Summary
Denna artikel beskriver ett detaljerat protokoll för att öka glukoskoncentrationen i cerebrospinalvätskan (CSF) hos möss. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart för att studera effekterna av hög CSF-glukos på neurodegeneration, kognition och perifer glukosmetabolism hos möss.
Abstract
Diabetes ökar risken för kognitiv nedgång och försämrar hjärnans funktion. Huruvida detta förhållande mellan högt glukos och kognitiva underskott är orsakssamband är fortfarande svårfångat. Dessutom, om dessa underskott medieras av en ökning av glukosnivåer i cerebrospinalvätska (CSF) och / eller blod är också oklart. Det finns mycket få studier som undersöker de direkta effekterna av höga CSF-glukosnivåer på centrala nervsystemets (CNS) funktion, särskilt på inlärning och minne, eftersom nuvarande diabetesmodeller inte är tillräckligt utvecklade för att ta itu med sådana forskningsfrågor. Denna artikel beskriver en metod för att kroniskt öka CSF-glukosnivåerna i 4 veckor genom att kontinuerligt infusera glukos i laterala ventrikeln med osmotiska minipumpar hos möss. Protokollet validerades genom att mäta glukosnivåer i CSF. Detta protokoll ökade CSF-glukosnivåerna till ~ 328 mg / dL efter infusion av en 50% glukoslösning vid en flödeshastighet på 0,25 μl / h, jämfört med en CSF-glukoskoncentration på ~ 56 mg / dL hos möss som fick artificiell cerebrospinalvätska (aCSF). Dessutom påverkade detta protokoll inte blodsockernivån. Därför kan denna metod användas för att bestämma de direkta effekterna av hög CSF-glukos på hjärnfunktionen eller en specifik neural väg oberoende av förändringar i blodsockernivåer. Sammantaget kommer det tillvägagångssätt som beskrivs här att underlätta utvecklingen av djurmodeller för att testa rollen av högt CSF-glukos i medierande egenskaper hos Alzheimers sjukdom och / eller andra neurodegenerativa störningar i samband med diabetes.
Introduction
Både typ 1 och typ 2 diabetes försämrar hjärnans funktion 1,2,3. Till exempel ökar diabetes risken för kognitiv nedgång och neurodegenerativa störningar, inklusive Alzheimers sjukdom 3,4. Dessutom har personer med diabetes defekt glukosavkänning i hjärnan 5,6. Denna defekt bidrar till patogenesen av hypoglykemiassocierad omedvetenhet och ett otillräckligt motreglerande svar på hypoglykemi7,8, vilket kan vara dödligt om det inte behandlas omedelbart.
Med tanke på att diabetes ökar glukosnivåerna i blodet såväl som i cerebrospinalvätska (CSF)9 är det viktigt att avgöra om en eller båda av dessa faktorer bidrar till nedsatt hjärnfunktion. Huruvida diabetes orsakar hjärnskador genom hög CSF-glukos ensam eller i kombination med andra faktorer som insulinbrist eller insulinresistens är också en öppen fråga. Djurmodeller av typ 1 och typ 2 diabetes visar kognitiv försämring och neurodegeneration utöver en påverkad energibalans och perifer glukosmetabolism10,11,12,13. Men från dessa modeller är det inte möjligt att koppla bort de selektiva effekterna av hög CSF-glukos kontra blodsockernivåer för att förmedla komplikationerna av diabetes på hjärnans funktion.
Detta protokoll beskriver metoder för att utveckla en musmodell av hyperglykorrhachia för att testa effekterna av kroniskt höga CSF-glukosnivåer på hjärnfunktion, energibalans och glukoshomeostas. Musmodellen som utvecklats genom denna teknik presenterar ett verktyg för studier som undersöker den etiologiska rollen av dysreglerad glukoshomeostas på neural och beteendefunktion.
