Summary
Анализ изменений сократительной функции и клеточной целостности кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, имеет огромное значение для разработки доклинических препаратов. Гибридная система анализа клеток с 96 лунками рассматривает оба параметра в режиме реального времени и физиологическим образом для получения надежных, релевантных человеку результатов, необходимых для безопасного перехода к клиническим стадиям.
Abstract
Оценка сократимости сердца имеет огромное значение для разработки новых терапевтических средств и их безопасного перехода в клинические стадии. В то время как индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), обещают служить в качестве актуальной для человека модели на доклинических этапах открытия лекарств и фармакологии безопасности, их зрелость все еще спорна в научном сообществе и находится в постоянном развитии. Мы представляем гибридную технологию сократимости и импеданса/внеклеточного потенциала поля (EFP), добавляя значительные функции про-созревания к стандартной платформе с 96 скважинами.
Система impedance/EFP контролирует функциональность сотовой связи в режиме реального времени. Помимо скорости биения сократительных клеток, показания электрической импедансной спектроскопии обнаруживают морфологические изменения, индуцированные соединениями, такие как плотность клеток и целостность клеточного монослоя. В другом компоненте гибридной системы анализа клеток клетки культивируются на биосоответствующих мембранах, которые имитируют механическую среду реальной сердечной ткани. Эта физиологическая среда поддерживает созревание hiPSC-CMs in vitro, что приводит к более взрослым сократительным реакциям, включая положительные инотропные эффекты после лечения изопротеренолом, S-Bay K8644 или омекамтивом мекарбилом. Такие параметры, как амплитуда силы сжатия (мН/мм2) и продолжительность биения, также выявляют последующие эффекты соединений с влиянием на электрофизиологические свойства и обработку кальция.
Гибридная система обеспечивает идеальный инструмент для целостного клеточного анализа, позволяя доклинической оценке сердечного риска выходить за рамки текущих перспектив клеточных анализов, связанных с человеком.
Introduction
Одной из основных целей разработки современных лекарств является улучшение показателей успеха новых терапевтических средств в процессе открытия лекарств. Фармакологическое тестирование безопасности этих новых препаратов часто выявляет побочные реакции на сердечно-сосудистую систему, на которые приходится почти четверть коэффициента истощения препарата на доклинических стадиях1. Разработка и интеграция методологий нового подхода (NAM) играют ключевую роль в модернизации доклинической оценки, в частности основных аккумуляторных органов, таких как сердце. Поскольку эти методологии являются подходами, свободными от животных, использование моделей клеток на основе человека, таких как кардиомиоциты (КМ) индуцированного происхождения плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), стало рабочей лошадкой за последнее десятилетие для современной оценки фармакологических и токсикологических проблем безопасности2. Широко используемыми системами анализа для таких исследований являются микроэлектродная решетка (MEA) и чувствительные к напряжению экспериментальные подходы на основе красителей3.
Тем не менее, заявленная фенотипическая и функциональная незрелость этого типа клеток ставит препятствия на пути идеальной модели клеток на основе человека, с потенциалом для уменьшения трансляционных разрывов между неклиническими и клиническими исследованиями4.
На протяжении многих лет были проведены огромные исследования, чтобы понять причину подразумеваемого незрелого фенотипа и найти способы подтолкнуть процесс созревания человеческих iPSC-CMs in vitro.
Было показано, что отсутствие сигналов созревания сердца, таких как длительное время культивирования клеток, отсутствие других типов клеток поблизости или отсутствие гормональной стимуляции, влияет на процесс созревания5. Кроме того, нефизиологическая среда обычных пластин клеточных культур была идентифицирована как существенная причина, препятствующая созреванию человеческих iPSC-CM, из-за отсутствующей физиологической жесткости субстрата нативного сердца человека 5,6.
Для решения этой проблемы были разработаны различные системы анализа с акцентом на нативные физиологические условия, в том числе системы 3D-культур клеток, где клетки выровнены трехмерно, чтобы напоминать нативную сердечную архитектуру вместо типичных двумерных клеточных культур7. Хотя улучшенное созревание достигается с помощью 3D-анализов, потребность в квалифицированной рабочей силе и низкая пропускная способность этих систем препятствуют обильному использованию этого в процессе разработки лекарств, поскольку время и стоимость играют фундаментальную роль в оценке новых терапевтических средств на финансовом уровне8.
