Summary
Bu makalede, farelerin beyin omurilik sıvısındaki (BOS) glikoz konsantrasyonunu arttırmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek BOS glikozunun farelerde nörodejenerasyon, biliş ve periferik glikoz metabolizması üzerindeki etkilerini incelemek için yararlı olabilir.
Abstract
Diyabet bilişsel gerileme riskini artırır ve beyin fonksiyonlarını bozar. Yüksek glikoz ve bilişsel eksiklikler arasındaki bu ilişkinin nedensel olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, bu eksikliklere beyin omurilik sıvısı (BOS) ve / veya kandaki glikoz seviyelerindeki bir artışın aracılık edip etmediği de belirsizdir. Yüksek BOS glukoz seviyelerinin merkezi sinir sistemi (CNS) fonksiyonu, özellikle öğrenme ve hafıza üzerindeki doğrudan etkilerini araştıran çok az çalışma vardır, çünkü mevcut diyabet modelleri bu tür araştırma sorularını ele almak için yeterince geliştirilmemiştir. Bu makalede, farelerde ozmotik minipompalar kullanılarak lateral ventriküle glikoz sürekli olarak infüze edilerek 4 hafta boyunca BOS glukoz seviyelerini kronik olarak arttırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, BOS'taki glikoz düzeyleri ölçülerek doğrulandı. Bu protokol, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) alan farelerde ~ 56 mg / dL'lik bir BOS glikoz konsantrasyonuna kıyasla, 0.25 μL / s akış hızında% 50'lik bir glikoz çözeltisinin infüzyonundan sonra BOS glikoz seviyelerini ~ 328 mg / dL'ye yükseltti. Ayrıca, bu protokol kan şekeri seviyelerini etkilemedi. Bu nedenle, bu yöntem, yüksek BOS glikozunun beyin fonksiyonu veya belirli bir sinir yolu üzerindeki doğrudan etkilerini, kan şekeri seviyelerindeki değişikliklerden bağımsız olarak belirlemek için kullanılabilir. Genel olarak, burada açıklanan yaklaşım, Alzheimer hastalığının ve / veya diyabetle ilişkili diğer nörodejeneratif bozuklukların aracılık özelliklerinde yüksek BOS glikozunun rolünü test etmek için hayvan modellerinin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.
Introduction
Hem tip 1 hem de tip 2 diyabet beyin fonksiyonlarını bozar 1,2,3. Örneğin, diyabet, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere bilişsel gerileme ve nörodejeneratif bozukluklar riskini artırır 3,4. Dahası, diyabetli kişilerin beyinlerinde kusurlu glikoz algılaması vardır 5,6. Bu defekt, hipoglisemiye bağlı bilinçsizliğin patogenezine ve hipoglisemiye karşı yetersiz birkarşı-düzenleyici yanıt 7,8'e katkıda bulunur ve bu da hemen tedavi edilmezse ölümcül olabilir.
Diyabetin kandaki ve beyin omurilik sıvısındaki (BOS)9 glikoz seviyelerini arttırdığı göz önüne alındığında, bu faktörlerden birinin veya her ikisinin de bozulmuş beyin fonksiyonuna katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek önemlidir. Diyabetin tek başına yüksek BOS glikozu ile veya insülin eksikliği veya insülin direnci gibi diğer faktörlerle kombinasyon halinde beyin hasarına neden olup olmadığı da açık bir sorudur. Tip 1 ve tip 2 diyabetin hayvan modelleri, etkilenen enerji dengesine ve periferik glikoz metabolizmasına ek olarak bilişsel gerileme ve nörodejenerasyon göstermektedir10,11,12,13. Bununla birlikte, bu modellerden, diyabetin beyin fonksiyonu üzerindeki komplikasyonlarına aracılık etmede yüksek BOS glikozunun kan şekeri seviyelerine karşı seçici etkilerini ayırmak mümkün değildir.
Bu protokol, kronik olarak yüksek BOS glukoz seviyelerinin beyin fonksiyonu, enerji dengesi ve glikoz homeostazı üzerindeki etkilerini test etmek için bir fare hiperglikorekrasi modeli geliştirme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu teknikle geliştirilen fare modeli, düzensiz glukoz homeostazının nöral ve davranışsal fonksiyon üzerindeki etiyolojik rolünü araştıran çalışmalar için bir araç sunmaktadır.