Därför kommer det föreslagna tillvägagångssättet att vara användbart för att förstå de direkta effekterna av förhöjda CSF-glukosnivåer vid olika patofysiologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Rochester och utfördes enligt US Public Health Service riktlinjer för human vård och användning av försöksdjur. Sex veckor gamla C57BL/6J hanmöss som användes för denna studie erhölls kommersiellt. Alla djuren var gruppinrymda (5 möss per bur) i ett rum med en 12 h dag / nattcykel och fick tillgång till mat och vatten ad libitum. Efter att mössen implanterades med en kanyl för att införa glukos i sidoventrikeln, var de enstaka inrymda för att förhindra skador på implantaten från andra möss.
1. Montering av osmotiska minipumpar
- Bered artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) enligt följande protokoll. Lös NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl 2,2H2O (0,206 g) ochMgCl2,6H2O (0,163 g) i 500 ml sterilt vatten för att bereda lösning A. Lös upp Na2HPO4,7H2O (0,214g) ochNaH2PO4. H2O(0,027 g) i 500 ml sterilt vatten för att bereda lösning B. Blanda sedan lösning A och B i förhållandet 1:1 för att bereda aCSF.
OBS: Denna formulering av aCSF innehåller ingen glukos. - För att bereda 50% glukoslösning, tillsätt 50 g glukos till 50 ml aCSF i en bägare. Placera bägaren på en värmeplatta och värm suspensionens temperatur till 60 °C. Blanda suspensionen med en magnetomrörare tills glukosen är helt upplöst.
- Tillsätt aCSF i bägaren för att göra den slutliga volymen 100 ml. För lösningen genom 0,22 μm porfilter för att sterilisera den.
- Bered en 0,9% saltlösning (NaCl) och passera lösningen genom 0,22 μm-filtret.
- Placera alla komponenter i minipumpen och infusionssatsen i en steril bricka och skär slangen från hjärninfusionssatsen till 1 tum i längd med en steril sax. Håll slangen med en steril hemostat och tryck den på toppen av kanylens ena ände. Anslut den andra änden av slangen till flödesmodulatorns ovansida. Täck båda ändarna av slangen med en liten mängd lim för en starkare anslutning.
- Sätt fast en 27 G nål på en 1 ml spruta och fyll den med antingen aCSF eller glukoslösningen. För in 27 G-nålen i en liten bit slang. Anslut sedan slangen till den öppna änden av flödesmodulatorn och fyll den med motsvarande lösning tills droppar av lösningen börjar komma ut från kanylen. Ta bort eventuella luftbubblor som fastnat i slangen.
- För att fylla minipumpen, håll pumpen upprätt och sätt in sprutnålen i pumpen. Fyll den med motsvarande lösning tills en droppe av lösningen börjar bildas vid minipumpens öppning.
- Sätt långsamt in flödesmodulatorn i pumpen samtidigt som du ser till att inte införa några luftbubblor i enheten.
- När de osmotiska minipumparna är monterade, överför dem till ett 50 ml koniskt rör. Fyll röret med den sterila saltlösningen så att pumparna är helt nedsänkta, samtidigt som du ser till att kanylen håller sig borta från saltlösningen. Fyra sådana monterade pumpar kan placeras i ett 50 ml rör.
- Placera locket löst på varje rör och inkubera pumparna vid 37 °C för att prima i minst 48 timmar.
2. Kirurgi för att implantera osmotiska pumpar
- Före operationen
- Sterilisera de kirurgiska instrumenten i en autoklav och låt dem svalna i minst 30 minuter före användning. Autoklavförhållandena innefattar ångsterilisering vid 121 °C i 30 minuter.
- Desinficera operationsområdet med 70% etanol. Torka av knopparna, öronstängerna och stereotaktisk ramyta.
OBS: Kirurgi bör utföras i en aseptisk miljö, med tanke på att undvika att vidröra icke-sterila ytor när du utför operation. Byt ut handskar om det finns misstanke om kontaminering. - Placera musen i en anestesikammare för att bedöva den med 3% isofluran blandat i luft i 3-5 min. Ta sedan bort musen från kammaren och placera den på ett sterilt draperi. Behåll anestesi via en näskon vid 1,5% -2%.
- Knippa musens bakpote för att observera eventuell reflex och verifiera anestesidjupet.