Важными показаниями для фармакологической и токсикологической оценки безопасности новых терапевтических средств являются изменения функциональных и структурных характеристик iPSC-КМ человека, поскольку индуцированные соединениями побочные реакции сердечно-сосудистой системы на лекарства обычно влияют на одно или оба из этих свойств 1,9. Известными примерами таких широких побочных реакций являются противораковые препараты семейства антрациклиновых. Здесь об опасных функциональных и неблагоприятных структурных воздействиях на сердечно-сосудистую систему широко сообщается во время и после лечения рака у пациентов, а также с помощью клеточных анализов in vitro 10,11.
В настоящем исследовании мы описываем комплексную методологию оценки как функциональных, так и структурных побочных эффектов соединений на hiPSC-CMs. Методология включает в себя анализ кардиомиоцитарной сократительной силы и импеданса/внеклеточного потенциала поля (EFP). Сократительная сила измеряется в физиологических механических условиях, при этом клетки культивируются на мягких (33 кПа) силиконовых субстратах, отражающих механическую среду нативной сердечной ткани человека.
Система оснащена 96-луночными пластинами для высокопроизводительного анализа iPSC-CMs человека для доклинических фармакологических и токсикологических исследований сердечной безопасности и, таким образом, обеспечивает преимущество для используемых в настоящее время 3D-подходов, таких как сердце Лангендорфа или сердечные срезы12,13.
В деталях гибридная система состоит из двух модулей, либо для оценки сократимости сердца в физиологических условиях, либо для анализа клеточной структурной токсичности в реальном времени 6,14. Оба модуля работают со специализированными высокопроизводительными 96-скважинными пластинами для быстрого и экономичного сбора данных.
Без необходимости в 3D-конструкции модуль сократимости использует специальные пластины, которые содержат гибкие силиконовые мембраны в качестве подложки для клеток вместо жесткого стекла или пластика, из которого обычно состоят обычные пластины клеточной культуры. Мембраны отражают типичные биомеханические свойства сердца человека и, следовательно, имитируют условия in vivo с высокой пропускной способностью. В то время как человеческие iPSC-CM часто не демонстрируют поведение взрослых кардиомиоцитов в отношении положительной инотропии, вызванной соединениями, в других клеточных анализах14, более взрослая реакция может быть оценена, когда клетки культивируются на пластинах модуля сократимости. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что iPSC-CMs проявляют положительные инотропные эффекты при обработке такими соединениями, как изопротеренол, S-Bay K8644 или омекамтивmecarbil 6,15. Здесь можно оценить несколько параметров сократимости, таких как первичные параметры, такие как амплитуда силы сжатия (мН/мм2), длительность биения и скорость биения, а также вторичные параметры цикла сжатия, такие как площадь под кривой, склоны сжатия и релаксации, вариации скорости биения и аритмии (дополнительный рисунок 1)16 . Медикаментозные изменения во всех параметрах оцениваются неинвазивно с помощью емкостного измерения расстояния. Необработанные данные впоследствии анализируются специализированным программным обеспечением.
Модуль структурной токсичности добавляет свои уникальные параметры импеданса и EFP в качестве показаний для структурной клеточной токсичности и анализа электрофизиологических свойств17,18. Технология электрической импедансной спектроскопии выявляет индуцированные соединениями изменения плотности клеток или целостности клеток и монослоев, контролируемые в режиме реального времени, как показано на человеческих iPSC-CM, обработанных известными кардиотоксическими соединениями13. При показаниях импеданса на разных частотах (1-100 кГц) можно дополнительно препарировать физиологический ответ, и, таким образом, достижимо выявление изменений в топографии мембраны, клеточно-клеточных или клеточно-матричных переходах. Дополнительная регистрация EFP человеческих iPSC-CMs дополнительно позволяет анализировать электрофизиологические эффекты, вызванные сложным лечением, как было показано в свете исследования CiPA17,19.
