Summary
Analysen av endringer i kontraktil funksjon og cellulær integritet av humane iPSC-avledede kardiomyocytter er av enorm betydning for ikke-klinisk legemiddelutvikling. Et hybrid 96-brønns celleanalysesystem adresserer begge parametrene i sanntid og fysiologisk måte for pålitelige, menneskerelevante resultater, som er nødvendige for en sikker overgang til kliniske stadier.
Abstract
Vurdering av hjertekontraktilitet er av enorm betydning for utviklingen av nye terapier og deres sikre overgang til kliniske stadier. Mens menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) holder løfte om å tjene som en menneskelig relevant modell i prekliniske faser av legemiddeloppdagelse og sikkerhetsfarmakologi, er deres modenhet fortsatt kontroversiell i det vitenskapelige samfunn og under konstant utvikling. Vi presenterer en EFP-teknologi (hybrid contractility and impedance/extracellular field potential), som tilfører betydelige pro-modningsfunksjoner til en industristandard 96-brønns plattform.
Impedans-/EFP-systemet overvåker cellulær funksjonalitet i sanntid. I tillegg til takthastigheten til kontraktile celler, oppdager de elektriske impedansspektroskopiavlesningene sammensatte morfologiske endringer som celletetthet og integritet av det cellulære monolaget. I den andre komponenten i hybridcelleanalysesystemet dyrkes cellene på biokompatible membraner som etterligner det mekaniske miljøet i ekte hjertevev. Dette fysiologiske miljøet støtter modningen av hiPSC-CMs in vitro, noe som fører til mer voksenlignende kontraktile responser, inkludert positive inotrope effekter etter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametere som amplituden av kontraksjonskraft (mN / mm2) og slagvarighet avslører også nedstrøms effekter av forbindelser med påvirkning på elektrofysiologiske egenskaper og kalsiumhåndtering.
Hybridsystemet gir det ideelle verktøyet for helhetlig celleanalyse, noe som muliggjør preklinisk hjerterisikovurdering utover dagens perspektiver for menneskerelevante cellebaserte analyser.
Introduction
Et av de viktigste målene for moderne medisinutvikling er forbedringen av suksessraten fra benk til seng for nye terapier i legemiddeloppdagelsesrørledningen. Sikkerhetsfarmakologisk testing av disse nye legemidlene avslører ofte bivirkninger på kardiovaskulærsystemet som står for nesten en fjerdedel av medikamentutmattelsesraten i prekliniske stadier1. Utvikling og integrering av nye tilnærmingsmetoder (NAMs) spiller en nøkkelrolle i moderniseringen av preklinisk vurdering, spesielt kjernebatteriorganer som hjertet. Siden disse metodene er dyrefrie tilnærminger, ble bruken av menneskebaserte cellemodeller som kardiomyocytter (CM) av indusert pluripotent stamcelleopprinnelse (iPSC) arbeidshesten i løpet av det siste tiåret for den moderne vurderingen av sikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske problemer2. Mye brukte analysesystemer for slike undersøkelser er mikroelektrode array (MEA) og spenningsfølsomme fargestoffbaserte eksperimentelle tilnærminger3.
Ikke desto mindre setter den påståtte fenotypiske og funksjonelle umodenheten til denne celletypen hindringer i veien for en ideell menneskebasert cellemodell, med potensial til å redusere translasjonsgap mellom ikke-kliniske og kliniske studier4.
Enorm forskning har blitt utført gjennom årene for å forstå årsaken til den underforståtte umodne fenotypen og for å finne måter å presse modningsprosessen til humane iPSC-CMs in vitro.
Manglende hjertemodningssignaler som forlengede cellekulturtider, fravær av andre celletyper i nærheten eller mangel på hormonell stimulering ble vist å påvirke modningsprosessen5. Også det ikke-fysiologiske miljøet til vanlige cellekulturplater ble identifisert som en signifikant årsak som hindrer modningen av humane iPSC-CM, på grunn av den manglende fysiologiske substratstivheten til det innfødte menneskelige hjertet 5,6.