Bu nedenle, önerilen yaklaşım, çeşitli patofizyolojik durumlarda yüksek BOS glukoz düzeylerinin doğrudan etkilerini anlamada yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare prosedürleri, Rochester Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve deney hayvanlarının insancıl bakımı ve kullanımı için ABD Halk Sağlığı Hizmeti kurallarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışma için kullanılan altı haftalık C57BL / 6J erkek fareler ticari olarak elde edildi. Tüm hayvanlar, 12 saatlik gündüz / gece döngüsüne sahip bir odada grup olarak barındırıldı (kafes başına 5 fare) ve yiyecek ve su ad libitumuna erişim izni verildi. Farelere, glikozu lateral ventriküle enjekte etmek için bir kanül implante edildikten sonra, implantlara diğer farelerden herhangi bir zarar gelmesini önlemek için tek bir yerleştirildiler.
1. Ozmotik mini pompaların montajı
- Aşağıdaki protokole göre yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın. NaCl (8.66 g), KCl (0.224 g), CaCl 2.2H 2 O (0.206 g) ve MgCl 2.6H 2 O (0.163 g) çözeltisini hazırlamak için 500 mL steril suda çözün A. Na 2 HPO 4.7H 2 O (0.214 g) ve NaH 2PO 4'ü çözün. B çözeltisini hazırlamak için 500 mL steril sudaH2O (0.027 g). Ardından, aCSF'yi hazırlamak için A ve B çözeltilerini 1:1 oranında karıştırın.
NOT: aCSF'nin bu formülasyonu glikoz içermez. - % 50 glikoz çözeltisini hazırlamak için, bir beherdeki 50 mL aCSF'ye 50 g glikoz ekleyin. Beheri bir sıcak plakaya yerleştirin ve süspansiyonun sıcaklığını 60 ° C'ye getirin. Glikoz tamamen çözülene kadar süspansiyonu manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın.
- Son hacmi 100 mL yapmak için behere aCSF ekleyin. Çözeltiyi sterilize etmek için 0,22 μm gözenek filtresinden geçirin.
- % 0,9'luk bir salin (NaCl) çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 0,22 μm filtreden geçirin.
- Mini pompanın ve infüzyon kitinin tüm bileşenlerini steril bir tepsiye yerleştirin ve tüpü beyin infüzyon kitinden steril bir makasla 1 inç uzunluğa kadar kesin. Tüpü steril bir hemostatla tutun ve kanülün bir ucunun üstüne itin. Borunun diğer ucunu akış modülatörünün üst tarafına bağlayın. Daha güçlü bir bağlantı için borunun her iki ucunu da az miktarda yapıştırıcı ile örtün.
- 1 mL'lik bir şırıngaya 27 G'lik bir iğne takın ve aCSF veya glikoz çözeltisi ile doldurun. 27 G iğnesini küçük bir boru parçasına yerleştirin. Daha sonra, boruyu akış modülatörünün açık ucuna bağlayın ve çözeltinin damlaları kanülden çıkmaya başlayana kadar ilgili çözelti ile doldurun. Boruda sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarın.
- Mini pompayı doldurmak için pompayı dik tutun ve şırınga iğnesini pompaya yerleştirin. Mini pompanın açılışında çözeltinin bir damlası oluşmaya başlayana kadar ilgili çözelti ile doldurun.
- Akış modülatörünü yavaşça pompaya yerleştirin ve tertibata herhangi bir hava kabarcığı sokmadığınızdan emin olun.
- Ozmotik mini pompalar monte edildikten sonra, bunları 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Kanülün tuzlu su çözeltisinden uzak kaldığından emin olurken, pompaların tamamen suya batırılması için tüpü steril salinle doldurun. Bu tür monte edilmiş dört pompa, 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilebilir.
- Kapağı her bir tüpün üzerine gevşek bir şekilde yerleştirin ve pompaları en az 48 saat boyunca astarlamak için 37 ° C'de inkübe edin.
