Summary
Denne artikel beskriver en detaljeret protokol til at øge glukosekoncentrationen i cerebrospinalvæsken (CSF) hos mus. Denne tilgang kan være nyttig til at studere virkningerne af høj CSF-glukose på neurodegeneration, kognition og perifer glukosemetabolisme hos mus.
Abstract
Diabetes øger risikoen for kognitiv tilbagegang og forringer hjernens funktion. Hvorvidt dette forhold mellem høj glukose og kognitive underskud er årsagssammenhæng, forbliver undvigende. Desuden er det også uklart, om disse underskud medieres af en stigning i glukoseniveauer i cerebrospinalvæske (CSF) og / eller blod. Der er meget få undersøgelser, der undersøger de direkte virkninger af høje CSF-glukoseniveauer på centralnervesystemet (CNS) funktion, især på læring og hukommelse, da de nuværende diabetesmodeller ikke er tilstrækkeligt udviklede til at løse sådanne forskningsspørgsmål. Denne artikel beskriver en metode til kronisk at øge CSF-glukoseniveauerne i 4 uger ved kontinuerligt at infundere glukose i den laterale ventrikel ved hjælp af osmotiske minipumper hos mus. Protokollen blev valideret ved at måle glukoseniveauer i CSF. Denne protokol øgede CSF-glukoseniveauerne til ~328 mg/dl efter infusion af en 50% glucoseopløsning ved en strømningshastighed på 0,25 μL/t sammenlignet med en CSF-glucosekoncentration på ~56 mg/dl hos mus, der modtog kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Desuden påvirkede denne protokol ikke blodsukkerniveauet. Derfor kan denne metode bruges til at bestemme de direkte virkninger af høj CSF-glukose på hjernefunktionen eller en specifik neural vej uafhængigt af ændringer i blodglukoseniveauer. Samlet set vil den tilgang, der er beskrevet her, lette udviklingen af dyremodeller til test af rollen som høj CSF-glukose i formidling af træk ved Alzheimers sygdom og / eller andre neurodegenerative lidelser forbundet med diabetes.
Introduction
Både type 1 og type 2 diabetes forringer hjernens funktion 1,2,3. For eksempel øger diabetes risikoen for kognitiv tilbagegang og neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom 3,4. Desuden har mennesker med diabetes defekt glukoseregistrering i hjernen 5,6. Denne defekt bidrager til patogenesen af hypoglykæmi associeret ubevidsthed og et utilstrækkeligt modregulerende respons på hypoglykæmi7,8, som kan være dødelig, hvis den ikke behandles straks.
I betragtning af at diabetes øger glukoseniveauerne i blodet såvel som i cerebrospinalvæske (CSF)9, er det vigtigt at afgøre, om en eller begge af disse faktorer bidrager til nedsat hjernefunktion. Hvorvidt diabetes forårsager hjerneskade ved høj CSF-glukose alene eller i kombination med andre faktorer som insulinmangel eller insulinresistens er også et åbent spørgsmål. Dyremodeller af type 1 og type 2 diabetes viser kognitiv tilbagegang og neurodegeneration ud over en påvirket energibalance og perifer glukosemetabolisme10,11,12,13. Fra disse modeller er det imidlertid ikke muligt at afkoble de selektive virkninger af høj CSF-glukose versus blodsukkerniveauer ved formidling af komplikationer af diabetes på hjernefunktionen.
Denne protokol beskriver metoder til at udvikle en musemodel af hyperglycorrhachia for at teste virkningerne af kronisk høje CSF-glukoseniveauer på hjernefunktion, energibalance og glukosehomeostase. Musmodellen udviklet gennem denne teknik præsenterer et værktøj til undersøgelser, der undersøger den etiologiske rolle af dysreguleret glukosehomeostase på neurale og adfærdsmæssige funktioner.
Derfor vil den foreslåede tilgang være nyttig til at forstå de direkte virkninger af forhøjede CSF-glukoseniveauer under forskellige patofysiologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Rochester og blev udført i henhold til US Public Health Service-retningslinjerne for human pleje og brug af forsøgsdyr. Seks uger gamle C57BL/6J hanmus, der blev anvendt til denne undersøgelse, blev opnået kommercielt. Alle dyrene blev grupperet (5 mus pr. bur) i et rum med en 12 timers dag/nat-cyklus og fik adgang til mad og vand ad libitum. Efter at musene blev implanteret med en kanyle til infusion af glukose i den laterale ventrikel, blev de enkelt anbragt for at forhindre skader på implantaterne fra andre mus.
