
- इसके बाद, सर्जरी के लिए माउस तैयार करें, जैसा कि ऊपर दी गई पूर्व-सर्जरी प्रक्रिया में वर्णित है।
- शल्य चिकित्सा प्रक्रिया
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर माउस रखें। फ्रेम पर सिर को ठीक करने के बाद, जैसा कि पहले वर्णित है, सिर को झुकाने के लिए नॉब्स को घुमाएं ताकि नाक नीचे की ओर हो। सर्जिकल क्षेत्र को सुरक्षित करने के लिए बाँझ ड्रेप लागू करें।
- पृष्ठीय सतह पर एक छोटा सा चीरा लगाएं, जो इंट्रा-ऑरल प्लेन से शुरू होकर पुच्छल पक्ष तक हो।
नोट: ध्यान रखें कि चीरा लगाते समय ट्यूबिंग को नुकसान न पहुंचे। - माउस शरीर से समर्थन निकालें और माउस को लंबवत आराम करने दें ताकि गर्दन पूरी तरह से पृष्ठीय रूप से विस्तारित हो।
- घुमावदार कुंद बल की मदद से, एक छोटी खिड़की बनाने के लिए मध्य रेखा से पीछे की गर्दन की मांसपेशियों को धीरे से विभाजित करें। फिर, गर्दन की मांसपेशियों को धीरे-धीरे मध्य-रेखा से परिधि तक विस्थापित करने के लिए एक गीले कपास टिप एप्लिकेटर का उपयोग करें।
- देखें कि क्या सिस्टर्न मैग्ना उजागर होता है, जो एक पारदर्शी ड्यूरा झिल्ली के साथ एक त्रिकोणीय खिड़की के रूप में दिखाई देता है।
- माइक्रोमैनिपुलेटर असेंबली को माउस के बगल में स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि केशिका टिप किसी भी सतह को नहीं छूती है।
- सेटअप को परेशान किए बिना धीरे से केशिका टिप को तोड़ें।
- मैग्नीफाइंग ग्लास (2.25x का आवर्धन) में देखते समय, माइक्रोमैनिपुलेटर पर संबंधित नॉब्स को घुमाएं ताकि केशिका टिप को धीरे-धीरे संरेखित किया जा सके और सिस्टर्ना मैग्ना की ओर ले जाया जा सके।
- केशिका की नोक के सिस्टर्ना मैग्ना झिल्ली को छूने के बाद कुछ प्रतिरोध महसूस होता है। बहुत धीरे-धीरे नॉब्स की मदद से झिल्ली के खिलाफ नोक को धक्का दें।
नोट: झिल्ली में किसी भी रक्त वाहिकाओं को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें। सीएसएफ में किसी भी रक्त संदूषण से बचने के लिए यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है। - बहुत धीरे से झिल्ली को छेददें। केशिका में नकारात्मक दबाव के कारण सीएसएफ एक बार में केशिका में बहने लगेगा।
- कुछ मिनटों के लिए सेटअप छोड़ दें जब तक कि केशिका में ~ 10 μL CSF एकत्र न हो जाए।
- फिर, धीरे-धीरे केशिका को सिस्टर्ना मैग्ना से बाहर निकालें और सीएसएफ रिसाव को रोकने के लिए सिस्टर्ना मैग्ना के उद्घाटन के खिलाफ एक बाँझ कपास टिप एप्लिकेटर को धीरे से दबाएं।
- सिरिंज से केशिका को सावधानी से निकालें और इसे माइक्रोकैप बल्ब डिस्पेंसर से संलग्न करें। सीएसएफ को बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बल्ब दबाएं।
- माउस के नीचे एक समर्थन रखें और सिर को समतल करने के लिए स्टीरियोटेक्सिक नॉब्स को घुमाएं।
- नायलॉन सीवन के साथ घाव को बंद करें।
- उपकरण से माउस को हटाने से पहले 300 μL बाँझ खारा चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
- ऊपर वर्णित जानवरों को पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल दें, जब तक कि सर्जरी के बाद सीवन को हटाने का समय न हो- ~ 7-10 दिन बाद।
5. ग्लूकोज परख
- ग्लूकोज कलरमेट्रिक परख किट में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें।
- किट में प्रदान किए गए सोडियम फॉस्फेट बफर स्टॉक समाधान को अल्ट्रा-शुद्ध पानी में 50 एमएम एकाग्रता तक पतला करें।
