Summary
이 기사에서는 생쥐의 뇌척수액(CSF)에서 포도당 농도를 증가시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 높은 CSF 포도당이 생쥐의 신경변성, 인지 및 말초 포도당 대사에 미치는 영향을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.
Abstract
당뇨병은 인지 기능 저하의 위험을 증가시키고 뇌 기능을 손상시킵니다. 높은 포도당과 인지 결핍 사이의 이러한 관계가 인과관계인지 여부는 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, 이러한 결손이 뇌척수액(CSF) 및/또는 혈액의 포도당 수치 증가에 의해 매개되는지 여부도 불분명합니다. 현재의 당뇨병 모델이 이러한 연구 문제를 해결하기에 충분히 개발되지 않았기 때문에 높은 CSF 포도당 수치가 중추신경계(CNS) 기능, 특히 학습 및 기억에 미치는 직접적인 영향을 조사한 연구는 거의 없습니다. 이 기사에서는 생쥐의 삼투압 미니 펌프를 사용하여 포도당을 측심실에 지속적으로 주입하여 4주 동안 CSF 포도당 수치를 만성적으로 증가시키는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 CSF의 포도당 수준을 측정하여 검증되었습니다. 이 프로토콜은 인공 뇌척수액(aCSF)을 투여받은 마우스에서 ~56mg/dL의 CSF 포도당 농도와 비교하여 0.25μL/h 유속으로 50% 포도당 용액을 주입한 후 CSF 포도당 수준을 ~328mg/dL로 증가시켰습니다. 또한, 이 프로토콜은 혈당 수치에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서 이 방법은 혈당 수치의 변화와 무관하게 뇌 기능 또는 특정 신경 경로에 대한 높은 CSF 포도당의 직접적인 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 전반적으로, 여기에 설명된 접근법은 알츠하이머병 및/또는 당뇨병과 관련된 다른 신경퇴행성 장애의 특징을 매개하는 데 있어 높은 CSF 포도당의 역할을 테스트하기 위한 동물 모델의 개발을 촉진할 것입니다.
Introduction
제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두 뇌 기능을 손상시킵니다 1,2,3. 예를 들어, 당뇨병은 인지 기능 저하 및 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 장애의 위험을 증가시킵니다 3,4. 또한, 당뇨병 환자는 뇌에서 포도당 감지에 결함이 있습니다 5,6. 이 결함은 저혈당증과 관련된 무의식의 발병기전과 저혈당증에 대한 불충분한 반조절 반응에 기여합니다7,8, 이는 즉시 치료하지 않으면 치명적일 수 있습니다.
당뇨병이 혈중 포도당 수치와 뇌척수액(CSF)을 증가시킨다는 점을 고려하면9, 이러한 요인 중 하나 또는 둘 모두가 뇌 기능 장애에 기여하는지 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 당뇨병이 높은 CSF 포도당 단독으로 또는 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성과 같은 다른 요인과 함께 뇌 손상을 유발하는지 여부도 열린 질문입니다. 제1형 및 제2형 당뇨병의 동물 모델은 영향을 받은 에너지 균형 및 말초 포도당 대사 외에도 인지 저하 및 신경퇴행을 나타낸다10,11,12,13. 그러나 이러한 모델에서 뇌 기능에 대한 당뇨병의 합병증을 매개하는 데 있어 높은 CSF 포도당 대 혈당 수치의 선택적 효과를 분리하는 것은 실현 가능하지 않습니다.
이 프로토콜은 만성적으로 높은 CSF 포도당 수치가 뇌 기능, 에너지 균형 및 포도당 항상성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 고혈당 마우스 모델을 개발하는 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 개발된 마우스 모델은 신경 및 행동 기능에 대한 조절 장애 포도당 항상성의 병인학적 역할을 조사하는 연구를 위한 도구를 제공합니다.
따라서 제안된 접근법은 다양한 병태생리학적 조건에서 상승된 CSF 포도당 수준의 직접적인 영향을 이해하는 데 유용할 것입니다.