1. Montering af osmotiske minipumper
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) i henhold til følgende protokol. NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl2,2H2O (0,206 g) og MgCl2,6H2O(0,163 g) opløses i 500 ml sterilt vand til fremstilling af opløsning A. Na 2 HPO 4,7H 2 O (0,214 g) og NaH2PO4 opløses. H2O (0,027 g) i 500 ml sterilt vand til fremstilling af opløsning B. Bland derefter opløsning A og B i forholdet 1: 1 for at forberede aCSF.
BEMÆRK: Denne formulering af aCSF indeholder ingen glucose. - For at forberede 50% glucoseopløsningen tilsættes 50 g glucose til 50 ml aCSF i et bægerglas. Bægerglasset anbringes på en varmeplade, og suspensionens temperatur bringes op på 60 °C. Bland suspensionen med en magnetisk omrører, indtil glukosen er helt opløst.
- Tilsæt aCSF til bægerglasset for at gøre det endelige volumen 100 ml. Før opløsningen gennem 0,22 μm porefilter for at sterilisere den.
- Forbered en 0,9% saltopløsning (NaCl) og før opløsningen gennem 0,22 μm filteret.
- Anbring alle komponenterne i minipumpen og infusionssættet i en steril bakke, og skær slangen fra hjerneinfusionssættet til 1 tomme i længden med en steril saks. Hold slangen med en steril hæmostat, og skub den på toppen af kanylens ene ende. Tilslut den anden ende af slangen til oversiden af flowmodulatoren. Dæk begge ender af slangen med en lille mængde lim for en stærkere forbindelse.
- Sæt en 27 G kanyle på en 1 ml sprøjte og fyld den med enten aCSF eller glucoseopløsningen. Sæt 27 G kanylen i et lille stykke slange. Tilslut derefter slangen til den åbne ende af flowmodulatoren og fyld den med den tilsvarende opløsning, indtil dråber af opløsningen begynder at komme ud fra kanylen. Fjern eventuelle luftbobler, der er fanget i slangen.
- For at fylde minipumpen skal du holde pumpen lodret og indsætte sprøjtenålen i pumpen. Fyld den med den tilsvarende opløsning, indtil der begynder at dannes en dråbe af opløsningen ved åbningen af minipumpen.
- Sæt langsomt flowmodulatoren ind i pumpen, mens du sørger for ikke at indføre luftbobler i enheden.
- Når de osmotiske minipumper er samlet, overføres de til et 50 ml konisk rør. Fyld røret med det sterile saltvand, så pumperne er helt nedsænket, samtidig med at du sørger for, at kanylen forbliver ude af saltopløsningen. Fire sådanne samlede pumper kan placeres i et 50 ml rør.
- Hætten anbringes løst på hvert rør, og pumperne inkuberes ved 37 °C for at prime i mindst 48 timer.
2. Kirurgi for at implantere osmotiske pumper
- Præ-kirurgisk procedure
- Steriliser de kirurgiske instrumenter i en autoklave og lad dem køle af i mindst 30 minutter før brug. Autoklavebetingelserne indebærer dampsterilisering ved 121 °C i 30 minutter.
- Desinficer operationsområdet med 70% ethanol. Tør knapperne, ørestængerne og den stereotaksiske rammeoverflade af.
BEMÆRK: Kirurgi skal udføres i et aseptisk miljø, idet man husker at undgå at berøre ikke-sterile overflader, mens du udfører kirurgi. Udskift handsker, hvis der er mistanke om forurening. - Placer musen i et anæstesikammer for at bedøve den med 3% isofluran blandet i luft i 3-5 min. Fjern derefter musen fra kammeret og læg den på en steril gardin. Oprethold anæstesi via en næsekegle på 1,5% -2%.
- Klem musens bagpote for at observere enhver refleks og kontrollere dybden af anæstesi.
- 5 mg/kg carprofen injiceres subkutant for analgesi.