Ulike analysesystemer med fokus på innfødte fysiologiske forhold ble utviklet for å takle dette problemet, inkludert 3D-cellekultursystemer der celler er justert tredimensjonalt for å ligne innfødt hjertearkitektur i stedet for typiske todimensjonale cellekulturer7. Selv om forbedret modning oppnås med 3D-analyser, hindrer behovet for en dyktig arbeidsstyrke og den lave gjennomstrømningen av disse systemene en rikelig bruk av dette i legemiddelutviklingsprosessen, siden tid og kostnader spiller en grunnleggende rolle i vurderingen av nye terapier på et økonomisk nivå8.
Viktige avlesninger for sikkerhetsfarmakologisk og toksikologisk vurdering av nye terapier er endringer i funksjonelle og strukturelle egenskaper ved humane iPSC-CM, siden sammensatte bivirkninger av kardiovaskulærsystemet vanligvis påvirker en eller begge av disse egenskapene 1,9. Kjente eksempler på slike brede bivirkninger er anti-kreftmedisiner av antracyklinfamilien. Her er farlige funksjonelle og negative strukturelle effekter på kardiovaskulærsystemet mye rapportert under og etter kreftbehandling hos pasienter, samt med in vitro cellebaserte analyser10,11.
I denne studien beskriver vi en omfattende metodikk for vurdering av både funksjonelle og strukturelle sammensatte bivirkninger på hiPSC-CM. Metodikken omfatter analyse av kardiomyocytt kontraktil kraft og impedans/ekstracellulært feltpotensial (EFP)-analyse. Den kontraktile kraften måles under fysiologiske mekaniske forhold, med cellene dyrket på myke (33 kPa) silikonsubstrater, noe som gjenspeiler det mekaniske miljøet i innfødt menneskelig hjertevev.
Systemet er utstyrt med 96-brønnsplater for høy gjennomstrømningsanalyse av humane iPSC-CMs for prekliniske hjertesikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske studier, og gir dermed en fordel for dagens brukte 3D-tilnærminger som Langendorff hjerte- eller hjerteskiver12,13.
I detalj består hybridsystemet av to moduler, enten for vurdering av hjertekontraktilitet under fysiologiske forhold eller analyse av sanntids cellulær strukturell toksisitet 6,14. Begge modulene arbeider med spesialiserte 96-brønnsplater med høy gjennomstrømning for rask og kostnadseffektiv datainnsamling.
Uten behov for en 3D-konstruksjon, benytter kontraktilitetsmodulen spesialplater som inneholder fleksible silikonmembraner som substrat for cellene i stedet for det stive glasset eller plasten som vanlige cellekulturplater vanligvis består av. Membranene reflekterer typiske menneskelige biomekaniske hjerteegenskaper og etterligner derfor in vivo-forhold på en høy gjennomstrømningsmåte. Mens humane iPSC-CM ofte ikke viser voksen kardiomyocytadferd angående sammensatt indusert positiv inotropi i andre cellebaserte analyser14, kan en mer voksenlignende reaksjon vurderes når cellene dyrkes på platene i kontraktilitetsmodulen. I tidligere studier har det vist seg at iPSC-CM utviser positive inotrope effekter ved behandling med forbindelser som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Her kan flere kontraktilitetsparametere vurderes, for eksempel primære parametere som amplituden til sammentrekningskraft (mN / mm2), slagvarighet og takthastighet, samt sekundære parametere for sammentrekningssyklusen som areal under kurven, sammentreknings- og avslapningsskråninger, slaghastighetsvariasjoner og arytmier (supplerende figur 1)16 . Legemiddelinduserte endringer i alle parametere vurderes ikke-invasivt ved kapasitiv avstandsmåling. Rådataene analyseres deretter av spesialisert programvare.