- Injicera 5 mg/kg karprofen subkutant för analgesi.
- Använd rena klippare för att klippa operationsområdet på mushuvudet. Gnid hårbotten först med povidon-jodlösning och sedan med alkoholpinnar noggrant i minst 2 minuter. Upprepa denna process minst tre gånger.
- Applicera ett ögonsmörjmedel för att förhindra att ögonen torkar under operationen.
- Kirurgi
- Placera musen på den stereotaxiska ramen och montera huvudet på snittstången. Täck näsan med näskonen. Applicera sterila draperier för att säkra operationsområdet.
- Flytta flödet av isofluran till noskonen. Fortsätt att hålla anestesin vid 1,5%-2% isofluran.
- Placera en värmedyna under musen för att bibehålla kroppstemperaturen.
- Sätt på nya sterila handskar och gör med en skalpell ett snitt (~ 10-15 mm långt) i hårbotten. Exponera skalleytan med en spatel medan du använder bomullsspetsar för att torka av blödning.
OBS: Använd en cauterizer om du blöder kraftigt, vilket är sällsynt. - Gnid med en bomullsspets doppad i 3% väteperoxid för att exponera kranialsuturerna.
- Notera bregma och lambda för att navigera i skallkoordinaterna. Ställ in alla koordinater på noll vid bregma.
OBS: Dessa koordinater erhölls från en mushjärnatlas14. Referensavståndet bregma-lambda i atlasen är 4,21 mm. För att korrigera för ålders- och könsbaserade skillnader i skallstorlek mättes bregma-lambdaavståndet för varje mus och dividerades sedan med 4,21 mm för att erhålla en multiplikationsfaktor. Till exempel, om avståndet mellan bregma och lambda var 4, 65 mm, gav division med 4, 21 mm en multiplikationsfaktor på 1, 10. Alla koordinater som erhölls från atlasen multiplicerades sedan med denna faktor för att mäta de faktiska koordinaterna som användes för att borra hålet. I exemplet ovan skulle de resulterande främre bakre (AP) och mediala laterala (ML) koordinaterna vara 0,55 respektive 1,1 mm (dvs 1,1 x 0,5 eller 1 mm). - Använd en elektrisk borr för att göra ett hål vid dessa koordinater: 0,5 mm bakom bregma och 1 mm lateralt till mittlinjen åt höger.
OBS: När du borrar hålet i skallen, var försiktig så att du inte brister dura mater. Se till att borrkronan är steril. Den kan placeras med andra instrument i samma autoklavpåse för sterilisering. - Sätt in en hemostat under den snittade huden och tryck den till den plats där den osmotiska minipumpen kommer att implanteras. Öppna och stäng försiktigt hemostaten för att göra en ficka för minipumpen.
- Använd en steril hemostat för att välja en primerad osmotisk minipump från flödesmodulatorns spets. Tryck pumpen genom den snittade huden i fickan.
OBS: Var försiktig så att pumpen och kanylen inte vidrör någon icke-steril yta. - Applicera lite lim på kanylens undersida och fixera det i kanylhållaren. Sänk kanylen långsamt genom det borrade hålet 2 mm ventralt till skallytan. Låt den stå där i minst 5 minuter så att limet stelnar.
- Innan du för ner kanylen i hjärnan, se till att kanylen inte är igensatt och att lösningen flyter ordentligt.
OBS: Ibland kan glukos deponeras vid kanylens spets på grund av en mycket låg flödeshastighet, vilket blockerar flödet. - Klipp med hjälp av en sax toppen av kanylen så att den inte lossnar från skallytan.
- Täck kanylen med ett lager tandcement för extra stöd.
- Använd nylonsuturer (5-0 storlek och 30 tum i längd) för att stänga såret och applicera aktuellt antibiotikum på såret för att förhindra infektion.
- Stäng av isofluran och låt djuret återhämta sig från narkosen. Överför sedan djuret till en ny ren bur.
- Vård efter operation
- Efter operationen, övervaka musen i minst 1 vecka.
