Sonder les rôles des Forces physiques dans la morphogenèse embryonnaire précoce de poussin

L’objectif général de ce protocole expérimental est d’étudier le rôle des forces mécaniques dans le développement précoce du cerveau embryonnaire par le biais d’expériences ex ovo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement et en biomécanique, telles que le rôle des indices mécaniques dans la morphogenèse, qui est la génération de la forme biologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de caractériser le rôle des forces mécaniques dans la morphogenèse au niveau tissulaire et de l’organisme.

Pour commencer cette procédure, utilisez des lingettes délicates contenant de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les œufs de poule White Leghorn fécondés sans agents pathogènes spécifiques. Ensuite, disposez les œufs dans une orientation longitudinale sur un support. Après cela, réglez l’incubateur d’œufs à une température cible de 37,5 degrés Celsius et maintenez l’humidité à 48 à 55 %L’humidité est contrôlée en ajoutant une quantité appropriée d’eau dans l’incubateur.

Incuber les œufs pendant environ 40 à 44 heures jusqu’à HH11 à 13. Ensuite, laissez les œufs refroidir à température ambiante pendant environ 15 à 30 minutes avant de les nettoyer avec de l’éthanol à 70 %. Dans cette étape, cassez les œufs par le bas, séparez doucement la coquille et déposez soigneusement le contenu dans une boîte de Pétri de 150 x 15 millimètres.

Pour vous assurer que le côté embryon est vers le haut, gardez les œufs dans la même orientation qu’ils ont été incubés lors de leur cassure. Prélever la fine albumine à l’aide d’une pipette Pasteur jetable. Séparez l’albumine épaisse du jaune à l’aide de la pince à bout émoussé.

Assurez-vous que l’albumine épaisse a été éliminée en raclant légèrement le haut du jaune. Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, placez un anneau en papier filtre sur l’embryon et centrez-le, en faisant correspondre l’axe long de l’anneau avec l’axe long de l’embryon. Par la suite, coupez le jaune entourant l’anneau de papier filtre avec des ciseaux.

Ensuite, retirez l’anneau et l’embryon du jaune dans une direction oblique vers le site où le jaune a été coupé pour la première fois. Ensuite, rincez l’embryon dans deux plats séquentiels de 100 millimètres avec du PBS à température ambiante. Ensuite, placez un anneau de papier filtre dans une boîte de Pétri de 35 millimètres.

Placez la face dorsale de l’embryon vers le haut sur l’autre papier filtre dans la boîte de Pétri de 35 millimètres. Après cela, placez un anneau en acier inoxydable sur le sandwich en papier filtre. Veillez à ne pas endommager l’embryon.

Maintenant, ajoutez trois millilitres du CCM préalablement préparé dans chaque boîte de Pétri. Retirez la membrane vitelline de chaque embryon en effleurant légèrement l’aiguille capillaire tirée sur le haut de l’embryon. Ensuite, décollez la membrane vitelline, en commençant par l’extrémité antérieure et en continuant jusqu’à la notocorde.

Ensuite, placez huit boîtes de Pétri de 35 millimètres dans une boîte de 150 millimètres recouverte de lingettes saturées d’eau pour maintenir l’humidité. Ensuite, placez la boîte de Pétri de 150 millimètres dans un sac en plastique refermable et remplissez le sac d’un mélange gazeux composé de 95 % d’oxygène et de 5 % de CO2. Fermez le sac et placez-le dans un incubateur à 37,5 degrés Celsius.

Maintenant, retirez l’embryon de l’incubateur et utilisez un système OCT pour les imager et déterminer l’angle de torsion du tube neural. Transférez les embryons dans un microscope optique et visualisez-les à un grossissement de 10X. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, on retire progressivement 0,2 millilitre de média de la boîte de Pétri.

Prenez des images en fond clair après chaque série de retrait du support pour observer l’effet de l’interface média-air sur l’embryon. Continuez à prélever le milieu jusqu’à ce que la tension superficielle à travers l’embryon induise une torsion. Imagez à nouveau l’embryon à l’aide du système OCT afin d’établir un angle de torsion final à comparer avec les embryons témoins.

Pour modifier la direction de l’anse cardiaque, utilisez une paire de pinces pour retourner le papier filtre afin que l’embryon devienne ventral vers le haut. Ensuite, utilisez le tube capillaire tiré pour ouvrir une fente dans la membrane du splanchnopleure et pour exercer une force mécanique pour pousser le cœur du côté droit vers le côté gauche. Appliquez la tension superficielle fluide pour maintenir le cœur du côté gauche.

Ensuite, incubez l’embryon pendant encore 20 heures pour voir le changement de chiralité de la torsion. On voit ici un embryon récolté avec VM retiré à HH11. Le même embryon a incubé pendant 27 heures après l’ablation de la VM, montrant une torsion réduite.

Voici le même embryon qui a subi une torsion cérébrale lors de l’application d’une tension superficielle fluide, et voici l’embryon témoin avec une torsion cérébrale normale à un stade comparable. Lors de cette procédure, il est important de faire attention à ne pas endommager l’embryon. En suivant cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse par éléments finis peuvent être effectuées afin de modéliser par calcul comment les forces physiques peuvent influencer la morphologie.

Par conséquent, cette technique développée ici a ouvert la voie à de futures études sur la mécanique de la morphogenèse chez les embryons de poulet. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment récolter des embryons de poussin pour la culture in vitro, retirer micro-chirurgicalement la membrane vitelline, récapituler la force fournie par la membrane vitelline et surveiller la morphologie embryonnaire grâce à l’OCT et à l’imagerie en fond clair.