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Protocol
모든 마우스 시술은 로체스터 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 미국 공중 보건 서비스 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 6주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 상업적으로 입수하였다. 모든 동물들은 12시간 낮/밤 주기로 방에 집단 수용되었고(케이지당 5마리의 마우스) 음식과 물에 임의로 접근할 수 있었습니다. 마우스에 포도당을 외심실에 주입하기 위한 캐뉼라를 이식한 후, 다른 마우스의 임플란트 손상을 방지하기 위해 단독으로 수용했습니다.
1. 삼투압 미니 펌프의 조립
- 다음 프로토콜에 따라 인공 뇌척수액(aCSF)을 준비합니다. NaCl (8.66 g), KCl (0.224 g), CaCl 2.2H2O (0.206 g), 및 MgCl2.6H2O (0.163 g)를 멸균수 500 mL에 녹여 용액 A를 제조하고, Na2HPO4.7H2O (0.214 g)와NaH2PO4를 용해시킨다. H2O(0.027 g)를 500 mL의 멸균수에 투입하여 용액 B를 제조하였다. 그런 다음 용액 A와 B를 1:1 비율로 혼합하여 aCSF를 제조합니다.
참고: 이 aCSF 제형에는 포도당이 포함되어 있지 않습니다. - 50 % 포도당 용액을 제조하기 위해, 50 g의 포도당을 50 mL의 aCSF에 비커에 첨가한다. 비커를 핫 플레이트에 놓고 현탁액의 온도를 60°C로 가져옵니다. 포도당이 완전히 용해 될 때까지 현탁액을 자기 교반기와 혼합하십시오.
- aCSF를 비커에 첨가하여 최종 부피 100mL를 만든다. 용액을 0.22μm 기공 필터에 통과시켜 멸균합니다.
- 0.9% 식염수(NaCl) 용액을 준비하고 용액을 0.22μm 필터에 통과시킵니다.
- 미니 펌프와 주입 키트의 모든 구성 요소를 멸균 트레이에 넣고 멸균 가위로 뇌 주입 키트의 튜브를 1인치 길이로 자릅니다. 멸균 지혈제로 튜브를 잡고 캐뉼라의 한쪽 끝 상단에 밀어 넣습니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 흐름 모듈레이터의 상단에 연결합니다. 더 강한 연결을 위해 튜브의 양쪽 끝을 소량의 접착제로 덮으십시오.
- 27G 바늘을 1mL 주사기에 연결하고 aCSF 또는 포도당 용액으로 채웁니다. 27G 바늘을 작은 튜브 조각에 삽입합니다. 그런 다음 튜브를 흐름 변조기의 열린 끝에 연결하고 캐뉼라에서 용액 방울이 나오기 시작할 때까지 해당 용액으로 채웁니다. 튜브에 갇힌 기포를 제거합니다.
- 미니 펌프를 채우려면 펌프를 똑바로 세우고 주사기 바늘을 펌프에 삽입하십시오. 미니 펌프의 입구에서 용액 한 방울이 형성되기 시작할 때까지 해당 용액으로 채 웁니다.
- 흐름 모듈레이터를 펌프에 천천히 삽입하면서 어셈블리에 기포가 들어가지 않도록 합니다.
- 삼투압 미니 펌프를 조립한 후 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 펌프가 완전히 잠길 수 있도록 튜브에 멸균 식염수를 채우고 캐뉼라가 식염수에서 나오지 않도록 합니다. 이렇게 조립된 펌프 4개를 하나의 50mL 튜브에 배치할 수 있습니다.
- 각 튜브에 캡을 느슨하게 놓고 펌프를 37°C에서 배양하여 최소 48시간 동안 프라이밍합니다.
2. 삼투압 펌프 이식 수술
- 수술 전 절차
- 수술 기구를 오토클레이브에서 소독하고 사용하기 전에 최소 30분 동안 식히십시오. 오토클레이브 조건에는 121°C에서 30분 동안 증기 멸균이 포함됩니다.
