Summary

Hybridcelleanalysesystem for å vurdere strukturelle og kontraktile endringer av humane iPSC-avledede kardiomyocytter for preklinisk hjerterisikovurdering

Published: October 20, 2022
doi:

Summary

Analysen av endringer i kontraktil funksjon og cellulær integritet av humane iPSC-avledede kardiomyocytter er av enorm betydning for ikke-klinisk legemiddelutvikling. Et hybrid 96-brønns celleanalysesystem adresserer begge parametrene i sanntid og fysiologisk måte for pålitelige, menneskerelevante resultater, som er nødvendige for en sikker overgang til kliniske stadier.

Abstract

Vurdering av hjertekontraktilitet er av enorm betydning for utviklingen av nye terapier og deres sikre overgang til kliniske stadier. Mens menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) holder løfte om å tjene som en menneskelig relevant modell i prekliniske faser av legemiddeloppdagelse og sikkerhetsfarmakologi, er deres modenhet fortsatt kontroversiell i det vitenskapelige samfunn og under konstant utvikling. Vi presenterer en EFP-teknologi (hybrid contractility and impedance/extracellular field potential), som tilfører betydelige pro-modningsfunksjoner til en industristandard 96-brønns plattform.

Impedans-/EFP-systemet overvåker cellulær funksjonalitet i sanntid. I tillegg til takthastigheten til kontraktile celler, oppdager de elektriske impedansspektroskopiavlesningene sammensatte morfologiske endringer som celletetthet og integritet av det cellulære monolaget. I den andre komponenten i hybridcelleanalysesystemet dyrkes cellene på biokompatible membraner som etterligner det mekaniske miljøet i ekte hjertevev. Dette fysiologiske miljøet støtter modningen av hiPSC-CMs in vitro, noe som fører til mer voksenlignende kontraktile responser, inkludert positive inotrope effekter etter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametere som amplituden av kontraksjonskraft (mN / mm2) og slagvarighet avslører også nedstrøms effekter av forbindelser med påvirkning på elektrofysiologiske egenskaper og kalsiumhåndtering.

Hybridsystemet gir det ideelle verktøyet for helhetlig celleanalyse, noe som muliggjør preklinisk hjerterisikovurdering utover dagens perspektiver for menneskerelevante cellebaserte analyser.

Introduction

Et av de viktigste målene for moderne medisinutvikling er forbedringen av suksessraten fra benk til seng for nye terapier i legemiddeloppdagelsesrørledningen. Sikkerhetsfarmakologisk testing av disse nye legemidlene avslører ofte bivirkninger på kardiovaskulærsystemet som står for nesten en fjerdedel av medikamentutmattelsesraten i prekliniske stadier1. Utvikling og integrering av nye tilnærmingsmetoder (NAMs) spiller en nøkkelrolle i moderniseringen av preklinisk vurdering, spesielt kjernebatteriorganer som hjertet. Siden disse metodene er dyrefrie tilnærminger, ble bruken av menneskebaserte cellemodeller som kardiomyocytter (CM) av indusert pluripotent stamcelleopprinnelse (iPSC) arbeidshesten i løpet av det siste tiåret for den moderne vurderingen av sikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske problemer2. Mye brukte analysesystemer for slike undersøkelser er mikroelektrode array (MEA) og spenningsfølsomme fargestoffbaserte eksperimentelle tilnærminger3.

Ikke desto mindre setter den påståtte fenotypiske og funksjonelle umodenheten til denne celletypen hindringer i veien for en ideell menneskebasert cellemodell, med potensial til å redusere translasjonsgap mellom ikke-kliniske og kliniske studier4.

Enorm forskning har blitt utført gjennom årene for å forstå årsaken til den underforståtte umodne fenotypen og for å finne måter å presse modningsprosessen til humane iPSC-CMs in vitro.

Manglende hjertemodningssignaler som forlengede cellekulturtider, fravær av andre celletyper i nærheten eller mangel på hormonell stimulering ble vist å påvirke modningsprosessen5. Også det ikke-fysiologiske miljøet til vanlige cellekulturplater ble identifisert som en signifikant årsak som hindrer modningen av humane iPSC-CM, på grunn av den manglende fysiologiske substratstivheten til det innfødte menneskelige hjertet 5,6.

Ulike analysesystemer med fokus på innfødte fysiologiske forhold ble utviklet for å takle dette problemet, inkludert 3D-cellekultursystemer der celler er justert tredimensjonalt for å ligne innfødt hjertearkitektur i stedet for typiske todimensjonale cellekulturer7. Selv om forbedret modning oppnås med 3D-analyser, hindrer behovet for en dyktig arbeidsstyrke og den lave gjennomstrømningen av disse systemene en rikelig bruk av dette i legemiddelutviklingsprosessen, siden tid og kostnader spiller en grunnleggende rolle i vurderingen av nye terapier på et økonomisk nivå8.

