Summary
Α-hydroxylering af kræftfremkaldende nitrosaminer af cytokrom P450s er den accepterede stofskiftevej, der producerer DNA-skader mellemprodukter, som forårsager mutationer. Men nye data viser yderligere oxidation til nitrosamides kan forekomme. Vi beskriver en generel metode til påvisning af nitrosamides fremstillet af in vitro- cytokrom P450-katalyseret metabolisme af nitrosaminer.
Abstract
N-nitrosaminer er en veletableret gruppe af miljømæssige kræftfremkaldende stoffer, som kræver cytokrom P450 oxidation at udstille aktivitet. Accepteret mekanisme af metabolisk aktivering omfatter dannelsen af α-hydroxynitrosamines, der spontant nedbrydes til DNA alkylerende stoffer. Ophobning af DNA-skader og de deraf følgende mutationer kan i sidste ende føre til kræft. Nye tyder på, at α-hydroxynitrosamines kan yderligere oxideres til nitrosamides processively af cytokrom P450s. Fordi nitrosamides er generelt mere stabile end α-hydroxynitrosamines og kan også alkylatbenzin DNA, kan nitrosamides spille en rolle i carcinogenese. I denne betænkning beskriver vi en generel protokol for at vurdere nitrosamide produktion fra in vitro- cytokrom P450-katalyseret metabolisme af nitrosaminer. Denne protokol udnytter en generel tilgang til syntesen af de relevante nitrosamides og en in vitro- cytokrom P450 stofskifte analyse ved hjælp af liquid chromatography-nanospray ionisering-høj opløsning tandem massespektrometri til påvisning. Denne metode fundet N′- nitrosonorcotinine som en mindre metabolit af N′- nitrosonornicotine i eksempel undersøgelse. Metoden har høj følsomhed og selektivt behørigt at nøjagtigt masse påvisning. Anvendelse af denne metode på en bred vifte af Nitrosamin-cytokrom P450 systemer vil hjælpe med at bestemme det generelle indhold af denne transformation. Fordi cytokrom P450s er polymorfe og varierer i aktivitet, kunne en bedre forståelse af nitrosamide dannelse støtte i enkelte kræft risikovurdering.
Introduction
N-nitrosaminer er en stor klasse af kræftfremkaldende stoffer fundet i kosten, tobaksvarer og det generelle miljø; de kan også dannes endogent i den menneskelige krop1. Mere end 300 N -nitroso forbindelser er blevet testet og > 90% blev evalueret som kræftfremkaldende i dyre modeller2,3. Til at udstille deres carcinogenicitet, skal disse forbindelser først aktiveres af cytokrom P450s1,2,3. Forskning viser, at cytokrom P450s let oxiderer nitrosaminer til α-hydroxynitrosamines (figur 1), som er meget reaktive forbindelser med halveringstider ~ 5 s før spontant nedbrydes til alkyldiazohydroxides. Sidstnævnte kan alkylatbenzin DNA efter tabet af H2O og N2. Den resulterende DNA adukter, hvis skadevirkningen, kan forårsage mutationer, der i kritiske Kræftpsykologisk- eller tumor suppressor gener, fører til kræft udvikling1. Af denne grund, meget indsats har blevet brugt for at opnå en fuld forståelse af de metaboliske reaktionsveje, DNA adukter, og downstream metabolitter af cytokrom P450 oxidation af kræftfremkaldende nitrosaminer. Denne viden har potentielle anvendelse i enkelte cancer risiko vurdering4.
Figur 1: General og foreslåede metabolisme af nitrosaminer.
