Summary
Denne artikkelen beskriver en detaljert protokoll for å øke glukosekonsentrasjonen i cerebrospinalvæsken (CSF) hos mus. Denne tilnærmingen kan være nyttig for å studere effekten av høy CSF-glukose på nevrodegenerasjon, kognisjon og perifer glukosemetabolisme hos mus.
Abstract
Diabetes øker risikoen for kognitiv tilbakegang og svekker hjernens funksjon. Hvorvidt dette forholdet mellom høy glukose og kognitive underskudd er årsakssammenheng, forblir unnvikende. Videre er det også uklart om disse underskuddene er mediert av en økning i glukosenivået i cerebrospinalvæske (CSF) og / eller blod. Det er svært få studier som undersøker de direkte effektene av høye CSF-glukosenivåer på sentralnervesystemet (CNS) funksjon, spesielt på læring og hukommelse, siden dagens diabetesmodeller ikke er tilstrekkelig utviklet for å løse slike forskningsspørsmål. Denne artikkelen beskriver en metode for kronisk å øke CSF glukosenivået i 4 uker ved kontinuerlig infusjon av glukose i lateral ventrikkel ved hjelp av osmotiske minipumper i mus. Protokollen ble validert ved å måle glukosenivået i CSF. Denne protokollen økte CSF-glukosenivået til ~328 mg/dl etter infusjon av en 50 % glukoseoppløsning ved en strømningshastighet på 0,25 μL/time, sammenlignet med en CSF-glukosekonsentrasjon på ~56 mg/dl hos mus som fikk kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Videre påvirket denne protokollen ikke blodsukkernivået. Derfor kan denne metoden brukes til å bestemme de direkte effektene av høy CSF-glukose på hjernefunksjon eller en spesifikk nevral vei uavhengig av endringer i blodsukkernivå. Samlet sett vil tilnærmingen beskrevet her legge til rette for utvikling av dyremodeller for å teste rollen til høy CSF-glukose i medierende trekk ved Alzheimers sykdom og / eller andre nevrodegenerative lidelser forbundet med diabetes.
Introduction
Både type 1 og type 2 diabetes svekker hjernens funksjon 1,2,3. For eksempel øker diabetes risikoen for kognitiv tilbakegang og nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom 3,4. Videre har personer med diabetes defekt glukose sensing i hjernen 5,6. Denne defekten bidrar til patogenesen av hypoglykemi assosiert ubevissthet og en utilstrekkelig motregulerende respons på hypoglykemi7,8, som kan være dødelig hvis den ikke behandles umiddelbart.
Tatt i betraktning at diabetes øker glukosenivået i blodet så vel som i cerebrospinalvæsken (CSF)9, er det viktig å avgjøre om en eller begge av disse faktorene bidrar til nedsatt hjernefunksjon. Hvorvidt diabetes forårsaker hjerneskade ved høy CSF-glukose alene eller i kombinasjon med andre faktorer som insulinmangel eller insulinresistens, er også et åpent spørsmål. Dyremodeller av type 1 og type 2 diabetes viser kognitiv tilbakegang og nevrodegenerasjon i tillegg til en påvirket energibalanse og perifer glukosemetabolisme10,11,12,13. Fra disse modellene er det imidlertid ikke mulig å koble fra de selektive effektene av høy CSF-glukose versus blodsukkernivå ved å formidle komplikasjonene av diabetes på hjernefunksjonen.
Denne protokollen beskriver metoder for å utvikle en musemodell av hyperglykorrhachia for å teste effekten av kronisk høye CSF-glukosenivåer på hjernefunksjon, energibalanse og glukosehomeostase. Musemodellen utviklet gjennom denne teknikken presenterer et verktøy for studier som undersøker den etiologiske rollen som dysregulert glukosehomeostase på nevral og atferdsfunksjon.
Derfor vil den foreslåtte tilnærmingen være nyttig for å forstå de direkte effektene av forhøyede CSF-glukosenivåer under ulike patofysiologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Rochester og ble utført i henhold til US Public Health Service retningslinjer for human omsorg og bruk av forsøksdyr. Seks uker gamle C57BL/6J hannmus som ble brukt til denne studien ble kommersielt oppnådd. Alle dyrene ble plassert (5 mus per bur) i et rom med en 12 timers dag/natt syklus og fikk tilgang til mat og vann ad libitum. Etter at musene ble implantert med en kanyle for infusjon av glukose i lateral ventrikkel, ble de enkelt plassert for å forhindre skade på implantatene fra andre mus.
