Name: Sonder les rôles des Forces physiques dans la morphogenèse embryonnaire précoce de poussin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Découvrez comment étudier les forces mécaniques dans la morphogenèse du cerveau embryonnaire de poussin grâce à des expériences ex-ovo et une modélisation physique. Cette méthode permet de caractériser les mécanismes du développement cérébral précoce.

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Z.C. reconnaît l’appui du Fonds de démarrage de Dartmouth et la Branco Weiss - Society for Science fellowship, administré par l’ETH Zurich. Les auteurs remercient Drs Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo et Yunfei Shi pour discussions utiles, ainsi que les réviseurs anonymes pour commentaires. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures sous le Grant No. DGE-1313911. Opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.

1. préparation des milieux de Culture de tissus
<ol><li>Utiliser une bouteille de 0,5 L du moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose, bicarbonate de sodium, L-glutamine et comme base pour les milieux de culture.</li>
	<li>Sous une hotte à flux laminaire stérile, ajouter 10 mL d’antibiotiques à la 0,5 L de DMEM.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette stérile, transférer 50 mL de la solution d’antibiotiques DMEM dans un tube conique stérile de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 50 mL de sérum de poussin à la solution d’antibiotiques DMEM restante dans la bouteille de 0,5 L dans la hotte stérile.</li>
	<li>Stocker la solution finale (dénommée ci-après poussin milieux de culture [CCM]) en aliquotes de tube à fond conique de 50 mL à-20 ° C.</li>
</ol>2. Incubation des oeufs
<ol><li>Utilisation délicate essuie avec de l’éthanol 70 % pour le nettoyage spécifique exempts de micro-organismes pathogènes Leghorn blanche poulet fécondés. Organiser les oeufs dans une orientation longitudinale sur les titulaires.</li>
	<li>Allumez un incubateur de œufs pour régler une température cible de 37,5 ° C et maintenir le taux d’humidité de 48 à 55 %. L’humidité est contrôlée en ajoutant une quantité appropriée d’eau dans l’incubateur.</li>
	<li>Incuber les œufs à HH11-13, 40-44 h environ.</li>
	<li>Laissez que les oeufs refroidissent à température ambiante pendant environ 15-30 min avant la pulvérisation/nettoyage avec l’éthanol à 70 %.</li>
</ol>3. Tirez les capillaires en verre
<ol><li>Monter un 10 tubes capillaires de verre cm de long avec un diamètre extérieur de 1,0 mm et 0,5 mm de diamètre intérieur sur un terrain de micropipettes.</li>
	<li>La valeur de la chaleur et tirez les paramètres à 750 et 400, respectivement. Appuyez sur le bouton tirer tirer le tube capillaire en fines aiguilles.</li>
</ol>4. papier filtre Carrier méthode
<ol><li>Couper des cercles d’environ 3 cm de diamètre de papier filtre.</li>
	<li>Couper un rectangle à peu près 1 cm par 2 cm du cercle à l’aide d’une perforatrice. Assurez-vous d’enlever toute saillie ou les coins pointus.</li>
</ol>5. embryon récolte et préparation
<ol><li>Casser les oeufs par le bas, écartez la coquille doucement et soigneusement déposer contenu dans une boîte de Pétri 150 x 15 mm. Pour assurer que le côté de l’embryon est en place, conserver les oeufs dans le même sens, qu'ils ont été incubés pendant leur fissuration.</li>
	<li>Supprimer l’albumine mince à l’aide d’une pipette Pasteur jetable.</li>
	<li>Séparer l’albumine épais le jaune d’oeuf avec une pincette terminé émoussé. Assurez-vous que l’albumine épais a été supprimée en grattant légèrement le dessus du jaune avec le forceps terminé émoussé.</li>
	<li>Pinces à pointe fine permet de centrer et placez un anneau de papier filtre sur l’embryon, correspondant à l’axe longitudinal de l’anneau avec l’axe longitudinal de l’embryon.</li>
	<li>Couper le jaune qui entoure l’anneau de filtre en papier avec des ciseaux.</li>
	<li>Tirez sur l’anneau et l’embryon hors le jaune dans une direction oblique vers le site où le jaune a été tout d’abord coupé.</li>
	<li>Rincer les embryons dans les deux plats de 100 mm séquentiels avec la température de la pièce 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Placez un anneau de papier filtre dans une boîte de Petri 35 mm tout d’abord. Puis placer la face dorsale de l’embryon vers le haut sur le papier filtre déjà dans 35 mm boîte de Pétri.</li>
