Summary
鞘脂是生物活性代谢物，在人类疾病中具有公认的作用。用质谱法表征组织改变可以揭示疾病病因学中的作用或确定治疗靶点。然而，用于生物储存库中冷冻保存的OCT化合物会干扰质谱分析。我们概述了使用LC-ESI-MS / MS分析嵌入OCT的人体组织中鞘脂的方法。
Abstract
鞘脂是在人体新陈代谢和疾病中具有明确作用的细胞成分。质谱可用于确定鞘脂在疾病中是否改变，并研究鞘脂是否可以在临床上靶向。然而，直接从手术室获取组织的适当把握度的前瞻性研究可能非常耗时，并且在技术、后勤和行政上具有挑战性。相比之下，回顾性研究可以利用组织生物储存库中已经存在的冷冻保存的人类标本，通常数量很大。从生物储存库采购组织的其他优点包括访问与组织标本相关的信息，包括组织学、病理学以及在某些情况下的临床病理学变量，所有这些都可用于检查与脂质组学数据的相关性。然而，与冷冻保存和质谱中使用的最佳切割温度化合物（OCT）不相容相关的技术限制是脂质分析的技术障碍。然而，我们之前已经证明，OCT可以通过洗涤和离心的循环轻松地从人类生物储存库标本中去除，而不会改变其鞘脂含量。我们之前还确定，在OCT中冷冻保存的人体组织中的鞘脂可以稳定长达16年。在本报告中，我们概述了分析嵌入OCT的人组织标本中鞘脂的步骤和工作流程，包括洗涤组织，称量组织以进行数据归一化，脂质提取，制备用于液相色谱电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS）分析的样品，质谱数据集成，数据归一化和数据分析。
Introduction
鞘脂是生物活性代谢物，以其在人体代谢和疾病中的作用而闻名1，2。它们调节复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活和死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭和转移、血管生成以及细胞因子的产生1，2，3，4，5，6，7，8，9.鞘脂代谢调节的缺陷有助于癌症的发生和进展，决定癌症的侵袭性，以及癌症如何对治疗产生反应和耐药性3，10。因此，由于这些对疾病病因的广泛影响，能够精确确定疾病特异性鞘脂改变的分析方法是重要的工具。质谱（MS）是分析鞘脂改变的最准确和可靠的方法。
可用于分析鞘脂改变的人类标本可以从手术室前瞻性地获得，也可以从组织生物储存库中回顾性地获得。来自手术的新鲜组织是有利的，因为它们可以通过MS或其他分析方法直接分析。然而，前瞻性地获取组织存在行政、技术和后勤障碍，收集足够的标本以达到统计能力可能具有挑战性。从生物储存库获取组织是有利的，因为它们可以回顾性地大量获取，并且生物储存库确认组织学和病理学，使用标准操作程序低温保存和储存组织，并且可以提供可用于相关性分析的临床病理学数据。然而，为了保留分子和结构特征，生物储存库可以通过将组织嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物来冷冻保存组织，我们已经证明这会干扰数据归一化测定和通过液相色谱电喷雾串联质谱 （LC-ESI-MS/MS） 对鞘脂的定量11.还表明，聚乙烯醇和聚乙二醇（OCT化合物中的主要成分）在其他MS分析平台中导致离子抑制12，13，14，15。因此，在通过MS进行鞘脂组学分析之前，必须从组织中去除OCT化合物。
在之前的报告中，我们验证了从人类标本中去除OCT化合物的方案，用于LC-ESI-MS/MS分析11 ，以及用于称量组织以进行数据归一化的方法11。在这里，我们详细介绍了鞘脂组OCT化合物去除方案（sOCTrP）的步骤，并显示了来自人肺腺癌肿瘤和正常邻近未受累组织的代表性数据。
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Protocol
根据内部审查委员会（IRB）批准的协议（#HM2471），从弗吉尼亚联邦大学（VCU）组织和数据采集和分析核心获得去识别的人肺组织。使用小鼠研究和收获小鼠组织得到了VCU机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 材料准备