- 수술 부위를 70% 에탄올로 소독합니다. 손잡이, 이어바 및 입체 프레임 표면을 닦습니다.
알림: 수술은 무균 환경에서 수행해야 하며 수술을 수행하는 동안 비멸균 표면을 만지지 않도록 주의해야 합니다. 오염이 의심되는 경우 장갑을 교체하십시오. - 마우스를 마취실에 넣고 3-5분 동안 공기 중에 혼합된 3% 이소플루란으로 마취합니다. 그런 다음 챔버에서 마우스를 꺼내 멸균 드레이프에 놓습니다. 노즈콘을 통해 마취를 1.5%-2%로 유지하십시오.
- 마우스 뒷발을 꼬집어 반사를 관찰하고 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 진통을 위해 5mg/kg 카프로펜을 피하 주사합니다.
- 깨끗한 가위를 사용하여 마우스 머리의 수술 부위를 자릅니다. 먼저 포비돈 요오드 용액으로 두피를 문지른 다음 알코올 면봉으로 최소 2분 동안 철저히 문지릅니다. 이 과정을 세 번 이상 반복하십시오.
- 수술 중 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 눈 윤활제를 바르십시오.
- 외과
- 마우스를 정위 프레임에 놓고 머리를 앞니 막대에 맞춥니다. 코 콘으로 코를 덮으십시오. 수술 부위를 고정하기 위해 멸균 커튼을 적용합니다.
- 이소 플루 란의 흐름을 코 콘으로 옮깁니다. 마취를 1.5%-2% 이소플루란으로 계속 유지하십시오.
- 체온을 유지하기 위해 마우스 아래에 가열 패드를 놓습니다.
- 새 멸균 장갑을 착용하고 메스로 두피에 정중선 절개(~10-15mm 길이)를 합니다. 주걱으로 두개골 표면을 노출시키면서 면봉을 사용하여 출혈을 닦아냅니다.
알림: 드물게 출혈이 심한 경우 소작기를 사용하십시오. - 3% 과산화수소에 적신 면봉으로 문질러 두개골 봉합사를 노출시킵니다.
- 두개골 좌표를 탐색하기 위해 bregma와 lambda를 기록해 두십시오. bregma에서 모든 좌표를 0으로 설정합니다.
참고: 이 좌표는 마우스 뇌 지도책14에서 얻은 것입니다. 아틀라스의 기준 브레그마-람다 거리는 4.21mm입니다. 두개골 크기의 연령 및 성별 차이를 보정하기 위해 각 마우스의 브레그마-람다 거리를 측정한 다음 4.21mm로 나누어 곱셈 계수를 얻었습니다. 예를 들어, 브레그마와 람다 사이의 거리가 4.65mm인 경우 4.21mm로 나누면 곱셈 계수는 1.10이 됩니다. 그런 다음 아틀라스에서 얻은 모든 좌표에 이 요소를 곱하여 구멍을 뚫는 데 사용된 실제 좌표를 측정했습니다. 상기 예에서, 결과적인 전후(AP) 및 내측(ML) 좌표는 각각 0.55 및 1.1mm(즉, 1.1 x 0.5 또는 1mm)가 될 것이다. - 전기 드릴을 사용하여 브레그마에서 뒤쪽으로 0.5mm, 오른쪽에서 측면으로 정중선에서 1mm 좌표에 구멍을 뚫습니다.
알림: 두개골에 구멍을 뚫는 동안 경질막이 파열되지 않도록 주의하십시오. 드릴 비트가 멸균되었는지 확인하십시오. 멸균을 위해 동일한 오토클레이브 파우치에 다른 기기와 함께 넣을 수 있습니다. - 절개 된 피부 아래에 지혈제를 삽입하고 삼투압 미니 펌프가 이식 될 장소로 밀어 넣습니다. 지혈기를 부드럽게 열고 닫아 미니 펌프용 주머니를 만듭니다.
