Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.
Abstract
Wir präsentieren hier einen integrativen Ansatz zur Erprobung der Wirksamkeit gezielter Therapien, der die Next Generation der Sequenzierungstechnologien, therapeutische Zielanalysen und die Überwachung der Wirkstoffabhängigkeit mit patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) kombiniert. Diese Strategie wurde am Beispiel von Eierstocktumoren validiert. Das Mate-Pair-Protokoll der nächsten Generation (MPseq) wurde verwendet, um strukturelle Änderungen zu identifizieren, und anschließend wurde eine Analyse potenziell zielbarer Änderungen durchgeführt. Menschliche Tumoren, die in immungeschwächten Mäusen angebaut wurden, wurden mit Medikamenten behandelt, die auf der Grundlage der genomischen Analysen ausgewählt wurden. Die Ergebnisse zeigten eine gute Korrelation zwischen den vorhergesagten und den beobachteten Antworten im PDX-Modell. Der vorgestellte Ansatz kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von Kombinationsbehandlungen zu testen und personalisierte Behandlungen für Patienten mit wiederkehrendem Krebs zu unterstützen, insbesondere in Fällen, in denen die Standardtherapie fehlschlägt und es notwendig ist, Medikamente außerhalb des Etiketts zu verwenden.
Introduction
Patienten-abgeleitete Xenografts (PDXs), die aus der Implantation von Tumorstücken von Patienten in immundefizienten Mäusen erzeugt werden, haben sich als ein leistungsfähiges präklinisches Modell zur Unterstützung einer personalisierten Krebsbehandlung herauskristallisiert. PDX-Modelle wurden erfolgreich für eine Vielzahl von menschlichen Malignitäten entwickelt. Dazu gehören Brust- und Eierstockkrebs, malignes Melanom, Dickdarmkrebs, Bauchspeicheldrüsenadenokarzinom und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs1,2,3,4,5. Tumorgewebe kann orthotopisch oder heterotopisch implantiert werden. Erstere, die als genauer, aber technisch schwierig gelten, beinhaltet eine Transplantation direkt in das Tumororgan. Diese Arten von Modellen werden geglaubt, um genau imitieren Histologie des ursprünglichen Tumors aufgrund der "natürlichen" Mikroumgebung für den Tumor6,7. Zum Beispiel führte die orthotopische Transplantation in die Bursa des Maus-Ovarials zur Tumorverbreitung in die Peritonealhöhle und zur Herstellung von Aszites, typisch für Eierstockkrebs8. In ähnlicher Weise beeinflusste die Injektion von Brusttumoren in die Brust anstelle der Bauchbrustdrüse die PDX-Erfolgsrate und das Verhalten9. Orthotopmodelle erfordern jedoch ausgeklügelte Bildgebungssysteme, um das Tumorwachstum zu überwachen. Die heterotopische Implantation eines soliden Tumors erfolgt in der Regel durch Implantation von Gewebe in die subkutane Flanke einer Maus, was eine einfachere Überwachung des Tumorwachstums ermöglicht und weniger teuer und zeitaufwändigist 7. Allerdings wuchsen Tumore subkutan selten metastasierend, anders als bei der orthotopischen Implantationbeobachtet 10.
Die Erfolgsrate der Transplantation hat sich als variierend erwiesen und hängt stark vom Tumortyp ab. Aggressivere Tumoren und Gewebeproben, die einen höheren Prozentsatz der Tumorzellen enthalten, hatten den Berichten zufolge bessere Erfolgsraten12,13. In Übereinstimmung damit, Tumoren von metastasierenden Stellen abgeleitet wurden gezeigt, um mit Frequenzen von 50-80%, während diejenigen von primären Standorten engraft bei Frequenzen so niedrig wie 14%12. Im Gegensatz dazu, Gewebe mit nekrotischen Zellen und weniger lebensfähige Tumorzellen engraft schlecht. Das Tumorwachstum kann auch durch die Zugabe von Kellermembran-Matrixproteinen in den Gewebemix zum Zeitpunkt der Injektion in Mäuse14 gefördert werden, ohne die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors zu beeinträchtigen. Die Größe und Anzahl der gewebeteile, die für die Implantation bestimmt sind, beeinflussen auch die Erfolgsrate der Engraftment. Größere Tumoraufnahmeraten wurden für die Implantation in der subrenalen Kapsel im Vergleich zur subkutanen Implantation aufgrund der Fähigkeit der subrenalen Kapsel berichtet, den ursprünglichen Tumor stroma zu erhalten und die Wirtsstromzellen sowie15zur Verfügung zu stellen.
Die meisten Studien verwenden NOD/SCID immundefizienten Mäusen, denen natürliche Killerzellen16 fehlen und die nachweislich die Tumorengraftment, das Wachstum und die Metastasierung im Vergleich zu anderen Stämmen erhöhen14. Eine zusätzliche Überwachung ist jedoch erforderlich, da sie thymische Lymphome bereits im Alter von3-4Monaten entwickeln können. Bei Eierstocktumortransplantationen, die in SCID-Mäusen angebaut wurden, wurde das Auswachsen von B-Zellen erfolgreich durch Rituximab gehemmt, was die Entwicklung von Lymphomen verhinderte, ohne jedoch die Engraftmentierung von Eierstocktumoren zu beeinträchtigen17.