Viktige avlesninger for sikkerhetsfarmakologisk og toksikologisk vurdering av nye terapier er endringer i funksjonelle og strukturelle egenskaper ved humane iPSC-CM, siden sammensatte bivirkninger av kardiovaskulærsystemet vanligvis påvirker en eller begge av disse egenskapene 1,9. Kjente eksempler på slike brede bivirkninger er anti-kreftmedisiner av antracyklinfamilien. Her er farlige funksjonelle og negative strukturelle effekter på kardiovaskulærsystemet mye rapportert under og etter kreftbehandling hos pasienter, samt med in vitro cellebaserte analyser10,11.

I denne studien beskriver vi en omfattende metodikk for vurdering av både funksjonelle og strukturelle sammensatte bivirkninger på hiPSC-CM. Metodikken omfatter analyse av kardiomyocytt kontraktil kraft og impedans/ekstracellulært feltpotensial (EFP)-analyse. Den kontraktile kraften måles under fysiologiske mekaniske forhold, med cellene dyrket på myke (33 kPa) silikonsubstrater, noe som gjenspeiler det mekaniske miljøet i innfødt menneskelig hjertevev.

Systemet er utstyrt med 96-brønnsplater for høy gjennomstrømningsanalyse av humane iPSC-CMs for prekliniske hjertesikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske studier, og gir dermed en fordel for dagens brukte 3D-tilnærminger som Langendorff hjerte- eller hjerteskiver12,13.

I detalj består hybridsystemet av to moduler, enten for vurdering av hjertekontraktilitet under fysiologiske forhold eller analyse av sanntids cellulær strukturell toksisitet 6,14. Begge modulene arbeider med spesialiserte 96-brønnsplater med høy gjennomstrømning for rask og kostnadseffektiv datainnsamling.

Uten behov for en 3D-konstruksjon, benytter kontraktilitetsmodulen spesialplater som inneholder fleksible silikonmembraner som substrat for cellene i stedet for det stive glasset eller plasten som vanlige cellekulturplater vanligvis består av. Membranene reflekterer typiske menneskelige biomekaniske hjerteegenskaper og etterligner derfor in vivo-forhold på en høy gjennomstrømningsmåte. Mens humane iPSC-CM ofte ikke viser voksen kardiomyocytadferd angående sammensatt indusert positiv inotropi i andre cellebaserte analyser14, kan en mer voksenlignende reaksjon vurderes når cellene dyrkes på platene i kontraktilitetsmodulen. I tidligere studier har det vist seg at iPSC-CM utviser positive inotrope effekter ved behandling med forbindelser som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Her kan flere kontraktilitetsparametere vurderes, for eksempel primære parametere som amplituden til sammentrekningskraft (mN / mm2), slagvarighet og takthastighet, samt sekundære parametere for sammentrekningssyklusen som areal under kurven, sammentreknings- og avslapningsskråninger, slaghastighetsvariasjoner og arytmier (supplerende figur 1)16 . Legemiddelinduserte endringer i alle parametere vurderes ikke-invasivt ved kapasitiv avstandsmåling. Rådataene analyseres deretter av spesialisert programvare.

Den strukturelle toksisitetsmodulen legger til sin unike impedans og EFP-parametere som avlesning for strukturell cellulær toksisitet og analyse av elektrofysiologiske egenskaper17,18. Den elektriske impedansspektroskopiteknologien avslører sammensatte induserte endringer i celletetthet eller celle- og monolagsintegritet overvåket i sanntid, som vist med humane iPSC-CM behandlet med kjente kardiotoksiske forbindelser13. Med impedansavlesninger ved forskjellige frekvenser (1-100 kHz) er det mulig å dissekere en fysiologisk respons ytterligere, og dermed er det oppnåelig å avsløre endringer i membrantopografi, celle-celle eller cellematrisekryss. Den ekstra EFP-registreringen av humane iPSC-CM-er muliggjør videre analyse av elektrofysiologiske effekter fremkalt ved sammensatt behandling, som vist i lys av CiPA-studien17,19.