注意：这些步骤应在纸巾清洗前一天进行。
- 对 1.5 mL 聚丙烯离心管进行预标记和称量，并为第二天处理的每个样品提供简洁明了的标识符代码。使用耐化学腐蚀的永久性标记（见 材料表），在反复的管处理下不会褪色。
- 打开电子电子表格，并用以下列标题标记连续的列：试管标识符 （ID）、单独试管、带组织的试管和总组织。输入将处理到标有试管 ID 的列中的试管标识符。
- 预先校准分析秤并将其归零。将干净的 10 mL 锥形瓶放在天平板的中心（培养瓶将充当试管支架）。关闭称量室门，用烧瓶去皮秤。
- 称取 1.5 mL 离心管。小心地将试管放入烧瓶中并关闭称量室门。让重量稳定并单独记录标记管中的重量。
注意：称量试管时避免移动 10 mL 锥形瓶。如果烧瓶被移动，将烧瓶重新居中并重新去皮天平。将封闭的管子放在架子上并存放直到需要为止。 - 在 13 x 100 mm 螺旋盖玻璃管和盖子上预先贴上标识符代码，并用 2 mL LC-MS 级甲醇填充。将它们放在管架中，盖上管子，并将它们存放在冰箱（4°C）中直至使用。
注意：使用瓶口溶剂分配器（见 材料表）。如果没有，请使用玻璃移液器，以避免在分配有机溶剂时使用塑料。 - 预先标记 13 x 100 mm 玻璃试管。盖上并在室温下储存试管。
- 带有标识符代码的预标记自动注射器小瓶。盖上并将自动注射器小瓶存放在室温下直至使用。
- 准备纸巾干燥灯芯。
- 首先将手术剪刀浸入LC-MS级甲醇中5分钟，然后用干净的实验室级纸巾擦拭。
- 使用无粉手套，旋转实验室级纸巾的末端（见 材料表），直到形成细锥形的30-40毫米灯芯。
- 使用甲醇清洁的剪刀，剪掉厚端的灯芯。将灯芯放入干净的纸板箱中。使芯的数量是处理所有样品所需的两倍。
- 准备缩短的 1 mL 移液器吸头。使用甲醇清洁的手术剪刀，从 1 mL 移液器吸头的尖端切下 4-5 mm，然后将吸头放回吸头支架中。准备的吸头数量是要处理的样品的两倍。
注意：这些将用于从管中取出洗涤过的纸巾。请勿触摸尖端的末端。 - 预冷分子生物学级磷酸盐缓冲盐水（PBS）至4°C（0.5L就足够了）。这将用于检索标本。对于将要处理的每个样品，预冷（4°C）60 mL超纯去离子水。
- 准备质谱内标。将以下脂质溶解在乙醇中：甲醇：水（7：2：1;v/v/v），浓度为25 nmol / mL：d17：1-鞘氨醇，（2S，3R，4E）-2-氨基十七烷-4-烯-1，3-二醇;D17：1-鞘氨醇-1-磷酸，十七烷-4-烯嘧啶-1-磷酸;C12-神经酰胺（d18：1/C12：0）， N-十二烷酰基-4-烯吩;C12-鞘磷脂（d18：1/C12：0）， N-十二烷基-鞘-4-烯-1-磷酸胆碱;C12-葡萄糖神经酰胺（d18：1/C12：0）， N-十二烷基-1-β-葡萄糖基-4-烯;C12-乳糖神经酰胺（d18：1/C12：0），N-（十二烷基）-1-β-乳糖基-4-烯。
2. 纸巾清洗
注意：提前一天完成第 1 节中的所有步骤，熟练的研究人员每天最多可以处理 40 个样品，新手每天可以处理 ~10-15 个样品。清晨开始，在完成第 2.1-3.8 节中的所有步骤之前不要停止。
- 在处理组织当天，通过配备涡流器、充满电的血清移液器和冰盘来准备生物安全柜工作区。对于本节中的所有步骤，请穿戴适当的个人防护用品，包括实验室外套、双层手套和防护眼镜。注意：人体组织和体液应被视为生物危害性材料并进行处理。
- 预冷（4°C）摆动桶离心机，容纳15 mL锥形离心管所需的任何适配器以及离心机生物防护盖。预冷（4°C）能够容纳1.5 mL离心管的固定角度离心机。
- 如果未将组织等分到15 mL聚丙烯离心管中，请使用甲醇清洁刮刀（对每个新组织样品清洁）将其转移到预先标记的15 mL聚丙烯管中。也标记 15 mL 盖子。
- 将能够容纳 15 mL 离心管的管架放入冰盘中，并在托盘中装满冰块。通过将当天将要处理的组织放在冰上的架子上来解冻它们。
注意：应从生物储存库中请求至少 3-4 mg 的组织进行处理，因为之前已经表明，在这些重量下组织洗涤和称量方案准确可靠11.
- 将能够容纳 15 mL 离心管的管架放入冰盘中，并在托盘中装满冰块。通过将当天将要处理的组织放在冰上的架子上来解冻它们。
- 将装有样品的冰盘移至生物安全柜中。
- 如下所述执行三个sOCTrP循环11 （即执行步骤2.5.1-2.5.5三次）。
- 向每个试管中加入 10 mL 冰冷的超纯去离子水，并盖紧。让试管孵育10分钟。
- 剧烈涡旋每个管10-20秒或直到沉积在管壁上的所有组织或组织颗粒完全重新悬浮。
注意：在sOCTrP循环2-3中，将沉淀重悬至关重要，以便将沉淀中的任何OCT稀释到洗涤溶液中。 - 将试管转移到预冷（4°C）水平桶离心机中。在4°C下以4，000-5，000× g 离心样品10分钟。
注意：通过用生物防护盖密封离心机载体，避免产生和暴露于离心过程中产生的生物危害性气溶胶（参见 材料表）。 - 从离心机中取出样品并转移到冰盘中。将托盘放入生物安全柜中并打开试管盖。保存大写字母。
- 小心地吸出洗涤液。通过在管中留下~0.5mL的上清液来避免吸出沉淀中的组织材料。盖上管子，并通过将标记的盖子与管子匹配来避免交叉污染。
注意：步骤2.5.5中的洗涤溶液（上清液）是生物危害性材料;按照适用于人类来源标本的生物安全准则进行处理和处置。
3. 纸巾称量（用于数据归一化）
- 在最后一个sOCTrP洗涤循环后，小心吸出大部分洗涤溶液，但避免干扰沉淀。将~0.5mL洗涤溶液留在管中。
- 使用缩短的移液器吸头（在步骤1.9中制备），吸取500μL冰冷的PBS并将其添加到管中。
- 使用相同的尖端，轻轻重悬沉淀并取出所有组织。避免湍流移液，通过粘附在管和移液器吸头壁上来减少组织损失。
- 将重悬的组织添加到相应的预标记和预称重的 1.5 mL 离心管中，并将管放在冰上。对数据集中的所有组织重复此操作。
- 将1.5mL管放入预冷离心机中，并以7，000× g 沉淀组织5-7分钟和4°C。
- 取回试管并小心地吸出尽可能多的PBS，而不会干扰颗粒。将管子放回冰上。
- 以7，000 x g 离心管再离心3分钟，以确保组织充分沉淀。将试管转移到冰上。
注意：额外的离心步骤对于防止在去除所有洗涤溶液和芯吸时组织损失很重要。如果处理超过五个样品，则在每处理第五个样品后重复3分钟，7，000× g 离心步骤，以确保组织保持沉淀。 - 使用步骤1.8中制备的灯芯，轻轻除去任何剩余的洗涤溶液。对每个样品使用干净的灯芯。用灯芯轻轻轻拍纸巾是可以接受的，这将有助于去除大部分洗涤液，但避免因粘附在灯芯上而丢失任何纸巾。关闭管子并将其放在冰上。
- 在最近校准、去皮和归零的分析天平中称量每个试管。
- 将每个试管放入玻璃锥形瓶中并关闭腔室门。当重量稳定下来时，将其记录在标有带组织的管子的电子电子表格列中。
- 称重后，将试管放回冰上。
- 加入 300 μL 冰冷的 PBS。使用缩短的移液器吸头（步骤1.9），小心地取出所有组织并沉积在含有2 mL冰冷LC-MS级甲醇的预标记螺旋盖玻璃管（在步骤1.5中制备）中（将组织添加到甲醇中，而不是管的侧面）。
- 通过从带有组织值的管中单独减去试管来计算洗涤的组织量。将此数字记录在总组织列中。总组织值将用于在步骤6.12中归一化质谱数据。
- 将样品储存在-80°C，直到准备好执行步骤4.1-4.15。
注意：这是一个很好的停止点，样品可以在-80°C下安全储存几周。 对于其他组织归一化方法，例如蛋白质浓度或脂质磷酸盐含量，请参阅Rohrbach等人11。
4. 脂质提取
注意：在早上开始这些步骤很重要，尤其是在要处理许多样品时。在开始之前，将水浴或培养箱预热至48°C。
- 从冰箱中取出步骤3.8中制备的样品和MS脂质标准品（在步骤1.11中制备）。让它们平衡至室温20分钟。
- 涡旋并将内标溶液浸入超声水浴（见 材料表）中2-3分钟或直到MS脂质标准品完全溶解，然后分液到样品中。这将避免数据规范化中的错误。
- 使用重复移液器，向每个试管中加入 250 pmol（来自步骤 1.11 中制备的 25 nmol/mL 溶液中的 10 μL）的内部质谱标准品。轻轻盖上试管。