2. Ozmotik pompaları implante etmek için cerrahi
- Ameliyat öncesi prosedür
- Cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin ve kullanmadan önce en az 30 dakika soğumaya bırakın. Otoklav koşulları, 30 dakika boyunca 121 ° C'de buhar sterilizasyonunu içerir.
- Ameliyat bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin. Düğmeleri, kulak çubuklarını ve stereotaksik çerçeve yüzeyini silin.
NOT: Ameliyat, ameliyat yapılırken steril olmayan yüzeylere dokunmamak için akılda tutularak aseptik bir ortamda yapılmalıdır. Kirlenme şüphesi varsa eldivenleri değiştirin. - Fareyi 3-5 dakika boyunca havada karıştırılmış% 3 izofluran ile uyuşturmak için bir anestezi odasına yerleştirin. Ardından, fareyi odadan çıkarın ve steril bir örtü üzerine yerleştirin. Burun konisi ile anesteziyi %1,5-%2 oranında sürdürün.
- Herhangi bir refleksi gözlemlemek ve anestezinin derinliğini doğrulamak için farenin arka pençesini sıkıştırın.
- Analjezi için deri altından 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
- Ameliyat alanını fare kafasına klipslemek için temiz makaslar kullanın. Kafa derisini önce povidon-iyot çözeltisi ile ve daha sonra alkollü çubuklarla en az 2 dakika boyunca iyice ovalayın. Bu işlemi en az üç kez tekrarlayın.
- Ameliyat sırasında gözlerin kurumasını önlemek için bir göz kayganlaştırıcısı uygulayın.
- Ameliyat
- Fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin ve kafayı kesici uç çubuğuna yerleştirin. Burnu burun konisi ile örtün. Cerrahi alanı sabitlemek için steril örtüler uygulayın.
- İzofluran akışını burun konisine kaydırın. Anesteziyi% 1.5 -% 2 izofluranda tutmaya devam edin.
- Vücut ısısını korumak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin.
- Yeni steril eldivenler giyin ve bir neşterle kafa derisinde orta hat kesisi (~ 10-15 mm uzunluğunda) yapın. Herhangi bir kanamayı silmek için pamuklu uçlar kullanırken kafatası yüzeyini bir spatula ile açığa çıkarın.
NOT: Bol miktarda kanama varsa bir koterizatör kullanın, ki bu nadirdir. - Kraniyal dikişleri açığa çıkarmak için% 3 hidrojen peroksit içine batırılmış bir pamuk ucu ile ovalayın.
- Kafatası koordinatlarında gezinmek için bregma ve lambda'yı not alın. Bregma'da tüm koordinatları sıfıra ayarlayın.
NOT: Bu koordinatlar bir fare beyni atlası14'ten elde edilmiştir. Atlastaki referans bregma-lambda mesafesi 4.21 mm'dir. Kafatası boyutundaki yaş ve cinsiyete dayalı farklılıkları düzeltmek için, her fare için bregma-lambda mesafesi ölçüldü ve daha sonra bir çarpma faktörü elde etmek için 4.21 mm'ye bölündü. Örneğin, bregma ve lambda arasındaki mesafe 4.65 mm ise, 4.21 mm'ye bölmek 1.10'luk bir çarpma faktörü verdi. Atlastan elde edilen tüm koordinatlar daha sonra deliği delmek için kullanılan gerçek koordinatları ölçmek için bu faktörle çarpıldı. Yukarıdaki örnekte, ortaya çıkan anterior-posterior (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatlar sırasıyla 0.55 ve 1.1 mm olacaktır (yani, 1.1 x 0.5 veya 1 mm). - Bu koordinatlarda bir delik açmak için elektrikli matkap kullanın: bregma'ya 0,5 mm posterior ve sağa doğru 1 mm yanal ila orta çizgi.
NOT: Kafatasındaki deliği delerken, dura mater yırtılmamaya dikkat edin. Matkap ucunun steril olduğundan emin olun. Sterilizasyon için aynı otoklav torbasına diğer aletlerle birlikte yerleştirilebilir. - Kesilmiş cildin altına bir hemostat yerleştirin ve ozmotik mini pompanın implante edileceği yere itin. Mini pompa için bir cep yapmak üzere hemostatı yavaşça açıp kapatın.