В настоящем исследовании использовались человеческие iPSC-CMs, получавшие эпирубицин и доксорубицин, которые хорошо описаны как кардиотоксические антрациклины, и эрлотиниб, ингибитор тирозинкиназы (TKI) с довольно низким риском сердечно-сосудистой токсичности. Хроническая оценка с применением эпирубицина, доксорубицина и эрлотиниба проводилась в течение 5 дней. Результат показывает незначительные изменения в сократимости и импедансе основания при обработке клеток эрлотинибом, но временное и дозозависимое токсическое снижение амплитуды сокращения и импеданса основания при лечении эпирубицином и доксорубицином соответственно. Острые измерения были выполнены с помощью блокатора кальциевых каналов нифедипина и показали снижение амплитуды сокращения, длительности потенциала поля и импеданса основания, демонстрируя кардиотоксические побочные эффекты этого соединения как на функциональном, так и на структурном уровнях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс измерения сократимости и импеданса/EFP приведен на дополнительном рисунке 2.
1. Покрытие пластин
- Откройте вакуумную упаковку и выньте пластину с 96 лунками. Процедуры обработки 96-луночных плит обоих модулей одинаковы. Оставьте сжимающую пластину закрытой дополнительно поставляемой мембранной защитой до измерения в модуле сократимости.
- Покрыть гибкие 96-луночные пластины для посева кардиомиоцитов.
- Приготовьте разбавленный раствор геля EHS, перенеся 2,75 мл готового к использованию раствора геля EHS в стерильную центрифужную трубку. Затем добавьте 8,25 мл DPBS с Ca2+ и Mg2+. Тщательно перемешайте раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно фибронектин также может быть использован для покрытия скважин: приготовить 13 мл раствора фибронектина в стерильной центрифужной трубке путем разбавления 650 мкл раствора фибронектина (1 мкг/мл) в 13 мл DPBS с Ca2+ и Mg2+, в результате чего получается рабочий раствор 50 мкг/мл. Тщательно перемешайте раствор.
- Приготовьте разбавленный раствор геля EHS, перенеся 2,75 мл готового к использованию раствора геля EHS в стерильную центрифужную трубку. Затем добавьте 8,25 мл DPBS с Ca2+ и Mg2+. Тщательно перемешайте раствор.
- Перенесите раствор покрытия в резервуар для стерильных реагентов, размещенный в роботе автоматизации лаборатории.
- Добавьте 100 мкл раствора покрытия на скважину с помощью робота автоматизации лаборатории с помощью программы «ADD100μL». Поместите крышку обратно на 96-луночную пластину и инкубируйте в течение 3 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа для робота автоматизации лаборатории должна быть предварительно настроена вручную заранее.
2. Посев кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в гибкие 96-луночные пластины (День 0)
- Разморозьте ячейки в соответствии с рекомендациями производителя.
- Подсчитайте ячейки с помощью ручной счетной камеры и отрегулируйте ячейки в рекомендуемой гальванической среде в соответствии с инструкциями производителя ячейки (например, 1 x 105 ячеек / лунка), в результате чего получится 11 x 106 ячеек / 11 мл для посева всей 96-луночной пластины.
- Удалите раствор геля EHS из скважин с помощью робота автоматизации лаборатории с помощью программы «REMOVE100μL». Извлеките из робота резервуар реагента, содержащий дозированный раствор покрытия.
- Переместите клеточную суспензию (всего 11 мл) в резервуар стерильных реагентов, помещенный в робот автоматизации лаборатории, и засейте клетки 100 мкл/лунку с помощью программы «CELLS_ADD100 мкл».
- Сразу после посева клеток перенесите гибкую 96-луночную пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2, с контролируемой влажностью) и дайте клеткам осесть на ночь.
3. Средний обмен гибких 96-луночных плит (День 1)
- Нагрейте не менее 22 мл поддерживающей среды кардиомиоцитов на пластину до 37 °C в центрифужной трубке объемом 50 мл через 18-24 ч после посева пластин.