	<li>Placez un anneau en acier inoxydable sur le dessus le papier filtre "sandwich". Veillez à ne pas endommager l’embryon.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de la CCM préalablement préparée pour chaque boîte de Pétri.</li>
	<li>Supprimer la machine virtuelle de chaque embryon par écrémage légèrement l’aiguille capillaire extraite dans la partie supérieure de l’embryon et épluchage de la machine virtuelle de suite, à partir de l’extrémité antérieure (juste au-dessus du prosencéphale) et procéder à la notochorde (Figure 1 a).</li>
	<li>Placez les huit plats de Pétri de 35 mm dans un plat de 150 mm qui était bordé de lingettes tâche délicate eau saturée (pour maintenir l’humidité).</li>
	<li>Place le plat de Pétri de 150 mm dans un sac en plastique refermable puis remplir le sac avec un mélange de gaz composé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2.</li>
	<li>Sceller le sac et placez-le dans un incubateur à 37,5 ° C.</li>
	<li>Incuber les embryons pendant 27 h supplémentaires jusqu’en HH15-CM16 (Figure 1 b).</li>
</ol>6. induisant la Tension superficielle
<ol><li>Sortir les embryons de l’incubateur et utiliser un système de tomographie par cohérence optique pour leur image. Utilisation OCT pour déterminer l’angle de torsion du tube neural (NT) (Figure 2).</li>
	<li>Transférer les embryons à un microscope optique et visualiser à un grossissement de 10 X. Utiliser une pipette de 200 microlitres de progressivement supprimer 0,2 mL de médias de la boîte de Pétri.</li>
	<li>Prendre des images de fond clair à chaque intervalle d’observer les effets de l’interface média-air sur l’embryon.</li>
	<li>Retirez le support jusqu'à ce que la tension de surface à travers l’embryon induit la torsion (Figure 1).</li>
	<li>Image de l’embryon en utilisant le système de OCT une fois de plus à mettre en place un angle de torsion final aux fins de comparaison contrôler des embryons.  Remarque : Les images de Bright-champ ont été acquis à l’aide d’un microscope à dissection. Un système de tomographie par cohérence optique avec un microscope ci-joint a été utilisé pour acquérir des piles d’image transversale des embryons vivants. Des images ont été obtenus dans un domaine de balayage3 3 x 10 x 3 mm, puis traitées dans un logiciel d’imagerie. Enfin, les images du modèle physique ont été prises avec un appareil de photo numérique reflex mono-objectif.</li>
</ol>7. physique modélisation des Forces de Tension superficielle/VM
<ol><li>Développer une géométrie 3D simplifiée qui ressemble à un embryon entre CM14-17 dans le logiciel de modélisation commerciale (Figure 3 a).</li>
	<li>La conception du moule négatif de la géométrie 3D dans les logiciels d’infographie 3D commercial.</li>
	<li>Utilisation d’une imprimante 3D dotée de 1,75 mm acrylonitrile butadiène styrène à incandescence à la 3D imprimer le moule conçu, au format stéreolithographie (.stl).</li>
	<li>Pour effectuer un cast du moule, mélanger silicone caoutchouc élastomère composants A et B en parties égales et versez le mélange dans le moule sans tarder ; mettre le moule de coulée pour guérir à température ambiante pendant 12 h (Figure 3 b).</li>
	<li>Marquer le modèle physique de l’embryon le long de la NT sur la face dorsale de visualiser la torsion.</li>
	<li>Utiliser un lamelle couvre-objet pour répliquer la force exercée sur le modèle physique 3D qui imite celle de la machine virtuelle ou de la tension de surface (Figure 3D).</li>
	<li>Insérer une série de fils rigides de longueur égale au côté du modèle physique. Après que la lamelle exerce une force extérieure sur le modèle du cerveau, les fils deviennent inclinés à un angle qui dépend de l’emplacement. Déterminer l’angle de rotation d’arctan de la durée prévue sur toute la longueur initiale de chaque fil (Figure 3E).</li>
</ol>8. modifier le sens de la boucle de coeur
<ol><li>Suivez les étapes aux points 3.1 et 3.2 pour obtenir un tube capillaire extraite.</li>
	<li>Suivez les étapes de 5.1 et 5.10 à préparer l’embryon.</li>
	<li>Utilisez une paire de pinces pour faire basculer le filtre en papier pour que l’embryon devient ventrale-côté-vers le haut.</li>
	<li>Utiliser le tube capillaire extraite pour couper une fente dans la membrane de la splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>Utiliser le tube capillaire pour exercer une force mécanique pour pousser le coeur du côté droit au côté gauche.</li>
	<li>Suivez les étapes de 5.12 par 5.15 pour observer le changement en torsion.</li>
</ol>