- 멸균 지혈기를 사용하여 유량 조절기 끝에서 프라이밍된 삼투압 미니펌프를 선택합니다. 절개된 피부를 통해 펌프를 주머니에 밀어 넣습니다.
알림: 펌프와 캐뉼라가 멸균되지 않은 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. - 캐뉼라 밑면에 접착제를 바르고 캐뉼라 홀더에 고정합니다. 뚫린 구멍을 통해 두개골 표면까지 복부 2mm를 천천히 내립니다. 접착제가 굳을 수 있도록 최소 5분 동안 그대로 두십시오.
- 캐뉼라를 뇌에 삽입하기 전에 캐뉼라가 막히지 않았는지, 용액이 제대로 흐르고 있는지 확인하십시오.
알림: 때때로 포도당은 매우 낮은 유속으로 인해 캐뉼라 끝에 침전되어 흐름을 차단할 수 있습니다. - 가위를 사용하여 캐뉼라 상단을 잘라 두개골 표면에서 떨어지지 않도록 합니다.
- 추가 지원을 위해 캐뉼라를 치과용 시멘트 층으로 덮으십시오.
- 나일론 봉합사(5-0 크기 및 길이 30인치)를 사용하여 상처를 봉합하고 감염을 예방하기 위해 상처에 국소 항생제를 바르십시오.
- 이소 플루 란을 끄고 동물이 마취에서 회복되도록하십시오. 그런 다음 동물을 새로운 깨끗한 케이지로 옮깁니다.
- 수술 후 관리
- 수술 후 최소 1주일 동안 마우스를 모니터링합니다.
- 수술 후 3일 동안 24시간마다 한 번씩 5mg/kg 카르프로펜을 피하 투여합니다.
- 수술 후 7-10 일 후에 봉합사를 제거하기 전에 상처가 완전히 치유되도록하십시오.
참고: CSF 포도당이 높은 마우스는 치유하는 데 더 오래 걸리는 것으로 관찰되었습니다. 쥐의 뒷발에 손톱을 다듬으면 쥐의 긁는 행동으로 인해 절개 부위가 다칠 가능성이 최소화됩니다.
3. 미니 펌프 교체
참고: 이 연구에 사용된 미니 펌프는 4주 동안만 지속되기 때문에 장기 연구의 경우 필요할 수 있으므로 미니 펌프의 교체도 포도당 주입 기간을 연장하는 것으로 테스트되었습니다. 여기에는 다음 단계가 포함되었습니다.
- 위에서 설명한대로 수술을 위해 마우스를 준비하십시오.
- 펌프 약간 위의 피부에 1cm의 작은 수직 절개를 합니다.
- 절개 된 피부 아래에 지혈제를 삽입하고 펌프를 당겨 빼냅니다.
- 튜브에서 펌프를 제거하고 새 프라이밍 펌프를 튜브에 연결합니다.
- 펌프를 다시 안쪽으로 삽입하고 피부를 꿰매십시오.
- 위에서 설명한 것과 동일한 수술 후 관리 지침을 따르십시오.
4. 뇌척수액 수집 절차
- 준비
- 마이크로피펫 풀러 기계로 1mm 직경의 유리 모세관을 당겨 0.5mm 직경의 팁을 얻습니다. 설정은 열 = 800, 당김 = 15, 속도 = 5, 시간 = 200 단위입니다. 당겨진 모세관을 사용할 때까지 멸균 상자에 넣습니다.
- 27G 바늘을 1mL 주사기에 연결합니다. 당겨진 모세관을 바늘에 삽입하고 작은 접착 테이프를 사용하여 연결을 고정합니다.
- 미세 매니퓰레이터의 모세관 홀더에 주사기를 단단히 고정하십시오.
- 다음으로, 위의 수술 전 절차에서 설명한 대로 수술을 위해 마우스를 준비합니다.