- पतला बफर घोल में किट में प्रदान किए गए 1,000 मिलीग्राम / डीएल स्टॉक समाधान से 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25 और 50 मिलीग्राम / डीएल रेंज में ग्लूकोज मानक तैयार करें।
- बफर में सीएसएफ नमूनों का 7 गुना कमजोर करने की तैयारी करें। उदाहरण के लिए, यदि एकत्र की गई कुल सीएसएफ मात्रा 10 μL है, तो सात गुना पतला वॉल्यूम 70 μL होगा।
- पिपेट 15 μL ग्लूकोज मानकों और 96-वेल प्लेट में डुप्लिकेट में पतला सीएसएफ है।
- मानकों और सीएसएफ के साथ प्रत्येक कुएं में पतला बफर का पाइपेट 85 μL।
- ग्लूकोज कैलोरीमेट्रिक एंजाइम मिश्रण शीशी में 6 मिलीलीटर पतला बफर जोड़ें और इसे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कुछ सेकंड के लिए भंवर करें।
- प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए प्रत्येक कुएं में एंजाइम मिश्रण तैयारी के 100 μL जोड़ें।
- प्लेट को कवर शीट के साथ सील करें और अभिकर्मकों को मिश्रण करने के लिए प्लेट पर धीरे से टैप करें।
- प्लेट को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। उच्च ग्लूकोज वाली शीशियां तुरंत बैंगनी होने लगती हैं।
- 10 मिनट के बाद, कवर को हटा दें और प्लेट रीडर का उपयोग करके 500-520 एनएम पर अवशोषण को मापें।
- सीएसएफ नमूनों में ग्लूकोज एकाग्रता की गणना मानक वक्र से उनके मूल्यों को जोड़कर करें।
6. रक्त ग्लूकोज परख
- मैनुअल निर्देशों के अनुसार, रेजर ब्लेड का उपयोग करके माउस पूंछ पर एक छोटा पार्श्व निक बनाएं और ग्लूकोमीटर के साथ रक्त शर्करा को मापने के लिए रक्त की एक बूंद का उपयोग करें।
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Representative Results
नर चूहों को एक आसमाटिक मिनीपंप (चित्रा 1) में इकट्ठा किए गए कैनुला के साथ प्रत्यारोपित किया गया था ताकि उनके पार्श्व वेंट्रिकल्स में एसीएसएफ या 50% ग्लूकोज समाधान को क्रोनिक रूप से इंजरेट किया जा सके (चित्रा 2)। इस प्रक्रिया की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए सर्जरी (चित्रा 3) के 10 दिन बाद सीएसएफ एकत्र किया गया था। परिणामों से पता चला कि एसीएसएफ से संक्रमित चूहों में 50% ग्लूकोज (औसत: 56.5 मिलीग्राम / डीएल) की तुलना में 50% ग्लूकोज के साथ संक्रमित चूहों में सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर (मतलब: 327.7 मिलीग्राम / डीएल) में वृद्धि हुई है। यह प्रयोगात्मक चूहों में सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर में उनके नियंत्रण कूड़े के साथियों की तुलना में लगभग छह गुना वृद्धि है (चित्रा 4 ए)। समूहों के बीच रक्त शर्करा का स्तर अलग नहीं था (चित्रा 4 बी)।
चित्र 1: आसमाटिक मिनीपंप की असेंबली। (ए) टयूबिंग के माध्यम से मिनीपंप से जुड़े कैनुला के साथ इन्फ्यूजन असेंबली। इन पंपों को प्राइम करने के लिए कम से कम 48 घंटे की आवश्यकता होती है। (बी) मिनीपंप के बाहर हवा के बुलबुले की उपस्थिति प्राइमिंग की पुष्टि करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: स्टीरियोटैक्सिक उपकरण और सहायक उपकरण। (ए, बी) एक संलग्न माइक्रोमैनिपुलेटर और अन्य सामान के साथ स्टीरियोटैक्सिक उपकरण। (सी) होल कैनुला डालने के लिए निर्देशांक करता है। (डी) आसमाटिक मिनी पंप आरोपण, (ई, एफ) ड्रिल किए गए छेद में कैनुला का सम्मिलन। सर्जरी के दौरान सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) संग्रह प्रक्रिया। (ए) पृष्ठीय गर्दन की मांसपेशियों को धीरे से कुंद बल के साथ विस्थापित किया गया था ताकि सिस्टर्ना मैग्ना को उजागर किया जा सके। 