- Administrera 5 mg/kg karprofen subkutant, en gång var 24:e timme i tre dagar efter operationen.
- Låt såret läka helt innan du tar bort suturerna 7-10 dagar efter operationen.
OBS: Det observerades att möss med hög CSF-glukos tog längre tid att läka. Trimning av naglar på musens bakpotar minimerar risken för skada på snittplatsen på grund av mössens repbeteende.
3. Byte av minipumpar
OBS: Eftersom minipumparna som används i denna studie endast varar i 4 veckor, testades utbytet av minipumpar också för att förlänga varaktigheten av glukosinfusion, vilket kan krävas vid långtidsstudier. Detta omfattade följande steg.
- Förbered mössen för operation enligt beskrivningen ovan.
- Gör ett litet 1 cm vertikalt snitt i huden något ovanför pumpen.
- Sätt in en hemostat under den snittade huden och dra ut pumpen.
- Ta bort pumpen från slangen och anslut en ny grundad pump till slangen.
- Sätt tillbaka pumpen inuti och sy huden.
- Följ samma skötselinstruktioner efter operationen som beskrivits ovan.
4. Förfarande för uppbörd av CSF
- Förberedelse
- Dra 1 mm diameter glaskapillärer med en mikropipettavdragare för att få 0,5 mm diameter spetsar. Inställningarna är: värme = 800, drag = 15, hastighet = 5 och tid = 200 enheter. Placera de dragna kapillärerna i en steril låda tills de används.
- Sätt fast en 27 G nål på en 1 ml spruta. Sätt i den dragna kapillären på nålen och använd en liten tejp för att säkra anslutningen.
- Fixera sprutan ordentligt i en kapillärhållare av en mikromanipulator.
- Förbered sedan musen för operation, som beskrivs i proceduren före operationen ovan.
- Kirurgiskt ingrepp
- Placera musen på den stereotaxiska ramen. Efter fixering av huvudet på ramen, som beskrivits tidigare, vrid knopparna för att luta huvudet så att näsan är vänd nedåt. Applicera sterila draperier för att säkra operationsområdet.
- Gör ett litet snitt på dorsalytan, från det intraaurala planet till den kaudala sidan.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar slangen när du gör snittet. - Ta bort stödet från muskroppen och låt musen vila vertikalt så att nacken är helt utsträckt dorsalt.
- Med hjälp av böjda trubbiga pincett, skär försiktigt de bakre nackmusklerna från mittlinjen för att skapa ett litet fönster. Använd sedan en våt bomullsspetsapplikator för att försiktigt förskjuta nackmusklerna från mittlinjen till periferin.
- Observera om cisterna magna är exponerad, vilket framträder som ett triangulärt fönster med ett transparent duramembran.
- Placera mikromanipulatorenheten på den stereotaxiska ramen bredvid musen samtidigt som du ser till att kapillärspetsen inte vidrör någon yta.
- Bryt försiktigt kapillärspetsen utan att störa inställningen.
- Medan du tittar in i förstoringsglaset (förstoring på 2,25x), vrid motsvarande rattar på mikromanipulatorn för att långsamt rikta in och flytta kapillärspetsen mot cisterna magna.
- Ett visst motstånd känns när kapillärspetsen vidrör cisterna magna-membranet. Tryck långsamt spetsen mot membranet med hjälp av knopparna.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar några blodkärl i membranet. Detta steg är mycket viktigt för att undvika blodförorening i CSF. - Mycket försiktigt genomborra membranet. CSF kommer att börja strömma in i kapillären på en gång på grund av negativt tryck i kapillären.
- Lämna inställningen i några minuter tills ~ 10 μL CSF samlas i kapillären.
- Dra sedan långsamt kapillären ur cisterna magna och tryck försiktigt en steril bomullsspetsapplikator mot öppningen av cisterna magna för att stoppa CSF-läckage.
- Ta försiktigt bort kapillären från sprutan och fäst den på en microcap-lampdispenser. Tryck på glödlampan för att överföra CSF till ett sterilt mikrocentrifugrör.