In jüngerer Zeit, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) Mäuse, die eine Nullmutation im Gen tragen, die die Interleukin-2-Rezeptor-Gammakette18kodiert, wurden zu einem häufig verwendeten Stamm für die Erzeugung von PDX-Modellen. Tumore aus etablierten PDX-Modellen, die an zukünftige Generationen von Mäusen weitergegeben werden, behalten berichtend histologische und molekulare Eigenschaften für 3 bis 6 Generationen19,20. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Behandlungsergebnisse in PDX-Modellen die ihrer entsprechenden Patienten imitieren2,3,4,21,22,23. Die Ansprechrate auf Chemotherapie in PDX-Modellen bei nicht-kleinen Lungenkrebs und dickdarmen Karzinomen war ähnlich wie in klinischen Studien für die gleichen Medikamente24,25. Studien, die in PDX-Modellen durchgeführt wurden und für Patienten entwickelt wurden, die an klinischen Studien teilnahmen, zeigten Reaktionen auf getestete Medikamente, die denen ähnlich waren, die bei entsprechendenPatienten2,3,4klinisch beobachtet wurden.
Genomanalysen eines Patiententumors mit hohem Durchsatz in Verbindung mit PDX-Modellen bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Korrelationen zwischen spezifischen genomischen Veränderungen und einer therapeutischen Reaktion zu untersuchen. Diese wurden in einigen Veröffentlichungen26,27beschrieben. Zum Beispiel therapeutische Reaktionen auf den EGFR-Hemmer Cetuximab in einer Reihe von kolorektalen PDX-Modellen, die EGFR-Amplifikation, parallele klinische Reaktionen auf Cetuximab bei Patienten28.
Es gibt einige Herausforderungen, die mit der Entwicklung und Anwendung von PDX-Modellen verbunden sind. Unter diesen ist Tumorheterogenität29,30, die die Genauigkeit der Behandlungsantwort Interpretation als ein einzelner Zellklon mit höherer proliferativer Kapazität innerhalb eines PDX beeinträchtigen kann die anderen31wachsen , was zu einem Verlust der Heterogenität. Darüber hinaus, wenn einzelne Tumorbiopsien verwendet werden, um PDX zu entwickeln, können einige der Zellpopulationen verpasst werden und werden nicht in der endgültigen Transplantation dargestellt werden. Mehrere Proben desselben Tumors werden für die Implantation empfohlen, um dieses Problem zu beheben. Obwohl PDX-Tumoren in der Regel alle Zelltypen des ursprünglichen Spendertumors enthalten, werden diese Zellen nach und nach durch solche murinen Ursprungsersetzt 3. Das Zusammenspiel zwischen muriner Stroma und menschlichen Tumorzellen in PDX-Modellen ist nicht gut verstanden. Dennoch wurde gezeigt, dass Stromalzellen die Tumormikroumgebung33rekapitulieren.
Trotz dieser Einschränkungen gehören PDX-Modelle nach wie vor zu den wertvollsten Werkzeugen für die translationale Forschung sowie zur personalisierten Medizin zur Auswahl von Patiententherapien. Zu den wichtigsten Anwendungen von PDXgehören gehören die Biomarker-Erkennung und Arzneimitteltests. PDX-Modelle werden auch erfolgreich verwendet, um Arzneimittelresistenzmechanismen zu studieren und Strategien zur Überwindung der Arzneimittelresistenz34,35zu identifizieren. Der in diesem Manuskript beschriebene Ansatz ermöglicht es dem Forscher, potenzielle therapeutische Ziele in menschlichen Tumoren zu identifizieren und die Wirksamkeit entsprechender Medikamente in vivo bei Mäusen zubewerten, die transplantierte Tumoren beherbergen, die zunächst genomisch charakterisiert waren. Das Protokoll verwendet Eierstocktumoren, die intraperitoneal transplantiert werden, ist aber auf jede Art von Tumor anwendbar, der ausreichend aggressiv ist, um bei Mäusen zu wachsen2,3,12.
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Protocol
Frisches Gewebe von einwilligenden Patienten mit Eierstockkrebs wurden zum Zeitpunkt der Entschärbungsoperation gemäß einem vom Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll gesammelt. Alle in diesem Protokoll verwendeten tierischen Verfahren und Behandlungen wurden vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und befolgten die Richtlinien für die Tierpflege.
1. Paarsequenzierung und Analysen
HINWEIS: Für die Sequenzierung des Paarpaares (MPseq) muss entweder frisches oder blitzgefrorenes Gewebe verwendet werden. Paraffin-Eingebettetes Material ist nicht geeignet, da es fragmentierte DNA enthält.
- Isolieren Sie DNA aus gefrorenem Tumorgewebe. Verwenden Sie original menschliche Proben aus chirurgischem Material oder Biopsie36.
- Verwenden Sie 1000 ng DNA, um MPseq-Bibliotheken und Sequenz als 2 Samples pro Spur auf der nächsten Generation Sequenzer (siehe Tabelle der Materialien)36zu machen.
- Analysieren Sie Daten mit einer Reihe von Algorithmen, um große chromosomale Aberrationen (Deletionen, Einfügungen, Verstärkungen, Inversionen und Translokationen) zu erkennen, wie zuvor beschrieben36,37.
2. Auswahl therapeutischer Ziele
- Verwenden Sie das Open-Access-Panda-Tool (Pfad und Anmerkung) oder ein analoges Werkzeug, um zielfähige Änderungen (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda) zu identifizieren.
- Erstellen Sie eine Liste von Genen, die von MSeq als verändert identifiziert werden, als einfache Datei mit Tab-Trennung, die standardmäßig akzeptierte Gensymbole verwendet.
HINWEIS: Das enthaltene Beispiel bietet die Analyse von Verstärkungen und Gewinnen. - Fügen Sie der Kopfzeile der Liste ein "-"-Zeichen hinzu, um sicherzustellen, dass der Tabellenkopf in die Pfadebenenansicht der Software übertragen wird.
- Laden Sie die Datei hoch, indem Sie auf die Navigationsregisterkarte "Annotationset hochladen" klicken.
- Weisen Sie ein einzelnes Symbol aus dem Menü zu, um die zugrunde liegenden Daten darzustellen, indem Sie auf das Symbol ihrer Wahl und dann auf die Registerkarte "Abschließen" klicken.