Nitrosaminer (1) oxideres af P450s til α-hydroxynitrosamines (2) der spontant nedbrydes til alkyldiazohydroxides (3). Disse forbindelser kan binde til DNA til at danne DNA adukter. Det er en hypotese at 2 oxideres videre af P450s til nitrosamides 4. Disse kan direkte binde til DNA til at danne nye DNA adukter eller være hydrolyseret 3 -form kendt DNA adukter. F1 og F2 repræsenterer enhver alkyl gruppen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Selv om α-hydroxynitrosamine hypotese er solidt understøttet af omfattende data, er der et par uoverensstemmelser; en større man er den korte half-life af α-hydroxynitrosamines5,6. Det er kendt, at disse forbindelser er produceret på endoplasmatiske reticulum membran og senere alkylatbenzin nukleare DNA. I betragtning af deres levetid af et par sekunder, det forvirrende, hvordan disse mellemprodukter overleve den nødvendige rejse selv i cytosol. En hypotese er, at en del af α-hydroxynitrosamines processively er oxideret til nitrosamides7,8, hvilket er ret stabilt i sammenligning9. Dette vil formentlig ske via fastholdelse af α-hydroxynitrosamines i cytokrom P450 aktive site. Præcedens for denne form for oxidering har været set med nikotin10, alkoholer11og enkle alkylnitrosamines12,13. Derudover er nitrosamides direkte virkende kræftfremkaldende2,3. Baseret på deres reaktivitet9, menes disse forbindelser at producere DNA adukter identiske med dem som følge af α-hydroxynitrosamines sammen med nye, uudforskede DNA adukter (figur 1). Således, denne hypotese ikke kun forklarer transport gennem i cytosol, men også dannelsen af DNA skade produkter.
I dette papir, er en generel protokol for at vurdere in vitro- cytokrom P450-medieret konvertering af nitrosaminer til nitrosamides beskrevet. Den tidligere rapporteret konvertering af N′- nitrosonornicotine (NNN) til N′- nitrosonorcotinine (NNC) af cytokrom P450 2A6 er fremvist som et eksempel14. Anvendelse af denne protokol på en bred vifte af substrat-enzym systemer vil hjælpe med at bestemme betydningen af nitrosamides i overordnede Nitrosamin stofskifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. materialer og generelle procedurer
- Synthesize NNN som tidligere beskrevet 15. Opnå norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH regenerering system, 0,5 x reaktion buffer, og alle andre kemikalier eller opløsningsmidler fra kommercielle kilder i reagens grade.
- Optage NMR spektre på en 500 MHz-spektrometer. Betænkningen kemiske Skift som dele per million (ppm). Bruge resterende opløsningsmiddel toppe som interne referencer for 1 H-NMR (7.26 ppm CDCl 3) og 13 C-NMR (77.2 ppm CDCl 3).
Bemærk: Peak opdeling anvendes følgende forkortelser: s = singlet, d = doublet, dd = doublet af dubletter, dt = doublet af trillinger, dq = doublet af kvartetter, ddd = doublet af doublet dubletter og m = multiplet. - Udføre høj opløsning massespektrometri (HRMS) for valgte forbindelser på en LTQ Orbitrap Velos og rapportdata som m/z.
- Brug polygram overfladebelagt silicagel TLC plader (40 mm x 80 mm, 0,2 mm tyk) med 254 nm fluorescerende indikator til tyndtlagskromatografi (TLC). Visualisere TLC plader af UV-lampen bestråling.
- Udføre flash kromatografi på en 60 Å, 70-150 mesh silica gel ved hjælp af en 1,5 cm x 15 cm glaskolonne.
2. Forberedelse af nitrosamide positiv kontrol (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- tør, i ovnen natten over (16 h, ~ 140 ° C), en 25 mL, runde-bunden kolbe indeholdende en magnetisk røre bar. Om morgenen, cool kolben under en strøm af N 2 mens du bruger en olie Bobleflasken for at holde N 2 flow Vurder under ét bubble per sekund.
Bemærk: Efter afkøling, ingen forholdsregler til at holde kolben under N 2 er påkrævet. - i et stinkskab, tilføje norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), eddikesyreanhydrid (5 mL) og eddikesyre (1 mL) til den afkølede kolbe. Rør blandingen konstant mens køling til 0 ° C med en vand-is bad.