1. Montering av osmotiske minipumper
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) i henhold til følgende protokoll. Løs opp NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl 2,2H2 O (0,206 g) og MgCl 2,6H2 O (0,163 g) i 500 ml sterilt vann for å fremstille oppløsning A. Løs opp Na 2 HPO 4,7 H 2 O (0,214 g) og NaH 2 PO4. H2O(0,027g) i 500 ml sterilt vann for å fremstille oppløsning B. Bland deretter oppløsning A og B i forholdet 1:1 for å klargjøre aCSF.
MERK: Denne formuleringen av aCSF inneholder ingen glukose. - For å forberede 50% glukoseoppløsningen, tilsett 50 g glukose til 50 ml aCSF i et begerglass. Legg begeret på en kokeplate og bring temperaturen på opphenget til 60 °C. Bland suspensjonen med en magnetomrører til glukosen er helt oppløst.
- Legg aCSF til begeret for å gjøre det endelige volumet 100 ml. Før løsningen gjennom 0,22 μm porefilter for å sterilisere den.
- Forbered en 0,9% saltoppløsning (NaCl) og før oppløsningen gjennom 0,22 μm filteret.
- Plasser alle komponentene i minipumpen og infusjonssettet i en steril skuff og kutt slangen fra hjerneinfusjonssettet til 1 tomme i lengde med en steril saks. Hold slangen med en steril hemostat og skyv den på toppen av den ene enden av kanylen. Koble den andre enden av slangen til oversiden av strømningsmodulatoren. Dekk begge ender av slangen med en liten mengde lim for en sterkere forbindelse.
- Fest en 27 G kanyle til en 1 ml sprøyte og fyll den med enten aCSF eller glukoseoppløsningen. Stikk 27 G kanylen inn i et lite stykke slange. Deretter kobler du slangen til den åpne enden av strømningsmodulatoren og fyller den med den tilsvarende løsningen til dråper av løsningen begynner å komme ut fra kanylen. Fjern eventuelle luftbobler som er fanget i slangen.
- For å fylle minipumpen, hold pumpen loddrett og sett sprøytekanylen inn i pumpen. Fyll den med den tilsvarende løsningen til en dråpe av løsningen begynner å danne seg ved åpningen av minipumpen.
- Sett strømningsmodulatoren sakte inn i pumpen mens du passer på at det ikke introduseres luftbobler i enheten.
- Etter at de osmotiske minipumpene er montert, overfør dem til et 50 ml konisk rør. Fyll røret med det sterile saltvannet slik at pumpene er helt nedsenket, samtidig som du sørger for at kanylen holder seg ute av saltoppløsningen. Fire slike monterte pumper kan plasseres i ett 50 ml rør.
- Sett hetten løst på hvert rør og inkuber pumpene ved 37 °C til grunning i minst 48 timer.
2. Kirurgi for å implantere osmotiske pumper
- Pre-kirurgi prosedyre
- Steriliser de kirurgiske instrumentene i en autoklav og la dem avkjøles i minst 30 minutter før bruk. Autoklavforholdene innebærer dampsterilisering ved 121 °C i 30 minutter.
- Desinfiser operasjonsområdet med 70% etanol. Tørk av knappene, ørestengene og den stereotaktiske rammeoverflaten.
MERK: Kirurgi bør utføres i et aseptisk miljø, husk å unngå å berøre ikke-sterile overflater mens du utfører kirurgi. Bytt hansker hvis det er mistanke om forurensning. - Plasser musen i et anestesikammer for å bedøve den med 3% isofluran blandet i luft i 3-5 minutter. Fjern deretter musen fra kammeret og legg den på en steril gardin. Opprettholde anestesi via en nesekegle på 1,5% -2%.
- Klem musens bakpote for å observere refleks og verifisere dybden av anestesi.
- Injiser 5 mg/kg karprofen subkutant ved analgesi.