I denne studien ble humane iPSC-CM brukt, behandlet med epirubicin og doksorubicin, begge godt beskrevet som kardiotoksiske antracykliner, og erlotinib, en tyrosinkinasehemmer (TKI) med en ganske lav risiko for kardiovaskulær toksisitet. Kronisk vurdering med epirubicin, doksorubicin og erlotinib ble utført i 5 dager. Resultatet viser små endringer i kontraktilitet og baseimpedans når celler ble behandlet med erlotinib, men en tids- og doseavhengig toksisk reduksjon i kontraksjonsamplitude og baseimpedans ved behandling med henholdsvis epirubicin og doksorubicin. Akutte målinger ble utført med kalsiumkanalblokker nifedipin og viser en reduksjon i kontraksjonsamplitude, feltpotensialvarighet og baseimpedans, som demonstrerer kardiotoksiske bivirkninger av denne forbindelsen på funksjonelle så vel som strukturelle nivåer.

Protocol

MERK: Arbeidsflyten for kontraktilitet og impedans/EFP-måling er gitt i supplerende figur 2. 1. Plate belegg Åpne den vakuumforseglede emballasjen og ta ut 96-brønnsplaten. Håndteringsprosedyrer for 96-brønnsplater på begge modulene er de samme. La sammentrekningsplaten være dekket av den ekstra tilførte membranbeskyttelsen til måling i kontraktilitetsmodulen. Belegg de fleksible 96-brønnsplatene for såing av kardiomyocytter….

Representative Results

Effektene av kinasehemmeren erlotinib på kontraktiliteten til hiPSC-CM er vist i figur 1. Cellene ble behandlet med konsentrasjoner fra 10 nM til 10 μM i 5 dager, og beatparametere ble registrert daglig. Erlotinib, en EGFR (epidermal vekstfaktorreseptor) og tyrosinkinasehemmer med sammenlignbart lav risiko for kardiotoksisitet, hadde en mindre dose- og tidsavhengig effekt på hiPSC-CM bare ved konsentrasjoner i mikromolarområdet. Ved laveste konsentrasjon (10 nM) induserte erlotinib en st…

Discussion

Impedans/EFP/kontraktilitetshybridsystemet er en omfattende metodikk for farmakologisk og toksikologisk vurdering av hjerteforpliktelser for preklinisk legemiddelutvikling. Det gir en moderne tilnærming til preklinisk sikkerhetstesting uten bruk av dyremodeller, men med høyere gjennomstrømningskapasitet som reduserer tid og kostnader betydelig. Dette systemet har potensial til å bli brukt som en komplementær tilnærming til Langendorff-hjertet og andre dyremodeller for preklinisk funksjonell og strukturell toksisite…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det tyske forbundsdepartementet for økonomiske saker og klimatiltak (ZIM) og fra det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (KMUinnovativ). Vi takker FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) for vennlig å gi kardiomyocytter og Ncardia B.V. (Leiden, Nederland) for vennlig å gi kardiomyocytter, brukt i denne studien.

Materials

Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes  Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) R1059
Centrifuge (50 mL tubes) Thermo Fisher Scientific 15878722
12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) Integra Biosciences 4634
DPBS with Ca2+ and Mg2+ GE Healthcare HyClone SH304264.01
96 deep well plate Thermo Fisher Scientific A43075
EHS gel Extracellular Matrix Gel
FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device Nanion Technologies  19 1004 1005 Hybrid cell analysis system 
FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates Nanion Technologies 20 1010
 Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) Sigma Aldrich F1141
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFischer Scientific A1569601
Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium FCDI R1059
Incubator (37 °C, 5% CO2) Thermo Fisher Scientific 51023121
Laminar Flow Hood Thermo Fisher Scientific 51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent Nanion Technologies 20 1011
Pipette tips (1250µL) Integra Biosciences 94420813
Reagent Reservoir Integra Biosciences 8096-11
Serological pipette (e.g. 25 mL) Thermo Fisher Scientific 16440901
Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) Eppendorf 3123000063
Vacuum aspiration system Thermo Fisher Scientific 15567479
Optional: VIAFLO ASSIST Integra Biosciences 4500 Lab automation Robot
Water bath (37 °C) Thermo Fisher Scientific 15365877

References

  1. Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. Today’s challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap&#34. Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
  2. Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
  3. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  4. Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
  5. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  6. Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
  7. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
  8. Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
  9. Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
  10. Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
  11. Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
  12. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  13. Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
  14. Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
  15. Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
  16. Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
  17. Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
  18. Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
  19. Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
  20. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  21. Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  22. Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).

Play Video

Cite This Article
Lickiss, B., Gossmann, M., Linder, P., Thomas, U., Dragicevic, E., Lemme, M., George, M., Fertig, N., Stölzle-Feix, S. Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation. J. Vis. Exp. (188), e64283, doi:10.3791/64283 (2022).

View Video