- 为便于均质化，将甲醇体积调节至 2 mL。仅使用 LC-MS/MS 级甲醇。
- 一次工作一个管，使用均质机研磨组织，直到没有可见的团块（通常为5-20秒）。以圆周运动移动均质器尖端，轻轻按压管壁以帮助研磨。重新盖上试管。
注意：确保所有组织都经过精细研磨将最大限度地提高脂质提取。在均质化之前，请勿向样品中添加氯仿，因为一次性均质器吸头由塑料制成，可溶解在含有氯仿的溶液中。 - 将管子以45°角浸入超声波水浴中5-10秒。
- 如果浸入超声波浴中时没有形成组织团块，请盖上盖子，然后移至下一个试管。
- 如果将管浸入超声波浴中时形成组织团块，请重新均质化并靶向团块。
- 重复此过程（均质化/浸入超声波浴中），直到所有大组织团块都被分解。
- 在通风橱中，向每个试管中加入LC-MS级氯仿和甲醇（使用瓶顶分配器），以达到2：1：0.1甲醇：氯仿：水的比例。使用干净的盖子，将管子密封好，放在工作台上直到一天结束。
- 对于重量不超过 50 mg 的组织，使用总提取体积为 4 mL，并使用此比例（50 mg：4 mL 提取溶液）调整较大的标本。
- 在当晚离开之前，将紧密盖的管放入48°C水浴或培养箱中，并孵育过夜。
注意：至关重要的是，管子必须紧闭，以免溶剂比例因蒸发而改变。 - 第二天早上，从48°C水浴中取出样品，并通过在4°C下以4，000-5，000× g 离心20分钟来沉淀任何溶剂不溶性碎片。
- 在通风橱中工作，小心地将上清液倒入预先标记的13 x 100 mm硼硅酸盐玻璃试管中。将 13 x 100 mm 的管子倾斜 30-45° 角，以便于倾析。
注意：如果处理超过12个样品，请勿让离心管长时间静置，因为执行步骤4.10时，颗粒会软化并且不溶性碎屑会转移。为避免这种情况，一次只能从离心机中取出 12 个试管，然后继续离心其他试管，直到您准备好倾析它们。 - 将管子转移到能够容纳 13 x 100 mm 管的真空浓缩器中。用最初的1小时加热步骤（40°C）蒸发所有溶剂，并在最大真空下运行。
- 从真空浓缩器中取出试管，向每个试管中加入 500 μL LC-MS 级甲醇（使用瓶顶分配器）。
- 通过涡旋5-10秒重悬干燥的脂质提取物，然后将管以45°角浸入超声波水浴中2分钟，同时旋转管。重新涡旋5秒，再浸入超声波水浴中一分钟。
注意：这是确保提取脂质的最大回收率的关键步骤。在管壁上的所有干燥材料重新悬浮之前，不要继续前进。 - 将13 x 100mm管置于预冷（4°C）离心机中，并通过在4°C下以4，000-5，000× g 离心20-30分钟除去任何不溶性碎片。
- 小心地将澄清的上清液倒入预先标记的自动进样器小瓶中。将自动注射器小瓶倾斜 30-45° 角将有助于倾析。确保将 13 x 100 mm 管的全部内容物倒入自动加载器小瓶中。
- 盖紧试管并将试管储存在-80°C，直到通过LC-ESI-MS / MS进行分析。
5. LC-ESI-MS/MS 分析
注意：以下程序使用二进制泵系统与自动注射器、脱气器和以三重四极杆模式运行的 LC-MS/MS 系统耦合。使用柱温箱保持柱温。有关所用设备的详细信息，请参阅 材料表 。
- 制备流动相A1（CH 3 OH：H2O：HCOOH，58：41：1，v：v：v，含5 mM甲酸铵）和流动相B1（CH3OH：HCOOH，99：1，v：v，含5 mM甲酸铵）。仅使用LC-MS级溶剂、水和试剂。
- 对于每组样品，准备四个含有 500 μL LC-MS 级甲醇的空白自动进样器小瓶。
- 对于每组样品，通过在500 μLLC-MS级甲醇中稀释10 μL（每个标准品总共250 pmol）在步骤1.11中制备的内标溶液，制备两个内标（标记为IS）自动进样器小瓶。
- 将柱温炉温度设置为60°C，离子源温度设置为500°C。
- 对于MS / MS分析，请使用光谱仪的三重四极杆模式。设置第一个四极杆 （Q1） 以传递母离子，同时将第三个四极杆 （Q3） 设置为传递分子独特的产物离子（或在 Q1 或 Q3 中扫描多个 m/z），使用 N2 碰撞诱导四极杆 2 （Q2） 中的解离，该解离与 Q1 偏移 30-120 eV。