- Brug rene klippere til at klippe operationsområdet på musehovedet. Gnid først hovedbunden med povidon-jodopløsning og derefter med spritservietter grundigt i mindst 2 min. Gentag denne proces mindst tre gange.
- Påfør et øjensmøremiddel for at forhindre øjnene i at tørre under operationen.
- Kirurgi
- Placer musen på den stereotaksiske ramme og monter hovedet på snitstangen. Dæk næsen med næsekeglen. Påfør sterile gardiner for at sikre det kirurgiske område.
- Strømmen af isofluran flyttes til næsekeglen. Fortsæt med at opretholde anæstesien ved 1,5% -2% isofluran.
- Placer en varmepude under musen for at opretholde kropstemperaturen.
- Tag nye sterile handsker på, og lav med en skalpel et midterlinjesnit (~ 10-15 mm langt) i hovedbunden. Udsæt kraniets overflade med en spatel, mens du bruger bomuldsspidser til at tørre enhver blødning.
BEMÆRK: Brug en cauterizer, hvis du bløder voldsomt, hvilket er sjældent. - Gnid med en bomuldsspids dyppet i 3% hydrogenperoxid for at udsætte kraniale suturer.
- Vær opmærksom på bregma og lambda for at navigere i kraniets koordinater. Indstil alle koordinaterne til nul ved bregma.
BEMÆRK: Disse koordinater blev hentet fra et musehjerneatlas14. Referenceafstanden bregma-lambda i atlaset er 4,21 mm. For at korrigere for alders- og kønsbaserede forskelle i kraniestørrelse blev bregma-lambda-afstanden for hver mus målt og derefter divideret med 4,21 mm for at opnå en multiplikationsfaktor. For eksempel, hvis afstanden mellem bregma og lambda var 4, 65 mm, gav division med 4, 21 mm en multiplikationsfaktor på 1, 10. Alle koordinaterne opnået fra atlasset blev derefter ganget med denne faktor for at måle de faktiske koordinater, der blev brugt til at bore hullet. I ovenstående eksempel ville de resulterende anterior-posterior (AP) og medial-laterale (ML) koordinater være henholdsvis 0,55 og 1,1 mm (dvs. 1,1 x 0,5 eller 1 mm). - Brug en elektrisk boremaskine til at lave et hul ved disse koordinater: 0,5 mm bageste til bregma og 1 mm lateral til midterlinje mod højre.
BEMÆRK: Mens du borer hullet i kraniet, skal du passe på ikke at sprænge dura mater. Sørg for, at boret er sterilt. Den kan placeres sammen med andre instrumenter i den samme autoklavepose til sterilisering. - Indsæt en hemostat under den indskårne hud og skub den til det sted, hvor den osmotiske minipumpe vil blive implanteret. Åbn og luk forsigtigt hæmostaten for at lave en lomme til minipumpen.
- Brug en steril hemostat til at vælge en primet osmotisk minipumpe fra spidsen af flowmodulatoren. Skub pumpen gennem den indskårne hud ned i lommen.
BEMÆRK: Pas på ikke at lade pumpen og kanylen berøre ikke-sterile overflader. - Påfør lidt lim på undersiden af kanylen og fastgør den i kanyleholderen. Sænk kanylen langsomt gennem det borede hul 2 mm ventral til kraniets overflade. Lad det stå der i mindst 5 minutter for at lade limen størkne.
- Før du indsætter kanylen ned i hjernen, skal du sørge for, at kanylen ikke er tilstoppet, og at opløsningen flyder korrekt.
BEMÆRK: Nogle gange kan glukose aflejres ved spidsen af kanylen på grund af en meget lav strømningshastighed, hvilket blokerer strømmen. - Ved hjælp af en saks skal du klippe toppen af kanylen og sørge for, at den ikke løsner sig fra kraniets overflade.
- Dæk kanylen med et lag tandcement for ekstra støtte.
- Brug nylonsuturer (5-0 størrelse og 30 inches i længden) for at lukke såret og anvende topisk antibiotikum på såret for at forhindre infektion.
- Sluk for isofluran og lad dyret komme sig efter anæstesi. Overfør derefter dyret til et nyt rent bur.
- Pleje efter operationen
- Efter operationen skal du overvåge musen i mindst 1 uge.
- Administrer 5 mg/kg carprofen subkutant én gang hver 24. time i tre dage efter operationen.
- Lad såret hele helt, inden suturerne fjernes 7-10 dage efter operationen.
BEMÆRK: Det blev observeret, at mus med høj CSF-glukose tog længere tid at helbrede. Trimning af negle på musens bagpoter minimerer risikoen for skade på snitstedet på grund af musens ridseadfærd.
3. Udskiftning af minipumperne
BEMÆRK: Da de minipumper, der blev anvendt i denne undersøgelse, kun holder i 4 uger, blev udskiftningen af minipumper også testet for at forlænge varigheden af glucoseinfusionen, som det kan være nødvendigt i tilfælde af langtidsundersøgelser. Dette involverede følgende trin.
- Forbered musene til operation som beskrevet ovenfor.
- Lav et lille 1 cm lodret snit i huden lidt over pumpen.
- Indsæt en hæmostat under den indskårne hud og træk pumpen ud.
- Fjern pumpen fra slangen, og tilslut en ny grundet pumpe til slangen.
- Sæt pumpen ind igen, og sy huden.
- Følg de samme plejeinstruktioner efter operationen som beskrevet ovenfor.
4. Procedure for opkrævning af FSR
- Præparation
- Træk glaskapillærer med en diameter på 1 mm med en mikropipetteaftrækker for at opnå spidser med en diameter på 0,5 mm. Indstillingerne er: varme = 800, træk = 15, hastighed = 5 og tid = 200 enheder. Anbring de trukne kapillærer i en steril kasse indtil brug.
- Sæt en 27 G kanyle på en 1 ml sprøjte. Indsæt den trukne kapillær på nålen, og brug en lille tape til at sikre forbindelsen.
- Fastgør sprøjten fast i en kapillærholder på en mikromanipulator.
- Forbered derefter musen til operation, som beskrevet i proceduren før operationen ovenfor.
- Kirurgisk procedure
- Placer musen på den stereotaksiske ramme. Når du har fastgjort hovedet på rammen, som beskrevet tidligere, skal du dreje knapperne for at vippe hovedet, så næsen vender nedad. Påfør sterile gardiner for at sikre det kirurgiske område.
- Lav et lille snit på dorsaloverfladen, startende fra det intra-aurale plan til den kaudale side.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige slangen, mens du foretager snittet. - Fjern støtten fra musekroppen og lad musen hvile lodret, så halsen er helt forlænget dorsalt.
- Ved hjælp af buede stumpe tang skærer du forsigtigt de bageste nakkemuskler fra midterlinjen for at skabe et lille vindue. Brug derefter en våd bomuldsspidsapplikator til forsigtigt at forskyde nakkemusklerne fra midterlinjen til periferien.
- Overhold om cisterna magna er udsat, som fremstår som et trekantet vindue med en gennemsigtig dura-membran.
- Placer mikromanipulatorenheden på den stereotaksiske ramme ved siden af musen, mens du sørger for, at kapillærspidsen ikke rører ved nogen overflade.
- Bryd forsigtigt kapillærspidsen uden at forstyrre opsætningen.
- Mens du kigger ind i forstørrelsesglasset (forstørrelse på 2,25x), skal du dreje de tilsvarende knapper på mikromanipulatoren for langsomt at justere og flytte kapillærspidsen mod cisterna magna.
- En vis modstand mærkes, når kapillærspidsen berører cisterna magna-membranen. Skub langsomt spidsen mod membranen ved hjælp af knapperne.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige blodkarrene i membranen. Dette trin er meget vigtigt for at undgå blodforurening i CSF. - Meget forsigtigt gennemborer membranen. CSF begynder straks at strømme ind i kapillæret på grund af undertryk i kapillærrøret.
- Lad opsætningen stå i nogle minutter, indtil ~ 10 μL CSF opsamles i kapillærrøret.
- Træk derefter langsomt kapillærrøret ud af cisterna magna og tryk forsigtigt en steril bomuldsspidsapplikator mod åbningen af cisterna magna for at stoppe CSF-lækage.