- Nachdem die Anmerkungsdateien hochgeladen wurden, identifizieren Sie eine Spalte, in der die Anzahl der annotierten Gene pro Pfad angezeigt wird. Dies ist die letzte Spalte auf der rechten Seite.
- Verwenden Sie den Pfadfilter oben links im Hauptfenster, um Pfade anzuzeigen, die Gene von Interesse enthalten.
- Identifizieren Sie Pfade, die mehr benotete Gene haben, als zufällig erwartet wird. Verwenden Sie die Funktion unter der Registerkarte Anreicherung.
- Wählen Sie eine Datenbank aus, um potenziell drogenfähige Gene aus Preset Annotation anzuzeigen, indem Sie ein entsprechendes Symbol links im Hauptfenster überprüfen (z. B. DGIdb, PharmGKB).
- Wählen Sie den Pfad für die Visualisierung aus, indem Sie auf den Namen klicken, der auf der Seite Pathway Viewer angezeigt wird.
HINWEIS: Symbole, die jeden Anmerkungssatz darstellen, werden neben dem zugeordneten Gen angezeigt. Klicken Sie auf das von Interesse sein Gen, um die entsprechende GeneCards-Webseite zu öffnen. - Wählen Sie die Wege aus, die die annotierten Gene von Interesse zeigten (d. h. in einem bestimmten Tumor verändert wurden) und "Treffer" für potenzielle Medikamente für weitere Analysen.
- Erstellen Sie eine Liste von Genen, die von MSeq als verändert identifiziert werden, als einfache Datei mit Tab-Trennung, die standardmäßig akzeptierte Gensymbole verwendet.
- Verwenden Sie eine Datenbank mit Arzneimitteln, die für die klinische Anwendung zugelassen sind (https://clinicaltrials.gov/), um die identifizierten Ziele zu referenzieren.
- Priorisieren Sie zielfähige Änderungen für weitere Tests in PDX-Modellen, indem Sie eine Literaturrecherche (z. B. PubMed) durchführen, um die Relevanz für die Biologie eines bestimmten Tumortyps zu bestätigen.
3. Validierung genomischer Umlagerungen durch PCR- und Sanger-Sequenzierung
- Designprimer mit Sequenzierungslesevorgängen, die aus MPseq-Daten stammen.
- Wählen Sie einen Knotenpunkt von Interesse für die Validierung (d. h. potenzielles therapeutisches Ziel) basierend auf MPseq-Analysen.
- Designgrundierungen richtungsweisend, so dass das Amplicon die Kreuzung enthält. Entwerfen Sie 2 Primer auf jeder Seite der Kreuzung, für insgesamt 4, um die Chancen zu erhöhen, die Kreuzung zu verstärken.
HINWEIS: Benennen Sie Primer je nach Gehäuse und Chromosomenposition. - Verwenden Sie Standard-PCR-Parameter für das Primer-Design und eine Software der Wahl. Wählen Sie die Schmelztemperatur (60-62 °C) und den GC-Gehalt (40-60%). Stellen Sie sicher, dass die Primersequenz keine Primer-Dimere, Palindrome oder Haarnadelschleifen bildet.
- Bestätigen Sie, dass der Primersequenz die Homologie zu anderen Bereichen des menschlichen Genoms fehlt, indem Sie sie mit BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) überprüfen.
- Führen Sie eine PCR aus, um die Verbindung von Interesse zu verstärken.
- Unterdünnen Sie Primer mit Wasser auf 10 mM und kombinieren Sie 10 ml jeder Grundierung, so dass jede Vorwärtsgrundierung mit jeder Reverse Primer zu einem Primer-Mix gepaart wird.
HINWEIS: Sequenzen für die Primer für das ausgewählte Beispiel sind in Tabelle 1dargestellt. - Etikettieren Sie 0,2 ml Streifenröhrchen wie: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 und T4, wobei C=Kontrolle der menschlichen genomischen DNA (kommerziell), T=Tumor-DNA, isoliert von Patient oder PDX-Tumor, und die Zahl zeigt die Primermischung an.
- Fügen Sie 1 ml jeder Primermischung in die beschrifteten Rohre ein.
- Bereiten Sie den Taq Mastermix vor, indem Sie die in Tabelle 2aufgeführten Reagenzien kombinieren und das Enzym bis zum Bedarf im Gefrierschrank lassen und ganz am Ende in die Mischung einfügt.
- Machen Sie 2 Master-Mischungen, eine für jede Schablone DNA, steuern menschliche DNA und Tumor-DNA. Fügen Sie 24 ml jedes Taq-Master-Mix zu seinem jeweiligen Streifenrohr hinzu. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 25 ml. Wirbel sehr kurz und dann drehen Sie das Streifenrohr nach unten.
- Führen Sie eine PCR in einem Thermocycler aus. Verwenden Sie die in Tabelle 3 dargestellten Parameter. Stellen Sie die Glühtemperatur so ein, dass sie mindestens 1 °C kälter ist als die Schmelztemperatur der Primer.
- Lagern Sie das fertige PCR-Produkt bei -20 °C (langfristig) oder gekühlt bei 4 °C (kurzfristig) bis erforderlich.
- Führen Sie die Elektrophorese bei 1-5 V/cm durch, um das PCR-Produkt mit einem 1,5% Agarose-Gel zu visualisieren. Lassen Sie 2 ml Aliquot des Produkts für die Sanger-Sequenzierung verwendet werden.
- Unterdünnen Sie Primer mit Wasser auf 10 mM und kombinieren Sie 10 ml jeder Grundierung, so dass jede Vorwärtsgrundierung mit jeder Reverse Primer zu einem Primer-Mix gepaart wird.