Den strukturelle toksisitetsmodulen legger til sin unike impedans og EFP-parametere som avlesning for strukturell cellulær toksisitet og analyse av elektrofysiologiske egenskaper17,18. Den elektriske impedansspektroskopiteknologien avslører sammensatte induserte endringer i celletetthet eller celle- og monolagsintegritet overvåket i sanntid, som vist med humane iPSC-CM behandlet med kjente kardiotoksiske forbindelser13. Med impedansavlesninger ved forskjellige frekvenser (1-100 kHz) er det mulig å dissekere en fysiologisk respons ytterligere, og dermed er det oppnåelig å avsløre endringer i membrantopografi, celle-celle eller cellematrisekryss. Den ekstra EFP-registreringen av humane iPSC-CM-er muliggjør videre analyse av elektrofysiologiske effekter fremkalt ved sammensatt behandling, som vist i lys av CiPA-studien17,19.
I denne studien ble humane iPSC-CM brukt, behandlet med epirubicin og doksorubicin, begge godt beskrevet som kardiotoksiske antracykliner, og erlotinib, en tyrosinkinasehemmer (TKI) med en ganske lav risiko for kardiovaskulær toksisitet. Kronisk vurdering med epirubicin, doksorubicin og erlotinib ble utført i 5 dager. Resultatet viser små endringer i kontraktilitet og baseimpedans når celler ble behandlet med erlotinib, men en tids- og doseavhengig toksisk reduksjon i kontraksjonsamplitude og baseimpedans ved behandling med henholdsvis epirubicin og doksorubicin. Akutte målinger ble utført med kalsiumkanalblokker nifedipin og viser en reduksjon i kontraksjonsamplitude, feltpotensialvarighet og baseimpedans, som demonstrerer kardiotoksiske bivirkninger av denne forbindelsen på funksjonelle så vel som strukturelle nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Arbeidsflyten for kontraktilitet og impedans/EFP-måling er gitt i supplerende figur 2.
1. Plate belegg
- Åpne den vakuumforseglede emballasjen og ta ut 96-brønnsplaten. Håndteringsprosedyrer for 96-brønnsplater på begge modulene er de samme. La sammentrekningsplaten være dekket av den ekstra tilførte membranbeskyttelsen til måling i kontraktilitetsmodulen.
- Belegg de fleksible 96-brønnsplatene for såing av kardiomyocytter.
- Klargjør en fortynnet EHS gelbeleggsløsning ved å overføre 2,75 ml EHS gel klar til bruk løsning i et sterilt sentrifugerør. Tilsett deretter 8,25 ml DPBS med Ca 2+ og Mg2+. Bland løsningen forsiktig.
MERK: Eventuelt kan fibronektin også brukes til å belegge brønnene: Klargjør 13 ml fibronektinbeleggløsning i et sterilt sentrifugerør ved å fortynne 650 μL fibronektin stamløsning (1 μg / ml) i 13 ml DPBS med Ca 2+ og Mg2+, noe som resulterer i en 50 μg / ml arbeidsløsning. Bland løsningen forsiktig.
- Klargjør en fortynnet EHS gelbeleggsløsning ved å overføre 2,75 ml EHS gel klar til bruk løsning i et sterilt sentrifugerør. Tilsett deretter 8,25 ml DPBS med Ca 2+ og Mg2+. Bland løsningen forsiktig.
- Overfør beleggløsningen til et sterilt reagensreservoar plassert i laboratorieautomatiseringsroboten.
- Tilsett 100 μL av beleggløsningen per brønn med laboratorieautomatiseringsroboten ved å bruke programmet "ADD100μL". Sett lokket tilbake på 96-brønnsplaten og inkuber i 3 timer ved 37 °C.
MERK: Programmet for laboratorieautomatiseringsroboten må forhåndsinnstilles manuelt på forhånd.