- Fjern forsigtigt kapillærrøret fra sprøjten og fastgør det til en mikrohættepæredispenser. Tryk på pæren for at overføre CSF til et sterilt mikrocentrifugerør.
- Placer en støtte under musen, og drej de stereotaksiske knapper for at udjævne hovedet.
- Luk såret med nylonsuturer.
- 300 μL sterilt saltvand injiceres subkutant, før musen tages ud af apparatet.
- Giv postoperativ pleje til dyrene som beskrevet ovenfor, indtil det er tid til at fjerne suturerne-~7-10 dage efter operationen.
5. Glukoseanalyse
- Følg protokollen som beskrevet i glucosekolorimetriske analysesæt.
- Natriumphosphatbufferstamopløsningen i sættet fortyndes til en koncentration på 50 mM i ultrarent vand.
- Forbered glucosestandarder i 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 og 50 mg / dL intervaller fra 1.000 mg / dl stamopløsning, der er angivet i sættet i fortyndet bufferopløsning.
- Forbered en 7 gange fortynding af CSF-prøver i bufferen. For eksempel, hvis det samlede indsamlede CSF-volumen er 10 μL, vil det syv gange fortyndede volumen være 70 μL.
- Pipette 15 μL glucosestandarder og fortyndet CSF i to eksemplarer i en plade med 96 brønde.
- Pipette 85 μL fortyndet buffer i hver af hullerne med standarder og CSF.
- Tilsæt 6 ml fortyndet buffer til hætteglasset med glucosekalorimetrisk enzymblanding og hvirvel det i nogle få sekunder for at blande grundigt.
- Der tilsættes 100 μL enzymblandingspræparatet til hvert hul for at starte reaktionen.
- Pladen forsegles med et dækark, og banken forsigtigt på pladen for at blande reagenserne.
- Pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C i 10 minutter. Hætteglas med høj glukose begynder straks at blive violette.
- Efter 10 minutter fjernes dækslet, og absorbansen måles ved 500-520 nm ved hjælp af en pladelæser.
- Beregn glukosekoncentrationen i CSF-prøverne ved at interpolere deres værdier fra standardkurven.
6. Blodsukkeranalyse
- Lav et lille lateralt nick til musehalen ved hjælp af et barberblad og brug en dråbe blod til at måle blodsukkeret med et glucometer i henhold til de manuelle instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hanmus blev implanteret med en kanyle samlet til en osmotisk minipumpe (figur 1) for kronisk at infundere aCSF eller en 50% glucoseopløsning i deres laterale ventrikler (figur 2). CSF blev indsamlet 10 dage efter operationen (figur 3) for at validere effektiviteten af denne procedure. Resultaterne viste en stigning i CSF-glukoseniveauerne (gennemsnit: 327,7 mg / dl) hos mus infunderet med 50% glucose sammenlignet med det (gennemsnit: 56,5 mg / dl) hos mus infunderet med aCSF. Dette handler om en seks gange stigning i CSF-glukoseniveauerne hos forsøgsmusene sammenlignet med deres kontrolkuldkammerater (figur 4A). Blodsukkerniveauet var ikke forskelligt mellem grupperne (figur 4B).
Figur 1: Samling af osmotiske minipumper . (A) Infusionsenhed med en kanyle forbundet til en minipumpe gennem slanger. Disse pumper kræver mindst 48 timer for at prime. (B) Tilstedeværelsen af luftbobler uden for minipumperne bekræfter primingen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Stereotaksiske apparater og tilbehør. (A,B) Stereotaksisk udstyr med påmonteret mikromanipulator og andet tilbehør. (C) Burr hulkoordinater for at indsætte kanylen. (D) Osmotisk minipumpeimplantation, (E,F) Indføring af kanylen i det borede hul. Oprethold aseptiske tilstande under hele operationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Procedure for opsamling af cerebrospinalvæske (CSF). (A) Nakkemusklerne blev forsigtigt forskudt med stump tang for at afsløre cisterna magna. En 1 mm kapillær med en 0,5 mm diameter spids blev brugt til (B) brud og (C, D) opsamling CSF fra cisterna magna. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Måling af glukose . (A) Forhøjet CSF-glucose (B) uden at påvirke ikke-fastende blodsukkerniveauer hos mus infunderet med 50% glucoseopløsning i lateral ventrikel. Effekten af denne protokol blev valideret ved at måle CSF og blodglucosekoncentrationen 10 dage efter initiering af glucoseinfusionen. Mus infunderet med 50% glucoseopløsning havde CSF-glukoseniveauer på 327,7 ± 30,1 mg / dL (gennemsnitlig ± standardfejl i gennemsnit) sammenlignet med mus, der modtog kunstig CSF-infusion, der havde glukoseniveauer på 56,5 ± 2,6 mg / dl. p < 0,0001, uparret t-test. Fejlbjælker repræsenterer standardfejl af middelværdi (n = 5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel rapporterer en detaljeret protokol til at øge CSF-glukose hos mus ved hjælp af osmotiske minipumper forbundet til en kanyle implanteret i lateral ventrikel. Den kroniske infusion af glukose i musehjernen gennem denne procedure vil være nyttig til at afgrænse virkningerne af langvarig hyperglycorrhachia på kognition, systemisk glukosemetabolisme og energibalance og for bedre forståelse af patogenesen af diabeteskomplikationer.
Kronisk diabetes forårsager hjerneskade, der afbryder kommunikationen mellem hjernen og de perifere organer15. Diabetes øger også risikoen for neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom 3,4. Streptozotocin (STZ)-induceret type 1-diabetes har været standardgnavermodellen i diabetesforskning16; STZ beskadiger β-celler i bugspytkirtlen, hvilket fører til type 1 diabeteslignende patologi. Endvidere kan brugen af STZ ledsaget af nikotinamider i en modificeret version fremkalde type 2-diabetes. En anden måde at udvikle type 2-diabeteslignende fænotyper hos dyr er ved at fodre dem med en fedtrig kost16. I forbindelse med undersøgelse af effekten af hyperglykæmi på hjernefunktionen er disse teknikker imidlertid begrænsede til at kontrollere for et stort antal faktorer (f.eks. Perifere insulin/glukagonniveauer og metabolisk funktion generelt). Således kan enhver effekt af STZ-induceret diabetes på hjernefunktionen kun fortolkes som en associeret komplikation i stedet for at identificere en enkelt ætiologisk faktor. Akut injektion eller kronisk infusion af stoffer i cerebroventrikulært rum er en teknik, der ofte bruges til at teste deres direkte virkninger på hjernefunktionen. Intracerebroventrikulær (ICV) injektion af STZ er blevet brugt til at udvikle en gnavermodel af Alzheimers sygdom, men det er stadig usikkert, om STZ-associeret neural skade skyldes dysregulering i glukosesensing / homeostase eller andre uafhængige mekanismer, som STZ-induceret oxidativ stress og DNA-skade17.
De procedurer, der er beskrevet i den nuværende protokol, vil være nyttige til udvikling af gnavermodeller, der kan besvare forskningsspørgsmål, som om en stigning i CSF-glukosekoncentration kan forårsage kognitiv svækkelse. Protokollen beskrevet her kunne bruges til at bestemme de direkte virkninger af høje CSF-glukoseniveauer på hypothalamus og hippocampus, blandt andre hjerneområder, der er involveret i næringsstofsen, metabolisme og / eller kognition. Denne metode vil også afklare, om en stigning i CSF-glukoseniveauer påvirker insulinfølsomhed, insulinsekretion, fødeindtagelse og / eller energibalance ved baseline og som reaktion på metaboliske fornærmelser. Desuden vil den protokol, der rapporteres her, være anvendelig i testhypoteser, der kræver langsgående undersøgelser. For eksempel kan data indsamles før, under og ved afslutningen af glukoseinfusionerne for at sammenligne fund fra de samme dyr på forskellige tidspunkter. En sådan strategi ville adressere, om komplikationer som følge af højt CSF-glukoseniveau er reversible, efter at det normale CSF-glukoseniveau er genoprettet. I modsætning hertil kan metoden også bruges til hypotesegenererende undersøgelser. For eksempel kunne CSF indsamles fra de samme dyr på forskellige tidspunkter og udsættes for metabolomics eller proteomics analyse for at identificere biomarkører eller metaboliske fornærmelser produceret af højt niveau af CSF-glucose. På samme måde kunne forskellige områder af hjernen analyseres ved rumlig transkriptomik for at give cellespecifik information, der kan være blevet ændret af høj CSF-glukose.