- Переложите свежую среду (не менее 22 мл) в резервуар стерильных реагентов и оставьте рядом с роботом автоматизации лаборатории. Поместите пустой резервуар реагента в робот и выполните удаление среды с помощью программы «REMOVE100μL». После этого замените резервуар реагента, содержащий среду отходов, на резервуар реагента, содержащий свежую среду, и дозируйте 200 мкл свежей среды на скважину с помощью программы «ADD100μL». Выполните этот шаг дважды, чтобы достичь 200 мкл/лунка.
- Сразу после обмена средой перенесите пластину обратно в инкубатор.
- Проводят средний обмен (200 мкл/лунка) через день до добавления соединения.
4. Окончательный обмен среды перед добавлением соединения (День 5-7)
- Выполните окончательную смену среды за 4-6 ч до добавления соединения.
- Нагрейте не менее 22 мл пробного буфера для одной гибкой 96-луночной пластины. Буфер анализа состоит из поддерживающей среды или ее производных (например, среды с низким содержанием/отсутствием сыворотки, фенольной красной свободной среды или других изотонических буферов).
- Переместите свежую среду в резервуар стерильных реагентов и оставьте ее рядом с роботом автоматизации лаборатории. Поместите пустой резервуар реагента в робот и выполните удаление среды. После этого замените резервуар реагента, содержащий среду отходов, на резервуар реагента, содержащий свежую среду, и дозируйте 200 мкл/лунку свежей среды.
- Сразу после обмена среды перенесите гибкую пластину обратно в инкубатор.
5. Сложение соединений и запись данных (День 5-7)
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример плана измерений для эксперимента приведен в дополнительном рисунке 3.
- Приготовьте рабочий раствор на соединение в концентрации 4x в ламинарной проточной вытяжке с использованием стерильной обычной плиты скважины глубиной 96. Раствор соединения основан на буфере анализа, используемом на этапе 4. Перенесите пластину скважины глубиной 96, содержащую раствор соединения, в течение, по меньшей мере, 1 ч, в инкубатор, чтобы отрегулировать ее до того же состояния, что и гибкая пластина.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1-кратная концентрация каждого препарата, используемого для каждого эксперимента, приведена в цифрах и легендах. - Перенесите пластину на соответствующее измерительное устройство за 1 ч до выполнения базового измерения.
- Откройте Edit Protocol в управляющем программном обеспечении (часть гибридной системы анализа ячеек) и выберите соответствующий режим измерения сократимости или импеданса/EFP.
- Определите продолжительность развертки (длина одного измерения; например, 30 с) и интервал повторения (время между измерениями; например, 5 мин) и сохраните номер протокола.
- Выберите Запустить протокол > Продолжить и заполните запрашиваемые поля.
- Наконец, выберите Начать измерение. Выполните как минимум три базовых измерения (развертки) с интервалом в 5 минут незадолго до добавления соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры исходных данных измерения сократимости с использованием модуля сократимости до добавления соединений показаны на дополнительном рисунке 4. - Извлеките 50 мкл пробирного буфера из каждой скважины, не снимая гибкую 96-луночную пластину с измерительного прибора.
- Добавьте 50 мкл 4x концентрированного раствора соединения в каждую лунку пластины, согласно плану измерения.
- Выберите Добавить маркер области и определите расположение составной пластины и объем раствора соединения после добавления соединения.
- Наконец, выберите Продолжить стандартное измерение или Продолжить с сериями измерений в соответствии с экспериментальным планом.
6. Анализ данных
- С помощью записывающего программного обеспечения измеряют развертки, длина и интервал повторения которых определяются пользователем.
- С помощью аналитического программного обеспечения фиксируйте форму сигнала, автоматически считывая такие параметры, как амплитуда, частота биения, ширина импульса и т. Д.