- Bruk rene klippere til å klippe operasjonsområdet på musehodet. Gni hodebunnen først med povidon-jodoppløsning og deretter med alkoholservietter grundig i minst 2 minutter. Gjenta denne prosessen minst tre ganger.
- Påfør et øye smøremiddel for å forhindre at øynene tørker under operasjonen.
- Kirurgi
- Plasser musen på den stereotaktiske rammen og sett hodet på snittstangen. Dekk nesen med nesekeglen. Påfør sterile gardiner for å sikre operasjonsområdet.
- Skift strømmen av isofluran til nesekjeglen. Fortsett å opprettholde anestesien på 1,5% -2% isofluran.
- Plasser en varmepute under musen for å opprettholde kroppstemperaturen.
- Ta på nye sterile hansker og, med en skalpell, gjør et midtlinjesnitt (~ 10-15 mm langt) i hodebunnen. Utsett hodeskalleoverflaten med en slikkepott mens du bruker bomullstips for å tørke blødninger.
MERK: Bruk en cauterizer hvis du blør kraftig, noe som er sjeldent. - Gni med en bomullsspiss dyppet i 3% hydrogenperoksid for å eksponere kranialsuturene.
- Legg merke til bregma og lambda for å navigere i hodeskallekoordinatene. Sett alle koordinatene til null ved bregma.
MERK: Disse koordinatene ble hentet fra et musehjerneatlas14. Referanse bregma-lambda-avstanden i atlaset er 4,21 mm. For å korrigere for alders- og kjønnsbaserte forskjeller i skallestørrelse, ble bregma-lambda-avstanden for hver mus målt og deretter delt med 4,21 mm for å oppnå en multiplikasjonsfaktor. For eksempel, hvis avstanden mellom bregma og lambda var 4,65 mm, ga deling med 4,21 mm en multiplikasjonsfaktor på 1,10. Alle koordinatene hentet fra atlaset ble deretter multiplisert med denne faktoren for å måle de faktiske koordinatene som ble brukt til å bore hullet. I eksemplet ovenfor vil de resulterende fremre-bakre (AP) og medial-laterale (ML) koordinatene være henholdsvis 0,55 og 1,1 mm (dvs. 1,1 x 0,5 eller 1 mm). - Bruk en elektrisk drill for å lage et hull på disse koordinatene: 0,5 mm bakre til bregma og 1 mm lateralt til midtlinje mot høyre.
MERK: Mens du borer hullet i skallen, vær forsiktig så du ikke brister dura materen. Forsikre deg om at borkronen er steril. Den kan plasseres sammen med andre instrumenter i samme autoklavpose for sterilisering. - Sett inn en hemostat under den snittede huden og skyv den til stedet der den osmotiske minipumpen skal implanteres. Åpne og lukk hemostaten forsiktig for å lage en lomme til minipumpen.
- Bruk en steril hemostat til å plukke en primet osmotisk minipumpe fra spissen av strømningsmodulatoren. Skyv pumpen gjennom den snittede huden og ned i lommen.
MERK: Pass på at pumpen og kanylen ikke berører en ikke-steril overflate. - Påfør litt lim på undersiden av kanylen og fest den i kanyleholderen. Senk kanylen sakte gjennom det borede hullet 2 mm ventral til skalleoverflaten. La den stå der i minst 5 min for å la limet stivne.
- Før du setter kanylen ned i hjernen, må du kontrollere at kanylen ikke er tilstoppet og at løsningen flyter riktig.
MERK: Noen ganger kan glukose avsette på spissen av kanylen på grunn av en svært lav strømningshastighet, som blokkerer strømmen. - Ved hjelp av en saks, klem toppen av kanylen og pass på at den ikke løsner fra skalleoverflaten.
- Dekk kanylen med et lag dental sement for ekstra støtte.
- Bruk nylonsuturer (5-0 størrelse og 30 tommer i lengde) for å lukke såret og påfør aktuelt antibiotika på såret for å forhindre infeksjon.
- Slå av isofluran og la dyret komme seg fra anestesien. Overfør deretter dyret til et nytt rent bur.
- Behandling etter operasjonen
- Etter operasjonen, overvåk musen i minst 1 uke.