Begrundelsen for at infusere glukosefri aCSF til en skingruppe var at holde CSF-glukosekoncentrationen på baselineniveauet, således at enhver ændring i CSF-glukoseniveau induceret af kanyleimplantation kan kontrolleres naturligt. Resultaterne i denne undersøgelse viste, at sham-gruppen havde en CSF-glukosekoncentration på ~ 60 mg / dL (~ 3 mM), hvilket er i det normale CSF-glukoseområde hos mus18. CSF-glukoseniveauerne observeret hos personer med type 2-diabetes er ~ 110 mg / dL eller ~ 6 mM9. I den aktuelle undersøgelse forhøjede ICV-infusion af 50% glucose med en hastighed på 125μg / h CSF-glukoseniveauer til ~ 300 mg / dL (16 mM), hvilket er suprafysiologisk19. Selvom dette suprafysiologiske niveau af CSF-glucose muligvis ikke er klinisk relevant for de niveauer, der observeres hos personer med type 2-diabetes, viser resultaterne præsenteret i denne undersøgelse, at infusion af glukose i CSF kan fremkalde en kronisk forhøjelse af CSF-glukosekoncentrationen hos mus.
Den metode, der præsenteres her, har nogle begrænsninger. Det involverer sofistikeret musehjernekirurgi, der kræver relevant træning, færdigheder og erfaring med at udføre sådanne avancerede procedurer. Da kateteret og minipumperne implanteres på lang sigt, er omhyggelig pleje af musene under hele undersøgelsen nødvendig for at overvåge for sundhedsmæssige problemer eller skader på katetersamlingen. En 50% glucosekoncentration blev valgt, fordi viskositeten af en opløsning ud over denne koncentration kunne have påvirket infusionen af glucose i ventriklerne. Minipumperne, der blev anvendt i denne protokol, havde en strømningshastighed på 0,25 μL/time, så gruppen af mus med 50% glucoseinfusion modtog glukose med en hastighed på 125 μg/time eller 3 mg glucose pr. dag. Denne dosis glukose pr. tidsenhed var derfor begrænset af minipumpernes strømningshastighed.
Sammenfattende rapporterer denne artikel en valideret metode til kronisk stigning i CSF-glukose hos mus. Oplysningerne fra denne model vil være nyttige til at bestemme, om eller hvordan en stigning i CSF-glukoseniveauer er involveret i formidling af diabetesassocierede komplikationer, såsom neurodegenerative lidelser eller forårsager perifere metaboliske fornærmelser i diabetes og fedme.
Fejlfinding
Hvis slangen kommer ud af kanylen i musene, kan der påføres en lille mængde lim på kanyleslangeforbindelsen under montering af minipumpen. Hvis stingene kommer af, og kanylen bliver synlig, kan snitområdet lukkes helt ved hjælp af suturer eller hæfteklammer. Negle fra musens bagpote skal trimmes, så der er en lavere mulighed for at ridse operationsområdet ved musen. Vær desuden forsigtig med ikke at binde suturerne så stramt, at huden vil rive, da mus har delikat hud.
For hurtig genopretning efter CSF-opsamling anbefales injektion af 300 μL sterilt saltvand subkutant efter operationen. Desuden er det også vigtigt at holde den maksimale mængde CSF-indsamling til 10 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
National Institutes of Health bevilling DK124619 til KHC.
Startfonde og pilotforskningspris, Department of Medicine, University of Rochester, NY, til KHC.
Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, til KHC.
University Research Award, Office of the Vice President for Research, University of Rochester, NY, til KHC.
MUR designede og udførte metoden, analyserede resultater, udarbejdede grafer og figurer og skrev og redigerede manuskriptet. KHC udtænkte og overvågede undersøgelsen, analyserede resultaterne og skrev og redigerede manuskriptet. KHC er garant for dette arbejde. Alle forfattere godkendte den endelige version af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
- Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
- Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W.
- Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
- Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H.
- Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
- Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
- Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
- Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
- Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263 (2013).
- Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587 (2022).
- Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
- Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R.
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78 (2021).
- Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
- Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
- Dougherty, J. M., Roth, R. M.