ПРИМЕЧАНИЕ: Усредненный сигнал, включающий стандартное отклонение, так называемый средний удар, автоматически вычисляется на основе данных одной развертки. Пользователь может определить параметры сократимости/IMP/EFP, которые программное обеспечение вычисляет и отображает. - С помощью аналитического программного обеспечения рассчитайте кривую доза-реакция и IC50/EC50 для каждого соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные и результаты анализа, полученные с помощью аналитического программного обеспечения, могут быть легко экспортированы в различные форматы. Наконец, отчеты о данных автоматически генерируются для обобщения и архивирования результатов экспериментов. Подробное описание того, что и как измеряется сигнал EFP, обсуждается в 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние ингибитора киназы эрлотиниба на сократимость hiPSC-CMs показано на рисунке 1. Клетки обрабатывали концентрациями в диапазоне от 10 нМ до 10 мкМ в течение 5 дней и ежедневно регистрировали параметры биения. Эрлотиниб, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) и ингибитор тирозинкиназы со сравнительно низким риском кардиотоксичности, оказывал незначительную дозу и зависящее от времени влияние на hiPSC-CMs только при концентрациях в микромолярном диапазоне. При самой низкой концентрации (10 нМ) эрлотиниб индуцировал статистически незначимое снижение амплитуды при первом измерении после применения соединения (1 ч). Во всех последующих измерениях не было измерено сопоставимого эффекта при этой концентрации. Переходное уменьшение может быть результатом составного эффекта, но также результатом переходного искажения паттерна биения во время процедуры добавления соединения, например, тепловой или механической природы. Микромолярные концентрации эрлотиниба показали незначительные, но значительные временные и дозозависимые кардиотоксические эффекты. Начало эффекта наблюдалось через 96 ч при приеме 1 мкМ эрлотиниба, в то время как 10 мкМ приводило к значительному снижению только через 24 ч после добавления соединения.
Химиотерапевтический агент эпирубицин оказывал как временное, так и дозозависимое действие на hiPSC-CM (рисунок 2). Клетки перестали биться в течение 24 ч после применения 10 мкМ эпирубицина. При 1 мкМ резкое снижение амплитуды до 44% ± 2% контроля через 24 ч сопровождалось полным прекращением биения до 48 ч после добавления соединения. При 100 нМ наблюдалось зависящее от времени снижение амплитуды биения в течение 5 дней с остаточной амплитудой 25% ± 3% на 5-й день. При самой низкой концентрации 10 нМ эффект эпирубицина был только дозозависимым, но не зависящим от времени, начиная с первого измерения (через 1 ч после добавления соединения). Амплитуда неуклонно колебалась между 60%-80% контроля в течение 5 дней. Отклонения в этой группе были больше по сравнению с более высокими концентрациями. Одной из возможных причин может быть тот факт, что эта концентрация оказала измеримое влияние только на часть скважин.
Доксорубицин является еще одним антрациклиновым классом лекарств, и жизнеспособность клеток hiPSC-CMs была исследована путем мониторинга базового импеданса с течением времени. На рисунке 3 показано, что 24-часовое воздействие 300, 1, 3 и 10 мкМ доксорубицина снижает жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и времени.
Нифедпиние является блокатором кальциевых каналов дигидропиридина, который в первую очередь блокирует кальциевые каналы L-типа. Долгосрочный мониторинг жизнеспособности клеток в течение 24 ч выявляет зависящее от времени и концентрации снижение импеданса основания, которое используется в качестве меры токсичности (рисунок 4А). При применении повышенных концентраций нифедипина (3 нМ, 10 нМ, 30 нМ, 100 нМ) полевые записи потенциала на hiPSC-CM показывают ожидаемое в зависимости от концентрации сокращение нормированной длительности поля (FPD) (рис. 4B,C). Оценка нифедипина в отношении сократимости сердца также показала значительное снижение амплитуды в зависимости от концентрации при остром измерении с концентрациями 10 нМ и 30 нМ (рисунок 5).
Результаты, полученные с помощью гибридной системы анализа клеток, показывают, что три сердечные конечные точки (сократимость, структура и электрофизиология) hiPSC-CM могут быть оценены с использованием одной системы.