- Administrer 5 mg/kg karprofen subkutant, én gang hver 24. time i tre dager etter operasjonen.
- La såret gro helt før du fjerner suturene 7-10 dager etter operasjonen.
MERK: Det ble observert at mus med høy CSF-glukose tok lengre tid å helbrede. Trimming av negler på musens bakpoter minimerer sjansen for skade på snittstedet på grunn av musens skrapeoppførsel.
3. Utskifting av minipumpene
MERK: Siden minipumpene som ble brukt i denne studien bare varer i 4 uker, ble utskifting av minipumper også testet for å forlenge varigheten av glukoseinfusjon, da det kan være nødvendig ved langtidsstudier. Dette innebar følgende trinn.
- Forbered musene for kirurgi som beskrevet ovenfor.
- Lag et lite 1 cm vertikalt snitt i huden litt over pumpen.
- Sett inn en hemostat under den snittede huden og trekk pumpen ut.
- Fjern pumpen fra slangen og koble en ny primet pumpe til slangen.
- Sett pumpen inn igjen og sy sammen huden.
- Følg de samme instruksjonene etter operasjonen som beskrevet ovenfor.
4. Prosedyre for CSF-innsamling
- Forberedelse
- Trekk glasskapillærene med en diameter på 1 mm med en mikropipettavtrekkermaskin for å oppnå spisser med diameter på 0,5 mm. Innstillingene er: varme = 800, trekk = 15, hastighet = 5 og tid = 200 enheter. Plasser de trukket kapillærene i en steril boks til bruk.
- Fest en 27 G kanyle til en 1 ml sprøyte. Sett den trukne kapillæren på nålen og bruk en liten tape for å sikre tilkoblingen.
- Fest sprøyten godt i en kapillærholder på en mikromanipulator.
- Forbered deretter musen for kirurgi, som beskrevet i prosedyren før operasjonen ovenfor.
- Kirurgisk prosedyre
- Plasser musen på den stereotaksiske rammen. Etter å ha festet hodet på rammen, som beskrevet tidligere, drei knappene for å vippe hodet slik at nesen vender nedover. Påfør sterile gardiner for å sikre operasjonsområdet.
- Lag et lite snitt på dorsaloverflaten, fra det intra-aurale planet til kaudalsiden.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skader slangen mens du gjør snittet. - Fjern støtten fra musekroppen og la musen hvile vertikalt slik at nakken er helt utstrakt dorsalt.
- Ved hjelp av buede, stumpe tang, kryss forsiktig de bakre nakke musklene fra midtlinjen for å skape et lite vindu. Bruk deretter en våt bomullsspissapplikator for å forsiktig forflytte nakkemusklene fra midtlinjen til periferien.
- Vær oppmerksom på om cisterna magna er eksponert, som fremstår som et trekantet vindu med en gjennomsiktig duramembran.
- Plasser mikromanipulatorenheten på den stereotaksiske rammen ved siden av musen mens du sørger for at kapillærspissen ikke berører noen overflate.
- Bryt kapillærspissen forsiktig uten å forstyrre oppsettet.
- Mens du ser inn i forstørrelsesglasset (forstørrelse på 2,25x), drei de tilsvarende knappene på mikromanipulatoren for sakte å justere og flytte kapillærspissen mot cisterna magna.
- Noe motstand føles når kapillærspissen berører cisterna magna-membranen. Skyv spissen sakte mot membranen ved hjelp av knottene.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skader blodkar i membranen. Dette trinnet er svært viktig for å unngå blodforurensning i spinalvæsken. - Veldig forsiktig pierce membranen. CSF vil begynne å strømme inn i kapillæren med en gang på grunn av undertrykk i kapillæren.
- La oppsettet stå i noen minutter til ~10 μL CSF samles i kapillæren.
- Trekk deretter kapillæren sakte ut av cisterna magna og trykk forsiktig en steril bomullsspissapplikator mot åpningen av cisterna magna for å stoppe CSF-lekkasje.
- Fjern kapillæren forsiktig fra sprøyten og fest den til en mikrohettepæredispenser. Trykk på pæren for å overføre CSF til et sterilt mikrosentrifugerør.