2. Såing av humane iPSC-avledede kardiomyocytter til fleksible 96-brønnsplater (dag 0)
- Tine cellene i henhold til produsentens retningslinjer.
- Tell cellene med et manuelt tellekammer og juster cellene i det anbefalte pletteringsmediet i henhold til instruksjonene fra celleprodusenten (f.eks. 1 x 105 celler/brønn), noe som resulterer i 11 x 106 celler/11 ml for såing av en hel plate med 96 brønner.
- Fjern EHS-gelløsningen fra brønnene med laboratorieautomatiseringsroboten ved hjelp av programmet "REMOVE100μL". Fjern reagensbeholderen som inneholder den dispenserte beleggløsningen fra roboten.
- Overfør cellesuspensjonen (11 ml totalt) til et sterilt reagensreservoar plassert i laboratorieautomatiseringsroboten og frø cellene med 100 μL / brønn ved hjelp av programmet "CELLS_ADD100 μL".
- Umiddelbart etter cellesåing, overfør den fleksible 96-brønnsplaten til inkubatoren (37 ° C, 5% CO2, fuktighetskontrollert) og la cellene slå seg ned over natten.
3. Middels bytte av fleksible plater med 96 brønner (dag 1)
- Varm minst 22 ml kardiomyositt vedlikeholdsmedium per plate til 37 °C i et 50 ml sentrifugerør, 18-24 timer etter sådd av platene.
- Overfør det ferske mediet (minst 22 ml) til et sterilt reagensreservoar og la det ligge rett ved siden av laboratorieautomatiseringsroboten. Plasser et tomt reagensreservoar i roboten og utfør middels fjerning med programmet "REMOVE100μL". Etterpå bytter du reagensbeholderen som inneholder avfallsmediet med reagensbeholderen som inneholder det ferske mediet og dispenserer 200 μL av det ferske mediet per brønn med programmet "ADD100μL". Utfør dette trinnet to ganger for å nå 200 μL / brønn.
- Umiddelbart etter middels utveksling, overfør platen tilbake til inkubatoren.
- Utfør en middels utveksling (200 μL / brønn) annenhver dag til sammensatt tilsetning.
4. Endelig middels bytte før tilsetning av forbindelse (dag 5-7)
- Utfør en endelig mediumendring 4-6 timer før tilsetning av forbindelse.
- Varm minst 22 ml analysebuffer for en fleksibel 96-brønns plate. Analysebufferen består av vedlikeholdsmedium eller derivater derav (f.eks. lave/ingen serummedier, fenolrøde frie medier eller andre isotoniske buffere).
- Overfør det ferske mediet til et sterilt reagensreservoar og la det ligge rett ved siden av laboratorieautomatiseringsroboten. Plasser et tomt reagensreservoar i roboten og utfør middels fjerning. Bytt deretter reagensbeholderen som inneholder avfallsmediet med reagensbeholderen som inneholder ferskmediet og dispenser 200 μL / brønn av det ferske mediet.
- Umiddelbart etter middels utveksling, overfør den fleksible platen tilbake til inkubatoren.
5. Sammensatt tillegg og dataregistrering (dag 5-7)
MERK: En eksempelmålingsplan for eksperimentet er gitt i supplerende figur 3.
- Forbered arbeidsløsning per forbindelse ved 4x konsentrasjon i den laminære strømningshetten ved hjelp av en steril vanlig 96-dyp brønnplate. Den sammensatte løsningen er basert på analysebufferen som ble brukt i trinn 4. Overfør den 96 dype brønnplaten som inneholder den sammensatte løsningen i minst 1 time inn i inkubatoren for å justere den til samme tilstand som den fleksible platen.
MERK: 1x-konsentrasjonen av hvert legemiddel som brukes til hvert eksperiment, er gitt i tallene og legendene. - Overfør platen til den respektive måleenheten 1 time før du utfører en basismåling.
- Åpne Edit Protocol i kontrollprogramvaren (en del av hybridcelleanalysesystemet) og velg den respektive målemoduskontraktiliteten eller impedansen/EFPen.