Forsigtighed: Eddikesyreanhydrid og eddikesyre er ætsende. - Tilføje NaNO 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) i en portion og løbende Rør blandingen til 2,5 h. skærm reaktion fremskridt ved TLC (100% EtOAc, R f = 0,19, se trin 1.4).
Bemærk: Over denne tid, blandingen bliver mere og mere gule med lejlighedsvise boblende. - Slukke reaktionen ved at hælde blandingen i iskold H 2 O (18 mL). Straks uddrag den vandige opløsning med 18 mL af CH 2 Cl 2 i en 100 mL skilletragt. Uddrag den vandige lag mindst 2 ekstra gange med CH 2 Cl 2 (9 mL hver).
- Tør de poolede organics over ~ 100 mg af MgSO 4 i 2 min. Filter og koncentrere sig løsningen af roterende fordampning til giver en rå, gul olie. Varme vandbad til 30 ° C under fordampning til at fjerne de resterende eddikesyre.
Bemærk: Protokollen kan blive standset her hvis stoffet er opløst i CH 2 Cl 2 og løsningen opbevaret i mørke ved 2-8 ° C. - Rense den rå sammensatte af kolonne kromatografi (Se trin 1,5) ved hjælp af silica gel som stationær fase og 100% EtOAc som elueringsvæsken 16.
Forsigtighed: NNC og relaterede nitrosamides skal håndteres med omhu, da de formodes for at være kræftfremkaldende hos mennesker. - Opløses det rene stof i CDCl 3 og bruge NMR (Se trin 1.2) til at bekræfte strukturen og bestemme molariteten af denne løsning 17. Gemme denne løsning i mørke ved 2-8 ° C indtil behov.
Bemærk: Denne løsning vil blive brugt som den positive kontrol i in vitro- analysen (trin 3.5). NMR spektre og kemiske Skift er tilgængelig i oplysningerne om støtte. - Med en ren NNC løsning, bekræfte den præcise overordnede masse og bestemme produkt ion masserne ved direkte infusion på en høj opløsning massespektrometer (HRMS) under parametre, der beskrives i trin 1.3 og 4.3.
Bemærk: Produktet masserne vil blive anvendt til påvisning af dette stof i in vitro- stofskifte analysen (trin 4.3).
3. Et eksempel Nitrosamin-P450 in vitro- inkubation
- fjerne P450 2A6 Baculosomes, livagtig-NADPH-regenerering System og 10 mM NADP + Stock løsning fra en-80 ° C fryser og lad dem tø på is. Når optøet, fortyndes Baculosomes og NADPH-regenerering System 1:10 og 1:50, henholdsvis ind i en ugifte 1 mL rør med 0,5 X reaktion Buffer. På samme måde tilføje 3 μL af NADP + Stock løsning til 97 μL af 0,5 X reaktion Buffer.
Bemærk: NADP + er lysfølsomt. Holde denne løsning, der er beskyttet af indpakning dets beholder i aluminiumsfolie. Enzym løsninger er følsomme over for fryse-tø cykler; begrænse denne til ikke mere end 2 cykler. Forberede delprøver som nødvendigt for fremtidige eksperimenter. - For hver inkubation, tilsættes 50 μL af enzymet løsning (indeholdende 5 pmol P450) til en 1 mL rør indeholdende 40 μL af 4 μM NNN løsning lavet med reaktion Buffer. Pre Inkuber denne nye blanding i 2 minutter ved 37 ° C ved hjælp af et vandbad og derefter tilsættes 10 μL fortyndet NADP + løsning. Inkuber den fuld ordning for 1-30 min. ved 37 ° C.
Bemærk: Brug af 5-min. intervaller for inkuberingstider (f.eks. 5, 10, 15 min, etc.) vil give en tilstrækkelig nitrosamide dannelse tidsforløb. - Efter den ønskede inkubationstiden, dæmpning af første tilføje 10 μl 3,0 N ZnSO 4 og derefter 10 μL 3,0 N Ba(OH) 2. Vortex denne løsning og et hvidt bundfald vil danne. Centrifugeres prøve på 8000 x g i 4 min. at sammenpresse bundfaldet.
Bemærk: Proceduren skal ikke pause på dette trin, da de dannede nitrosamides har begrænset stabilitet i vandige opløsninger. Lange pauser kan resultere i falske negativer. - Straks afpipetteres supernatanten og analysere 2 μl af væskekromatografi positive nanoelectrospray-ionisering høj opløsning tandem massespektrometri (LC-NSI +-HRMS/MS, trin 4.1-4.3).
- For positiv kontrol inkubationer, fordampe en alikvot del indeholdende 100 fmol syntetiserede NNC løsning i en 1 mL rør under en strøm af N 2. Denne hætteglas, tilføje fuld enzym-systemet fra trin 3.2 og fortsætte som beskrevet for trin 3.3-3.4.
- For negativ kontrol inkubationer, udføre eksperimentet som beskrevet (trin 3.2-3.4) undtagen Erstat 50 μL enzym løsning med 0,5 X reaktion buffer.
4. Eksempel parametre for nitrosamide påvisning af LC-NSI +-HRMS/MS
- For LC komponent, gælder følgende multi-step gradient taktfast 4.2 til et UPLC system ved hjælp af en kommerciel, hånd-pakket 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm blænde kapillarkolonne.
- Ved hjælp af 5 mM NH 4 OAc som opløsningsmiddel A og MeCN som opløsningsmiddel B, indlæser prøven kolonne ved at køre på 5% B på 1 μL/min fra 0 - 5 min, og derefter bremse strømningshastighed til 0,3 μl/min. bagefter. Kør derefter en gradient fra 5 til 20% B over 4 min, efterfulgt af en rampe til 55% B over 10 min, og derefter fornyet ækvilibrering til 5% B.
- Udføre LC-NSI +-HRMS/MS på et LTQ Orbitrap. Skærm for NNC af både fuld scanning og MS 2 fragmentering. Udfør fuld scanning med en opløsning på 60.000 og uddrag den nøjagtige overordnede masse (192.07670) på en masse tolerance af 5 ppm. Brug MS 2 fragmentering at isolere overordnede ioner (2,0 amu) og fragment af kollision-induceret dissociation (CID) med en kollisionen energi af 25 eV, opløsning af 15.000, og scan tid af 30 ms. udtrække nøjagtige masserne for produkt ioner af NNC (m/z 192 m/z 134.04739 og 162.07874) på en masse tolerance af 5 ppm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseret på arbejde udført af hvide mfl. 19, norcotinine var nitrosoderivater til NNC Proper og i højt udbytte (80-92%) til at producere en standard for in vitro- eksperiment. Strukturelle beviser for en vellykket reaktion blev indhentet fra spektroskopiske analyser herunder 1H-NMR, 13C-NMR, HYGGELIGE og HSQC (støtte oplysninger) sammen med HRMS, som bekræftede den overordnede masse [M + H]+ i 5 ppm af de teoretiske værdi (figur 2). MS2 fragmentering af NNC blev brugt til at bestemme de mest rigelige produkt ion masserne. Målrettet præcis overordnede masse og produkt ion masserne blev brugt i LC-NSI+- HRMS/MS metoden af in vitro assay. Hvis opbevaret i mørke ved 2-8 ° C, er NNC løsningen stabil i mindst 3 måneder. Da dette er en meget generel reaktion, har det ansøgning til enhver 2° akrylamid.
Figur 2: HRMS og HRMS2 spektrum af NNC.
A) nøjagtig overordnede masse NNC med en masse tolerance af 5 ppm: beregnet: [M + H]+ = 192.07675, fundet: 192.07670. B) MS2 fragmentering af m/z 192 med en isolation bredde 2.0 amu. De to mest udbredte produkt ioner er 134.04739 og 162.07875. Genoptrykt med tilladelse fra Chem. Res. Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Syntetiserede NNC blev udnyttet som standard for in vitro- P450 stofskifte assay. Cytokrom P450 2A6 blev brugt, fordi det er kendt for at være en effektiv katalysator for NNN oxidation20. Ligeledes, NNN koncentrationen blev sat til 2 μM som det tilnærmer Km til α-hydroxylering21. Under de chromatografiske betingelser beskrevet, eluerer syntetiske NNC ~17.5 min. med godt løst tinder i både den overordnede ion og produkt ion kanaler. I overensstemmelse med den positive kontrol fremgår dannelsen af NNC af 1, 5 og 10 min inkubationer.