<ol><li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://appliedmechanicsreviews.asmedigitalcollection.asme.org/article.aspx?articleid=1395451">Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis.</a> Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).</li>
<li>Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+models+for+mechanics+of+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Computational models for mechanics of morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).</li>
<li>Savin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+growth+and+form+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On the growth and form of the gut.</a> Nature. 476, 57-62 (2011).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+of+development%3A+Models+and+methods+for+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).</li>
<li>Shyer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Villification%3A+how+the+gut+gets+its+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Villification: how the gut gets its villi.</a> Science. 342, 212-218 (2013).</li>
<li>Ambrosi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+biological+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanics+and+Physics+of+Solids%22%5BJournal%5D)">Perspectives on biological growth and remodeling.</a> Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3530441">Tunable helical ribbons.</a> Appl. Phys. Lett. 98, (2011).</li>
<li>Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+cucumber+tendril+coils+and+overwinds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the cucumber tendril coils and overwinds.</a> Science. 337, 1087-1091 (2012).</li>
<li>Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+mechanics+in+the+opening+of+chiral+seed+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods.</a> Science. 333, 1726-1730 (2011).</li>
<li>Filas, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+role+for+differential+contractility+in+early+brain+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">A potential role for differential contractility in early brain development and evolution.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axons+pull+on+the+brain%2C+but+tension+does+not+drive+cortical+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding.</a> J. Biomech. Eng. 132, 71013(2010).</li>
<li>Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+embryonic+chick+brain+twists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">How the embryonic chick brain twists.</a> J. R. Soc. Interface. 13, (2016).</li>
<li>Manca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+regulates+axial+rotation+during+early+stages+of+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).</li>
<li>Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+of+the+looping+heart%3A+differential+growth+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bending of the looping heart: differential growth revisited.</a> J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+and+twisting+the+embryonic+heart%3A+A+computational+model+for+c-looping+based+on+realistic+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry.</a> Front. Physiol. 5, (2014).</li>
<li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphomechanics%3A+Transforming+tubes+into+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Morphomechanics: Transforming tubes into organs.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).</li>
<li>Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+effects+of+the+surface+ectoderm+on+optic+vesicle+morphogenesis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo.</a> J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+cytoskeletal+contraction+required+for+cardiac+fusion+before+but+not+after+looping+begins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?</a> Phys. Biol. 12, 16012(2015).</li>
<li>Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+and+stress-dependent+growth+shape+the+forebrain+of+the+early+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mech.+Behav.+Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).</li>
<li>Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotatin+is+a+novel+gene+required+for+axial+rotation+and+left-right+specification+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a, Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+chicken+embryo+culture+system+suitable+for+imaging+and+microsurgery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).</li>
<li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Arch.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).</li>
<li>Chuai, M., Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanisms+Underlying+Primitive+Streak+Formation+in+the+Chick+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo.</a> Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).</li>
<li>Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+forces+in+dextral+rotation+during+cardiac+looping+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo.</a> Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).</li>
<li>Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo.</a> Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+Effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces.</a> Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. <a target="_blank" href="https://journals.aps.org/prapplied/abstract/10.1103/PhysRevApplied.5.017001">Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting.</a> Phys. Rev. Appl. 5, (2016).</li>
<li>Manner, J., Seidl, W., Steding, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+cervical+flexure%3A+an+experimental+study+on+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos.</a> Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).</li>
<li>Ware, M., Schubert, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+early+axon+scaffold+in+the+rostral+brain+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo.</a> J. Anat. 219, 203-216 (2011).</li>
<li>Ramasubramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+intrinsic+and+extrinsic+forces+in+early+cardiac+S-looping%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping.</a> Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).</li>
<li>Hoyle, C., Brown, N. a, Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+left%2Fright+handedness+in+the+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of left/right handedness in the chick heart.</a> Development. 115, 1071-1078 (1992).</li>
<li>Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+adaptation+of+the+looping+embryonic+heart+to+altered+mechanical+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads.</a> Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).</li>
<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and the chick embryo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).</li>
<li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li>
<li>Peebles, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+proton+spectroscopy+and+diffusion+weighted+imaging+of+chick+embryo+brain+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo.</a> Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerberus+regulates+left-right+asymmetry+of+the+embryonic+head+and+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart.</a> Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Alors que les phénomènes physiques jouent un rôle essentiel dans la morphogenèse26,27,28,29,30, les mécanismes mécaniques spécifiques, ainsi que la coordination de la mécanique et mécanismes moléculaires, restent largement inexplorées. Il est connu que la flexion ventrale et la torsion vers la droite du cerveau primitif sont deux processus centrales qui contri...