- Führen Sie die Sanger-Sequenzierung durch, um die Kreuzung zu bestätigen und den genauen Haltepunkt38 zuidentifizieren.
- Verwenden Sie das PCR-Produkt, wenn die PCR ein einzelnes Produkt (Band) generiert hat. Alternativ können Sie das Band aus Gel schneiden, reinigen und für die Sanger-Sequenzierung zusammen mit dem Grundierung für die Verstärkung einreichen.
HINWEIS: Die Tumoren, für die dann genomische Analysen durchgeführt wurden, werden für die Implantation bei Mäusen verwendet.
- Verwenden Sie das PCR-Produkt, wenn die PCR ein einzelnes Produkt (Band) generiert hat. Alternativ können Sie das Band aus Gel schneiden, reinigen und für die Sanger-Sequenzierung zusammen mit dem Grundierung für die Verstärkung einreichen.
4. Tumorengraftment und -erhaltung
- Richten Sie Präparate ein, um Tumore in PDX-Mausmodelle einzupflanzen. Wählen Sie für Transplantationstumoren aus, für die genomische Analysen durchgeführt werden oder durchgeführt wurden.
- Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt des Beginns der Entwicklung von PDX-Modellen eine unterstützende Infrastruktur vorhanden ist, einschließlich spezieller Labor- und Tiereinrichtungen, qualifiziertem technischen Personal und detaillierten Standardbetriebsverfahren.
- Stellen Sie den schnellen Transport und die Verarbeitung von Proben sicher, da die Geschwindigkeit für die Zelllebensfähigkeit und die erfolgreiche Engraftmentierung entscheidend ist.
- Verwenden Sie eine sterile Umgebung, um bakterielle und Pilzkontamination für die Verarbeitung und Verengung von Proben zu reduzieren.
- Behandeln Sie menschliche Proben mit Vorsicht, in Übereinstimmung mit der institutionellen Politik in Bezug auf potenziell biogefährliche Materialien, da sie durch Blut übertragene Krankheitserreger beherbergen können.
- Bereiten Sie das Gewebe (0,5-0,7 cm3 in der Größe) für die Engraftmentierung vor, indem Sie die chirurgische Probe in ein vorgekühltes 50 ml-Rohr mit 20 ml Gewebekulturmedien geben.
HINWEIS: Das Tumorgewebe kann frisch sein oder aus zuvor kryokonserviertem Material5zurückgewonnen werden. - Bestätigen Sie den Tumorgehalt in der Probe, indem Sie einen Pathologen konsultieren.
- Legen Sie das Tumorgewebe in eine Schale, die 10-15 ml kalte sE enthält, oder Gewebekulturmedien wie RPMI 1640 oder DMEM, die Antibiotika enthalten (1% Penicillin und Streptomycin).
- Identifizieren und isolieren Sie lebensfähiges Tumormaterial aus angrenzendem normalen und nekrotischen Gewebe mit Hilfe eines Pathologen. Verwenden Sie sterile Zangen und Skalpell, um nekrotisches Material zu entfernen, auf das ein Pathologe hingewiesen hat.
HINWEIS: Der Tumor kann entweder intraperitoneal oder subkutan in die Mäuse implantiert werden. Führen Sie Schritt 4.2 aus, um eine intraperitoneale Implantation durchzuführen, oder fahren Sie mit Schritt 4.3 fort, um eine subkutane Engraftmentierung durchzuführen. In dieser Studie wurden gezielte Therapien, die auf der Grundlage genomischer Analysen ausgewählt wurden, in einer Reihe von PDX-Modellen auf hochwertigen serösen Eierstockkrebs mit intraperitonealer Implantation getestet.
- Bereiten Sie das Gewebe für intraperitoneale (IP) Implantation das Gewebe mit sterilen Zangen und einem Skalpell auf Eis zu stücken ca. 1-1,5 mm3 in der Größe und Mischen mit kalten Kultur Medium. Injizieren Sie 0,3–0,5 ml Tumorschlämme mit einer 16-17-Messnadel.
HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe werden mit aseptischen Techniken durchgeführt. Sterile Handschuhe, sterile Instrumente, Vorräte und implantierte Materialien wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu reduzieren.- Mischen Sie die Stücke 1:1 mit eiskaltem Kulturmedium und injizieren Sie 100 ml intraperitoneal in mindestens drei weibliche SCID-Mäuse.
- Schneiden Sie das Tumorgewebe für die subkutane Engraftmentierung mit sterilen Zangen, Skalpell oder chirurgischen Scheren in kleine Fragmente, etwa 2 x 2 x 2 mm groß, und übertragen Sie das fragmentierte Gewebe auf eine vorgekühlte Petrischale auf Eis.
- Fügen Sie die kalte Kellermembranmatrix mit dem fragmentierten Gewebe (ca. 200 ml pro 10 Stück Gewebe) in die Schale ein, mischen Sie sie gut und lassen Sie die Gewebefragmente 10 min in der kalten Kellermembranmatrix einweichen.
- Anästhetisieren Sie 5 weibliche NOD/SCID-Mäuse, um sie für die Engraftmentierung vorzubereiten.
- Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit Ketamin (150 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) Kombination.
- Bestätigen Sie, dass die Maus richtig beästhebt ist, indem Sie die Schwanzspitze mit atraumatischen Zangen kneifen.
- Entfernen Sie sanft vollständig anästhesisierte Maus aus der Kammer und setzen Sie auf die Maus einen Nasenkegel, der Eingang von Verdampfer und Ausgang von Abgas-Aufräumsystem hat.
- Setzen Sie Tierarzt Salbe auf Mausaugen, um Trockenheit zu verhindern, während unter Anästhesie. Bereiten Sie den Bereich vor, in dem die Operation durchgeführt wird. Verwenden Sie aseptische Technik, um die Operation durchzuführen.
- Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche, auf der die Operation stattfinden wird, nicht porös, versiegelt und vor der Operation desinfiziert wird.
- Beginnen Sie die Operation mit sterilen (durch Autoklaven, Gas oder chemische Sterilisation) Instrumente.
- Verwenden Sie Handschuhe, um Instrumente zu handhaben und die Sterilität der Instrumentenspitzen während des gesamten Verfahrens zu erhalten, indem Sie sie zwischen den Operationsschritten in Ethanol untertauchen.
- Sterilisieren Sie die chirurgische Stelle, indem Sie 3 abwechselnde Peelings von Jod und Alkohol anwenden. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Zangen, um einen 5-10 mm vertikalen Hautschnitt an beiden Flanken einer Maus zu machen.
- Setzen Sie gerade Zangen sanft in den subkutanen Raum ein, um eine Tasche zu schaffen, die groß genug ist, um ein Tumorfragment unter das Fettpolster zu legen.
- Verwenden Sie die sterilen geraden Zangen, um Tumorfragmente in zuvor vorbereitete Tasche in jeder der 5 Mäuse einzufügen.
HINWEIS: Legen Sie 3-4 Stück Tumorgewebe in eine Tasche. - Schließen Sie die Hautschnitte mit Gewebekleber.
- Intraperitoneally injizieren jede Maus mit 100 ml Rituximab nach der Implantation, um die Lymphozytenproliferation zu hemmen.
- Legen Sie die Maus in einen Käfig unter einer Wärmelampe für ca. 20 min, bis sie von der Anästhesie erholt ist. Überwachen Sie die Maus Vitalzeichen und stellen Sie seine ausreichende Hydratation.
- Bringen Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück, nachdem sie sich von der Anästhesie erholt und begann, Nahrung und Wasser zu haben. Bereitstellung postoperativer Betreuung und Überwachung gemäß institutionellen Richtlinien. Überprüfen Sie täglich 3 aufeinanderfolgende Tage nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen und Schmerzen.
HINWEIS: Kriterien für Schmerzen oder Not sind Nekrose oder Geschwüre, Gewichtsverlust / Körperzustand Scoring, Verhaltenszeichen wie Aktivitätsniveau, motorische Funktion und Körperhaltung. - Überprüfen Sie die Mäuse routinemäßig zweiwöchentlich auf Tumorbildung, bis die Tumore die Größe von 0,5 cm Durchmesser erreichen, gemessen mit einem Bremssattel.
- Bewerten Sie den Integritätswert jeder Maus, die von Aussehen, Verhalten und Körperzustand39abgeleitet ist. Verwenden Sie Die Werte von 6 € als Kriterien für moribunde Mäuse, die durch Kohlendioxid-Inhalation geopfert werden.
5. Testen von Reaktionen auf genomisch identifizierte Ziele in PDX-Modellen
- Beginnen Sie die ausgewählten zielgerichteten Behandlungen, wenn die Tumore spürbar sind und erreichen Sie 0,5 cm3, gemessen durch einen Ultraschall-Scan.
- Vor der Durchführung einer Ultraschalluntersuchung des Bauches entfernen Sie die Maus Bauchfell und tragen sterilgelee Schmiermittel.
- Verwenden Sie eine Ultraschallmaschine mit einem Messumformer, um Bilder mit dem Tumor im Querschnitt zu erhalten. Machen Sie 3 Messungen pro Sitzung für jedes Tier und durchschnittlich den Wert für eine genauere Bewertung der Tumorgröße.
- Analysieren Sie die Bilder mit der verfügbaren Software40.
- Chemotherapie, bestehend aus einer Mischung aus Carboplatin bei 51 mg/kg und Paclitaxel bei 15 mg/kg intraperitoneal (IP) einmal pro Woche für eine Gesamtbehandlungsdauer von 4-6 Wochen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen für die Injektion 0,2 ml nicht überschreitet.
- Machen Sie eine MK-220641 Stofflösung in 30% Cyclodextrin (z.B. Captisol) und liefern Sie über orale Gavage bei 120 mg/kg täglich für 4 aufeinander folgende Wochen.
- Bereiten Sie die Maus für die orale Gavage vor, indem Sie sie halten, indem Sie die Haut des Rückens kneifen und sie zurückstecken, so dass der Kopf und die Gliedmaßen der Maus immobilisiert sind.
- Setzen Sie die Gavage-Sonde an der Rückseite der Mauskehle ein, bis die Sonde die Speiseröhre erreicht. Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht zu weit eingesetzt wird, da die Lunge der Maus perforiert und den Tod verursacht.
- Stellen Sie eine MK-866942 Stofflösung in Ethanol bei 25 mg/ml her. Verdünnen Sie es in einem Fahrzeug mit 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 in sterilem Wasser für IP-Injektionen bei 10 mg/kg für 5 Tage jede zweite Woche, mit einer Gesamtdauer der Behandlung von 4 Wochen.
HINWEIS: Das Volumen, das Mäusen injiziert wird, sollte 50-120 ml betragen, abhängig vom Gewicht des Tieres. - Verwenden Sie 7-8 Mäuse pro Behandlungsgruppe, um genügend statistische Leistung zu haben, um Unterschiede zu erkennen43,44.
- Beurteilen Sie das Körpergewicht und den allgemeinen Zustand der Mäuse in der Therapie täglich. Halten Sie Medikamente zurück, wenn das Gewicht eines Tieres um 20 % oder mehr ab dem ursprünglichen Gewicht sinkt.
- Bewerten Sie die Tumorgröße wöchentlich mit Ultraschall-Scans. Stellen Sie sicher, dass die Person, die die Überwachung des Tumorwachstums durchführt, für die Behandlung geblendet ist, um die unvoreingenommene Bewertung der Reaktionen zu gewährleisten.