- Plasser en støtte under musen og roter de stereotaktiske knappene for å utjevne hodet.
- Lukk såret med nylonsuturer.
- Injiser 300 mikrol steril saltoppløsning subkutant før musen fjernes fra apparatet.
- Gi postoperativ omsorg til dyrene som beskrevet ovenfor, til det er på tide å fjerne suturene-~ 7-10 dager etter operasjonen.
5. Glukose analyse
- Følg protokollen som beskrevet i glukosekolorimetriske analysesettet.
- Fortynn natriumfosfatbufferstamløsningen som følger med i settet til 50 mM konsentrasjon i ultrarent vann.
- Forbered glukosestandarder i 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 og 50 mg / dl varierer fra 1,000 mg / dL-stamløsningen som følger med i settet i fortynnet bufferløsning.
- Forbered en 7 ganger fortynning av CSF-prøver i bufferen. For eksempel, hvis det totale CSF-volumet som samles inn er 10 μL, vil det syv ganger fortynnede volumet være 70 μL.
- Pipette 15 μL glukosestandarder og fortynnet CSF i duplikater i en 96-brønnsplate.
- Pipette 85 μL fortynnet buffer i hver av brønnene med standarder og CSF.
- Tilsett 6 ml fortynnet buffer til hetteglasset med glukosekalorimetrisk enzymblanding, og virvle det i noen sekunder for å blande det grundig.
- Tilsett 100 μL av enzymblandingspreparatet til hver brønn for å starte reaksjonen.
- Forsegl platen med et dekselark og trykk forsiktig på platen for å blande reagensene.
- Legg platen i en inkubator ved 37 °C i 10 minutter. Hetteglass med høy glukose begynner å bli fiolett umiddelbart.
- Etter 10 min, fjern dekselet og mål absorbansen ved 500-520 nm ved hjelp av en plateleser.
- Beregn glukosekonsentrasjonen i CSF-prøvene ved å interpolere verdiene fra standardkurven.
6. Blodsukkeranalyse
- Lag et lite sideveis nick til musehalen ved hjelp av et barberblad og bruk en dråpe blod for å måle blodsukkeret med et glukometer, i henhold til de manuelle instruksjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hannmus ble implantert med en kanyle satt sammen til en osmotisk minipumpe (figur 1) for kronisk å tilføre aCSF eller en 50 % glukoseoppløsning i laterale ventrikler (figur 2). CSF ble samlet inn 10 dager etter operasjonen (figur 3) for å validere effekten av denne prosedyren. Resultatene viste en økning i CSF-glukosenivået (gjennomsnitt: 327,7 mg / dL) hos mus infundert med 50% glukose sammenlignet med det (gjennomsnitt: 56,5 mg / dL) hos mus infundert med aCSF. Dette er omtrent en seks ganger økning i CSF-glukosenivået i eksperimentelle mus sammenlignet med deres kontrollkullkamerater (figur 4A). Blodsukkernivået var ikke forskjellig mellom gruppene (figur 4B).
Figur 1: Montering av osmotiske minipumper . (A) Infusjonsenhet med kanyle koblet til en minipumpe gjennom slangen. Disse pumpene krever minst 48 timer for å prime. (B) Tilstedeværelsen av luftbobler utenfor minipumpene bekrefter grunningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Stereotaksiske apparater og tilbehør. (A,B) Stereotaksisk utstyr med påmontert mikromanipulator og annet tilbehør. (C) Burr hullkoordinater for å sette inn kanylen. (D) Implantasjon av osmotisk minipumpe, (E,F) Innsetting av kanylen i det borede hullet. Oppretthold aseptiske forhold gjennom hele operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Prosedyre for oppsamling av spinalvæske (CSF). (A) Dorsal nakkemusklene ble forsiktig forskjøvet med butt tang for å avsløre cisterna magna. En 1 mm kapillær spiss med en spiss med diameter på 0,5 mm ble brukt til å (B) ruptur og (C,D) samle CSF fra cisterna magna. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Måling av glukose . (A) Økt CSF-glukose (B) uten å påvirke ikke-fastende blodsukkernivåer hos mus infundert med 50% glukoseoppløsning i lateral ventrikkel. Effekten av denne protokollen ble validert ved å måle CSF og blodglukosekonsentrasjon 10 dager etter oppstart av glukoseinfusjonen. Mus infundert med 50 % glukoseoppløsning hadde CSF-glukosenivåer på 327,7 ± 30,1 mg/dl (gjennomsnittlig ± standard gjennomsnittsfeil) sammenlignet med mus som fikk kunstig CSF-infusjon som hadde glukosenivåer på 56,5 ± 2,6 mg/dl. p < 0,0001, uparet t-test. Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnitt (n = 5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen rapporterer en detaljert protokoll for å øke CSF-glukose hos mus ved å bruke osmotiske minipumper koblet til en kanyle implantert i lateral ventrikkel. Den kroniske infusjonen av glukose i musehjernen gjennom denne prosedyren vil være nyttig for å avgrense effekten av langsiktig hyperglykorikorrhachia på kognisjon, systemisk glukosemetabolisme og energibalanse og for bedre å forstå patogenesen av diabeteskomplikasjoner.