La recherche en biologie du développement moderne en grande partie met l’accent sur le développement de la compréhension du point de vue de la génétique moléculaire1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. on sait que les phénomènes physiques jouent un rôle central dans la morphogenèse, ou la génération de biologique forme14,15,16,17; Cependant, les mécanismes mécaniques spécifiques de développement restent globalement peu étudiés. Ventrale flexion et torsion vers la droite du tube cerveau primitif après Hamburger-Hamilton étape 11 (HH 11)18 sont les deux principaux processus qui contribuent à la forme embryonnaire changent19,20. En particulier, le mécanisme physique qui sous-tendent le développement de torsion dans le cerveau embryonnaire reste incomplètement compris.
La torsion embryonnaire dans l’embryon de poulet est parmi les premiers événements morphogénétiques d’asymétrie (L-R) gauche-droite dans le développement. Lorsque le processus de l’asymétrie de la L-R est perturbé, malformations congénitales comme situs inversus, isomérieou heterotaxia aura lieu le21. Nous présentons ici un protocole qui allie ex-ovo expériences22,23 à modélisation physique pour caractériser les forces mécaniques pendant le développement précoce du cerveau embryonnaire. La méthode présentée vise à identifier les forces mécaniques responsables de torsion du cerveau ainsi que les facteurs qui influent sur le degré de torsion pendant début développement12. Basée sur l’observation expérimentale que la membrane vitelline (VM) contraint la face dorsale de l’embryon, nous avons émis l’hypothèse que la machine virtuelle fournit la force nécessaire pour induire la torsion du cerveau en développement. Par conséquent, dans cette méthode, nous avons supprimé la partie de la machine virtuelle qui couvre la zone du cerveau pour savoir les effets sur la torsion du cerveau. En outre, la méthode d’application liquide de tension superficielle a été utilisée pour confirmer le rôle mécanique de la machine virtuelle et de fournir une estimation de la force nécessaire pour la torsion de cerveau, qui n’avait pas été faite auparavant. Mesurer les forces au cours de la morphogenèse embryonnaire est une tâche difficile. Notamment, dans une étude pionnière, Campàs et ses collaborateurs24 a développé une nouvelle méthode pour quantifier le stress cellulaire à l’aide de gouttelettes injectée. Néanmoins, cette méthode se limite à mesurer des forces au niveau cellulaire, donc non applicable pour sonder les forces au niveau des tissus ou organisme. Le protocole présenté dans le présent document a été développé pour combler partiellement cette lacune.