- 수술
- 스테레오탁스 프레임에 마우스를 놓습니다. 앞에서 설명한 대로 헤드를 프레임에 고정한 후 노브를 돌려 코가 아래를 향하도록 헤드를 기울입니다. 수술 부위를 고정하기 위해 멸균 커튼을 적용합니다.
- 귀 내면부터 꼬리 쪽까지 등 표면에 작은 절개를하십시오.
알림: 절개하는 동안 튜브가 손상되지 않도록 주의하십시오. - 마우스 본체에서 지지대를 제거하고 목이 등쪽으로 완전히 확장되도록 마우스를 수직으로 놓습니다.
- 구부러진 뭉툭한 집게를 사용하여 정중선에서 뒤쪽 목 근육을 부드럽게 이등분하여 작은 창을 만듭니다. 그런 다음 젖은 면봉 어플리케이터를 사용하여 목 근육을 정중선에서 주변으로 부드럽게 옮깁니다.
- 투명한 경막이있는 삼각형 창으로 나타나는 cisterna magna가 노출되어 있는지 관찰하십시오.
- 마이크로 매니퓰레이터 어셈블리를 마우스 옆의 정위 프레임에 놓고 모세관 팁이 표면에 닿지 않도록 합니다.
- 설정을 방해하지 않고 모세관 팁을 부드럽게 부수십시오.
- 돋보기(배율 2.25x)를 들여다보면서 미세 매니퓰레이터의 해당 손잡이를 돌려 모세관 끝을 수조 마그나 쪽으로 천천히 정렬하고 움직입니다.
- 모세관 끝이 수조 마그나 막에 닿으면 약간의 저항이 느껴집니다. 손잡이를 사용하여 팁을 멤브레인에 대고 매우 천천히 밉니다.
알림: 멤브레인의 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이 단계는 뇌척수액의 혈액 오염을 방지하는 데 매우 중요합니다. - 멤브레인을 아주 부드럽게 뚫습니다. CSF는 모세관의 음압으로 인해 즉시 모세관으로 유입되기 시작합니다.
- ~10μL의 CSF가 모세관에 수집될 때까지 몇 분 동안 설정을 그대로 두십시오.
- 그런 다음 수조에서 모세관을 천천히 빼내고 멸균 면봉 어플리케이터를 수조 마그나 입구에 부드럽게 눌러 뇌척수액 누출을 막습니다.
- 주사기에서 모세관을 조심스럽게 제거하고 마이크로캡 전구 디스펜서에 부착합니다. 전구를 눌러 CSF를 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 마우스 아래에 지지대를 놓고 정체 손잡이를 돌려 헤드의 수평을 맞춥니다.
- 나일론 봉합사로 상처를 봉합하십시오.
- 장치에서 마우스를 제거하기 전에 300μL의 멸균 식염수를 피하 주사합니다.
- 수술 후 ~7-10일 후에 봉합사를 제거할 때까지 위에서 설명한 대로 동물에게 수술 후 관리를 제공합니다.
5. 포도당 분석
- 포도당 비색 분석 키트에 설명된 프로토콜을 따르십시오.
- 키트에 제공된 인산나트륨 완충용액을 초순수에 50 mM 농도로 희석한다.
- 희석된 완충액에 키트에 제공된 1,000mg/dL 원액에서 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25 및 50mg/dL 범위의 포도당 표준물질을 준비합니다.
- 완충액에서 CSF 샘플의 7배 희석액을 준비합니다. 예를 들어, 수집된 총 CSF 부피가 10μL인 경우 7배 희석된 부피는 70μL가 됩니다.
- 15 μL의 포도당 표준물을 피펫팅하고 96-웰 플레이트에서 중복으로 희석된 CSF를 첨가하였다.
- 85 μL의 희석된 완충액을 표준물질 및 CSF와 함께 각각의 웰에 피펫팅한다.