Figur 3: LC-NSI-HRMS kromatogrammer skyldes NNN-cytokrom P450 2A6 inkubationer.
For alle sektioner er top kromatogrammet den nøjagtige overordnede masse udvundet fra fuld scanning for NNC. De midterste og nederste kromatogrammer er to præcise produkt ion masserne udvundet fra MS2 fragmentering for NNC. Sektioner er som følger: NNC standard (A), NNC-cytokrom P450 2A6 inkubationer indeholdende alle relevante enzymer og cofaktorer med inkuberingstider 1 min (B), 5 min (C) og 10 min (D). RT = retentionstid; MA = masse område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
NNC niveauer var maksimal på 5 min og faldt på senere tidspunkter. Relative kvantificering ved hjælp af syntetiske NNC som en standard anslået maksimale NNC niveauer for at være 10 nM. I den negative kontrol mangler P450 systemet, ingen NNC dannelse blev opdaget (data ikke vist), således der angiver enzymatisk konvertering var påkrævet. Sammen, viser denne protokol direkte beviser for konvertering af NNN til NNC af P450 2A6, selv om omfanget af dannelse er mindre sammenlignet med α-hydroxylering af NNN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belyse metabolismen af nitrosaminer er et afgørende element til at forstå deres kræftfremkaldende egenskaber. Da de involverede cytokrom P450s og andre metaboliske enzymer er polymorfe, kunne yderligere anvendelse af denne viden potentielt identificere høj risiko personer1,4. Nye data viser, at yderligere oxidation af α-hydroxynitrosamines, de formodede vigtigste metabolitter af nitrosaminer involveret i DNA bindende, at nitrosamides er muligt; men dette har ikke været håndfast testet på tværs af en bred vifte af substrater. Vi har beskrevet en protokol til bestemmelse af omfanget af processive oxidation af nitrosaminer til nitrosamides in vitro. Bred anvendelse af denne metode vil hjælpe med at bestemme den overordnede vigtighed af denne rute af stofskiftet.
Metoden, der starter ved at udarbejde en standard for nitrosamide af interesse. I eksempel undersøgelse er det NNC, en hypotetisk metabolit af tobak kræftfremkaldende NNN, et kræftfremkaldende stof fundet i tobak produkter14,22. Som beskrevet, gik nitrosation af norcotinine glat med ingen mærkbar side produkter. Den rå vare blev forurenet med kun start akrylamid og eddikesyre, som var let fjernes ved kolonne kromatografi. Dette blev efterfulgt af bekræftelse af strukturen af NMR og HRMS. En fordel ved denne metode er, at det er velegnet til stort set alle akrylamid, som giver mulighed for flere Nitrosamin/nitrosamide systemer skal undersøges. Desuden giver brug af NMR til kvantitering en direkte måling af molariteten for standardopløsning17. Dette giver mulighed for opbevaring af sammensatte under inert betingelser i stedet kræver måling af destruktive teknikker såsom omvendt-fase HPLC. Derefter kan forskellige fortyndinger gøres der passer til eksperiment designet.