<table><tbody><tr><td>Fécondé Œufs de poule White Leghorn exempts d’agents pathogènes spécifiques</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à tomographie cohérente</td><td>optique Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de poussin</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modèle P-30</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Logiciel</td> d’infographie 3D Comsol <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope attaché avec OCT</td><td>Nikon&nbsp ;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo reflex numérique mono-objectif</td><td>EOS&nbsp ;</td><td>Rebel T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

sonder les rôles des forces physiques dans la morphogenèse embryonnaire précoce de poussin

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Le développement embryonnaire est traditionnellement étudié du point de vue de la génétique biomoléculaire, mais l’importance fondamentale de la mécanique dans la morphogenèse est devenant de plus en plus reconnue. En particulier, le tube de coeur et le cerveau embryon de poulet, qui subissent des changements morphologiques qu’ils développent, sont parmi les candidats de choix pour étudier le rôle des forces physiques dans la morphogénèse. Progressive de flexion ventrale et de torsion vers la droite du cerveau de l’embryon de poulet tubulaire arrivent au stade plus précoce d’asymétrie gauche-droite au niveau de l’organe dans le développement embryonnaire de poussin. La membrane vitelline (VM) contraint la face dorsale de l’embryon et a été impliquée dans la fourniture de la force nécessaire pour induire la torsion du cerveau en développement. Nous présentons ici une combinaison de nouvelles expériences de l’ex-ovo et physique modélisation afin d’identifier les mécanismes de la torsion du cerveau. Au stade 11 de Hamburger-Hamilton, les embryons sont récoltés et mis en culture ex ovo (dans les médias). La machine virtuelle est ensuite supprimée à l’aide d’un tube capillaire extraite. En contrôlant le niveau d’huile et en soumettant l’embryon à une interface liquide-air, la tension de surface fluide des médias peut servir à remplacer le rôle mécanique de la machine virtuelle. Expériences de microchirurgie ont également été effectuées pour modifier la position du coeur de trouver les changements qui en résultent dans la chiralité de torsion de cerveau. Les résultats de ce protocole illustrent les rôles fondamentaux de la mécanique dans la conduite de la morphogenèse.

Dans cette étude, la machine virtuelle de l’embryon à HH11 a été retirée de l’extrémité antérieure de la flexion thoracique. Les embryons ont été photographiés par un système d’OCT. À ce stade, la torsion du tube de cerveau n’a pas démarré (Figure 1 a). Après être incubées à HH15-16, embryons avec leur VM enlevé expose réduite du cerveau, torsion du tube, environ 35 degrés (Figure 1 b) par rapport à contrôler des embryons, qui pr...

Nous présentons ici un protocole introduisant un ensemble de nouvelles expériences de l’ex-ovo et approches de modélisation physique pour étudier les mécanismes de la morphogenèse lors de torsion de cerveau embryonnaire précoce poussin.

Sonder les rôles des Forces physiques dans la morphogenèse embryonnaire précoce de poussin

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

L’objectif général de ce protocole expérimental est d’étudier le rôle des forces mécaniques dans le développement précoce du cerveau embryonnaire par le biais d’expériences ex ovo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement et en biomécanique, telles que le rôle des indices mécaniques dans la morphogenèse, qui est la génération de la forme biologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de caractériser le rôle des forces mécaniques dans la morphogenèse au niveau tissulaire et de l’organisme.Pour commencer cette procédure, utilisez des lingettes délicates contenant de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les œufs de poule White Leghorn fécondés sans agents pathogènes spécifiques. Ensuite, disposez les œufs dans une orientation longitudinale sur un support. Après cela, réglez l’incubateur d’œufs à une température cible de 37,5 degrés Celsius et maintenez l’humidité à 48 à 55 %L’humidité est contrôlée en ajoutant une quantité appropriée d’eau dans l’incubateur.Incuber les œufs pendant environ 40 à 44 heures jusqu’à HH11 à 13. Ensuite, laissez les œufs refroidir à température ambiante pendant environ 15 à 30 minutes avant de

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Cette vidéo montre deux couleurs monter toute l'hybridation in situ, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle des deux gènes différents peuvent être visualisées dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil et David Ingham Ish-Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Cet article décrit l'étiquetage de surface...