HINWEIS: Kleinere Laboratorien können 2 verschiedene Personen beschäftigen, um Behandlung und Ultraschallüberwachung zu verwalten.
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Representative Results
Gewebe aus resezierten Eierstocktumoren zum Zeitpunkt der Entschärlung samten wurden gemäß IRB-Leitfaden gesammelt und für 1) genomische Charakterisierung und 2) Engraftment bei immungeschwächten Mäusen verwendet (Abbildung 1). Mate-pair-Sequenzierungsprotokoll36,37 wurde verwendet, um strukturelle Veränderungen in der DNA einschließlich Verluste, Gewinne und Verstärkungen zu identifizieren. Abbildung 2zeigt eine repräsentative Genomdiagramm, die eine Landschaft genomischer Veränderungen in einem Tumor (als OC101 bezeichnet) veranschaulicht. Typisch für hochgradige seröse Subtyp-Tumoren wurden mehrere Gewinne (blaue Linien) und Deletionen (rote Linien) gefunden, was auf ein hohes Maß an genomischer Instabilität hindeutet, sowie Chromosomenverluste und -gewinne, die auf Aneuploidie hindeuten. Im Durchschnitt werden 300-700 Veränderungen insgesamt in hochgradigen serösen Subtyptumorenidentifiziert 45. Nachfolgende Analysen ergaben einige DNA-Veränderungen, die potenziell mit klinisch relevanten Medikamenten zielfähig waren. Die ranghöchste Veränderung für therapeutische Interventionen im OC101-Tumor war eine Amplifikation am Chromosom 17 mit ERBB2 (Abbildung 2 und Abbildung 3A). ERBB2 ist ein Gen, das für her2-Rezeptoren kodiert, das bei Dimerisierung mit EGFR, HER3 oder HER4 bekannt ist, um RAS/ERK- und PI3K/AKT-Signalwege zu aktivieren und Zellwachstum, Zellmigration und Invasion zu fördern. HER2-Inhibitoren (z. B. monoklonale Antikörper Pertuzumab und Trastuzumab) sind wirksam bei der Behandlung von Brustkrebspatientinnen, wenn Tumore das HER2-Protein überausdrücken. Die Anti-HER2-Therapie bei Eierstockkrebs ist jedoch nicht von der FDA zugelassen.
Ein Vergleich des genomischen Profils des Tumors von Spenderpatienten(Abbildung 1) mit dem eines entsprechenden PDX-Modells (nicht dargestellt) ergab eine frappierende Ähnlichkeit, die mit allen früheren Studien übereinstimmte, die die molekulare Nähe von Originaltumoren zu ihren PDX-Derivaten berichteten.
Um die MPseq-Ergebnisse auf DNA-Ebene zu validieren, wurden mehrere Sätze spezifischer Primer für die Ränder der amplifizierten Region entwickelt, die das ERBB2-Gen enthält, und PCR wurde mit DNA durchgeführt, die aus dem ursprünglichen Tumor isoliert wurde, sowie aus einem Tumor, der sich für mehrere Generationen bei den Mäusen vermehrte. Abbildung 3Bzeigt ein repräsentatives Gelbild von verstärkten Produkten mit zwei verschiedenen Primern. Es wurde kein Band nachgewiesen, wenn normale gepoolte genomische DNA (bezeichnet als C), die keine Amplifikation des ERBB-Lokus enthielt, verstärkt wurde. Die Reinigung der Produkte aus der Gel- und Sanger-Sequenzierung (nicht dargestellt) bestätigte die von MPseq vorhergesagte Veränderung. Eine weitere Validierung wurde durchgeführt, indem die Expression von HER2-Protein im entsprechenden PDX-Tumor mittels Immunoblotting untersucht wurde. Die Analyse ergab einen hohen Gehalt an HER2-Protein (das Ergebnis wird nicht gezeigt), im Einklang mit der beobachteten Amplifikation des ERBB2-Gens.
In der DNA eines anderen Eierstocktumors (bezeichnet T14) wurden zahlreiche regionale Gewinne beobachtet. Dazu gehörten AKT2- und RICTOR-Gene (Abbildung 3C). Beide waren aus therapeutischer Sicht von großem Interesse, da Inhibitoren von AKT2 und mTOR, mit denen RICTOR assoziiert, verfügbar sind und sich derzeit in klinischen Studien befinden. Da es keine Mate-Pair-Lesevorgänge gab, die sich über die Nähe eines der beiden Gene erstreckten, war eine einfache PCR-Validierung des gewinngemäß, wie sie von MPseq erkannt wurde, nicht möglich. Wir haben daher den Expressionsgrad der entsprechenden Proteine durch Immunoblotting getestet. Es wurden hohe Konzentrationen von AKT und RICTOR beobachtet (Abbildung 3D), was darauf hindeutet, dass eine Behandlung mit gezielten Medikamenten gerechtfertigt ist.
Um die Empfindlichkeit dieses Tumors gegenüber Inhibitoren von AKT und mTOR zu testen, wurden PDX-Mäuse mit intraperitoneal implantiertem T14-Tumor erweitert und randomisiert, um nur eine Chemotherapie (Carboplatin/Paclitaxel) oder eine Kombination von Chemotherapie mit Pan-AKT-Hemmer MK-220641 oder mTOR-Hemmer MK-866942zu erhalten. Die Chemotherapie wurde Mäusen im Kombinationsarm 2 Wochen lang vor der Zugabe der zielgerichteten Therapie verabreicht (Abbildung 4). Ultraschallmessungen wurden wöchentlich durchgeführt, um die Tumorregression/das Tumorwachstum zu überwachen.