- Akış modülatörünün ucundan astarlanmış bir ozmotik mini pompa seçmek için steril bir hemostat kullanın. Pompayı kesilmiş deriden cebe doğru itin.
NOT: Pompanın ve kanülün steril olmayan herhangi bir yüzeye temas etmesine izin vermemeye dikkat edin. - Kanülün alt tarafına biraz yapıştırıcı uygulayın ve kanül tutucusuna sabitleyin. Kanülü 2 mm ventral delikten kafatası yüzeyine yavaşça indirin. Yapıştırıcının katılaşmasını sağlamak için en az 5 dakika orada bırakın.
- Kanülü beyne yerleştirmeden önce, kanülün tıkanmadığından ve çözeltinin düzgün aktığından emin olun.
NOT: Bazen, glikoz çok düşük bir akış hızı nedeniyle kanülün ucunda birikebilir ve akışı bloke edebilir. - Bir makas yardımıyla, kafatası yüzeyinden çıkmadığından emin olmak için kanülün üstünü kırpın.
- Ekstra destek için kanülü bir diş çimentosu tabakası ile örtün.
- Yarayı kapatmak için naylon dikişler (5-0 boyut ve 30 inç uzunluğunda) kullanın ve enfeksiyonu önlemek için yaraya topikal antibiyotik uygulayın.
- İzofluranı kapatın ve hayvanın anesteziden kurtulmasına izin verin. Ardından, hayvanı yeni bir temiz kafese aktarın.
- Ameliyat sonrası bakım
- Ameliyattan sonra, fareyi en az 1 hafta boyunca izleyin.
- Ameliyat sonrası üç gün boyunca her 24 saatte bir, deri altından 5 mg / kg karprofen uygulayın.
- Ameliyattan 7-10 gün sonra dikişleri almadan önce yaranın tamamen iyileşmesine izin verin.
NOT: Yüksek BOS glukozu olan farelerin iyileşmesinin daha uzun sürdüğü gözlenmiştir. Farenin arka pençelerindeki tırnakların kesilmesi, farelerin çizilme davranışı nedeniyle kesi yerine yaralanma olasılığını en aza indirir.
3. Mini pompaların değiştirilmesi
NOT: Bu çalışmada kullanılan mini pompalar sadece 4 hafta sürdüğü için, uzun süreli çalışmalarda gerekebileceği gibi, glikoz infüzyon süresini uzatmak için mini pompaların değiştirilmesi de test edilmiştir. Bu, aşağıdaki adımları içeriyordu.
- Fareleri yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ameliyat için hazırlayın.
- Pompanın biraz yukarısındaki deride 1 cm'lik küçük bir dikey kesi yapın.
- Kesilmiş cildin altına bir hemostat yerleştirin ve pompayı dışarı çekin.
- Pompayı borudan çıkarın ve boruya yeni bir astarlanmış pompa bağlayın.
- Pompayı tekrar içeri yerleştirin ve cildi dikin.
- Yukarıda açıklandığı gibi aynı ameliyat sonrası bakım talimatlarını izleyin.
4. BOS toplama prosedürü
- Hazırlık
- 0,5 mm çapında uçlar elde etmek için 1 mm çapında cam kılcal damarları mikropipet çektirme makinesi ile çekin. Ayarlar şunlardır: ısı = 800, çekme = 15, hız = 5 ve zaman = 200 birim. Çekilen kılcal damarları kullanıma kadar steril bir kutuya koyun.
- 1 mL'lik bir şırıngaya 27 G'lik bir iğne takın. Çekilen kılcal damarı iğnenin üzerine yerleştirin ve bağlantıyı sabitlemek için küçük bir yapışkan bant kullanın.
- Şırıngayı bir mikromanipülatörün kılcal tutucusuna sıkıca sabitleyin.
- Ardından, yukarıdaki ameliyat öncesi prosedürde açıklandığı gibi fareyi ameliyat için hazırlayın.
- Cerrahi prosedür
- Fareyi stereotaksik çerçevenin üzerine yerleştirin. Kafayı çerçeveye sabitledikten sonra, daha önce açıklandığı gibi, kafayı burun aşağı bakacak şekilde eğmek için düğmeleri döndürün. Cerrahi alanı sabitlemek için steril örtüler uygulayın.