- 희석된 완충액 6mL를 포도당 열량 측정 효소 혼합물 바이알에 넣고 몇 초 동안 소용돌이쳐 완전히 혼합합니다.
- 효소 혼합물 제제 100 μL를 각 웰에 첨가하여 반응을 시작한다.
- 플레이트를 커버 시트로 밀봉하고 플레이트를 가볍게 두드려 시약을 혼합합니다.
- 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 10분 동안 놓습니다. 포도당이 높은 바이알은 즉시 보라색으로 변하기 시작합니다.
- 10분 후, 커버를 제거하고 플레이트 리더를 이용하여 500-520 nm에서 흡광도를 측정한다.
- CSF 샘플의 포도당 농도를 표준 곡선에서 값을 보간하여 계산합니다.
6. 혈당 분석
- 면도날을 사용하여 마우스 꼬리에 작은 측면 흠집을 만들고 수동 지침에 따라 혈액 한 방울을 사용하여 혈당계로 혈당을 측정하십시오.
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Representative Results
수컷 마우스에 삼투압 미니 펌프(그림 1)에 조립된 캐뉼라를 이식하여 aCSF 또는 50% 포도당 용액을 측심실에 만성적으로 주입했습니다(그림 2). 이 절차의 효능을 검증하기 위해 수술 10일 후(그림 3) CSF를 수집했습니다. 결과는 aCSF가 주입 된 마우스의 327.7 % 포도당 (평균 : 56.5 mg / dL)에 비해 50 % 포도당이 주입 된 마우스에서 CSF 포도당 수치 (평균 : 56.5 mg / dL)가 증가한 것으로 나타났습니다. 이것은 대조군 새끼에 비해 실험 마우스의 CSF 포도당 수준이 약 6배 증가한 것입니다(그림 4A). 혈당 수치는 그룹 간에 차이가 없었습니다(그림 4B).
그림 1: 삼투압 미니 펌프의 조립 . (A) 튜브를 통해 미니 펌프에 연결된 캐뉼라가 있는 주입 어셈블리. 이 펌프는 프라이밍하는 데 최소 48시간이 필요합니다. (B) 미니 펌프 외부에 기포가 있으면 프라이밍이 확인됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Stereotaxic 장치 및 액세서리. (A,B) 마이크로 매니퓰레이터 및 기타 액세서리가 부착된 정체 장비. (C) 캐뉼라를 삽입하기 위한 버 구멍 좌표. (D) 삼투압 미니 펌프 이식, (E,F) 천공된 구멍에 캐뉼라 삽입. 수술 내내 무균 상태를 유지하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌척수액(CSF) 수집 절차. (A) 등쪽 목 근육을 뭉툭한 집게로 부드럽게 옮겨 수조 마그나를 노출시켰습니다. 직경 1mm의 팁이 있는 0.5mm 모세관을 사용하여 (B) 파열 및 (C,D) 수조 마그나에서 CSF를 수집했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 포도당 측정 . (A) 뇌척수액 증가(B) 외심실에 50% 포도당 용액을 주입한 마우스의 비공복 혈당 수치에 영향을 미치지 않으면서. 이 프로토콜의 효능은 포도당 주입 시작 10일 후 CSF 및 혈당 농도를 측정하여 검증되었습니다. 50% 포도당 용액을 주입한 마우스는 포도당 수치가 56.5 ± 2.6mg/dL인 인공 CSF 주입을 받은 마우스에 비해 CSF 포도당 수치가 327.7± 30.1mg/dL(평균 표준 오차± 평균)이었습니다. p < 0.0001, unpaired t-검정. 오차 막대는 평균의 표준 오차(n = 5)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기사는 외심실에 이식된 캐뉼라에 연결된 삼투압 미니 펌프를 사용하여 생쥐에서 CSF 포도당을 증가시키는 자세한 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 쥐 뇌에 포도당을 만성적으로 주입하면 인지, 전신 포도당 대사 및 에너지 균형에 대한 장기 고혈당 과다증의 영향을 설명하고 당뇨병 합병증의 발병기전을 더 잘 이해하는 데 유용할 것입니다.