Jeder Behandlungsarm enthielt nicht weniger als 7 Mäuse. Diese Zahl reichte aus, um Unterschiede in den Antworten zwischen den Gruppen zu beobachten und gleichzeitig die Kosten der Studie auf einem deutlich niedrigeren Stand zu halten. Weniger Mäuse (drei bis vier) können in der kontrollunbehandelten Gruppe verwendet werden, da individuelle Variationen der Tumorwachstumsrate vernachlässigbar sind und das Wachstum auf eine Tumorgröße normalisiert wird, bei der die Behandlung in anderen Armen beginnt.
In den ersten 3 Wochen der Beobachtung (nicht gezeigt) wurde kein Unterschied zwischen chemobehandelten und unbehandelten Gruppen beobachtet. Eine signifikante Verringerung der Tumorbelastung (58% Median) wurde in der chemotherapiebehandelten Gruppe bis zum Ende der 6. Woche beobachtet. Ein zusätzlicher Nutzen gegenüber der Chemotherapie allein wurde in Gruppen beobachtet, die eine Kombination von Chemotherapie mit gezielten Therapien erhielten. Der Unterschied wurde in Woche 4 und 3 für MK-8669 (Abbildung 4A) bzw. MK-2206 (Abbildung 4B) deutlich.
Tiere wurden eingeschläfert und Tumorgewebe für molekulare Analysen der Behandlungsreaktion am Ende der Behandlungsstudie in Woche 7 gesammelt. Zu diesem Zweck wurden die Mengen der Gesamt- und phosphorylierten S6-Kinase (Abbildung 5A,B), AKT und mTOR (Abbildung 5C,D) mittels Immunoblotting ermittelt. Ribosomale Protein S6 Kinase ist ein nachgeschalteter Botenstoff des AKT-mTOR-Signalwegs, bekannt als up-reguliert und phosphoryliert bei Stimulation der AKT-mTOR-Achse durch Wachstumsfaktoren zur Förderung des Zellüberlebens und -wachstums. Der Vergleich der Konzentrationen dieser Proteine in unbehandelten oder mit Chemotherapie behandelten PDX-Tumoren mit Mäusen, die AKT- oder mTOR-Hemmer erhielten, zeigte eine deutliche Abnahme der beiden letztgenannten (Abbildung 5), was auf die Wirksamkeit der zielgerichteten Therapie auf molekularer Ebene hindeutet. Anpassungen des Behandlungsregiments, soweit der Anwendungszeitpunkt für die kombinierten Medikamente und die Therapiedauer, sollten vorgenommen und getestet werden, um bessere Reaktionen zu erzielen.
| Primername | Sequenz | Primer Mix | Primer kombiniert | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 und R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACTAGTAGTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 und R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 und R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 und R2 | ||
Tabelle 1: Grundierungen, die zur Validierung der Oc101chromosom 17-Änderung verwendet werden.
| Reagenz | Menge, die für 1 Reaktion addiert werden soll (L) | Menge, die für 4 Reaktionen addiert werden soll (L). [Multiplizieren Sie mit 4.3, um genug für jeden Primer-Mix (4)] zu machen. |
| Nukleasefreies Wasser | 20.45 | 89.94 |
| 10x Puffer (Easy A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Vorlagen-DNA (Konzentration >10 ng/L) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymerase | 0.25 | 1.08 |
Tabelle 2: PCR-Setup zum Überprüfen einer Verbindung.
| Temp (C) | Zeit | |
| 94 | 5 Min. | |
| 94 | 40 s | 35 Zyklen |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 Min. | |
| 72 | 5 Min. | |
| 4 | Halten |
Tabelle 3: Fahrradbedingungen für PCR zur Validierung einer Kreuzung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Strategie für genomisch geführte Therapietests mit PDX-Modellen für seröses Ovarialkarzinom. H&E-Färbung des Eierstocktumors wird gezeigt (oben). Skala bar=100 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Genomische Charakterisierung von Eierstocktumoren mit MPseq. Genom-Plot zeigt die Landschaft der strukturellen Veränderungen und Kopiernummernänderungen, wie von MPseq erkannt. Die X-Achse überspannt die Länge des Chromosoms mit der angezeigten Chromosompositionszahl. Jedes Chromosom ist auf der rechten und linken Y-Achse angezeigt. Die Höhe der horizontalen Spuren für jedes Chromosom gibt die Anzahl der Lesevorgänge an, die für 30k Basispaarfenster erkannt wurden. DNA-Kopiernummern werden durch Farbe angezeigt, wobei Grau den normalen 2N-Kopierzustand darstellt, rot, der Löschungen entspricht, und Blau-zu-Gewinnen. Das Verbinden schwarzer Linien entspricht chromosomalen Umlagerungen. Änderungen am ERBB2-Lokus werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswahl zielbarer Änderungen und deren Validierung. (A) Ein Nahaufnahmesegment des Genomdiagramms, das in Abb.1 dargestellt ist und eine Verstärkung des ERBB2-Gens auf Chromosom 17 (blau) veranschaulicht. Chromosomenzahlen sind wie angegeben. (B) Validierungsanalyse von Haltepunkten am ERBB2-Standort, wie sie von MPseq mittels PCR-Amplifikation identifiziert wurden. C ist eine gepoolte genomische DNA-Kontrolle, OC101 ist DNA aus Patiententumor, M ist eine DNA-Leiter. (C) Eine Nahaufnahme von Segmenten des Genomdiagramms für einen anderen Eierstocktumor, der Gewinne (angezeigt durch blaue Linie) am AKT-Lokus (oben) und am RICTOR-Gen (unten) zeigt. Chromosomen sind wie angegeben. (D) Validierungsanalyse der Expression von Proteinen des AKT/mTOR-Signalwegs durch Immunoblotting unter Verwendung von Tumorgewebe aus PDX (T14), genomische Veränderungen, für die in C. 30 mg Gesamtprotein und spezifische Antikörper gegen AKT, RICTOR, p-mTOR dargestellt werden. MAPK