- İşitsel içirme düzleminden kaudal tarafa doğru dorsal yüzeyde küçük bir kesi yapın.
NOT: Kesi yaparken boruya zarar vermemeye dikkat ediniz. - Desteği fare gövdesinden çıkarın ve boynun dorsal olarak tamamen uzatılması için farenin dikey olarak dinlenmesine izin verin.
- Kavisli künt forsepslerin yardımıyla, küçük bir pencere oluşturmak için arka boyun kaslarını orta hattan hafifçe ikiye bölün. Ardından, boyun kaslarını orta hattan çevreye nazikçe yerinden etmek için ıslak bir pamuk ucu aplikatörü kullanın.
- Şeffaf bir dura membranlı üçgen bir pencere olarak görünen cisterna magna'nın açığa çıkıp çıkmadığını gözlemleyin.
- Kılcal ucun herhangi bir yüzeye temas etmediğinden emin olurken mikromanipülatör tertibatını farenin yanındaki stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- Kurulumu bozmadan kılcal ucu yavaşça kırın.
- Büyüteç içine bakarken (2.25x büyütme), kılcal ucu yavaşça hizalamak ve cisterna magna'ya doğru hareket ettirmek için mikromanipülatördeki ilgili düğmeleri döndürün.
- Kılcal uç cisterna magna membranına dokunduğunda bir miktar direnç hissedilir. Düğmelerin yardımıyla ucu çok yavaş bir şekilde membrana doğru itin.
NOT: Membrandaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Bu adım, BOS'ta herhangi bir kan kontaminasyonunu önlemek için çok önemlidir. - Membranı çok nazikçe delin. CSF, kılcal damardaki negatif basınç nedeniyle bir anda kılcal damara akmaya başlayacaktır.
- Kılcal damarda ~10 μL BOS toplanana kadar kurulumu birkaç dakika bekletin.
- Daha sonra, kılcal damarı yavaşça cisterna magna'dan dışarı çekin ve BOS sızıntısını durdurmak için steril bir pamuk ucu aplikatörünü cisterna magna'nın açıklığına hafifçe bastırın.
- Kılcal damarı şırıngadan dikkatlice çıkarın ve bir mikrokap ampul dağıtıcısına takın. CSF'yi steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için ampule basın.
- Farenin altına bir destek yerleştirin ve kafayı düzleştirmek için stereotaksik düğmeleri döndürün.
- Yarayı naylon dikişlerle kapatın.
- Fareyi cihazdan çıkarmadan önce deri altından 300 μL steril salin enjekte edin.
- Ameliyattan ~ 7-10 gün sonra dikişlerin alınma zamanı gelene kadar yukarıda tarif edildiği gibi hayvanlara ameliyat sonrası bakım verin.
5. Glikoz tahlili
- Glikoz kolorimetrik tahlil kitinde açıklandığı gibi protokolü takip edin.
- Kitte sağlanan sodyum fosfat tampon stok çözeltisini ultra saf suda 50 mM konsantrasyona kadar seyreltin.
- Seyreltilmiş tampon çözeltisinde kitte sağlanan 1.000 mg/dL stok çözeltisinden 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25 ve 50 mg/dL aralıklarında glikoz standartlarını hazırlayın.
- Tampondaki BOS numunelerinin 7 kat seyreltilmesini hazırlayın. Örneğin, toplanan toplam CSF hacmi 10 μL ise, yedi kat seyreltilmiş hacim 70 μL olacaktır.
- Pipet: 15 μL glikoz standartları ve seyreltilmiş CSF, 96 delikli bir plakada kopyalar halinde.
- Pipet 85 μL seyreltilmiş tampon kuyucukların her birinde standartlara ve CSF'ye sahiptir.
- Glikoz kalorimetrik enzim karışımı şişesine 6 mL seyreltilmiş tampon ekleyin ve iyice karıştırmak için birkaç saniye boyunca vorteks yapın.
- Reaksiyonu başlatmak için her bir oyuğa 100 μL enzim karışımı preparatı ekleyin.
- Plakayı bir kapak tabakası ile kapatın ve reaktifleri karıştırmak için plakaya hafifçe dokunun.
- Plakayı 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Yüksek glikozlu şişeler hemen menekşe rengine dönmeye başlar.
- 10 dakika sonra, kapağı çıkarın ve bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı 500-520 nm'de ölçün.
- BOS numunelerindeki glikoz konsantrasyonunu, değerlerini standart eğriden interpolasyona tabi tutarak hesaplayın.
6. Kan şekeri tahlili
- Bir tıraş bıçağı kullanarak fare kuyruğuna küçük bir yanal çentik yapın ve manuel talimatlara göre kan şekerini bir glukometre ile ölçmek için bir damla kan kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erkek farelere, aCSF veya% 50'lik bir glikoz çözeltisini lateral ventriküllerine kronik olarak infüze etmek için ozmotik bir mini pompaya monte edilmiş bir kanül (Şekil 1) implante edildi (Şekil 2). BOS, bu prosedürün etkinliğini doğrulamak için ameliyattan 10 gün sonra toplandı (Şekil 3). Sonuçlar, aCSF ile aşılanmış farelerde% 50 glikoz ile aşılanmış farelerde BOS glikoz seviyelerinde (ortalama: 56.5 mg / dL) bir artış olduğunu göstermiştir. Bu, deney farelerinde BOS glikoz seviyelerinde, kontrol çöp arkadaşlarına kıyasla yaklaşık altı kat artıştır (Şekil 4A). Kan şekeri düzeyleri gruplar arasında farklı değildi (Şekil 4B).
Resim 1: Ozmotik mini pompaların montajı . (A) Boru vasıtasıyla bir mini pompaya bağlı bir kanül ile infüzyon tertibatı. Bu pompaların astarlanması için en az 48 saat gerekir. (B) Minipompaların dışında hava kabarcıklarının bulunması, astarlamayı doğrular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Stereotaksik aparat ve aksesuarlar. (A,B) Takılı bir mikromanipülatöre sahip stereotaksik ekipman ve diğer aksesuarlar. (C) Kanülü yerleştirmek için çapak deliği koordinatları. (D) Ozmotik mini pompa implantasyonu, (E,F) Kanülün delinmiş deliğe yerleştirilmesi. Ameliyat boyunca aseptik koşulları koruyun. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beyin omurilik sıvısı (BOS) toplama prosedürü. (A) Dorsal boyun kasları, cisterna magna'yı açığa çıkarmak için künt forsepslerle hafifçe yer değiştirdi. (B) kopması ve (C,D) cisterna magna'dan BOS toplamak için 0.5 mm çapında ucu olan 1 mm'lik bir kılcal damar kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Glikoz ölçümü. (A) Lateral ventrikülde %50 glikoz çözeltisi ile aşılanmış farelerde açlık yapmayan kan şekeri seviyelerini etkilemeden artmış BOS glukozu (B). Bu protokolün etkinliği, glukoz infüzyonunu başlattıktan 10 gün sonra BOS ve kan şekeri konsantrasyonu ölçülerek doğrulandı. % 50 glikoz çözeltisi ile infüze edilen fareler, 56.5 ± 2.6 mg / dL glikoz seviyelerine sahip yapay BOS infüzyonu alan farelere kıyasla, 327.7 ± 30.1 mg / dL (ortalamanın standart ± hatası) BOS glikoz seviyelerine sahipti. p < 0.0001, eşlenmemiş t-testi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder (n = 5). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, lateral ventriküle implante edilen bir kanüle bağlı ozmotik minipompalar kullanılarak farelerde BOS glukozunu arttırmak için ayrıntılı bir protokol bildirilmiştir. Bu prosedürle fare beyninde glukozun kronik infüzyonu, uzun süreli hiperglikorerazinin biliş, sistemik glukoz metabolizması ve enerji dengesi üzerindeki etkilerini tanımlamada ve diyabet komplikasyonlarının patogenezini daha iyi anlamada yararlı olacaktır.
Kronik diyabet, beyin ve çevre organları arasındaki iletişimi kesen beyin hasarına neden olur15. Diyabet ayrıca Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalık riskini artırır 3,4. Streptozotosin (STZ) kaynaklı tip 1 diyabet, diyabet araştırmalarında standart kemirgen modeli olmuştur16; STZ, pankreastaki β hücrelerine zarar vererek tip 1 diyabet benzeri patolojiye yol açar. Ayrıca, modifiye edilmiş bir versiyonda, nikotinamidlerle birlikte STZ kullanımı tip 2 diyabeti indükleyebilir. Hayvanlarda tip 2 diyabet benzeri fenotipler geliştirmenin bir başka yolu da onları yüksek yağlı bir diyetle beslemektir16. Bununla birlikte, hipergliseminin beyin fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek bağlamında, bu teknikler çok sayıda faktörün (örneğin, periferik insülin / glukagon seviyeleri ve genel olarak metabolik fonksiyon) kontrolünde sınırlıdır. Bu nedenle, STZ kaynaklı diyabetin beyin fonksiyonu üzerindeki herhangi bir etkisi, tek bir etiyolojik faktörü belirlemek yerine, yalnızca ilişkili bir komplikasyon olarak yorumlanabilir. Serebroventriküler boşluktaki maddelerin akut enjeksiyonu veya kronik infüzyonu, beyin fonksiyonu üzerindeki doğrudan etkilerini test etmek için sıklıkla kullanılan bir tekniktir. STZ'nin intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonu, Alzheimer hastalığının kemirgen modelini geliştirmek için kullanılmıştır, ancak STZ ile ilişkili nöral hasarın, glikoz algılama / homeostazdaki veya STZ'nin neden olduğu oksidatif stres ve DNA hasarı gibi diğer bağımsız mekanizmalardaki düzensizlikten kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirsizliğini korumaktadır17.
Mevcut protokolde açıklanan prosedürler, BOS glukoz konsantrasyonundaki bir artışın bilişsel bozulmaya neden olup olamayacağı gibi araştırma sorularını cevaplayabilecek kemirgen modellerinin geliştirilmesinde yararlı olacaktır. Burada açıklanan protokol, yüksek BOS glikoz seviyelerinin, besin algılama, metabolizma ve / veya bilişle ilgili diğer beyin bölgelerinin yanı sıra hipotalamus ve hipokampus üzerindeki doğrudan etkilerini belirlemede kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda BOS glukoz seviyelerindeki bir artışın insülin duyarlılığını, insülin sekresyonunu, gıda alımını ve / veya başlangıçta ve metabolik hakaretlere yanıt olarak enerji dengesini etkileyip etkilemediğini açıklığa kavuşturacaktır. Ayrıca, burada bildirilen protokol, uzunlamasına çalışmalar gerektiren hipotezlerin test edilmesinde geçerli olacaktır. Örneğin, aynı hayvanlardan farklı zamanlarda elde edilen bulguları karşılaştırmak için glikoz infüzyonlarının öncesinde, sırasında ve sonunda veri toplanabilir. Böyle bir strateji, normal BOS glikoz seviyesi geri yüklendikten sonra yüksek BOS glikoz seviyesinden kaynaklanan komplikasyonların geri dönüşümlü olup olmadığını ele alacaktır. Buna karşılık, yöntem hipotez üreten çalışmalar için de kullanılabilir. Örneğin, BOS aynı hayvanlardan farklı zamanlarda toplanabilir ve biyobelirteçleri veya yüksek düzeyde BOS glikozu tarafından üretilen metabolik hakaretleri tanımlamak için metabolomik veya proteomik analize tabi tutulabilir. Benzer şekilde, beynin farklı bölgeleri, yüksek BOS glikozu tarafından değiştirilmiş olabilecek hücreye özgü bilgileri elde etmek için uzamsal transkriptomiklerle analiz edilebilir.