- Definer feievarigheten (lengden på en måling, f.eks. 30 s) og repetisjonsintervallet (tid mellom målinger, f.eks. 5 min) og lagre protokollnummeret.
- Velg Start protokoll > Fortsett , og fyll ut de forespurte feltene.
- Til slutt velger du Start måling. Utfør minst tre basismålinger (sveip) i intervaller på 5 minutter kort tid før tilsetning av forbindelsen.
MERK: Eksempeldata for en kontraktilitetsbasemåling ved bruk av kontraktilitetsmodulen før sammensatt addisjon er avbildet i Supplerende figur 4 - Fjern 50 μL av analysebufferen fra hver brønn uten å fjerne den fleksible 96-brønnsplaten fra måleenheten.
- Tilsett 50 μL av den 4x konsentrerte forbindelsesløsningen i hver brønn på platen, i henhold til måleplanen.
- Velg Legg til regionmarkør og definer oppsettet for forbindelsesplaten og volumet av den sammensatte løsningen etter tilsetning av forbindelsen.
- Til slutt velger du Fortsett med standardmåling eller Fortsett med måleserier i henhold til eksperimentplanen.
6. Dataanalyse
- Med opptaksprogramvare måler du feier, hvis lengde og repetisjonsintervall er definert av brukeren.
- Med analyseprogramvare kan du fange formen på signalet ved å lese ut parametere som amplitude, takthastighet, pulsbredde og så videre, automatisk.
MERK: Et gjennomsnittlig signal inkludert standardavviket, den såkalte mean beat, beregnes automatisk basert på dataene til en feie. Brukeren kan definere kontraktilitet / IMP / EFP parametere som programvaren beregner og viser. - Med analyseprogramvare beregne dose-respons kurven og IC50/EC50 for hver forbindelse.
MERK: Rådataene og analyseresultatene som genereres med analyseprogramvaren, kan enkelt eksporteres i en rekke formater. Til slutt genereres datarapportene automatisk for å oppsummere og arkivere de eksperimentelle resultatene. En omfattende beskrivelse av hva og hvordan et EFP-signal måles er omtalt i 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektene av kinasehemmeren erlotinib på kontraktiliteten til hiPSC-CM er vist i figur 1. Cellene ble behandlet med konsentrasjoner fra 10 nM til 10 μM i 5 dager, og beatparametere ble registrert daglig. Erlotinib, en EGFR (epidermal vekstfaktorreseptor) og tyrosinkinasehemmer med sammenlignbart lav risiko for kardiotoksisitet, hadde en mindre dose- og tidsavhengig effekt på hiPSC-CM bare ved konsentrasjoner i mikromolarområdet. Ved laveste konsentrasjon (10 nM) induserte erlotinib en statistisk ubetydelig reduksjon i amplitude ved første måling etter påføring av forbindelsen (1 time). I alle påfølgende målinger ble det ikke målt noen sammenlignbar effekt ved denne konsentrasjonen. Den forbigående reduksjonen kan være et resultat av en sammensatt effekt, men også et resultat av en forbigående forvrengning av taktmønsteret under den sammensatte tilsetningsprosedyren, for eksempel av termisk eller mekanisk natur. Mikromolære konsentrasjoner av erlotinib viste lette, men signifikante tids- og doseavhengige kardiotoksiske effekter. Effekten ble sett fra 96 timer med 1 μM erlotinib, mens 10 μM resulterte i en signifikant reduksjon bare 24 timer etter tilsetning av forbindelsen.