만성 당뇨병은 뇌와 말초 기관 사이의 통신을 방해하는 뇌 손상을 일으킨다(15). 당뇨병은 또한 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환의 위험을 증가시킨다 3,4. 스트렙토조토신(Streptozotocin, STZ)으로 유발된 제1형 당뇨병은 당뇨병 연구에서 표준 설치류 모델로 사용되었다16. STZ는 췌장의 β 세포를 손상시켜 제1형 당뇨병과 유사한 병리를 유발합니다. 또한, 변형 된 버전에서, 니코틴 아미드와 함께 STZ의 사용은 제 2 형 당뇨병을 유발할 수있다. 동물에서 제2형 당뇨병 유사 표현형을 발달시키는 또 다른 방법은 고지방 식단을 먹이는 것이다16. 그러나 고혈당증이 뇌 기능에 미치는 영향을 연구하는 맥락에서 이러한 기술은 많은 요인(예: 말초 인슐린/글루카곤 수치 및 일반적으로 대사 기능)을 제어하는 데 한계가 있습니다. 따라서 STZ로 인한 당뇨병이 뇌 기능에 미치는 영향은 단일 병인을 정확히 찾아내는 대신 관련 합병증으로만 해석될 수 있습니다. 뇌실 공간에 물질의 급성 주사 또는 만성 주입은 뇌 기능에 대한 직접적인 영향을 테스트하는 데 자주 사용되는 기술입니다. STZ의 뇌실내(ICV) 주사는 알츠하이머병의 설치류 모델을 개발하는 데 사용되어 왔지만, STZ 관련 신경 손상이 포도당 감지/항상성의 조절 장애 때문인지 아니면 STZ 유발 산화 스트레스 및 DNA 손상과 같은 기타 독립적인 메커니즘으로 인한 것인지는 불확실합니다17.
현재 프로토콜에 설명된 절차는 CSF 포도당 농도의 증가가 인지 장애를 유발할 수 있는지 여부와 같은 연구 질문에 답할 수 있는 설치류 모델을 개발하는 데 유용할 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 영양 감지, 대사 및/또는 인지와 관련된 다른 뇌 영역 중에서 시상하부와 해마에 대한 높은 CSF 포도당 수준의 직접적인 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 CSF 포도당 수치의 증가가 기준선 및 대사 손상에 대한 반응으로 인슐린 감수성, 인슐린 분비, 음식 섭취 및/또는 에너지 균형에 영향을 미치는지 여부를 명확히 합니다. 또한 여기에 보고된 프로토콜은 종단 연구가 필요한 가설을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 포도당 주입 전, 도중 및 종료 시 데이터를 수집하여 동일한 동물의 결과를 서로 다른 시간에 비교할 수 있습니다. 이러한 전략은 높은 CSF 포도당 수치로 인해 발생하는 합병증이 정상 CSF 포도당 수치가 회복된 후 가역적인지 여부를 다룰 것입니다. 대조적으로, 이 방법은 가설 생성 연구에도 사용될 수 있습니다. 예를 들어, CSF는 동일한 동물로부터 상이한 시간에 수집될 수 있고, 높은 수준의 CSF 포도당에 의해 생성된 바이오마커 또는 임의의 대사 모욕을 확인하기 위해 대사체학 또는 단백질체학 분석을 받을 수 있다. 유사하게, 뇌의 다른 영역은 높은 CSF 포도당에 의해 변경되었을 수 있는 세포 특이적 정보를 얻기 위해 공간 전사체학에 의해 분석될 수 있습니다.