0.5 मिमी व्यास की नोक के साथ एक 1 मिमी केशिका का उपयोग (बी) टूटने और (सी, डी) सिस्टर्ना मैग्ना से सीएसएफ एकत्र करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: ग्लूकोज का माप । (ए) पार्श्व वेंट्रिकल में 50% ग्लूकोज समाधान के साथ संक्रमित चूहों में गैर-उपवास रक्त शर्करा के स्तर को प्रभावित किए बिना सीएसएफ ग्लूकोज (बी) में वृद्धि। ग्लूकोज इन्फ्यूजन शुरू करने के 10 दिन बाद सीएसएफ और रक्त ग्लूकोज एकाग्रता को मापकर इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता को मान्य किया गया था। 50% ग्लूकोज घोल के साथ संक्रमित चूहों में सीएसएफ ग्लूकोज का स्तर 327.7 ± 30.1 मिलीग्राम / डीएल (औसत ± मानक त्रुटि) था, उन चूहों की तुलना में जिन्हें कृत्रिम सीएसएफ इन्फ्यूजन प्राप्त हुआ था, जिसमें ग्लूकोज का स्तर 56.5 ± 2.6 मिलीग्राम / डीएल था। पी < 0.0001, अप्रकाशित टी-टेस्ट। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (n = 5) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह लेख पार्श्व वेंट्रिकल में प्रत्यारोपित कैनुला से जुड़े आसमाटिक मिनीपंप का उपयोग करके चूहों में सीएसएफ ग्लूकोज को बढ़ाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करता है। इस प्रक्रिया के माध्यम से माउस मस्तिष्क में ग्लूकोज का पुराना जलसेक अनुभूति, प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय और ऊर्जा संतुलन पर दीर्घकालिक हाइपरग्लाइकोराचिया के प्रभावों को रेखांकित करने और मधुमेह जटिलताओं के रोगजनन को बेहतर ढंग से समझने में उपयोगी होगा।
क्रोनिक मधुमेह मस्तिष्क क्षति का कारण बनता है जो मस्तिष्क और परिधीय अंगों के बीच संचार को बाधित करताहै। मधुमेह भी अल्जाइमर रोग 3,4 सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के जोखिम को बढ़ाता है। स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन (एसटीजेड) -प्रेरित टाइप 1 मधुमेह मधुमेह अनुसंधान में मानक कृंतक मॉडल रहाहै16; एसटीजेड अग्न्याशय में β-कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाता है, जिससे टाइप 1 मधुमेह जैसी विकृति होती है। इसके अलावा, एक संशोधित संस्करण में, निकोटिनामाइड्स के साथ एसटीजेड का उपयोग टाइप 2 मधुमेह को प्रेरित कर सकता है। जानवरों में टाइप 2 मधुमेह जैसे फेनोटाइप विकसित करने का एक और तरीका उन्हें उच्च वसावाले आहार खिलाना है। हालांकि, मस्तिष्क समारोह पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव का अध्ययन करने के संदर्भ में, ये तकनीक बड़ी संख्या में कारकों (जैसे, परिधीय इंसुलिन / ग्लूकागन स्तर, और सामान्य रूप से चयापचय समारोह) को नियंत्रित करने में सीमित हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क समारोह पर एसटीजेड-प्रेरित मधुमेह के किसी भी प्रभाव को केवल एक एकल एटियलॉजिकल कारक को इंगित करने के बजाय एक संबंधित जटिलता के रूप में व्याख्या की जा सकती है। सेरेब्रोवेंट्रिकुलर स्पेस में पदार्थों का तीव्र इंजेक्शन या क्रोनिक इन्फ्यूजन एक तकनीक है जिसका उपयोग अक्सर मस्तिष्क समारोह पर उनके प्रत्यक्ष प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जाता है। एसटीजेड के इनट्रेसरेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) इंजेक्शन का उपयोग अल्जाइमर रोग के कृंतक मॉडल को विकसित करने के लिए किया गया है, हालांकि, यह अनिश्चित है कि एसटीजेड से जुड़ी तंत्रिका क्षति ग्लूकोज सेंसिंग / होमियोस्टैसिस या अन्य स्वतंत्र तंत्र, जैसे एसटीजेड-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और डीएनए क्षति17 में विकृति के कारण है या नहीं।
वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाएं कृंतक मॉडल विकसित करने में उपयोगी होंगी जो अनुसंधान प्रश्नों का उत्तर दे सकती हैं, जैसे कि क्या सीएसएफ ग्लूकोज एकाग्रता में वृद्धि संज्ञानात्मक हानि का कारण बन सकती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हाइपोथैलेमस और हिप्पोकैम्पस पर उच्च सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर के प्रत्यक्ष प्रभावों को निर्धारित करने में किया जा सकता है, पोषक तत्व संवेदन, चयापचय और / या अनुभूति में शामिल अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच। यह विधि यह भी स्पष्ट करेगी कि सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर में वृद्धि इंसुलिन संवेदनशीलता, इंसुलिन स्राव, भोजन का सेवन, और / या बेसलाइन पर और चयापचय अपमान के जवाब में ऊर्जा संतुलन को प्रभावित करती है या नहीं। इसके अलावा, यहां रिपोर्ट किया गया प्रोटोकॉल परीक्षण परिकल्पनाओं में लागू होगा जिनके लिए अनुदैर्ध्य अध्ययन की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, अलग-अलग समय पर एक ही जानवर से निष्कर्षों की तुलना करने के लिए ग्लूकोज इन्फ्यूजन के पहले, दौरान और अंत में डेटा एकत्र किया जा सकता है। इस तरह की रणनीति से पता चलेगा कि सामान्य सीएसएफ ग्लूकोज स्तर बहाल होने के बाद उच्च सीएसएफ ग्लूकोज स्तर से उत्पन्न जटिलताएं प्रतिवर्ती हैं या नहीं। इसके विपरीत, विधि का उपयोग परिकल्पना-उत्पन्न अध्ययन के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सीएसएफ को अलग-अलग समय पर एक ही जानवर से एकत्र किया जा सकता है और बायोमार्कर या सीएसएफ ग्लूकोज के उच्च स्तर द्वारा उत्पादित किसी भी चयापचय अपमान की पहचान करने के लिए मेटाबोलॉमिक्स या प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। इसी तरह, मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों का विश्लेषण स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स द्वारा सेल-विशिष्ट जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जो उच्च सीएसएफ ग्लूकोज द्वारा बदल दिया गया हो सकता है।
एक दिखावटी समूह में ग्लूकोज-मुक्त एसीएसएफ को शामिल करने का तर्क सीएसएफ ग्लूकोज एकाग्रता को बेसलाइन स्तर पर रखना था, ताकि कैनुला प्रत्यारोपण द्वारा प्रेरित सीएसएफ ग्लूकोज स्तर में किसी भी बदलाव को स्वाभाविक रूप से नियंत्रित किया जा सके। इस अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि शाम समूह में ~ 60 मिलीग्राम / डीएल (~ 3 एमएम) की सीएसएफ ग्लूकोज एकाग्रता थी,जो चूहों में सामान्य सीएसएफ ग्लूकोज रेंज में है। टाइप 2 मधुमेह वाले व्यक्तियों में देखा गया सीएसएफ ग्लूकोज का स्तर ~ 110 मिलीग्राम / डीएल या ~ 6 एमएम9 है। वर्तमान अध्ययन में, 125μg / h की दर से 50% ग्लूकोज के ICV इन्फ्यूजन ने CSF ग्लूकोज के स्तर को ~ 300 mg / dL (16 mM) तक बढ़ा दिया, जो कि सुपरफिजियोलॉजिकल19 है। यद्यपि सीएसएफ ग्लूकोज का यह सुपरफिजियोलॉजिकल स्तर टाइप 2 मधुमेह वाले व्यक्तियों में देखे गए स्तरों के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक नहीं हो सकता है, इस अध्ययन में प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि सीएसएफ में ग्लूकोज का जलसेक चूहों में सीएसएफ ग्लूकोज एकाग्रता की पुरानी ऊंचाई को प्रेरित कर सकता है।