Suivi des déformations des tissus morphogénétiques dans l&#39;embryon de poulet Early

En greffant des billes imbibées de facteurs de croissance ou d’inhibiteurs spécifiques des voies de signalisation dans les embryons en développement, il est possible de tester directement leurs effets in vivo. Dans ce protocole, des billes sont greffées dans le bourgeon du membre pour déterminer les effets de ces molécules sur l’expression des gènes et la transduction du signal.

Intensification des Perles dans le développement d&#39;embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l&#39;expression des gènes

Des protocoles utilisant des barrières imperméables pour bloquer les événements d’induction entre les tissus de l’axe principal du corps et du flanc de l’embryon de poussin nécessaires à la formation des membres sont décrits. Des billes imprégnées de signaux inductifs candidats sont utilisées pour surmonter l’effet du placement de la barrière et l’analyse de l’expression des gènes le confirme.

Application des barrières imperméables combinées avec le facteur de candidat Perles Soaked pour étudier les signaux inductifs dans le poussin

Le manque d’outils pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo empêche de valider leurs rôles au cours du développement. Nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) et suivi des nanoparticules pour quantifier les caractéristiques mécaniques sur la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie. Ces méthodes sont fiables et largement applicable en évitant des interventions intrusives.

AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre

Nous présentons un programme d’installation de pinces optiques couplées à un microscope de nappe de lumière et sa mise en œuvre pour sonder la mécanique cellulaire sans billes dans l’embryon de drosophile .

Palpage mécanique cellulaire avec des pinces optiques exempt de perle dans l’embryon de drosophile

Les membres recombinants sont un modèle expérimental puissant qui permet d’étudier le processus de différenciation cellulaire et la génération de motifs sous l’influence de signaux embryonnaires. Ce protocole présente une méthode détaillée pour générer des membres recombinants avec des cellules mésodermiques de membres de poulet, adaptables à d’autres types de cellules obtenues à partir de différents organismes.

Test des membres recombinants du poulet pour comprendre la morphogenèse, la modelation et les premières étapes de la différenciation cellulaire

Le test des billes trempées implique l’administration ciblée de réactif de test à n’importe quel moment du développement pour étudier la régulation de la différenciation cellulaire et de la morphogenèse. Un protocole détaillé, applicable à tout modèle animal expérimental, pour préparer trois types différents de perles trempées et les implanter dans l’interdigit d’un embryon de poulet est présenté.

Analyse de la différenciation cellulaire, de la morphogenèse et de la modelation au cours de l’embryogenèse du poulet à l’aide du test des perles trempées

Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.

Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus

Ce protocole a été développé pour surveiller longitudinalement les propriétés mécaniques du tissu de la plaque neurale pendant la neurulation de l’embryon de poulet. Il repose sur l’intégration d’un microscope Brillouin et d’un système d’incubation sur scène, permettant l’imagerie mécanique en direct du tissu de la plaque neurale dans des embryons de poussins cultivés ex ovo .

Surveillance de l’évolution mécanique des tissus lors de la fermeture du tube neural d’un embryon de poussin

Découvrez comment étudier les forces mécaniques dans la morphogenèse du cerveau embryonnaire de poussin grâce à des expériences ex-ovo et une modélisation physique. Cette méthode permet de caractériser les mécanismes du développement cérébral précoce.

Sonder les rôles des Forces physiques dans la morphogenèse embryonnaire précoce de poussin

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