가짜 그룹에 무혈당 aCSF를 주입하는 근거는 CSF 포도당 농도를 기준선 수준으로 유지하여 캐뉼라 이식으로 유도된 CSF 포도당 수준의 변화를 자연적으로 제어할 수 있도록 하는 것이었습니다. 이 연구의 결과는 가짜 그룹의 CSF 포도당 농도가 ~60mg/dL(~3mM)로 생쥐18에서 정상 CSF 포도당 범위에 있음을 보여주었습니다. 제2형 당뇨병 환자에서 관찰되는 뇌척수액 포도당 수치는 ~110mg/dL 또는 ~6mM이다 9. 현재 연구에서 125μg/h의 속도로 50% 포도당을 ICV 주입하면 CSF 포도당 수치가 ~300mg/dL(16mM)로 상승했으며 이는 초생리학적입니다19. 이러한 CSF 포도당의 초생리학적 수준은 제2형 당뇨병 환자에서 관찰되는 수준과 임상적으로 관련이 없을 수 있지만, 이 연구에서 제시된 결과는 CSF에 포도당을 주입하면 마우스에서 CSF 포도당 농도의 만성 상승을 유도할 수 있음을 보여줍니다.
여기에 제시된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에는 이러한 고급 절차를 수행하는 데 관련 교육, 기술 및 경험이 필요한 정교한 마우스 뇌 수술이 포함됩니다. 카테터와 미니 펌프는 장기간 이식되기 때문에 건강 문제나 카테터 어셈블리 손상을 모니터링하기 위해 연구 전반에 걸쳐 마우스를 세심하게 관리해야 합니다. 50% 포도당 농도가 선택되었는데, 그 이유는 이 농도를 초과하는 용액의 점도가 심실로의 포도당 주입에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜에 사용된 미니 펌프의 유속은 0.25μL/h였으므로 50% 포도당을 주입한 마우스 그룹은 125μg/h 또는 하루 3mg의 포도당을 받았습니다. 따라서 단위 시간당 이 포도당 용량은 미니 펌프의 유속에 의해 제한되었습니다.
요약하면, 이 기사는 생쥐에서 CSF 포도당의 만성 증가에 대한 검증된 방법을 보고합니다. 이 모델로부터 얻어진 정보는 뇌척수액 포도당 수치의 증가가 신경퇴행성 장애와 같은 당뇨병 관련 합병증을 매개하거나 당뇨병 및 비만에서 말초 대사 장애를 유발하는 데 관여하는지 여부 또는 방법을 결정하는 데 유용할 것입니다.
문제 해결
튜브가 마우스의 캐뉼라에서 떨어지면 미니 펌프를 조립하는 동안 캐뉼라-튜빙 연결부에 소량의 접착제를 도포할 수 있습니다. 실밥이 벗겨지고 캐뉼라가 보이면 봉합사나 스테이플을 사용하여 절개 부위를 완전히 닫을 수 있습니다. 마우스의 뒷발에서 손톱을 다듬어 마우스가 수술 부위를 긁을 가능성을 줄여야합니다. 또한 마우스는 섬세한 피부를 가지고 있으므로 피부가 찢어 질 정도로 봉합사를 단단히 묶지 않도록주의하십시오.
뇌척수액 수집 후 빠른 회복을 위해 수술 후 멸균 식염수 300μL를 피하 주사하는 것이 좋습니다. 또한 CSF 수집의 최대 부피를 10μL로 유지하는 것도 중요합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
국립 보건원 (National Institutes of Health)은 KHC에 DK124619를 부여합니다.
창업 자금 및 파일럿 연구 상, 의과대학, 로체스터 대학교, 뉴욕, KHC.
델 몬테 신경 과학 연구소 파일럿 연구상, 로체스터 대학, KHC.
University Research Award, Office of the Vice President for Research, University of Rochester, NY, to KHC.
MUR은 방법을 설계 및 수행하고, 결과를 분석하고, 그래프와 그림을 준비하고, 원고를 작성 및 편집했습니다. KHC는 연구를 구상하고 감독하며 결과를 분석하고 원고를 작성 및 편집했습니다. KHC는이 작업의 보증인입니다. 모든 저자는 원고의 최종 버전을 승인했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
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