यहां प्रस्तुत विधि की कुछ सीमाएं हैं। इसमें परिष्कृत माउस मस्तिष्क सर्जरी शामिल है जिसके लिए ऐसी उन्नत प्रक्रियाओं को करने में प्रासंगिक प्रशिक्षण, कौशल और अनुभव की आवश्यकता होती है। क्योंकि कैथेटर और मिनीपंप को लंबी अवधि के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है, स्वास्थ्य संबंधी चिंताओं या कैथेटर असेंबली को नुकसान की निगरानी के लिए पूरे अध्ययन में चूहों की सावधानीपूर्वक देखभाल आवश्यक है। एक 50% ग्लूकोज एकाग्रता का चयन किया गया था क्योंकि इस एकाग्रता से परे एक समाधान की चिपचिपाहट ने वेंट्रिकल्स में ग्लूकोज के जलसेक को प्रभावित किया हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मिनीपंप ों की प्रवाह दर 0.25 μL / h थी, इसलिए 50% ग्लूकोज जलसेक वाले चूहों के समूह को 125 μg / h की दर से ग्लूकोज प्राप्त हुआ, या प्रति दिन 3 मिलीग्राम ग्लूकोज। प्रति यूनिट समय में ग्लूकोज की यह खुराक इसलिए मिनीपंप की प्रवाह दर से सीमित थी।
सारांश में, यह लेख चूहों में सीएसएफ ग्लूकोज की पुरानी वृद्धि के लिए एक मान्य विधि की रिपोर्ट करता है। इस मॉडल से प्राप्त जानकारी यह निर्धारित करने में उपयोगी होगी कि सीएसएफ ग्लूकोज के स्तर में वृद्धि मधुमेह से जुड़ी जटिलताओं की मध्यस्थता में शामिल है, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार, या मधुमेह और मोटापे में परिधीय चयापचय अपमान का कारण बनता है।
समस्या निवारण
यदि ट्यूबिंग चूहों में प्रवेशनी से बाहर आती है, तो मिनीपंप को इकट्ठा करते समय कैनुला-ट्यूबिंग कनेक्शन पर गोंद की थोड़ी मात्रा लागू की जा सकती है। यदि टांके निकल जाते हैं और प्रवेशनी दिखाई देती है, तो चीरा क्षेत्र को सीवन या स्टेपल का उपयोग करके पूरी तरह से बंद किया जा सकता है। माउस के पिछले पंजे से नाखूनों को ट्रिम किया जाना चाहिए, ताकि माउस द्वारा सर्जरी क्षेत्र को खरोंचने की संभावना कम हो। इसके अलावा, सावधान रहें कि सीवन को इतना तंग न बांधें कि त्वचा फट जाए, क्योंकि चूहों की नाजुक त्वचा होती है।
सीएसएफ संग्रह के बाद तेजी से वसूली के लिए, सर्जरी के बाद 300 μL बाँझ खारा के इंजेक्शन की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, सीएसएफ संग्रह की अधिकतम मात्रा 10 μL रखना भी महत्वपूर्ण है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान केएचसी को डीके 124619 अनुदान देता है।
स्टार्ट-अप फंड और पायलट अनुसंधान पुरस्कार, चिकित्सा विभाग, रोचेस्टर विश्वविद्यालय, एनवाई, केएचसी को।
डेल मोंटे इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोसाइंस पायलट रिसर्च अवार्ड, रोचेस्टर विश्वविद्यालय, केएचसी को।
विश्वविद्यालय अनुसंधान पुरस्कार, अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष का कार्यालय, रोचेस्टर विश्वविद्यालय, एनवाई, केएचसी को।
एमयूआर ने विधि को डिजाइन और प्रदर्शन किया, परिणामों का विश्लेषण किया, रेखांकन और आंकड़े तैयार किए, और पांडुलिपि को लिखा और संपादित किया। केएचसी ने अध्ययन की कल्पना और पर्यवेक्षण किया, परिणामों का विश्लेषण किया, और पांडुलिपि को लिखा और संपादित किया। केएचसी इस काम का गारंटर है। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के अंतिम संस्करण को मंजूरी दे दी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
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