Kronisk diabetes forårsaker hjerneskade som forstyrrer kommunikasjonen mellom hjernen og de perifere organene15. Diabetes øker også risikoen for nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom 3,4. Streptozotocin (STZ)-indusert type 1 diabetes har vært standard gnagermodell i diabetesforskning16; STZ skader β-celler i bukspyttkjertelen, noe som fører til type 1 diabetes-lignende patologi. Videre, i en modifisert versjon, kan bruk av STZ ledsaget av nikotinamider indusere type 2 diabetes. En annen måte å utvikle type 2 diabeteslignende fenotyper hos dyr er gjennom å gi dem et fettrikt kosthold16. Imidlertid, i sammenheng med å studere effekten av hyperglykemi på hjernens funksjon, er disse teknikkene begrenset til å kontrollere for et stort antall faktorer (f.eks. Perifere insulin / glukagonnivåer og metabolsk funksjon generelt). Dermed kan enhver effekt av STZ-indusert diabetes på hjernefunksjonen bare tolkes som en tilknyttet komplikasjon, i stedet for å identifisere en enkelt etiologisk faktor. Akutt injeksjon eller kronisk infusjon av stoffer i cerebroventrikulært rom er en teknikk som ofte brukes til å teste deres direkte effekter på hjernefunksjonen. Intracerebroventrikulær (ICV) injeksjon av STZ har blitt brukt til å utvikle en gnagermodell av Alzheimers sykdom, men det er fortsatt usikkert om STZ-assosiert nevral skade skyldes dysregulering i glukosesensing / homeostase eller andre uavhengige mekanismer, som STZ-indusert oksidativt stress og DNA-skade17.
Prosedyrene beskrevet i den nåværende protokollen vil være nyttige for å utvikle gnagermodeller som kan svare på forskningsspørsmål, som om en økning i CSF-glukosekonsentrasjon kan forårsake kognitiv svekkelse. Protokollen beskrevet her kan brukes til å bestemme de direkte effektene av høye CSF-glukosenivåer på hypothalamus og hippocampus, blant andre hjernegrupper involvert i næringssensing, metabolisme og / eller kognisjon. Denne metoden vil også avklare om en økning i CSF-glukosenivået påvirker insulinfølsomhet, insulinsekresjon, matinntak og/eller energibalanse ved baseline og som respons på metabolske fornærmelser. Videre vil protokollen rapportert her være anvendelig ved testing av hypoteser som krever longitudinelle studier. For eksempel kan data samles inn før, under og på slutten av glukoseinfusjonene for å sammenligne funn fra de samme dyrene på forskjellige tidspunkter. En slik strategi vil adressere hvorvidt komplikasjoner som oppstår fra høyt CSF-glukosenivå er reversible etter at det normale CSF-glukosenivået er gjenopprettet. Derimot kan metoden også brukes til hypotesegenererende studier. For eksempel kan CSF samles fra de samme dyrene på forskjellige tidspunkter og underkastes metabolomikk eller proteomikkanalyse for å identifisere biomarkører eller metabolske fornærmelser produsert av høyt nivå av CSF-glukose. På samme måte kan forskjellige regioner i hjernen analyseres av romlig transkriptomikk for å gi cellespesifikk informasjon som kan ha blitt endret av høy CSF-glukose.