- Placera ett stöd under musen och vrid de stereotaxiska rattarna för att jämna ut huvudet.
- Stäng såret med nylonsuturer.
- Injicera 300 μl steril saltlösning subkutant innan musen avlägsnas från apparaten.
- Ge postoperativ vård till djuren som beskrivits ovan, tills det är dags att ta bort suturerna - ~ 7-10 dagar efter operationen.
5. Glukosanalys
- Följ protokollet enligt beskrivningen i glukoskolorimetriska analyssatsen.
- Späd natriumfosfatbuffertlösningen som medföljer satsen till 50 mM koncentration i ultrarent vatten.
- Bered glukosstandarder i 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 och 50 mg / dL intervall från 1,000 mg / dL stamlösning som tillhandahålls i satsen i utspädd buffertlösning.
- Bered en 7-faldig utspädning av CSF-prover i bufferten. Till exempel, om den totala CSF-volymen som samlas in är 10 μL, kommer den sjufaldiga utspädda volymen att vara 70 μL.
- Pipettera 15 μL glukosstandard och utspädd CSF i två exemplar i en 96-brunnsplatta.
- Pipettera 85 μL utspädd buffert i var och en av brunnarna med standarder och CSF.
- Tillsätt 6 ml utspädd buffert till injektionsflaskan med glukoskalorimetrisk enzymblandning och virvla den i några sekunder för att blanda noggrant.
- Tillsätt 100 μL av enzymblandningspreparatet till varje brunn för att starta reaktionen.
- Försegla plattan med ett täckplåt och knacka försiktigt på plattan för att blanda reagenserna.
- Placera plattan i en inkubator vid 37 °C i 10 minuter. Injektionsflaskor med hög glukos börjar bli violetta omedelbart.
- Efter 10 minuter, ta bort locket och mät absorbansen vid 500-520 nm med en plattläsare.
- Beräkna glukoskoncentrationen i CSF-proverna genom att interpolera deras värden från standardkurvan.
6. Blodsockeranalys
- Gör ett litet lateralt nick till mussvansen med ett rakblad och använd en droppe blod för att mäta blodsockret med en glukometer, enligt de manuella instruktionerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manliga möss implanterades med en kanyl monterad på en osmotisk minipump (figur 1) för att kroniskt införa aCSF eller en 50% glukoslösning i sina laterala ventriklar (figur 2). CSF samlades in 10 dagar efter operationen (figur 3) för att validera effekten av denna procedur. Resultaten visade en ökning av CSF-glukosnivåerna (medelvärde: 327,7 mg / dL) hos möss infunderade med 50% glukos jämfört med det (medelvärde: 56,5 mg / dL) hos möss infunderade med aCSF. Detta handlar om en sexfaldig ökning av CSF-glukosnivåerna hos försöksmössen jämfört med deras kontrollkullkamrater (figur 4A). Blodsockernivåerna skilde sig inte åt mellan grupperna (figur 4B).
Figur 1: Montering av osmotiska minipumpar. (A) Infusionsenhet med en kanyl ansluten till en minipump genom slang. Dessa pumpar kräver minst 48 timmar för att prima. (B) Förekomsten av luftbubblor utanför minipumparna bekräftar grundningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Stereotaxisk apparatur och tillbehör. (A,B) Stereotaxisk utrustning med en ansluten mikromanipulator och andra tillbehör. (C) Burrhålkoordinater för att infoga kanylen. (D) Osmotisk minipumpimplantation, (E,F) Insättning av kanylen i det borrade hålet. Behåll aseptiska tillstånd under hela operationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förfarande för uppsamling av cerebrospinalvätska (CSF). (A) Dorsala nackmusklerna förflyttades försiktigt med trubbiga pincett för att exponera cisterna magna. En 1 mm kapillär med en spets på 0,5 mm diameter användes för att (B) brista och (C,D) samla CSF från cisterna magna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mätning av glukos. (A) Ökad CSF-glukos (B) utan att påverka icke-fastande blodsockernivåer hos möss infunderade med 50% glukoslösning i sidoventrikeln. Effekten av detta protokoll validerades genom mätning av CSF och blodglukoskoncentration 10 dagar efter påbörjad glukosinfusion. Möss infunderade med 50% glukoslösning hade CSF-glukosnivåer på 327,7 ± 30,1 mg / dL (medelvärde ± standardfel av medelvärdet) jämfört med möss som fick artificiell CSF-infusion som hade glukosnivåer på 56,5 ± 2,6 mg / dL. p < 0,0001, oparad t-test. Felstaplar representerar medelfel (n = 5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel rapporterar ett detaljerat protokoll för att öka CSF-glukos hos möss genom att använda osmotiska minipumpar anslutna till en kanyl implanterad i laterala ventrikeln. Den kroniska infusionen av glukos i mushjärnan genom denna procedur kommer att vara användbar för att avgränsa effekterna av långvarig hyperglykorrhachia på kognition, systemisk glukosmetabolism och energibalans och för att bättre förstå patogenesen av diabeteskomplikationer.