Med en positiv kontrol og en vel karakteriseret masse opsplitning mønster, den yderst følsom og selektiv LC-NSI+- HRMS/MS metode giver mulighed for påvisning af nitrosamides i en relativt kompleks matrix. Som vist, anslået metoden en NNC koncentration af 1-10 nM eller 2-20 fmol på kolonnen trods den 1000-fold overskud af starter Nitrosamin, enzym og andre cofaktorer. Følsomhed og selektivitet af metoden er på grund af brugen af høj opløsning masse overvågning, som standard LC-MS systems manglende. Overordnede ion udvalg med en 5-ppm masse tolerance sikrer, at kun forbindelser med den ønskede molekylformel er isoleret. Ligeledes giver nøjagtige masse påvisning af de to mest udbredte produkt ioner sammen med deres retentionstid yderligere analysand bekræftelse. Derfor kræver metoden massespektrometri, mange parametre er optimeret herunder isolation bredde, kollisionen energi og scanning tid. LC gradient kan også ændres for at forbedre følsomheden som co eluering med andre stoffer vil begrænse fylde ion trap med målet nitrosamide.
I eksempel undersøgelse14var NNC dannelse mindre. Baseret på massive område, NNC blev ~ 4000-fold mindre rigelige end de hydrolyseret produkter af α-hydroxyNNN21. Selvom dette indikerer NNC er en meget mindre metabolit af NNN, kan andre systemer variere. Chowdhury mfl. fundet betydelige, processive oxidation af dimethylnitrosamine og diethylnitrosamine; men nitrosamide mellemliggende var målbart under deres betingelser12. Det er muligt at Genanalyse deres system af den teknik beskrevet her kunne afsløre nitrosamide dannelse. Uanset deres dannelse niveau, kan den højere stabilitet af nitrosamides i forhold til α-hydroxynitrosamines indikere, at disse forbindelser har biologisk betydning, som de bør lettere transport i cellen.
Selvom denne metode vil være gældende for de fleste Nitrosamin-enzym systemer, er der visse begrænsninger. Den mest betydningsfulde er, at metoden ikke er kvantitativ. I eksempel eksperiment, blev dannelse anslået fra den massespektrometriske topareal af en positive kontrolprøve. En mere nøjagtig måling, kunne en isotop-fortynding metode udnytter en brændselsfremstilling mærket nitrosamide udvikles. En anden fremgangsmåde ville gennemførelse af en diffusering strategi med forbindelser som N- acetyllysine eller N- acetylcystein, men dette lykkedes ikke til dato i vores hænder14.
En anden begrænsning er nitrosamides tendens til at hydrolysere nemt9; dermed skal prøver behandles individuelt. Dette bremser arbejdsprocessen og forhindrer prøver sendes til samarbejdspartnere for analyse. Endelig skal det bemærkes, at selv om cytokrom P450 2A6 og mange andre er kommercielt tilgængelige, nogle kræver protein proteinekspression og -oprensning at opnå. For eksempel, denne analyse blev anvendt til cytokrom P450 2A1314, men det er kun tilgængelig efter en streng isolation proces23.
I sammendrag, har vi beskrevet en protokol til påvisning af nitrosamides som følge af cytokrom P450-katalyseret oxidation af nitrosaminer in vitro. Protokollen indeholder en generel syntese for en nitrosamide standard som positiv kontrol og en in vitro- cytokrom P450 stofskifte analyse ved hjælp af LC-NSI+- HRMS/MS til påvisning. I undersøgelsen eksempel blev NNC registreret på alle inkubation times spænder fra 1-10 min, men kun som en mindre metabolit af NNN. Anvendelse af denne protokol på andre nitrosaminer vil vurdere dets generalitet og nitrosamides i Nitrosamin carcinogenese potentielle rolle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud ikke. CA-81301 fra National Cancer Institute. Vi takker Bob Carlson for redaktionelle bistand, Dr. Peter Villalta og Xun Ming for massespektrometri bistand i den analytisk biokemi delt ressource af frimurerisk Cancer Center, og Dr. Adam T. Zarth og Dr. Anna K. Michel for deres værdifulde drøftelser og input. Analytisk biokemi delt ressource understøttes delvist af National Cancer Institute kræft Center støtte Grant CA-77598
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
- Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
- Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
- Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
- Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
- Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
- Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
- Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
- Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
- Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
- von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
- Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
- Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
- Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
- Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
- Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
- van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
- White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
- Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
- Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
- Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
- von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).