diente als Ladesteuerung. Pos con ist ein unabhängiger Tumor, der als Positivkontrolle verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Der Vergleich der Reaktionen auf die Chemotherapie allein und kombiniert mit einer gezielten Therapie bei Tumoren, die Gewinne bei AKT2- und RICTOR-Genen mit entsprechenden Medikamenten bergen. Behandlungsreaktionen auf eine Kombination von Chemotherapie und Anti-MTOR-Medikament MK-8669 (A) oder Inhibitor von pan-AKT MK2206 (B) im Vergleich zur Chemotherapie allein. Die Zeit der Verabreichung für jede Behandlung und die Dauer werden durch die Pfeile angezeigt. Volumen werden zu Beginn der Behandlung als Prozentsatz des Anfangsvolumens als Mittelwert +/- SD ausgedrückt. Chemo ist Chemotherapie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleich der molekularen Veränderungen, die bei jeder Behandlung ausgelöst werden, wie durch Immunoblotting-Analyse bestimmt. (A) Ebenen von S6 und Phospho-S6, dem nachgeschalteten Effektor des AKT-mTOR-Signalwegs, werden gezeigt. Es wurden 30 mg Gesamtprotein und spezifischer Antikörper gegen S6 und p-S6 verwendet. GAPDH wurde als Ladesteuerung eingesetzt. Die Quantifizierung des auf GAPDH normalisierten Proteinspiegels wird in (B) (C) In den MTOR-, p-mTOR-, AKT- und p-AKT-Werten gezeigt, wie sie durch Immunoblotting nachgewiesen werden. GAPDH wurde als Ladesteuerung eingesetzt. (D) Quantifizierung des Auflagenspiegels auf GAPDH normalisierten Proteinspiegel. NT wird nicht behandelt, Chemo ist Chemotherapie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben den Ansatz und die Protokolle, die wir verwendet haben, um eine "klinische Studie" in PDX-Modellen durchzuführen, die die molekularen Eigenschaften des Tumors nutzt, wie sie durch genomisches Profiling gewonnen werden, um die beste Auswahl an Medikamenten für Tests zu bestimmen. Mehrere Sequenzierungsplattformen werden derzeit für die genomische Charakterisierung von Primärtumoren verwendet, einschließlich der gesamten Genomsequenzierung, RNAseq und kundenspezifischer Genpanels. Für hochgradige seröse Seramenkarzinom, MPseq strukturelle Veränderungen zu identifizieren, DNA-Umlagerungen und Kopiernummer Änderungen, ist besonders nützlich wegen der hohen Grad der genomischen Instabilität in dieser Art von Tumor beobachtet. Der zweite Vorteil der MPseq-Plattform besteht darin, dass sie das gesamte Genom abdeckt, aber deutlich weniger kostet als andere umfassende Sequenzierungstechnologien. MPseq ist jedoch nicht für die Punktmutationsdetektion geeignet, da die Basisabdeckung nicht ausreicht und nur 8-10x erreicht. Eine der Einschränkungen bei der Verwendung von MPseq allein für die genomische Charakterisierung eines Tumors ist das Vorhandensein komplexer gruppierter chromosomaler Umlagerungen, deren Analyse die Expression von betroffenen Genen nicht vorhersagt. Eine von MPseq entdeckte Kreuzung, die ein vermeintliches Fusionsgen erzeugt, das in der DNA durch PCR validiert, kann aufgrund einer Frameverschiebung oder kleiner Deletionen und Einfügungen im Promotorbereich nicht exprimiert werden. Ebenso sollten Chromosomengewinne und Amplifikationen für potenzielle therapeutische Ziele sorgfältig bewertet und auf RNA- oder Proteinebene validiert werden, um die Expression des Gens von Interesse zu gewährleisten.
Obwohl die molekulare Auswuchsform des Tumors nach der Ausbreitung bei Mäusen für mehrere Generationen weitgehend erhalten bleibt, können Veränderungen der Expressionsniveaus wichtiger Gene im Laufe der Zeit auftreten, entweder was die Tumorentwicklung, die klonale Selektion oder die adaptive Reaktion auf die murine Umgebung widerspiegelt. Daher ist die Validierung einer Veränderung, die für therapeutische Interventionen sowohl im ursprünglichen Spendertumor als auch im PDX-Tumor bestimmt ist, von entscheidender Bedeutung. Für Tumorisoliert aus PDX-Modellen können sowohl RNA als auch Protein verwendet werden, um die Expressionsebene abzuhören, da das Material reichlich vorhanden ist. Beide können gewählt werden, um die Expression im ursprünglichen Tumor zu überprüfen, abhängig von der Verfügbarkeit und Art des gespeicherten Gewebes, und die Verfügbarkeit von Antikörpern für den entsprechenden Proteinnachweis. Das PDX-Modell ist besonders bei der Prüfung von Kombinationstherapien von unschätzbarem Wert, da die In-vivo-Einstellung die Überwachung von Nebenwirkungen sowie Dosis- oder Daueranpassungen im Behandlungsschema ermöglicht.
Die Wahl zwischen orthotopischer und subkutaner Transplantation kann je nach den spezifischen Fragen, die in der Studie behandelt werden, getroffen werden. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die Empfindlichkeit von xenografted Tumoren gegenüber Therapeutika durch die Stelle der Implantation moduliert werden kann46. Auf der anderen Seite wurden noch keine Beweise über die Entdeckung von Medikamenten berichtet, die eine therapeutische Reaktion in orthotopischen Modellen zeigen, aber nicht in subkutan implantiert PDX9.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang und Faye R. Harris, MS, für die Hilfe bei der Durchführung von Experimenten. Diese Arbeit wurde unterstützt von Herrn und Frau Neil E. Eckles' Gift an das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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