Kronisk diabetes orsakar hjärnskador som avbryter kommunikationen mellan hjärnan och de perifera organen15. Diabetes ökar också risken för neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom 3,4. Streptozotocin (STZ)-inducerad typ 1-diabetes har varit standardmodellen för gnagare inom diabetesforskning16; STZ skadar β-celler i bukspottkörteln, vilket leder till typ 1-diabetesliknande patologi. Vidare, i en modifierad version, kan användningen av STZ tillsammans med nikotinamider inducera typ 2-diabetes. Ett annat sätt att utveckla typ 2-diabetesliknande fenotyper hos djur är genom att mata dem med en fettrik diet16. Men i samband med att studera effekten av hyperglykemi på hjärnans funktion är dessa tekniker begränsade när det gäller att kontrollera för ett stort antal faktorer (t.ex. perifera insulin/glukagonnivåer och metabolisk funktion i allmänhet). Således kan någon effekt av STZ-inducerad diabetes på hjärnans funktion endast tolkas som en associerad komplikation, istället för att fastställa en enda etiologisk faktor. Akut injektion eller kronisk infusion av ämnen i cerebroventrikulär utrymme är en teknik som ofta används för att testa deras direkta effekter på hjärnans funktion. Intracerebroventrikulär (ICV) injektion av STZ har använts för att utveckla en gnagarmodell av Alzheimers sjukdom, men det är fortfarande osäkert om STZ-associerad neural skada beror på dysregulering i glukosavkänning / homeostas eller andra oberoende mekanismer, som STZ-inducerad oxidativ stress och DNA-skada17.
De procedurer som beskrivs i det nuvarande protokollet kommer att vara användbara för att utveckla gnagarmodeller som kan svara på forskningsfrågor, som om en ökning av CSF-glukoskoncentrationen kan orsaka kognitiv försämring. Protokollet som beskrivs här kan användas för att bestämma de direkta effekterna av höga CSF-glukosnivåer på hypotalamus och hippocampus, bland andra hjärnregioner som är involverade i näringsavkänning, metabolism och / eller kognition. Denna metod skulle också klargöra om en ökning av CSF-glukosnivåer påverkar insulinkänslighet, insulinsekretion, matintag och / eller energibalans vid baslinjen och som svar på metaboliska förolämpningar. Dessutom skulle protokollet som rapporteras här vara tillämpligt vid testning av hypoteser som kräver longitudinella studier. Till exempel kan data samlas in före, under och i slutet av glukosinfusionerna för att jämföra fynd från samma djur vid olika tidpunkter. En sådan strategi skulle ta itu med huruvida komplikationer som uppstår på grund av hög CSF-glukosnivå är reversibla efter att den normala CSF-glukosnivån har återställts. Däremot skulle metoden även kunna användas för hypotesgenererande studier. Till exempel kan CSF samlas in från samma djur vid olika tidpunkter och utsättas för metabolomik eller proteomikanalys för att identifiera biomarkörer eller metaboliska förolämpningar som produceras av hög nivå av CSF-glukos. På liknande sätt kan olika regioner i hjärnan analyseras med rumslig transkriptomik för att ge cellspecifik information som kan ha förändrats av hög CSF-glukos.
Anledningen till att införa glukosfri aCSF till en skengrupp var att hålla CSF-glukoskoncentrationen på baslinjenivån, så att varje förändring i CSF-glukosnivån inducerad av kanylimplantation kan kontrolleras naturligt. Resultaten i denna studie visade att skengruppen hade en CSF-glukoskoncentration på ~ 60 mg / dL (~ 3 mM), vilket ligger i det normala CSF-glukosområdet hos möss18. CSF-glukosnivåerna som observerats hos individer med typ 2-diabetes är ~ 110 mg / dL eller ~ 6 mM9. I den aktuella studien ökade ICV-infusion av 50% glukos med en hastighet av 125μg / h CSF-glukosnivåerna till ~ 300 mg / dL (16 mM), vilket är suprafysiologiskt19. Även om denna suprafysiologiska nivå av CSF-glukos kanske inte är kliniskt relevant för de nivåer som observerats hos individer med typ 2-diabetes, visar resultaten som presenteras i denna studie att infusionen av glukos i CSF kan inducera en kronisk höjning av CSF-glukoskoncentrationen hos möss.
Metoden som presenteras här har vissa begränsningar. Det handlar om sofistikerad hjärnkirurgi hos möss som kräver relevant utbildning, färdigheter och erfarenhet av att utföra sådana avancerade procedurer. Eftersom katetern och minipumparna implanteras på lång sikt är noggrann vård av mössen under hela studien nödvändig för att övervaka hälsoproblem eller skador på kateterenheten. En 50% glukoskoncentration valdes eftersom viskositeten hos en lösning utöver denna koncentration kan ha påverkat infusionen av glukos i ventriklerna. Minipumparna som användes i detta protokoll hade en flödeshastighet på 0,25 μl / h, så gruppen möss med 50% glukosinfusion fick glukos med en hastighet av 125 μg / h eller 3 mg glukos per dag. Denna dos glukos per tidsenhet begränsades därför av minipumparnas flödeshastighet.
Sammanfattningsvis rapporterar denna artikel en validerad metod för kronisk ökning av CSF-glukos hos möss. Informationen som erhålls från denna modell kommer att vara användbar för att bestämma huruvida eller hur en ökning av CSF-glukosnivåerna är involverad i att förmedla diabetesassocierade komplikationer, såsom neurodegenerativa störningar, eller orsaka perifera metaboliska förolämpningar vid diabetes och fetma.
Felsökning
Om slangen lossnar från kanylen i mössen kan en liten mängd lim på kanylslanganslutningen appliceras vid montering av minipumpen. Om stygnen lossnar och kanylen blir synlig kan snittområdet stängas helt med suturer eller häftklamrar. Naglar från musens bakpotar ska trimmas, så att det finns en lägre möjlighet att skrapa operationsområdet med musen. Var också försiktig så att du inte knyter av suturerna så tätt att huden kommer att riva, eftersom möss har känslig hud.
För snabb återhämtning efter CSF-insamling rekommenderas injektion av 300 μL steril saltlösning subkutant efter operationen. Dessutom är det viktigt att hålla den maximala volymen CSF-insamling till 10 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
National Institutes of Health beviljar DK124619 till KHC.
Start-up fonder och pilotforskningspris, Institutionen för medicin, University of Rochester, NY, till KHC.
Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, till KHC.
University Research Award, Office of the Vice President for Research, University of Rochester, NY, till KHC.
MUR utformade och utförde metoden, analyserade resultat, utarbetade grafer och figurer samt skrev och redigerade manuskriptet. KHC utformade och övervakade studien, analyserade resultat och skrev och redigerade manuskriptet. KHC är garant för detta arbete. Alla författare godkände den slutliga versionen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
References
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
- Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
- Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W.
- Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
- Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H.
- Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
- Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
- Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
- Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
- Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263 (2013).
- Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587 (2022).
- Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
- Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R.
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78 (2021).
- Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
- Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
- Dougherty, J. M., Roth, R. M.
