Analysen av endringer i kontraktil funksjon og cellulær integritet av humane iPSC-avledede kardiomyocytter er av enorm betydning for ikke-klinisk legemiddelutvikling. Et hybrid 96-brønns celleanalysesystem adresserer begge parametrene i sanntid og fysiologisk måte for pålitelige, menneskerelevante resultater, som er nødvendige for en sikker overgang til kliniske stadier.
Vurdering av hjertekontraktilitet er av enorm betydning for utviklingen av nye terapier og deres sikre overgang til kliniske stadier. Mens menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) holder løfte om å tjene som en menneskelig relevant modell i prekliniske faser av legemiddeloppdagelse og sikkerhetsfarmakologi, er deres modenhet fortsatt kontroversiell i det vitenskapelige samfunn og under konstant utvikling. Vi presenterer en EFP-teknologi (hybrid contractility and impedance/extracellular field potential), som tilfører betydelige pro-modningsfunksjoner til en industristandard 96-brønns plattform.
Impedans-/EFP-systemet overvåker cellulær funksjonalitet i sanntid. I tillegg til takthastigheten til kontraktile celler, oppdager de elektriske impedansspektroskopiavlesningene sammensatte morfologiske endringer som celletetthet og integritet av det cellulære monolaget. I den andre komponenten i hybridcelleanalysesystemet dyrkes cellene på biokompatible membraner som etterligner det mekaniske miljøet i ekte hjertevev. Dette fysiologiske miljøet støtter modningen av hiPSC-CMs in vitro, noe som fører til mer voksenlignende kontraktile responser, inkludert positive inotrope effekter etter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametere som amplituden av kontraksjonskraft (mN / mm2) og slagvarighet avslører også nedstrøms effekter av forbindelser med påvirkning på elektrofysiologiske egenskaper og kalsiumhåndtering.
Hybridsystemet gir det ideelle verktøyet for helhetlig celleanalyse, noe som muliggjør preklinisk hjerterisikovurdering utover dagens perspektiver for menneskerelevante cellebaserte analyser.
Et av de viktigste målene for moderne medisinutvikling er forbedringen av suksessraten fra benk til seng for nye terapier i legemiddeloppdagelsesrørledningen. Sikkerhetsfarmakologisk testing av disse nye legemidlene avslører ofte bivirkninger på kardiovaskulærsystemet som står for nesten en fjerdedel av medikamentutmattelsesraten i prekliniske stadier1. Utvikling og integrering av nye tilnærmingsmetoder (NAMs) spiller en nøkkelrolle i moderniseringen av preklinisk vurdering, spesielt kjernebatteriorganer som hjertet. Siden disse metodene er dyrefrie tilnærminger, ble bruken av menneskebaserte cellemodeller som kardiomyocytter (CM) av indusert pluripotent stamcelleopprinnelse (iPSC) arbeidshesten i løpet av det siste tiåret for den moderne vurderingen av sikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske problemer2. Mye brukte analysesystemer for slike undersøkelser er mikroelektrode array (MEA) og spenningsfølsomme fargestoffbaserte eksperimentelle tilnærminger3.
Ikke desto mindre setter den påståtte fenotypiske og funksjonelle umodenheten til denne celletypen hindringer i veien for en ideell menneskebasert cellemodell, med potensial til å redusere translasjonsgap mellom ikke-kliniske og kliniske studier4.
Enorm forskning har blitt utført gjennom årene for å forstå årsaken til den underforståtte umodne fenotypen og for å finne måter å presse modningsprosessen til humane iPSC-CMs in vitro.
Manglende hjertemodningssignaler som forlengede cellekulturtider, fravær av andre celletyper i nærheten eller mangel på hormonell stimulering ble vist å påvirke modningsprosessen5. Også det ikke-fysiologiske miljøet til vanlige cellekulturplater ble identifisert som en signifikant årsak som hindrer modningen av humane iPSC-CM, på grunn av den manglende fysiologiske substratstivheten til det innfødte menneskelige hjertet 5,6.
Ulike analysesystemer med fokus på innfødte fysiologiske forhold ble utviklet for å takle dette problemet, inkludert 3D-cellekultursystemer der celler er justert tredimensjonalt for å ligne innfødt hjertearkitektur i stedet for typiske todimensjonale cellekulturer7. Selv om forbedret modning oppnås med 3D-analyser, hindrer behovet for en dyktig arbeidsstyrke og den lave gjennomstrømningen av disse systemene en rikelig bruk av dette i legemiddelutviklingsprosessen, siden tid og kostnader spiller en grunnleggende rolle i vurderingen av nye terapier på et økonomisk nivå8.
Viktige avlesninger for sikkerhetsfarmakologisk og toksikologisk vurdering av nye terapier er endringer i funksjonelle og strukturelle egenskaper ved humane iPSC-CM, siden sammensatte bivirkninger av kardiovaskulærsystemet vanligvis påvirker en eller begge av disse egenskapene 1,9. Kjente eksempler på slike brede bivirkninger er anti-kreftmedisiner av antracyklinfamilien. Her er farlige funksjonelle og negative strukturelle effekter på kardiovaskulærsystemet mye rapportert under og etter kreftbehandling hos pasienter, samt med in vitro cellebaserte analyser10,11.