- 将多反应监测对 （MRM） 检测窗口设置为 120 秒，目标扫描时间为 1.0 秒。有关MRM对、电离能和碰撞能的列表，请参阅 表1 。
- 使用以下参数在液相色谱步骤中分离鞘脂：使用0.7 mL/min的流速，用95%流动相A1和5%流动相B1的溶剂混合物平衡2.1（内径）x 50 mm C18反相柱0.5分钟。
- 进样后，将流动相A1/B1比值保持在95/52.25分钟，然后在1.5分钟内线性梯度至100%B1，然后在100%B1下保持5.5分钟，然后梯度0.5分钟返回95/5 A1/B1。
- 运行后，用95/5 A1 / B1的混合物重新平衡色谱柱0.5分钟。
- 对样品自动进样器使用以下设置：冲洗体积，500 μL;针行程，52毫米（应根据每个小瓶中的小瓶尺寸和体积进行调整）;冲洗速度，35 μL/s;采样速度，5.0 μL/s;漂洗浸渍时间，2秒;冲洗模式，抽吸前后;冲洗时间，2秒。
- 将步骤4.15中制备的样品按以下顺序放在自动加载器托盘上：空白;是;空白;步骤4.15制备的样品;空白，IS，空白。
- 通过LC-ESI-MS/MS分析每个样品的5-10 μL.分析数据集中所有样品的相同体积。
6. 数据处理、集成和规范化
注意：虽然以下步骤概述了特定软件的程序（参见 材料表），但等效LC-MS仪器和软件上的类似程序可用于整合所分析脂质类别和相应内标的MRM对。
- 打开定量软件。在 “定量 ”选项卡中，双击“ 定量向导”。在弹出窗口中最左侧的工作区中，导航到正确的数据集，然后单击鼠标左键。可用示例将显示在中间工作区中。
- 突出显示要分析的样本，然后单击右侧箭头将样本添加到 “所选样本 ”工作区。单击“ 下一步 ”导航到通常使用默认设置的设置和查询屏幕。
- 点击 下一步 导航到集成方法选择屏幕。选择包含MRM过渡对的适当积分方法，用于分析脂质。有关 MRM 转换对，请参阅 表 1 。点击 完成。
注意：保留时间因仪器和个别设置而异，因此必须针对每个单独的设置进行验证。 - 在导航栏中，单击 “峰值查看 ”窗格，以便可以检查 MRM 对。为便于查看，请右键单击 “峰值查看 ”窗格，将自动 缩放 更改为 最大峰值的 100%，缩放 窗口 为 1.00 - 2.00 分钟。
- 右键单击“ 定量显示 ”窗口，然后选择分析 物 和所需的鞘脂进行检查。验证空白样品中没有峰，并且IS样品中是否积分了正确的峰。
- 开始整合未知样本。一次处理一个鞘脂等级，检查内标MRM对的保留时间（即C12：0神经酰胺），并确保软件已积分正确的峰。
- 继续使用相同脂质类别（即 C14：0神经酰胺、C16：0-神经酰胺等），从同类中链长最短的脂质开始。验证每个链长脂质的软件例程是否积分了正确的MRM对峰。
- 整合所有分析物后，为分析的每种鞘脂种类（例如神经酰胺、鞘磷脂等）创建一个电子电子表格。标记列标题，以匹配LC-MS/MS定量软件中分析物的顺序和链长。还包括步骤 3.9 中确定的样品 ID 和样品归一化权重的列标题。
注意：如前所述11，其它常见的归一化措施包括总脂质磷酸盐含量或蛋白质量。 - 将所有分析物和内标的峰面积导出或复制到电子电子表格中。
- 通过将给定鞘脂类别的每个链长物种的积分峰面积除以其相应内标的峰面积来归一化数据。例如，C14：0神经酰胺， C16：0神经酰胺、C18：1神经酰胺等，应各按C12：0除以神经酰胺内标峰面积。
- 通过将归一化峰面积（在步骤6.10中计算）乘以步骤4.3中添加到样品中的内标量（以皮摩尔为单位），将峰面积转换为回收的脂质摩尔数。在该协议中，该量为250 pmol。
- 为了获得每个样品中脂质的相对量，将每个脂质链长度的皮摩尔除以步骤3.9中确定的组织重量。这将给出每毫克组织的脂质皮摩尔单位。
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Representative Results