Begrunnelsen for å infisere glukosefri aCSF til en simuleringsgruppe var å holde CSF-glukosekonsentrasjonen på utgangsnivået, slik at enhver endring i CSF-glukosenivået indusert av kanyleimplantasjon kan kontrolleres naturlig. Resultatene i denne studien viste at sham-gruppen hadde en CSF-glukosekonsentrasjon på ~ 60 mg / dL (~ 3 mM), som er i det normale CSF-glukoseområdet hos mus18. CSF glukosenivået observert hos personer med type 2 diabetes er ~ 110 mg / dL eller ~ 6 mM9. I den nåværende studien økte ICV-infusjon av 50% glukose med en hastighet på 125 μg / t CSF-glukosenivået til ~ 300 mg / dL (16 mM), som er suprafysiologisk19. Selv om dette suprafysiologiske nivået av CSF-glukose kanskje ikke er klinisk relevant for nivåene observert hos personer med type 2 diabetes, viser resultatene som presenteres i denne studien at infusjon av glukose i CSF kan indusere en kronisk økning av CSF-glukosekonsentrasjonen hos mus.
Metoden som presenteres her har noen begrensninger. Det innebærer sofistikert musehjernekirurgi som krever relevant opplæring, ferdigheter og erfaring med å utføre slike avanserte prosedyrer. Fordi kateteret og minipumpene er implantert på lang sikt, er det nødvendig med omhyggelig pleie av musene gjennom hele studien for å overvåke helseproblemer eller skade på kateterenheten. En glukosekonsentrasjon på 50 % ble valgt fordi viskositeten til en oppløsning utover denne konsentrasjonen kunne ha påvirket infusjonen av glukose inn i ventriklene. Minipumpene som ble brukt i denne protokollen hadde en strømningshastighet på 0,25 μL / time, slik at gruppen mus med 50% glukoseinfusjon fikk glukose med en hastighet på 125 μg / t, eller 3 mg glukose per dag. Denne dosen glukose per tidsenhet var derfor begrenset av strømningshastigheten til minipumpene.
Oppsummert rapporterer denne artikkelen en validert metode for kronisk økning av CSF-glukose hos mus. Informasjonen hentet fra denne modellen vil være nyttig for å avgjøre om eller hvordan en økning i CSF-glukosenivået er involvert i formidling av diabetesassosierte komplikasjoner, for eksempel nevrodegenerative lidelser, eller forårsaker perifere metabolske fornærmelser i diabetes og fedme.
Feilsøking
Hvis slangen kommer ut av kanylen i musene, kan en liten mengde lim på kanyleslangeforbindelsen påføres mens minipumpen monteres. Hvis stingene løsner og kanylen blir synlig, kan snittområdet lukkes helt ved hjelp av suturer eller stifter. Negler fra musens bakpoter skal trimmes, slik at det er lavere mulighet for å skrape operasjonsområdet med musen. Vær dessuten forsiktig så du ikke binder av suturene så stramt at huden vil rive, da mus har delikat hud.
For rask gjenoppretting etter CSF-samling, anbefales injeksjon av 300 μl steril saltoppløsning subkutant etter operasjonen. Videre er det også viktig å holde det maksimale volumet av CSF-innsamling til 10 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
National Institutes of Health gir DK124619 til KHC.
Oppstartsmidler og pilotforskningspris, Institutt for medisin, University of Rochester, NY, til KHC.
Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, til KHC.
University Research Award, kontoret til visepresidenten for forskning, University of Rochester, NY, til KHC.
MUR designet og utførte metoden, analyserte resultater, utarbeidet grafer og figurer, og skrev og redigerte manuskriptet. KHC unnfanget og overvåket studien, analyserte resultater og skrev og redigerte manuskriptet. KHC er garantist for dette arbeidet. Alle forfatterne godkjente den endelige versjonen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
- Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
- Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W.
- Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
- Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H.
- Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
- Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
- Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
- Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
- Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263 (2013).
- Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587 (2022).
- Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
- Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R.
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78 (2021).
- Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
- Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
- Dougherty, J. M., Roth, R. M.