Kjemoterapimiddel epirubicin hadde både tids- og doseavhengig effekt på hiPSC-CM (figur 2). Cellene sluttet å slå innen 24 timer etter påføring av 10 μM epirubicin. Med 1 μM ble en drastisk reduksjon i amplitude til 44% ± 2% av kontrollen etter 24 timer etterfulgt av fullstendig beatstopp til 48 timer etter sammensatt tilsetning. Ved 100 nM ble det observert en tidsavhengig reduksjon i slagamplitude over en periode på 5 dager med en restamplitude på 25 % ± 3 % på dag 5. Ved den laveste konsentrasjonen på 10 nM var effekten av epirubicin kun doseavhengig, men ikke tidsavhengig, med start ved første måling (1 time etter tilsetning av forbindelsen). Amplituden svingte jevnt mellom 60% -80% av kontrollen i løpet av 5 dager. Avvikene i denne gruppen var større sammenlignet med de høyere konsentrasjonene. En mulig årsak kan være at denne konsentrasjonen bare hadde målbar effekt på en del av brønnene.
Doxorubicin er en annen antracyklinklasse av medisinering, og cellens vitalitet av hiPSC-CMs ble undersøkt ved å overvåke baseimpedansen over tid. Figur 3 viser at en 24 timers eksponering for 300, 1, 3 og 10 μM doksorubicin reduserer cellens levedyktighet på en konsentrasjons- og tidsavhengig måte.
Nifedpinie er en dihydropyridin kalsiumkanalblokker som primært blokkerer L-type kalsiumkanaler. Langtidsovervåking over 24 timer av cellens levedyktighet viser en tids- og konsentrasjonsavhengig reduksjon av baseimpedans som brukes som mål på toksisitet (figur 4A). Ved bruk av økende nifedipinkonsentrasjoner (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM) viser feltpotensialregistreringer på hiPSC-CM en konsentrasjonsavhengig forkortelse av feltvarigheten normalisert (FPD) som forventet (figur 4B,C). Nifedipinvurdering vedrørende hjertekontraktilitet viste også signifikant konsentrasjonsavhengig amplitudereduksjon ved akutt måling med konsentrasjoner på 10 nM og 30 nM (figur 5).
Resultatene oppnådd med hybridcelleanalysesystemet viser at tre hjerteendepunkter (kontraktilitet, struktur og elektrofysiologi) av hiPSC-CM kan vurderes ved hjelp av ett system.
Figur 1: Kontraktilitetsvurdering av humane iPSC-avledede kardiomyocytter behandlet med erlotinib i 5 dager. X-aksen viser tid i timer, y-akse plotter parameteramplitude i prosent. Stjerner representerer statistisk signifikans med p < 0,05 (*) eller p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney test, n = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kontraktilitetsvurdering av humane iPSC-avledede kardiomyocytter behandlet med kardiotoksisk antracyklinepirubicin over 5 dager. X-aksen viser tid i timer, y-akse plotter parameteramplitude i prosent. Stjerner representerer statistisk signifikans med p < 0,05 (*) eller p < 0. 01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney test, n = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Baseimpedans av humane iPSC-avledede kardiomyocytter etter doksorubicinbehandling. Tidsforløp for baseimpedansen til humane iPSC-avledede kardiomyocytter ved 24 timers eksponering for 300, 1, 3 og 10 μM doksorubicin (n = 5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Impedans og EFP-opptak av humane iPSC-avledede kardiomyocytter. (A) Tidsforløp for baseimpedansen til humane iPSC-avledede kardiomyocytter i 24 timer, ved eksponering for 3, 10, 30 og 100 nM nifedipin (n = 5). (B) Tidsforløp for feltets potensielle varighet av humane iPSC-avledede kardiomyocytter i 1 time, ved eksponering for 3, 10, 30 og 100 nM nifedipin (n = 5). (C) Elektrodeoppsett av impedansen / EFP-platen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Contractility assessment (contractility module) av humane iPSC-avledede kardiomyocytter behandlet med nifedipin i 20 min. X-aksen viser tid i min, Y-aksen plotter parameteramplitude i prosent. Stjerner representerer statistisk signifikans med p < 0. 05 (*) eller p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney test, n = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Kontraktilitetsparametere og rådata vurdert med kontraktilitetsmodulen. (Venstre) Parametere vurdert med kontraktilitetsmodulen. Parametere: Amplitude av kontraksjonskraft (mN/mm2), slagvarighet, opp- og nedslagshastighet, opp- og nedslagsområde under kurve (AUC), slagfrekvens, slaghastighetsvariasjoner, arytmiske hendelser. (Høyre) Kontraktilitetsrådataregistreringer av én brønn med ubehandlet kardiomyocytt (A) slagfrekvens, (B) slagfrekvensvariasjoner, (C) tidlig etter rier og (D) arytmiske hendelser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Arbeidsflyt for kontraktilitet og impedans/EFP-måling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Eksempeloppsett av en måleplan for en 96-brønns plate. Fire forbindelser (uthevet i rød, lysegrønn, brun og mørkegrønn) med fire konsentrasjoner og fire replikasjoner er avbildet. Positive og negative kontroller (f.eks. førkulturelle forhold og DMSO) er uthevet i gult. Sikkerhetskopiceller er uthevet i blått. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Eksempeldata for en kontraktilitetsbasemåling ved bruk av kontraktilitetsmodulen før sammensatt addisjon. I hvert diagram er gjennomsnittet av alle sammentrekningssykluser av en feie avbildet. For å visualisere taktfrekvensen vises to påfølgende sammentrekninger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Impedans/EFP/kontraktilitetshybridsystemet er en omfattende metodikk for farmakologisk og toksikologisk vurdering av hjerteforpliktelser for preklinisk legemiddelutvikling. Det gir en moderne tilnærming til preklinisk sikkerhetstesting uten bruk av dyremodeller, men med høyere gjennomstrømningskapasitet som reduserer tid og kostnader betydelig. Dette systemet har potensial til å bli brukt som en komplementær tilnærming til Langendorff-hjertet og andre dyremodeller for preklinisk funksjonell og strukturell toksisitetsvurdering.
Som en dyrefri tilnærming brukes menneskelige iPSC-CM-er for hybridsystemet20. Her gir de spesielle fleksible 96-brønnsplatene med pro-modningseffekten på humane iPSC-CM en viktig fordel i forhold til andre cellebaserte analyser21,22, siden gjennomstrømning og et fysiologisk miljø er unikt kombinert for mer voksenlignende menneskelig hjerterisikovurdering 6,15.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er anvendelsen av forbindelsen, spesielt når akutte effekter skal undersøkes. Siden cellene dyrkes på myke underlag som utfører mekaniske krefter, kan overdreven akselerasjon under platehåndtering og påføring av skjærkrefter under pipettering resultere i forbigående (5-10 min) endringer av kontraksjonsparametrene og bør unngås. Generelt bør det utvises forsiktighet ved utskifting av medier for å unngå forstyrrelser i membranene. Bruk av laboratorieautomatiseringsutstyr anbefales.
Før forbindelsesanalysen utføres, er det nødvendig med et prekulturtrinn på 5-7 dager, slik at humane iPSC-CM, vanligvis anskaffet i kryo-bevart tilstand, kan gjenopprette fra tineprosedyren og bygge et riktig syncytium. For begge modulene gir sammentrekningsamplituden, samt slaghastigheten, innsikt i det ideelle utgangspunktet for målingen som vanligvis skjer mellom dag 5-7. Basismålingen er et kritisk trinn for å identifisere funksjonelle baselinekarakteristika som brukes som inklusjonskriterier for hiPSC-CM-ene som er studert3. Utgangsverdiene må registreres rett før sammensatt behandling, slik at endringer i kontraksjonsatferd kan sammenlignes med ikke-behandlingstilstander (supplerende figur 3).