在该协议中，我们详细描述了一种从冷冻保存的人体组织中去除OCT的方法，并称量组织以进行LC-ESI-MS / MS分析。此程序所需的材料列在 材料表中。 图1 所示是一个典型实验的结果，其中洗涤10个人肺腺癌肿瘤和10个正常邻近组织以去除OCT，并通过LC-ESI-MS / MS进行分析。 重要的是，正如我们之前显示的11所示，与正常的相邻未受累组织相比，肺腺癌肿瘤中存在各种链长的神经酰胺（图1A）和单己糖神经酰胺（图1B）显着升高。
在评估OCT对第4节中概述的脂质提取步骤影响的对照实验中，将200mg小鼠肝脏（C57BL6;雄性;14-16周龄）重悬于2mL磷酸盐缓冲盐水中并匀浆直至精细研磨。然后用探针超声仪对所得的细肝悬浮液进行广泛的超声处理（三轮1分钟在冰上超声处理，在冰上休息1分钟，60%功率;微尖）。从该溶液中制备了六个300 μL肝匀浆重复。在三个重复中，加入 200 mg OCT（在生物储存库标本11 中发现的平均量），并向其他三个重复添加 200 μL 水。然后按照第4节中概述的步骤并行处理样品。重要的是，在单相Bligh-Dryer溶液离心后，含有OCT的样品是浑浊的，而含有水的对照样品是透明的（图2A）。即使在增加离心和广泛超声处理后，单相脂质提取溶液中的混浊仍然存在（未显示）。溶剂蒸发后，含有OCT的样品具有大颗粒（图2B），即使在剧烈涡旋和广泛的超声处理下也无法在甲醇中复溶。含有OCT的样品也显示出所有分析物种的内标信号损失较大（图3A-G）。我们之前还表明，含有OCT的样品对分析的许多鞘脂表现出信号丢失11。
通常，预计鞘脂标准品将按以下顺序依次洗脱，如图4所示：d17：1鞘氨醇，d17：1鞘氨醇-1-磷酸，C12：0乳糖神经酰胺， C12：0单己糖基神经酰胺， C12：0鞘磷脂和C12：0神经酰胺。对于这些鞘脂种类中的每一种，使用第 5 节和之前第 11 节中描述的梯度和仪器设置，链长每增加 2 碳，保留时间将发生大约 +0.15 分钟的偏移。例如，如图5所示，C14：0-神经酰胺（图5B）的洗脱时间比C12：0-神经酰胺（图5A）晚约+0.15分钟。脂肪酸中的双键通常会导致保留时间发生-0.15偏移，因此C16：0-神经酰胺（图5C）的保留时间与C18：1-神经酰胺（图5D）相似。然而，较长的链长脂质（即C24：0，C26：0）可能具有更大的保留时间偏移（分别为图5I，K）。
图 1：肺腺癌和邻近未受累肺组织的鞘脂谱。 将组织低温储存在OCT中，解冻，用三个sOCTrP循环处理，称重，并通过LC-ESI-MS / MS进行分析。指示的酰基链长种类为神经酰胺 （A）、单己糖神经酰胺 （B）、鞘磷脂 （C）、乳糖神经酰胺 （D） 和鞘氨醇 （E;Sph），鞘氨醇-1-磷酸酯（F;对S1P）、二氢-Sph（E）和二氢-S1P（F）进行了定量。n = 10 个肿瘤和 n = 10 个相邻的未受累组织。箱形图显示最小到最大 ns 的中位数（黑线）和晶须，不显著;， p≤0.005;，p ≤ 0.0005。 请点击此处查看此图的大图。
图2：有和没有OCT的提取样品的代表性图像。 将小鼠肝脏均质化并超声处理，分成六个相同的样品：向三个样品中加入200mgOCT，向其他三个样品中加入水。（A）加入甲醇和氯仿达到2∶1∶0.1甲醇：氯仿：水（v：v：v）的比例，在48°C孵育过夜，然后离心，含OCT的样品上清液浑浊，超声、涡旋或离心法无法澄清。（B）溶剂蒸发后，从含有OCT的样品中回收大颗粒，经过大量超声处理和涡旋处理后，该样品无法完全复溶于0.5 mL甲醇中。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：存在或不存在 OCT 的情况下鞘脂标准品的 LC-ESI-MS/MS 定量。 将小鼠肝脏均质化，超声处理并分成六个相同的样品。六个样品中的三个添加了200毫克OCT，而另外三个样品则添加了水。加入内标、甲醇和氯仿后，对样品进行相同处理，并通过LC-ESI-MS/MS分析提取的脂质，图中显示了所示脂质（A-F）的多个反应监测（MRM）对和相应的积分峰面积（G）。缩写：Sph，鞘氨醇;S1P，鞘氨醇-1-磷酸。黑色箭头指向指示的鞘脂的正确 MRM 对。请点击此处查看此图的大图。