I denne studien beskriver vi en omfattende metodikk for vurdering av både funksjonelle og strukturelle sammensatte bivirkninger på hiPSC-CM. Metodikken omfatter analyse av kardiomyocytt kontraktil kraft og impedans/ekstracellulært feltpotensial (EFP)-analyse. Den kontraktile kraften måles under fysiologiske mekaniske forhold, med cellene dyrket på myke (33 kPa) silikonsubstrater, noe som gjenspeiler det mekaniske miljøet i innfødt menneskelig hjertevev.
Systemet er utstyrt med 96-brønnsplater for høy gjennomstrømningsanalyse av humane iPSC-CMs for prekliniske hjertesikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske studier, og gir dermed en fordel for dagens brukte 3D-tilnærminger som Langendorff hjerte- eller hjerteskiver12,13.
I detalj består hybridsystemet av to moduler, enten for vurdering av hjertekontraktilitet under fysiologiske forhold eller analyse av sanntids cellulær strukturell toksisitet 6,14. Begge modulene arbeider med spesialiserte 96-brønnsplater med høy gjennomstrømning for rask og kostnadseffektiv datainnsamling.
Uten behov for en 3D-konstruksjon, benytter kontraktilitetsmodulen spesialplater som inneholder fleksible silikonmembraner som substrat for cellene i stedet for det stive glasset eller plasten som vanlige cellekulturplater vanligvis består av. Membranene reflekterer typiske menneskelige biomekaniske hjerteegenskaper og etterligner derfor in vivo-forhold på en høy gjennomstrømningsmåte. Mens humane iPSC-CM ofte ikke viser voksen kardiomyocytadferd angående sammensatt indusert positiv inotropi i andre cellebaserte analyser14, kan en mer voksenlignende reaksjon vurderes når cellene dyrkes på platene i kontraktilitetsmodulen. I tidligere studier har det vist seg at iPSC-CM utviser positive inotrope effekter ved behandling med forbindelser som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Her kan flere kontraktilitetsparametere vurderes, for eksempel primære parametere som amplituden til sammentrekningskraft (mN / mm2), slagvarighet og takthastighet, samt sekundære parametere for sammentrekningssyklusen som areal under kurven, sammentreknings- og avslapningsskråninger, slaghastighetsvariasjoner og arytmier (supplerende figur 1)16 . Legemiddelinduserte endringer i alle parametere vurderes ikke-invasivt ved kapasitiv avstandsmåling. Rådataene analyseres deretter av spesialisert programvare.
Den strukturelle toksisitetsmodulen legger til sin unike impedans og EFP-parametere som avlesning for strukturell cellulær toksisitet og analyse av elektrofysiologiske egenskaper17,18. Den elektriske impedansspektroskopiteknologien avslører sammensatte induserte endringer i celletetthet eller celle- og monolagsintegritet overvåket i sanntid, som vist med humane iPSC-CM behandlet med kjente kardiotoksiske forbindelser13. Med impedansavlesninger ved forskjellige frekvenser (1-100 kHz) er det mulig å dissekere en fysiologisk respons ytterligere, og dermed er det oppnåelig å avsløre endringer i membrantopografi, celle-celle eller cellematrisekryss. Den ekstra EFP-registreringen av humane iPSC-CM-er muliggjør videre analyse av elektrofysiologiske effekter fremkalt ved sammensatt behandling, som vist i lys av CiPA-studien17,19.
I denne studien ble humane iPSC-CM brukt, behandlet med epirubicin og doksorubicin, begge godt beskrevet som kardiotoksiske antracykliner, og erlotinib, en tyrosinkinasehemmer (TKI) med en ganske lav risiko for kardiovaskulær toksisitet. Kronisk vurdering med epirubicin, doksorubicin og erlotinib ble utført i 5 dager. Resultatet viser små endringer i kontraktilitet og baseimpedans når celler ble behandlet med erlotinib, men en tids- og doseavhengig toksisk reduksjon i kontraksjonsamplitude og baseimpedans ved behandling med henholdsvis epirubicin og doksorubicin. Akutte målinger ble utført med kalsiumkanalblokker nifedipin og viser en reduksjon i kontraksjonsamplitude, feltpotensialvarighet og baseimpedans, som demonstrerer kardiotoksiske bivirkninger av denne forbindelsen på funksjonelle så vel som strukturelle nivåer.
Impedans/EFP/kontraktilitetshybridsystemet er en omfattende metodikk for farmakologisk og toksikologisk vurdering av hjerteforpliktelser for preklinisk legemiddelutvikling. Det gir en moderne tilnærming til preklinisk sikkerhetstesting uten bruk av dyremodeller, men med høyere gjennomstrømningskapasitet som reduserer tid og kostnader betydelig. Dette systemet har potensial til å bli brukt som en komplementær tilnærming til Langendorff-hjertet og andre dyremodeller for preklinisk funksjonell og strukturell toksisite…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det tyske forbundsdepartementet for økonomiske saker og klimatiltak (ZIM) og fra det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (KMUinnovativ). Vi takker FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) for vennlig å gi kardiomyocytter og Ncardia B.V. (Leiden, Nederland) for vennlig å gi kardiomyocytter, brukt i denne studien.
Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |