Summary
यहाँ, सिंथेटिक या इन इन इन इन विट्रो लिखित आरएनए पर मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए इन विट्रो परख में एक एंटीबॉडी मुक्त वर्णित है।
Abstract
आरएनए के 100 से अधिक रासायनिक रूप से अलग संशोधन हैं, जिनमें से दो तिहाई मेथिलेशन से मिलकर बनता है। आरएनए संशोधनों में रुचि, और विशेष रूप से मिथाइलेशन, एंजाइमों कि लिखने और उन्हें रोग और कैंसर के लिए प्रासंगिक जैविक प्रक्रियाओं में मिटा द्वारा निभाई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण फिर से उभर गया है. यहाँ, सिंथेटिक या इन इन विट्रो लिखित आरएनए पर आरएनए मिथाइलेशन लेखक गतिविधि के सटीक विश्लेषण के लिए इन विट्रो परख प्रदान की गई है। इस परख एस-एडेनोसिल-मेथियोनीन के एक tritiated रूप का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्राइटियम के साथ मेथिलेटेड आरएनए की सीधी लेबलिंग होती है। ट्राइटियम विकिरण की कम ऊर्जा विधि को सुरक्षित बनाती है, और ट्राइटियम संकेत प्रवर्धन के पूर्व-मौजूदा तरीकों, यह संभव मात्रा निर्धारित करने के लिए और एंटीबॉडी के उपयोग के बिना methylated आरएनए कल्पना करने के लिए, जो आमतौर पर कलाकृतियों के लिए प्रवण हैं बनाते हैं। हालांकि इस विधि आरएनए मिथाइलेशन के लिए लिखा गया है, कुछ tweaks यह अन्य आरएनए संशोधनों कि रेडियोधर्मी लेबल किया जा सकता है के अध्ययन के लिए लागू करते हैं, जैसे आरएनए एसिटाइलेशन के साथ 14सी एसिटाइल कोएंजाइम ए कुल मिलाकर, इस परख जल्दी आरएनए का आकलन करने के लिए अनुमति देता है methylation शर्तों, छोटे अणु inhibitors, या आरएनए या एंजाइम उत्परिवर्ती के प्रभाव के साथ निषेध, और सत्यापित करने और कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों का विस्तार करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Introduction
डीएनए, आरएनए और प्रोटीन संशोधन है कि कसकर जीन अभिव्यक्ति1को विनियमित करने के अधीन हैं. इन संशोधनों में, मिथाइलेशन सभी तीन जैवबहुलकों पर पाए जाते हैं। पिछले तीन दशकों के दौरान डीएनए और प्रोटीन मिथाइलेशन का बहुत अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है। इसके विपरीत, आरएनए मिथाइलेशन में रुचि हाल ही में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के प्रकाश में राज ित की गई है कि प्रोटीन जो विकास और रोग2में आरएनए मेथिलेशन लिखते हैं, मिटाते हैं या बांधते हैं। प्रचुर मात्रा में राइबोसोमल और स्थानांतरण आरएनए में बेहतर ज्ञात कार्यों के अलावा, आरएनए मिथाइलेशन रास्ते विशिष्ट दूत आरएनए स्थिरता को विनियमित3,4, जोड़5 और अनुवाद6,7, मिर्ना प्रसंस्करण8,9 और प्रतिलेखन ीय ठहराव और रिलीज10,11.
यहाँ, आण्विक जीव विज्ञान प्रयोगशाला की स्थापना में आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि के इन विट्रो सत्यापन के लिए एक सरल और मजबूत विधि की सूचना दी गई है (चित्र 1में संक्षिप्त)। कई अध्ययन ब्याज के आरएनए संशोधन के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ डॉट-ब्लॉट के माध्यम से एक आरएनए मिथाइलट्रांसफर्स की गतिविधि का आकलन करते हैं। तथापि, डॉट ब्लॉट आरएनए मिथाइलट्रांसफर्स के साथ ऊष्मायन पर आरएनए की अखंडता की पुष्टि नहीं करता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि nucleases के साथ रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की भी मामूली संदूषण आंशिक आरएनए गिरावट और confounding परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, यहां तक कि अत्यधिक विशिष्ट आरएनए संशोधन एंटीबॉडी विशिष्ट दृश्यों या संरचनाओं के साथ असंशोधित आरएनए को पहचान सकते हैं। इन विट्रो आरएनए मेथिलट्रांसफरेज परख यहाँ रिपोर्ट इस तथ्य का लाभ लेता है कि एस-एडेनोसिल मेथियोनीन को मिथाइल समूह दाता पर tritiated किया जा सकता है (चित्र 1), मेथिलेटेड आरएनए के लिए एंटीबॉडी के उपयोग के बिना सही तरीके से पता लगाया जा सकता है . निर्देश इन विट्रो प्रतिलेखन और ब्याज की एक प्रतिलिपि के शुद्धि और ब्याज के एंजाइम द्वारा कहा प्रतिलिपि के मिथाइलेशन के परीक्षण के लिए प्रदान की जाती हैं. इस विधि लचीला और मजबूत है, और किसी भी परियोजना की जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इन विट्रो लिखित और शुद्ध आरएनए, रासायनिक संश्लेषित आरएनए, लेकिन सेलुलर आरएनए का भी उपयोग किया जा सकता है। इस परख scintillation मायने रखता है के रूप में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है, साथ ही गुणात्मक जानकारी दिखा रहा है, जहां वास्तव में methylated आरएनए एक जेल पर चलाता है. यह एक आरएनए methyltransferase के समारोह में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, विशेष रूप से जब एक सब्सट्रेट के रूप में सेलुलर आरएनए का उपयोग कर, के रूप में यह सीधे आरएनए या आरएनए कि मिथाइल के लिए लक्षित कर रहे हैं के आकार का निरीक्षण करने के लिए एक विधि प्रदान करता है.
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Protocol
1. इन विट्रो प्रतिलेखन और लक्ष्य आरएनए के जेल शुद्धिकरण में
- स्थापित आणविक क्लोनिंग तकनीक12 या किट का उपयोग कर T7 और/या SP6 प्रमोटरों युक्त प्लाज्मिड में ब्याज के अनुक्रम क्लोन.
- इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट linearizing
- प्लाज्मिड के पीसीआर द्वारा ब्याज के अनुक्रम को सम्मिलित करने के माध्यम से टी 7 प्रमोटर क्षेत्र को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर के साथ, +20-30 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम को पहले वर्णित13के रूप में बढ़ाना ।
- वैकल्पिक रूप से, एक प्रतिबंध एंजाइम (आरई) कट साइट उपलब्ध बहाव आरई के आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों के अनुसार डालने के नीचे का उपयोग कर प्लाज्मिड के 5 डिग्री ग्राम पचाने।
नोट: सम्मिलित चयनित RE द्वारा काटा नहीं है कि डबल-चेक करने के लिए याद रखें। इस चरण में प्रयुक्त RE का चयन नाटकीय रूप से प्रतिलिपि की उपज को प्रभावित कर सकता है. अधिमानत:, विपरीत डीएनए किनारा14पर T7 आरएनए पॉलिमरेज के टेम्पलेट स्विचन से बचने के लिए एक कुंद या 5'-ओवरहैंगिंग अंत उत्पादन आरई के साथ linearize। यदि प्रारंभिक पैदावार अपर्याप्त हैं तो भिन्न RE का प्रयास करें.
- डीएनए agarose जेल निष्कर्षण और साफ अप के लिए किट का उपयोग कर जिसके परिणामस्वरूप डीएनए को शुद्ध. 30 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ डीएनए को एल्यूट करें।
- भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिक्स, पाइप्ट 1.5 डिग्री सेल्सियस और एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए एकाग्रता को मापने.
- 1x TBE बफर में 1% agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस पर शुद्ध डीएनए की गुणवत्ता और आकार की जांच करने के लिए डीएनए के 250 एनजी का प्रयोग करें 4 वी /
- इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट के जमे हुए अभिकर्मकों को थपथपाना। बर्फ पर T7 आरएनए पॉलिमरेज मिक्स रखें, और कमरे के तापमान पर एक अखरोट पर अन्य अभिकर्मकों. तुरंत पूरा thwing के बाद, जल्दी 5 s के लिए rNTP ट्यूबस्पिन ट्यूब ों के तल पर समाधान इकट्ठा करने के लिए और बर्फ पर जगह है. वर्षा से बचने के लिए कमरे के तापमान पर 10x प्रतिक्रिया बफर रखें।
- संकेत आदेश में कमरे के तापमान पर 20 डिग्री एल प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के निम्नलिखित घटकों में एक 1.5 एमएल ट्यूब में पाइपेट: 6 डिग्री सेल्सियस पानी की, रैखिक डीएनए टेम्पलेट के 2 डिग्री एल (0.1 - 1 डिग्री), 75 एम एम एटीपी समाधान के 2 $L, 75 एम एम GTP समाधान के 2 डिग्री एल , 75 एमएम सीटीपी समाधान का 2 डिग्री एल, 75 एमएम यूटीपी समाधान का 2 डिग्री एल, 10x रिएक्शन बफर का 2 डिग्री एल और टी7 आरएनए पॉलिमरेज मिक्स का 2 डिग्री एल।
नोट: पीसीआर द्वारा उत्पन्न डीएनए टेम्पलेट के लिए, 100 - 200 एनजी डीएनए का उपयोग करें; एक प्लाज्मिड के प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट द्वारा उत्पन्न डीएनए टेम्पलेट केलिए, एक प्लाज्मिड के प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्टर द्वारा उत्पन्न किए गए, उपयोग करें $1g. सक्रिय पुनः संयोजक उसकी 6-टैग किए गए T7 आरएनए पॉलिमरेज को ई. कोलाई15में शुद्ध किया जा सकता है। - ट्यूब को अच्छी तरह मिला लें। ट्यूब के तल पर प्रतिक्रिया समाधान इकट्ठा करने के लिए 5 s के लिए त्वरित स्पिन, फिर 2-4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: हर प्रतिलिपि अलग ढंग से डीएनए टेम्पलेट, इसकी लंबाई, अपने अनुक्रम या संरचना के आधार पर व्यवहार करेंगे. 6 ज तक विभिन्न ऊष्मायन समय का परीक्षण करके इन विट्रो प्रतिलेखन स्थितियों में ऑप्टिमाइज़ करें; डीएनए टेम्पलेट के विभिन्न सांद्रता, T7 आरएनए पॉलिमरेज, या NTP; या पूरक MgCl2 के अलावा क्या T7 आरएनए पॉलिमरेज मिक्स में मौजूद है. - ऊष्मायन अवधि के अंत में, DNase I के 1 $L को 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया के अनुसार जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रतिलेखन प्रतिक्रिया अस्थायी रूप से बर्फ पर रखा जा सकता है जब तक polyacrylamide जेल तैयार है. - polyacrylamide जेल द्वारा शुद्धि के साथ आगे बढ़ें.
नोट: चूंकि आरएनए पीएच और RNase संदूषण के प्रति संवेदनशील है, आरएनए समर्पित उपकरण और RNase मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करें। - ब्याज की प्रतिलिपि के आकार के आधार पर जेल के लिए polyacrylamide का प्रतिशत निर्धारित: 100-2000 nt के लिए 3.5% (XC: 460 nt; बी बी: 100 nt), 80-500 nt के लिए 5% (XC: 260 nt ; बी बी: 65 nt), 60-400 nt के लिए 8% (XC: 160 nt ; बी बी: 45 nt), 40-200 nt के लिए 12% (XC: 70 nt ; बी बी: 20 nt), 25-150 nt के लिए 15% (XC: 60 nt ; बी बी: 15 nt), और 6-100 nt के लिए 20% (XC: 45 nt ; बी बी: 12 nt).
- यूरिया denaturing polyacrylamide जेल एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों के संयोजन के द्वारा तैयार: 9.6 ग्राम आणविक ग्रेड यूरिया के, 10x TBE के 2 एमएल, एक्स एमएल 40% acrylamide: बिस-एकक्रिलमाइड मिश्रण (29:1) और ट्यूब पर 20 एमएल निशान तक पानी , जहां x $20 mL/(40%/जेल प्रतिशत %) है.
चेतावनी: Polyacrylamide जैल अक्सर संयुक्त राष्ट्र-बहुलक acrylamide जो एक विषाक्त सामग्री है कि एक खतरा पैदा कर सकते हैं जब पर्यावरण के लिए पेश किया है होते हैं. संस्था के रासायनिक अपशिष्ट कार्यक्रम के माध्यम से polyacrylamide जैल के निपटान. - 30% बिजली पर 15 s के लिए माइक्रोवेव. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए या यूरिया पूरी तरह से भंग हो गया है जब तक अखरोट पर रखें।
- जेल मिश्रण घूर्णन है, एक जेल कैसेट पुनः प्राप्त (18 अच्छी तरह से, 1 मिमी मोटी; 13.3 x 8.7 सेमी (डब्ल्यू एक्स एल)), कंघी को हटाने और जेल कास्टिंग के लिए कैसेट की स्थिति.
- ट्यूब के तल पर जेल समाधान इकट्ठा करने के लिए 5 s के लिए 50 एमएल ट्यूब त्वरित स्पिन। 10% अमोनियम persulphate समाधान (एपीएस) के 125 $L जोड़ें। $ 1 मिनट के लिए अखरोट पर रखें त्वरित स्पिन फिर से 5 s के लिए.
- टेट्रामेथिलेथिलीनडिआमिन (टीईएमईडी) का 25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ध्यान से एक 25 एमएल पिपेट से बचने के बुलबुले के साथ 5 बार पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
- जेल डाली में Pipette और ध्यान से जेल कंघी बुलबुले से बचने डालने.
- कैसेट के शीर्ष पर एक बड़ी बांधने की मशीन क्लिप जोड़कर सील कस.
- जेल 1 ज के लिए बहुलक करने के लिए अनुमति दें।
- एक बार जेल जम गया है, बांधने की मशीन क्लिप को हटा दें. इलेक्ट्रोफोरोसिस बॉक्स में कैसेट डालें। ऊपर और नीचे जलाशयों में 1x TBE बफर जोड़ें.
- प्रतिलेखन प्रतिक्रिया प्राप्त करें. 100 डिग्री सेल्सियस तक पानी जोड़ें, फिर 2x जेल लोड हो रहा बफर के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब के लिए 10 $L और 2x जेल लोड हो रहा है बफर के 10 डिग्री एल के लिए पानी के साथ सिफारिश की राशि मिश्रण द्वारा सीढ़ी तैयार करें।
- 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर में सीढ़ी और इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया दोनों को इनक्यूबेट करें।
- जबकि नमूने 70 डिग्री सेल्सियस पर denaturing हैं, ध्यान से कंघी को हटा दें, ऊपर और नीचे एक P1000 pipette के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से pipeting द्वारा कुओं को साफ, और तुरंत 100 वी पर 10 मिनट के लिए पूर्व चलाने के लिए.
- एक बार नमूनों 70 डिग्री सेल्सियस पर अपने 15 मिनट विकृतीकरण पूरा कर लिया है, थर्मोमिक्सर से ट्यूबों को हटाने और तुरंत बर्फ पर जगह है।
- जेल के प्रत्येक अच्छी तरह से P1000 पिपेट के साथ फिर से साफ करें. पहले कुएं पर सीढ़ी का 20 डिग्री सेल्सियस, आरएनए के नमूने का 20 डिग्री सेल्सियस 10 अलग-अलग कुओं पर और 1x जेल लोडिंग बफर का 20 डिग्री सेल्सियस अप्रयुक्त कुओं पर लोड करें।
- जेल के % polyacrylamide पर निर्भर करता है, 60 -240 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चलाएँ.
नोट: जेल लोड हो रहा बफर में रंगों के रूप में वे जेल पार दो बैंड में अलग हो जाएगा, एक धीमी गति से पलायन ब्रोमोफेनोल ब्लू (बीबी) नीले बैंड, और एक तेजी से पलायन Xylene Cyanol (XC) सियान बैंड. विभिन्न % polyacrylamide जैल में इन बैंड के अनुमानित प्रवास अच्छी तरह से जाना जाता है (चरण 1.11 देखें) और जेल में आरएनए के प्रवास का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - एक बार जेल बंद कर दिया गया है, ध्यान से कैसेट से जेल हटा दें.
- एक साफ बॉक्स में जेल रखें जिसमें 1x TBE बफर के 50 एमएल का समाधान हो जिसमें 50 डिग्री न्यूक्लिक एसिड जेल दाग होता है और आरएनए को दाग लगाने के लिए रॉकर पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट होता है।
- जेल इमेजिंग सिस्टम पर जेल के बैंड एक्साइस तस्वीर से पहले और बाद में लें, अधिमानतः यूवी ट्रांसलिल्यूमिनेशन के बजाय नीले प्रकाश का उपयोग करें।
- एक nuclease मुक्त डिस्पोजेबल जेल काटने टिप का उपयोग कर ब्याज की प्रत्येक बैंड उत्पाद शुल्क. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के बाद, एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए जेल टुकड़ा युक्त टिप हस्तांतरण और संक्षेप में जेल टुकड़ा इकट्ठा करने के लिए स्पिन. दोहराएँ जब तक सभी बैंड एक ही 1.5 एमएल ट्यूब में एकत्र किया गया है.
- एक बार सभी जेल स्लाइस एकत्र किया गया है, nuclease मुक्त पानी या 1.5 एमएल ट्यूब के लिए TE बफर के 100 डिग्री एल जोड़ें. $ 48 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह आरएनए समाधान में जेल स्लाइस से बाहर निकलने के लिए अनुमति देता है.
- 48 ज के बाद, एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब के लिए पानी या TE बफर पाइप। शेष जेल स्लाइस के निपटान. साफ-सफाई किट के माध्यम से आरएनए को इस प्रकार शुद्ध करें।
- कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्पिन कॉलम बराबर करें।
- चरण 1.32 से नई 1.5 एमएल ट्यूब में आरएनए विलयन के 100 डिग्री लीटर के लिए, 350 $L RLT बफर जोड़ें और एक पोषक पर 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रण. ट्यूब के तल पर समाधान इकट्ठा करने के लिए 200 x ग्राम पर 1 s के लिए स्पिन करें।
- 100% EtOH के 675 $L जोड़ें और nutator पर 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रण. 200 x ग्राम पर 1 s के लिए स्पिन और तुरंत अगले चरण के लिए आगे बढ़ना.
- मिश्रण के 565 डिग्री सेल्सियस को स्पिन कॉलम पर स्थानांतरित करें और 1 5000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए स्पिन करें। आकांक्षा द्वारा संग्रह ट्यूब खाली करें।
- नमूने की दूसरी छमाही के साथ पिछले चरण दोहराएँ.
- कॉलम में आरपीई बफर का 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 15,000 x gपर 1 मिनट के लिए स्पिन करें। आकांक्षा द्वारा संग्रह ट्यूब खाली करें।
- कॉलम में 80% एथेनॉल का 750 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 15,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए स्पिन करें। आकांक्षा द्वारा संग्रह ट्यूब खाली करें।
- ढक्कन खुला और 5 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर स्पिन के साथ एक नया 2 एमएल संग्रह ट्यूब में स्तंभ प्लेस.
- स्तंभ को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें.
- कॉलम के केंद्र पर 17 डिग्री सेल्सियस पानी जोड़ें और 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए पतला करने के लिए 15,000 x ग्राम पर स्पिन। एक बार फिर 17 डिग्री सेल्सियस पानी का उपयोग कर। कुल पुनर्प्राप्त मात्रा 32 डिग्री सेल्सियस होनी चाहिए।
- भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिक्स, पाइप्ट 1.5 डिग्री सेल्सियस और एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर आरएनए की एकाग्रता को मापने.
- चरण 1.11-1.29 में यूरिया denaturing polyacrylamide जेल द्वारा आरएनए शुद्धि की गुणवत्ता की जाँच करें।
2. इन विट्रो आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज परख
- बर्फ पर एक 1.5 एमएल ट्यूब में 100 जेडएल आरएनए मिथाइलट्रांसफरेस परख की स्थापना करें: 23 डिग्री सेल्सियस पानी, 10 x टीबीएस के 10 डिग्री एल (500 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.5; 1.5 एम एन एच एल), 0.05 एम ईडीटीए के 2 जेडएल, 100 एम डी टी के 5 डिग्रीएल , 50% ग्लिसरॉल के 40 डिग्री एल, 58 डिग्री एम 3एच-एसएएम के 4 डिग्री एल, 20x प्रोटीज़ इनीक्यूबर कॉकटेल के 5 जेडएल, 1 $L के RNaseOUT (वैकल्पिक), आरएनए के 5 डिग्री एल और मिथाइलट्रांसफरेज के 5 डिग्री एल।
चेतावनी: रेडियोधर्मी tritiated सामग्री खतरनाक है और केवल दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट और किसी भी अन्य आवश्यक PPE पहने हुए संभाला जाना चाहिए. रेडियोधर्मी सामग्री के साथ संपर्क में सभी पिपेट युक्तियाँ और ट्यूब ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट माना जाता है। प्रयोगशाला के अनुमोदित रेडियोधर्मी अपशिष्ट प्रोटोकॉल के अनुसार सभी ठोस और तरल रेडियोधर्मी कचरे का निपटान।
नोट: methyltransferase के बिना और आरएनए के बिना नियंत्रण नमूने शामिल करें. अभिकर्मक सांद्रता के लिए अनुकूलन और/या द्विसंयोजक धन लवणों को शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है, जैसे MgCl2, या लेबल न किए गए SAM. अंतिम आरएनए सांद्रता की इष्टतम श्रेणी 50 एनएम से 1 डिग्री द उ है, जबकि मिथाइलट्रांसफरेस सांद्रता 25 एनएम से 300 दउ है। - धीरे ट्यूब भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. ट्यूब के तल पर समाधान एकत्र करने के लिए 200 x ग्राम पर 5 s स्पिन करें। ट्यूब (ओं) को 2 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- चरण 1.32 के रूप में स्तंभ शुद्धि का उपयोग कर प्रतिक्रिया को साफ करें।
चेतावनी: किसी भी रेडियोधर्मी सामग्री के ठीक से निपटान करने के लिए बहुत सावधान रहें, विशेष रूप से कॉलम washes के दौरान (संग्रह ट्यूबों से अपशिष्ट को नष्ट करने के बजाय पिपेट बाहर)। - तरल प्रस्फुरेशन गिनती करें
- नमूना प्रति एक शीशी, पृष्ठभूमि माप के लिए एक शीशी और कड़ी चोट परीक्षण के लिए एक शीशी के साथ scintillation गिनती रैक सेट करें। 5 एमएल के साथ शीशियों भरें scintillation गिनती समाधान.
- 1 शीशी में प्रत्येक eluted रेडियोधर्मी आरएनए नमूना के 10 डिग्री एल जोड़ें, और ढक्कन कस और धीरे मिश्रण.
- कड़ी चोट परीक्षण शीशियों तैयार करें। प्रोटोकॉल के दौरान इस्तेमाल की जाने वाली सभी सतहों और उपकरणों पर कपास के झाड़ू को अच्छी तरह से रगड़ें। 5 एमएल की शानदार घोल से भरी शीशियों में झाड़ू जोड़ें और ढक्कन को कस दें।
- इस प्रकार scintillation काउंटर पर नमूने चलाएँ. काउंटर हुड खोलें, मशीन में रैक डालने और हुड बंद करें। गणना एकल रैकका चयन करें| उपयोगकर्ता प्रोग्रामका चयन करें का चयन करें. 60 s. हिट काउंट रैकके लिए ट्राइटियम (3एच) को मापता है कि एक प्रोग्राम का चयन करें या बनाएँ . तीन बार scintillation गिनती दोहराएँ.
नोट: उपकरण दोनों स्क्रीन और एक प्रिंटआउट के लिए प्रत्येक नमूना और उत्पादन के scintillation गिनती उपाय होगा. प्रोटोकॉल यदि चाहें तो यहाँ रोका जा सकता है। चरण 2.3 से शेष आरएनए नमूनों को बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जाना चाहिए।
- ऑटोरेडियोग्राम के साथ आगे बढ़ें
- तैयार करें और पूर्व चलाने यूरिया denaturing polyacrylamide जेल के रूप में कदम 1.11-1.20 में.
- पिपेट 20 डिग्री रेडियोधर्मी आरएनए सामग्री के एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में 2x जेल लोड हो रहा बफर के 20 डिग्री एल युक्त। अच्छी तरह मिला लें। चरण 1.21 में सीढ़ी तैयार करें। 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
- नमूना लोड होने से पहले जेल के कुओं को एक बार फिर धो लें। तैयार सीढ़ी के 20 डिग्री एल लोड, नमूनों के 20 डिग्री एल, और शेष गलियों पर 1x जेल लोड बफर के 20 डिग्री एल. 60-180 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चलाने के लिए, polyacrylamide प्रतिशत पर निर्भर करता है.
- एक बार जेल चल खत्म, कैसेट से जेल को हटाने और यह एक बॉक्स में जगह 1x TBE बफर के 5 $L के साथ 5 ultrasensitive न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के 5 $L युक्त.
- आरएनए दाग करने के लिए रॉकर पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- ध्यान से बॉक्स से बाहर जेल ले और यह अच्छी तरह से ऊपर और बाईं ओर सीढ़ी के साथ जेल इमेजिंग प्रणाली के यूवी transilluminator पर जगह है.
- जेल पर कैमरा फोकस, यूवी प्रकाश पर बारी और फिर से उजागर द्वारा जेल की एक छवि ले 50 एमएस करने के लिए 1 संकेत तीव्रता के आधार पर s.
- यूवी जोखिम बंद करें, और Tiff फ़ाइल के रूप में छवि सहेजें।
- जेल को बॉक्स में वापस रखें। TBE निकालें. समाधान फिक्सिंग के 50 एमएल के साथ जेल को ठीक करें (50% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड, 40% अल्ट्रा-शुद्ध पानी) एक रॉकर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए।
- धीरे से एक ताजा ब्लैक बॉक्स में जेल फिर से ले जाएँ जिसमें 25 एमएल ऑटोरेडियोग्राफी बढ़ाने के समाधान शामिल हैं। एक ब्लैक बॉक्स की अनुपस्थिति में, प्रकाश से समाधान की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बॉक्स को कवर करें।
- रॉकर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- धीरे से जेल उठा और यह ऊपर कुओं और सही हाथ की ओर सीढ़ी के साथ प्लास्टिक की चादर की एक चादर पर चेहरा नीचे जगह है. जेल के पीछे क्रोमैटोग्राफी पेपर की दो चादरें रखें। धीरे से पूरे ढेर फ्लिप.
- जेल ड्रायर को 80 डिग्री सेल्सियस तक प्री-हीट करें। जेल ड्रायर पर प्लास्टिक कवर वापस ले जाएँ. प्लास्टिक कवर के तहत रैप, जेल और क्रोमैटोग्राफी पेपर स्टैक डालें और प्लास्टिक कवर को सील बनाने के लिए वापस नीचे ले जाएं।
- जेल ड्रायर में 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए सूखी।
- जेल ड्रायर बंद करें और धीरे से ढेर हटा दें. रैप और दूसरा क्रोमैटोग्राफी पेपर निकालें। टेप एक autoradiogram कैसेट में सूखे जेल के साथ शेष क्रोमैटोग्राफी कागज.
- अंधेरे कमरे में autoradiography फिल्म के 1 पत्रक जोड़ें.
- -80 डिग्री सेल्सियस पर कैसेट रखें और संकेत तीव्रता के आधार पर 1 h से 4 सप्ताह के बाद फिल्म का विकास करें, जिसे पहले से मापे गए प्रस्तारण गणना के आधार पर आंका जा सकता है: 250-1,000 सीपीएम के लिए 1-4 सप्ताह, 1,000-10,000 सीपीएम के लिए 24 एच और 1 h से 24 एच के लिए 1 h एम.
- एक बार फिल्म विकसित की है, कैसेट के शीर्ष पर फिल्म जगह है और ध्यान से एक प्रयोगशाला मार्कर जेल के 4 किनारों के साथ निशान, प्रत्येक अच्छी तरह से, और XC और बी बी रंगों की स्थिति.
- फिल्म को 300 या 600 पिक्सल प्रति इंच रिज़ॉल्यूशन पर स्कैन करें और छवि को टिफ फ़ाइल के रूप में सहेजें।
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Representative Results
इन विट्रो प्रतिलेखन अभिक्रिया
चित्र 2 ए 7SK SnRNA के T7 आरएनए पॉलिमरेज के साथ एक इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया से एक ठेठ चलाने का प्रतिनिधित्व करता है, जो एक अपेक्षाकृत कम है (331 nt) और उच्च संरचित आरएनए. के रूप में है कि कच्चे छवि पर दिखाया गया है, वहाँ कई अवांछित बैंड, दोनों छोटे और 7SK से अधिक समय, शायद यादृच्छिक प्रतिलेखन दीक्षा या समाप्ति की घटनाओं से उत्पन्न कर रहे हैं. इस वजह से, इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के बाद जेल शोधन एक साफ आरएनए नमूना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है जैसा कि चित्र 2खमें दिखाया गया है। इस बिंदु पर, ब्याज की आरएनए सीढ़ी के सापेक्ष अपने स्थान से पहचाना जा सकता है और जेल शुद्धि द्वारा शुद्ध.
जैसा कि पहले उल्लेख किया है, यह जेल शोधन कदम से पहले प्रतिलेखन प्रतिक्रिया की लंबाई का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं है कि बहुत लंबे समय के लिए चलाने के आरएनए उत्पादन के अत्यंत उच्च मात्रा में परिणाम कर सकते हैं, सही प्रतिलिपि के बहाव पहचान मुश्किल बना रही है. यह भी रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा शुद्ध प्रतिलिपि की पहचान सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है (आरटीक्यूपीसीआर) विशिष्ट प्राइमर का उपयोग कर.
इन विट्रो आरएनए मिथाइलट्रांसफरेस परख
चित्र 3 हमारे अनुशंसित आरएनए और प्रोटीन सांद्रता की निम्न सीमा का उपयोग करते हुए प्रोटोकॉल में वर्णित आरएनए मेथिलट्रांसफरेस परख के एक प्रतिनिधि परिणाम को दर्शाता है। इस परख scintillation मायने रखता है से दोनों मात्रात्मक परिणाम के लिए अनुमति देता है, साथ ही autoradiogram से गुणात्मक परिणाम. यहाँ, MePCE, एक आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज़ मिथाइलेट 7SK10के लिए जाना जाता है, भी U6 मिथाइल ेट करने में सक्षम होना दिखाया गया था. इसके अलावा, के रूप में हाल ही में 7SK16के लिए दिखाया गया है , histone H4 के बंधन MePCE के लिए भी U6 मिथाइलेशन रोकता है. हम इसे दोनों प्रकार की संमतों (चित्र 3ब्) और स्व-रेडियोग्राम (चित्र 3ठ) दोनों में देख पाए थे, जो इस प्रोटोकॉल की मजबूती को दर्शाते हैं।
चित्र 1 . एक ठेठ आरएनए मिथाइलट्रांसफरज परख कार्यप्रवाह और अपेक्षित परिणाम के Schematic प्रतिनिधित्व. सिनफजिन एक प्रतिस्पर्धी मेथिलट्रांसफरेज अवरोधक है। एल: सीढ़ी; WT: जंगली प्रकार; एम: उत्प्रेरक उत्परिवर्ती; सीपीएम: प्रति मिनट मायने रखता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 . प्रतिनिधि प्रयोग से पहले इन विट्रो प्रतिलेखन के उत्पाद दिखा (ए) और बाद (बी) एक denaturing यूरिया-polyacrylamide 8% जेल न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ दाग पर शुद्धि. तीर जेल शुद्धिसेपहले और बाद में 7SK प्रतिलिपि को इंगित करते हैं. एल: सीढ़ी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 . इन विट्रो आरएनए मिथाइल-ट्रांसफरेज़ परख U6 के खिलाफ MePCE के साथ प्रदर्शन किया. इन विट्रो मेथिलट्रांसफरेज परख में रिकॉमबिनेंट GST-MePCE (25 एनएम), 3एच-रेडियोएक्टिव सैम को मिथाइल समूह दाता के रूप में और इन विट्रो लिखित U6 RNA (50 nM) को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करते हुए। autoradiogram के लिए उजागर किया गया था 2 सप्ताह के क्रम में अवशिष्ट गतिविधि का पता लगाने के लिए (250 सीपीएम) +Histone H4 नमूने में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ, विशिष्ट प्रतिलिपियों की ओर आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि के इन विट्रो सत्यापन के लिए एक सरल और मजबूत विधि की सूचना दी गई है। परख इस तथ्य का लाभ उठाती है कि एस-एडेनोसिल मेथियोनीन को मिथाइल समूह दाता पर tritiated किया जा सकता है (चित्र1), एंटीबॉडी के उपयोग के बिना मेथिलेटेड आरएनए को सही तरीके से पता लगाया जा सकता है। तथापि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस परख से यह संकेत नहीं मिल सकता है कि एंजाइम द्वारा कौन से अवशेष या रासायनिक समूह को मिथाइल किया गया है। की पहचान करने के लिए या सत्यापित करने के लिए कि एक विशिष्ट अवशेष methylated है, उत्परिवर्तन विश्लेषण जैसे अन्य तरीकों, रिवर्स प्रतिलेखन ब्लॉक या आरएनए सब्सट्रेट के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज परख के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
आरएनए का चुनाव और संश्लेषण का उनका तरीका आरएनए के आकार पर निर्भर करता है। 18 और 120 nt के बीच आकार के विशिष्ट RNAs आसानी से कस्टम कई प्रतिष्ठित न्यूक्लिक एसिड प्रदाताओं से synthesized किया जा सकता है. हालांकि, सबसे अधिक, विभिन्न आकारों के विशिष्ट आरएनए इन विट्रो लिखित में हैं। इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट्स विभिन्न तरीकों से उत्पन्न किया जा सकता है, और ब्याज के अनुक्रम की आवश्यकता के लिए एक T7 या SP6 प्रमोटर के बहाव स्थित हो. जब RNAs के सटीक छोर महत्वपूर्ण हैं, तो PR$ प्लाज्मिड की सिफारिश की जाती है17. परख की उच्च संवेदनशीलता (चित्र 3) भी उदाहरण के लिए, या तो कुल या दूत आरएनए, सेलुलर आरएनए के मिश्रण के साथ एक शुद्ध आरएनए स्थानापन्न करने के लिए अनुमति देता है। दरअसल, जेल और autoradiogram सीधे मिथाइल के लिए लक्षित आरएनए (ओं) के आकार का निरीक्षण करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।
प्रोटोकॉल के चरण 2.1 में यहाँ रिपोर्ट की गई शर्तें मिथाइलट्रांसफरेस के BIN3 परिवार के लिए इष्टतम हैं, जिसमें मनुष्यों में दो होमोलॉग हैं, MePCE10 और BCDIN3D9. यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि परख शर्तों को विशिष्ट प्रोटीन और ब्याज की आरएनए के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया था कि MgCl2 की उपस्थिति BCDIN3D गतिविधि18कम हो जाती है, तथापि, MgCl2 आरएनए संरचना का एक महत्वपूर्ण समन्वयक हो सकता है, और इस प्रकार अन्य आरएनए के लिए परख का एक महत्वपूर्ण घटक का गठन कर सकते हैं मेथिलट्रांसफरेस।
समय की एक विस्तारित अवधि के लिए उजागर किया जा सकता है, जो एक autoradiogram का उपयोग करने का लाभ, यह scintillation परख में पता नहीं है कि बहुत कमजोर गतिविधि का पता लगाने के लिए अनुमति दे सकते हैं. आमतौर पर यह इंगित करता है कि प्रोटीन एक methyltransferase है, लेकिन है कि एक या अधिक प्रतिक्रिया की स्थिति या अभिकर्मकों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए: एंजाइम; सबस्ट्रेट, cofactor, बफर शर्तों, आदि9. उदाहरण के लिए, एंजाइम शुद्धि को हटाने या टैग की स्थिति को बदलने के लिए सुधार करने की आवश्यकता हो सकती है. यह भी हो सकता है कि आरएनए एक सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया ठीक से जोड़ या किसी अन्य प्रोटीन या आरएनए कारक के साथ बातचीत करने के लिए एंजाइम द्वारा methylated की जरूरत है. इस प्रकार, पहले से मौजूद साहित्य और / या कोशिकाओं में खुद के परिणाम ध्यान से एंजाइम और ब्याज की आरएनए के लिए परख शर्तों की स्थापना की समीक्षा की जरूरत है.
परख भी अत्यंत लचीला है. उदाहरण के लिए, यह परख का एक और प्रकार के लिए एक अग्रदूत कदम हो सकता है, इस तरह है कि रेडियोधर्मी methylated आरएनए मात्रात्मक और गुणात्मक demethylase assays11में प्रयोग किया जाता है , या आरएनए बाध्यकारी परख में विशेष रूप से के व्यवहार कल्पना करने की अनुमति असंशोधित की तुलना में मेथिलयुक्त आरएनए। परख को आरएनए के संशोधन का विश्लेषण करने के लिए भी हल्के से समायोजित किया जा सकता है जो रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए जा सकते हैं , जैसे आरएनए एसिटाइलेशन19,20के अध्ययन के लिए एसिटाइल कोएंजाइम ए .
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक ों को केमड्रा के साथ उनकी मदद के लिए डॉ. Xhemale प्रयोगशाला में अनुसंधान रक्षा विभाग द्वारा समर्थित है - कांग्रेस द्वारा निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम - स्तन कैंसर निर्णायक पुरस्कार (W81XWH-16-1-0352), NIH अनुदान R01 GM127802 और सेलुलर संस्थान से शुरू धन और आणविक जीव विज्ञान और ऑस्टिन, संयुक्त राज्य अमेरिका में टेक्सास विश्वविद्यालय में प्राकृतिक विज्ञान के कॉलेज.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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