Å redegjøre for variabiliteter og ha definerte basisegenskaper er nøkkelen til vellykkede målinger av hiPSC-CM og datatolkning. Av denne grunn følges beste praksisanbefalinger fra Gintant et al., ved hjelp av hybridcelleanalysesystemet; For eksempel skal grunnlinjen registreres før den sammensatte addisjonen, og grunnlinjeregistreringen skal oppfylle visse forutsetninger3.
Selv om de fleksible platene med 96 brønner er utstyrt med skjøre membraner, vil en medfølgende beskyttelsesplate i kombinasjon med forsiktig håndtering forhindre skade. Membranene er forbehandlet for å muliggjøre stabil festing av celler til silikonsubstratet, som har lav inneboende biokompatibilitet. Behandlingen er stabil i minst 6 måneder. Mens cellene holdes konstant ved 37 °C, er de mekaniske egenskapene til silikonmaterialer stabile over et bredt temperaturområde. I tillegg påvirker verken legemidler eller løsningsmidler silikonets egenskaper ved konsentrasjoner som brukes i cellebaserte analyser (f.eks. forblir DMSO-konsentrasjoner under 0,1%).
Systemet ble validert og optimalisert med et bredt spekter av kommersielt tilgjengelige hiPSC-CM-er. Ved bruk av skreddersydde celler anbefales testing av standard ekstracellulære matriksproteiner (ECM) for optimal cellefeste (f.eks. fibronektin, EHS-matrise og poly-L-lysin 6,15).
Elektrofysiologi, kalsiumsignalering og kontraktilitet er de tre viktigste hjerteendepunktene som behandles i preklinisk utvikling. Hybridsystemet er for tiden begrenset til å analysere to av disse hjerteendepunktene kontraktilitet og elektrofysiologi. Kalsiumsignalering i kardiomyocytter kan ikke analyseres direkte, men detekteres tangentielt via kontraktilitet og elektrofysiologiske egenskaper.
Både impedans/EFP og kontraksjonskraftmåling utføres med monolag av kardiomyocytter. Til tross for fordelen med en fysiologisk mekanisk substratstivhet under sammentrekningsmåling, opplever cellene ikke det tredimensjonale miljøet i ekte menneskelig vev. På den annen side tillater dette bruk av bare en brøkdel av de dyre stamcelleavledede cellemodellene med standard laboratorieutstyr. Derfor lover denne applikasjonen å ha et gunstig forhold mellom kostnad, robusthet og prediktivitet sammenlignet med in vivo / ex vivo eller 3D-modeller. Fremtidige anvendelser av hybridsystemet kan omfatte analyse av andre kontraktile celletyper som glatte muskelceller. I reguleringen av kardiovaskulær homeostase spiller disse cellene en viktig rolle som kolleger av kardiomyocytter. Hybridsystemet gir også tillegg for spesifikke prosjekter, for eksempel optisk stimulering av humane iPSC-CM-er. Til dette formål kan et dedikert optisk lokk påføres begge modulene for stimulering av humane iPSC-CM-er som ble transfisert med Channelrhodopsin-2 under prekulturtider.
Hybridsystemet impedans/EFP/kontraktilitet muliggjør således moderne preklinisk sikkerhets- og toksisitetsvurdering ved å analysere tre forskjellige hjerteendepunkter (kontraktilitet, strukturelle endringer og elektrofysiologi) innenfor én metodikk. Fordelen med å adressere disse endepunktene med en menneskebasert hjertecellemodell på høyt gjennomstrømningsnivå løfter dette hybridsystemet utover dagens perspektiver for preklinisk hjerterisikovurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go., og P.L. er ansatt hos innoVitro GmbH, produsenten av de fleksible platene. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. og S.S. er ansatt hos Nanion Technologies GmbH, produsenten av hybridenheten.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det tyske forbundsdepartementet for økonomiske saker og klimatiltak (ZIM) og fra det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (KMUinnovativ). Vi takker FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) for vennlig å gi kardiomyocytter og Ncardia B.V. (Leiden, Nederland) for vennlig å gi kardiomyocytter, brukt i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