Рисунок 1: Оценка сократимости кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, получавших эрлотиниб в течение 5 дней. Ось X показывает время в часах, ось Y строит амплитуду параметров в процентах. Звездочки представляют статистическую значимость с p < 0,05 (*) или p < 0,01 (**) (тест Уилкоксона Манна Уитни, n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка сократимости кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, получавших кардиотоксический антрациклиновый эпирубицин в течение 5 дней. Ось X показывает время в часах, ось Y строит амплитуду параметров в процентах. Звездочки представляют статистическую значимость с p < 0,05 (*) или p < 0. 01 (**) (тест Уилкоксона Манна Уитни, n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Импеданс основания кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, после лечения доксорубицином. Временной ход импеданса основания кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в течение 24 ч воздействия 300, 1, 3 и 10 мкМ доксорубицина (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Записи импеданса и EFP кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. (A) Временной ход импеданса основания кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в течение 24 ч при воздействии 3, 10, 30 и 100 нМ нифедипина (n = 5). (B) Временной ход полевой потенциальной продолжительности кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в течение 1 ч при воздействии 3, 10, 30 и 100 нМ нифедипина (n = 5). (C) Расположение электрода пластины импеданса/EFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Оценка сократимости (модуль сократимости) кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, получавших нифедипин в течение 20 мин. Ось X показывает время в мин, амплитуда параметров по оси Y в процентах. Звездочки представляют статистическую значимость с p < 0. 05 (*) или p < 0,01 (**) (тест Уилкоксона Манна Уитни, n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Параметры сократимости и необработанные данные, оцениваемые с помощью модуля сократимости. (Слева) Параметры, оцениваемые с помощью модуля сократимости. Параметры: Амплитуда силы сжатия (мН/мм2), продолжительность биения, скорость восходящего и нисходящего хода, область восходящего и нисходящего хода под кривой (AUC), частота биения, изменения частоты ударов, аритмические события. (Справа) Записи необработанных данных о сократимости одной скважины с необработанной частотой биения кардиомиоцитов (А), (В) вариациями скорости биения, (В) ранними после сокращений и (D) аритмическими событиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Рабочий процесс для измерения сократимости и импеданса/EFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Пример макета плана измерений для плиты из 96 скважин. Изображены четыре соединения (выделенные красным, светло-зеленым, коричневым и темно-зеленым) с четырьмя концентрациями и четырьмя репликами. Положительные и отрицательные контрольные элементы (например, докультурные условия и ДМСО) выделены желтым цветом. Резервные ячейки выделены синим цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Пример данных измерения исходного уровня сократимости с использованием модуля сократимости до добавления соединения. На каждом графике показано среднее значение всех циклов сжатия одной развертки. Для визуализации скорости биения показаны два последовательных сокращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гибридная система импеданса/ЕФП/сократительной способности представляет собой комплексную методологию фармакологической и токсикологической оценки высокопроизводительной безопасности сердечных обязательств при разработке доклинических препаратов. Он обеспечивает современный подход к доклиническим испытаниям безопасности без использования животных моделей, но с более высокой пропускной способностью, что значительно сокращает время и затраты. Эта система может быть использована в качестве дополнительного подхода для сердца Лангендорфа и других животных моделей для доклинической функциональной и структурной оценки токсичности.
В качестве подхода, свободного от животных, человеческие iPSC-CM используются для гибридной системы20. Здесь специальные гибкие 96-луночные пластины с эффектом провозрастания на человеческие iPSC-CM обеспечивают важное преимущество по сравнению с другими клеточными анализами21,22, поскольку пропускная способность и физиологическая среда уникально сочетаются для более взрослой оценки сердечного риска человека 6,15.
Наиболее важным этапом в протоколе является применение соединения, особенно когда необходимо изучить острые эффекты. Поскольку клетки культивируются на мягких подложках, которые проводят механические силы, чрезмерное ускорение при обработке пластин и применение сил сдвига во время пипетки может привести к переходным (5-10 мин) изменениям параметров сжатия и их следует избегать. В целом, следует соблюдать осторожность во время замены среды, чтобы избежать нарушения мембран. Рекомендуется использовать оборудование для автоматизации лабораторий.
Перед проведением анализа соединений требуется предкультурный этап в 5-7 дней, чтобы человеческие iPSC-CMs, обычно приобретенные в крио-сохраненном состоянии, могли восстановиться после процедуры оттаивания и построить правильный синцитий. Для обоих модулей амплитуда сжатия, а также скорость биения дают представление об идеальной отправной точке измерения, которое обычно происходит между днями 5-7. Измерение исходных условий является критически важным шагом для определения функциональных базовых характеристик, используемых в качестве критериев включения для изученных hiPSC-CM3. Исходные значения должны быть зарегистрированы непосредственно перед обработкой соединения, чтобы изменения в поведении при сокращении можно было сравнить с состояниями, не связанными с лечением (дополнительный рисунок 3).