Glikozsuz aCSF'yi sahte bir gruba aşılamanın mantığı, BOS glikoz konsantrasyonunu başlangıç seviyesinde tutmaktı, böylece kanül implantasyonunun neden olduğu BOS glikoz seviyesindeki herhangi bir değişiklik doğal olarak kontrol edilebilirdi. Bu çalışmadaki sonuçlar, sahte grubun, farelerde normal BOS glikoz aralığında olan ~ 60 mg / dL (~ 3 mM) BOS glikoz konsantrasyonuna sahip olduğunu göstermiştir18. Tip 2 diyabetli bireylerde gözlenen BOS glukoz seviyeleri ~ 110 mg / dL veya ~ 6 mM9'dur. Bu çalışmada, 125μg / s oranında% 50 glikoz ICV infüzyonu, BOS glukoz seviyelerini suprafizyolojik 19 olan ~ 300 mg / dL'ye (16 mM) yükseltmiştir. BOS glukozunun bu suprafizyolojik seviyesi, tip 2 diyabetli bireylerde gözlenen seviyelerle klinik olarak ilişkili olmasa da, bu çalışmada sunulan sonuçlar, BOS'taki glikoz infüzyonunun farelerde BOS glukoz konsantrasyonunun kronik olarak yükselmesine neden olabileceğini göstermektedir.
Burada sunulan yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Bu tür gelişmiş prosedürlerin gerçekleştirilmesinde ilgili eğitim, beceri ve deneyim gerektiren sofistike fare beyni ameliyatını içerir. Kateter ve mini pompalar uzun süre implante edildiğinden, sağlık endişelerini veya kateter tertibatındaki hasarı izlemek için çalışma boyunca farelerin titiz bakımı gereklidir. % 50'lik bir glikoz konsantrasyonu seçildi, çünkü bu konsantrasyonun ötesindeki bir çözeltinin viskozitesi, glikozun ventriküllere infüzyonunu etkilemiş olabilir. Bu protokolde kullanılan mini pompalar 0.25 μL / s'lik bir akış hızına sahipti, bu nedenle% 50 glikoz infüzyonuna sahip fare grubu, 125 μg / s oranında glikoz veya günde 3 mg glikoz aldı. Bu nedenle, birim zaman başına bu glikoz dozu, mini pompaların akış hızı ile sınırlıydı.
Özetle, bu makale farelerde BOS glukozunun kronik artışı için doğrulanmış bir yöntem bildirmektedir. Bu modelden elde edilen bilgiler, BOS glukoz düzeylerindeki bir artışın, nörodejeneratif bozukluklar gibi diyabetle ilişkili komplikasyonlara aracılık etmede veya diyabet ve obezitede periferik metabolik hakaretlere neden olmada rol oynayıp oynamadığını veya nasıl rol oynadığını belirlemede yararlı olacaktır.
Sorun giderme
Boru farelerdeki kanülden çıkarsa, mini pompa monte edilirken kanül-boru bağlantısına az miktarda yapıştırıcı uygulanabilir. Dikişler çıkar ve kanül görünür hale gelirse, dikişler veya zımbalar kullanılarak kesi alanı tamamen kapatılabilir. Farenin arka pençelerinden gelen tırnaklar kesilmelidir, böylece ameliyat alanını fare tarafından çizilme olasılığı daha düşüktür. Ayrıca, farelerin hassas bir cilde sahip olması nedeniyle dikişleri cildin yırtılacağı kadar sıkı bağlamamaya dikkat edin.
BOS toplanmasından sonra hızlı iyileşme için, ameliyattan sonra deri altından 300 μL steril salin enjeksiyonu önerilir. Ayrıca, CSF koleksiyonunun maksimum hacmini 10 μL'de tutmak da önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüleri, KHC'ye DK124619 hibesi verdi.
Başlangıç fonları ve pilot araştırma ödülü, Rochester Üniversitesi, Tıp Bölümü, NY, KHC'ye.
Del Monte Sinirbilim Enstitüsü Pilot Araştırma Ödülü, Rochester Üniversitesi, KHC'ye.
Üniversite Araştırma Ödülü, Araştırma Başkan Yardımcısı Ofisi, Rochester Üniversitesi, NY, KHC'ye.
MUR yöntemi tasarladı ve uyguladı, sonuçları analiz etti, grafikler ve şekiller hazırladı ve makaleyi yazdı ve düzenledi. KHC çalışmayı tasarladı ve denetledi, sonuçları analiz etti ve makaleyi yazdı ve düzenledi. KHC bu çalışmanın garantörüdür. Tüm yazarlar makalenin son halini onaylamıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
- Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
- Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W.
- Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
- Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H.
- Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
- Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
- Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
- Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
- Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263 (2013).
- Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587 (2022).
- Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
- Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R.
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78 (2021).
- Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
- Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
- Dougherty, J. M., Roth, R. M.