图 4：LC-ESI-MS/MS 鞘脂标准品多反应监测对的相对保留时间。 小鼠肝脏均质化和超声处理;添加内标、甲醇和氯仿;以及通过LC-ESI-MS/MS提取和分析的脂质，图中显示了指示脂质（A-F）的多个反应监测对的保留时间。注意脂质在液相色谱梯度中洗脱的相对顺序。缩写：Sph，鞘氨醇;S1P，鞘氨醇-1-磷酸;SM，鞘磷脂。X 轴是 MRM 对保留时间（以分钟为单位）。Y 轴是 MRM 对的信号强度。请点击此处查看此图的大图。
图 5：LC-ESI-MS/MS MRM 对保留时间的酰基链长依赖性偏移。 小鼠肝脏均质化和超声处理;添加内标、甲醇和氯仿;以及通过LC-ESI-MS/MS提取和分析的脂质，图中显示了所示脂质的保留时间和MRM对。请注意，随着各种脂质（A-K）酰基链长度的增加，保留时间的变化，这通常对应于每增加2个碳+0.15分钟的保留时间。双键将导致-0.15分钟的保留时间偏移（D，H，J）。然而，对于较长的链脂质，保留时间的相对增加可能更长（G-K）。X 轴是 MRM 对保留时间（以分钟为单位）。Y 轴是 MRM 对的信号强度。请点击此处查看此图的大图。
表 1：用于 LC-ESI-MS/MS 分析的 MRM 对、电离参数和碰撞能。DP，去集群潜力;CE，碰撞能量。请按此下载此表格。
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Discussion
OCT是一种常见的长期冷冻保存剂，用于生物储存库。然而，当通过各种质谱平台12、13、14、15分析组织时，OCT会导致离子抑制，或者当通过LC-ESI-MS/MS11分析样品时，会导致信号丢失。冷冻保存组织中的OCT也会干扰组织标准化方法，例如称量和蛋白质定量测定，例如Bradford和BCA11。在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从人体组织中去除OCT，然后通过质谱分析。该方案可以修改为使用非肺的其他组织来源，或来自小鼠组织，如我们之前描述的11。此外，可以使用其他质谱数据归一化策略，包括我们之前描述的11，以及其他经过验证的方法。
该方案的一个重要限制是，它不足以分析先前用甲醛或其他固定剂固定的组织。它仅适用于未固定且已在OCT中冷冻保存的组织。此外，该方法不适用于处理重量小于1-2mg的组织，因为在sOCTrP步骤和管之间的转移过程中总是存在一些组织损失。使用标准分析秤很难称量如此小的组织，并且在芯吸阶段未去除的任何剩余PBS都会大大增加实验误差。以下是使用此方法清洗纸巾以去除OCT时的其他重要注意事项。
为确保该方案的顺利执行，特别是如果要处理许多样品，应提前执行第 1 节中概述的步骤，包括预标记和预称量 1.5 mL 管、预标记 13 x 100 mm 螺旋盖管和盖子、13 x 100 mm 培养管和自动进样器小瓶， 准备所有吸芯， 预缩短 1 mL 移液器吸头， 和预冷洗涤溶液。这将防止在清洗纸巾的当天必须执行耗时的程序，这可能导致延误。一般来说，我们发现，如果在前一天执行其中许多步骤，经验丰富的研究人员可以在正常工作日清洗 30-40 个标本。然而，由于第一个建议的停止点是在所有组织都经过洗涤、称重并置于甲醇中并储存在-80°C之后，因此不提前进行1.5 mL预称量和标记将影响效率并延长洗涤30-40张组织所需的时间。
组织称量是最重要的步骤之一，因为错误或粗心会影响数据质量，因为它们将延续到数据标准化中。校准、正确归零和去皮用于称量的分析天平至关重要。因此，当使用灯芯时，尽可能多地去除洗涤溶液很重要，特别是对于重量小于5mg的组织。在这些纸巾重量下，剩余的洗涤液会使称量不准确很大百分比，并作为数据归一化中的错误结转。当去除洗涤溶液时，我们发现可以用灯芯轻轻接触组织几秒钟，以去除尽可能多的洗涤溶液，而不会因粘附在吸芯上而导致组织显着损失。然而，应测试每种被洗涤的组织类型对灯芯的粘附性，并相应地调整方案中的这些步骤。
为了促进组织清洗工作流程，建议从生物储存库中请求15 mL聚丙烯管中的组织屑。这将减少洗涤前对纸巾的处理。
洗涤组织时，如果在第三个sOCTrP循环后在管底部观察到凝胶状材料，则表明并非所有OCT都已被去除，需要更多的sOCTrP循环。跟踪需要多少个循环，为了保持一致性，在数据集中的所有标本中执行相同数量的sOCTrP循环。我们之前已经评估了多达9个sOCTrP循环，发现对组织中鞘脂的消耗没有影响11。
使用灯芯去除洗涤液时，轻轻轻拍纸巾将确保去除所有洗涤液。这提高了组织重量估计的准确性。但是，必须非常小心非常小的组织，因为这些组织会粘在灯芯上并导致标本丢失。对同一管使用多个吸芯以去除尽可能多的溶液是有帮助的。为防止交叉样品污染，请始终为每个样品使用新的干净吸芯。制作灯芯时，请使用实验室级组织（见 材料表），因为我们之前测试过这些组织，发现含有可忽略不计的污染鞘脂11。如果按照描述11进行测试，则可以使用其他材料的灯芯。
称量后从 1.5 mL 管中取出标本时，回收所有组织至关重要。否则将导致数据规范化错误。如果需要更多的PBS来回收所有组织，请将等量的PBS添加到所有其他试管中，以避免含有不同量PBS的样品可能导致提取效率的差异。调整氯仿和甲醇体积以考虑水量的任何增加，以保持 2：1：0.1 甲醇：氯仿：水的比例。
解冻标本时，重要的是在冰上进行此步骤，以避免不稳定脂质（如鞘氨醇-1-磷酸）的降解。完全解冻样品直到OCT处于液态也将有助于其去除，因为它更容易溶解在冷洗溶液中，而不是在早期洗涤步骤中保留为沉淀。
偶尔，特别是在洗涤肺组织时，会有碎片不会沉淀，并且在离心后会漂浮在洗涤液的顶部。小心地将吸液尖端浸入浮动组织下方以去除洗涤液可以防止抽吸过程中的损失。
在均质化之前，请勿向样品中添加氯仿，因为一次性均质机吸头由塑料制成，会溶解在含有氯仿的溶液中。这会显著影响样品中脂质的LC-MS/MS定量。因此，一般来说，在分配氯仿和甲醇时应避免使用不耐溶剂的塑料。这些溶剂也是有毒的，应在适当的通风橱中处理。处理甲醇和氯仿等溶剂时，请穿戴适当的个人防护用品。
人体组织应在适当的生物安全柜（例如II类）中处理。用户应接受处理人类来源的生物危害材料和液体的培训，并遵循安全规程，例如穿戴适当的个人防护设备，并对与标本接触的任何表面或设备进行净化。用户应彻底消毒（建议的去污剂见 材料表 ）清洗过程中使用的任何表面或设备（离心机、离心机载体和适配器、移液器、涡流器、通风柜表面、天平、玻璃器皿、冰盘、电脑键盘、电脑鼠标等）。实验室成员在彻底消毒之前不应使用用于纸巾清洗的设备或头罩。避免在钢表面和电子设备上使用漂白剂。
处理许多样品时，在脂质提取步骤的重新加盖步骤中使用干净的盖子时，请小心防止交叉污染。如果盖子贴有标签，也可以重复使用。然而，在实践中，我们发现标记物在黑色盖子上很不突出，并且在过夜48°C孵育期间不干胶标签从试管上脱落。
鞘脂在疾病和人类癌症的病因学中被证明是重要的参与者。因此，人们对精确定义这些疾病的鞘脂代谢改变非常感兴趣，因为它们可能揭示治疗靶点。然而，研究人员容易获得的许多组织在OCT中被冷冻保存，这与质谱分析不兼容。因此，这里描述的详细方案将扩展足以进行定量鞘脂组学分析的组织库，从而有助于增加我们对人类疾病和癌症中脂质代谢改变生物学的理解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究项目的服务和支持由VCU Massey癌症中心组织和数据采集和分析核心以及VCU脂质组学和代谢组学核心提供，部分资金来自NIH-NCI癌症中心支持拨款P30CA016059。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R21CA232234（圣地亚哥利马）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
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