Учет изменчивости и определение базовых характеристик является ключом к успешным измерениям hiPSC-CM и интерпретации данных. По этой причине рекомендации Gintant et al. по передовой практике соблюдаются с использованием гибридной системы анализа клеток; например, исходный уровень должен быть зарегистрирован до добавления соединения, и базовая запись должна соответствовать определенным предварительным условиям3.
Хотя гибкие 96-луночные плиты оснащены хрупкими мембранами, предусмотренная защитная пластина в сочетании с осторожным обращением предотвратит повреждение. Мембраны предварительно обработаны, чтобы обеспечить стабильное прикрепление клеток к силиконовой подложке, которая имеет низкую внутреннюю биосовместимость. Лечение стабильно в течение не менее 6 месяцев. В то время как ячейки постоянно поддерживаются при 37 °C, механические свойства силиконовых материалов стабильны в широком диапазоне температур. Кроме того, ни лекарства, ни растворители не влияют на свойства силикона в концентрациях, используемых в клеточных анализах (например, концентрации ДМСО остаются ниже 0,1%).
Система была проверена и оптимизирована с широким спектром коммерчески доступных hiPSC-CM. При использовании клеток, изготовленных на заказ, рекомендуется тестирование стандартных белков внеклеточного матрикса (ECM) для оптимального прикрепления клеток (например, фибронектин, матрица EHS и поли-L-лизин 6,15).
Электрофизиология, передача сигналов кальция и сократимость являются тремя основными конечными точками сердца, которые рассматриваются в доклиническом развитии. Гибридная система в настоящее время ограничена анализом двух из этих сердечных конечных точек - сократимости и электрофизиологии. Передача сигналов кальция в кардиомиоцитах не может быть проанализирована напрямую, но обнаружена тангенциально через сократимость и электрофизиологические свойства.
Как импеданс/ЭФП, так и измерение силы сокращения выполняются с монослоями кардиомиоцитов. Несмотря на преимущество физиологической механической жесткости субстрата при измерении сокращения, клетки не испытывают трехмерной среды реальной ткани человека. С другой стороны, это позволяет использовать только часть дорогостоящих моделей клеток, полученных из стволовых клеток, со стандартным лабораторным оборудованием. Следовательно, это приложение обещает иметь благоприятное соотношение стоимости, надежности и предсказуемости по сравнению с in vivo / ex vivo или 3D-моделями. Будущие применения гибридной системы могут включать анализ других сократительных типов клеток, таких как гладкомышечные клетки. В регуляции сердечно-сосудистого гомеостаза эти клетки играют главную роль в качестве аналогов кардиомиоцитов. Гибридная система также предоставляет дополнения для конкретных проектов, таких как оптическая стимуляция человеческих iPSC-CM. Для этого к обоим модулям может быть применена специальная оптическая крышка для стимуляции человеческих iPSC-CM, которые были трансфектированы Channelrhodopsin-2 во времена прекультуры.
Таким образом, гибридная система импеданса/ЭФП/сократимости позволяет проводить современную доклиническую оценку безопасности и токсичности путем анализа трех различных конечных точек сердца (сократимость, структурные изменения и электрофизиология) в рамках одной методологии. Преимущество решения этих конечных точек с помощью модели сердечных клеток на основе человека на высоком уровне пропускной способности поднимает эту гибридную систему за пределы текущих перспектив доклинической оценки сердечного риска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go. и P.L. работают в innoVitro GmbH, производителе гибких пластин. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. и S.S. работают в Nanion Technologies GmbH, производителе гибридного устройства.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Федерального министерства экономики и климатических действий Германии (ZIM) и Федерального министерства образования и исследований Германии (KMUinnovativ). Мы благодарим FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, США) за любезное предоставление кардиомиоцитов и Ncardia B.V. (Лейден, Нидерланды) за любезное предоставление кардиомиоцитов, используемых в этом исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
