Summary
该协议详细介绍了清除猪脑的全部技术，并剖析了神经科学中常见的几个大脑区域。
Abstract
使用猪作为一种前颅和可翻译的动物模型已被研究心血管系统、胃肠道系统和营养的研究领域所充分记录和接受，猪正越来越多地被用作神经科学中的一种大型动物模型。此外，猪是研究神经发育的公认模型，因为它显示的大脑生长和发展模式类似于人类。作为神经科学中不太常见的动物模型，对猪的手术和解剖程序在研究人员中可能并不熟悉或实践得那么充分。因此，一个标准化的视觉协议，详细说明一致的提取和解剖方法，可能证明有价值的研究人员与猪的工作。以下视频展示了一种技术，以消除猪脑，同时保持皮层和脑干完好无损，并审查方法解剖几个常见的调查的大脑区域，包括脑干，小脑，中脑，海马，纹状体，沙拉穆斯和前额叶皮质中。这段视频的目的是为研究人员提供必要的工具和知识，以持续对这头四周大的猪进行大脑提取和解剖。
Introduction
这头猪已被记录在案，并被公认为心血管系统1、胃肠道系统2、营养3、4、糖尿病5、毒理学6和外科技术7的可翻译动物模型。猪在神经科学中的使用开始增加，因为PubMed搜索关键词"猪脑动物模型"的结果是1996-2005年的四倍，比前10年8年，甚至更多的结果。猪模型之所以流行，一个主要原因是它与人类在生长、结构和大脑功能上的相似性。与人脑相比，猪脑表现出相似的陀螺图案、血管化和灰白物质分布9。此外，猪脑已被用于神经成像程序，唤起潜在的记录，并在建立神经外科技术8，9。然而，与其他动物模型不同，猪和人类经历的围产期大脑生长突飞猛进，而不是产前或产后生长突飞猛进。出生时，人类和猪脑的体重分别占成年脑重的27%和25%，而大鼠脑的体重占成年脑体重的12%，恒河猴脑的体重占成人体重的76%。
猪之所以被缓慢地作为神经科学的动物模型采用，原因之一是许多研究人员对这种动物不熟悉。研究人员可能不知道它在该领域的潜在用途，也可能不知道使用这种模型所需的适当技术。随着猪作为生物医学和产前模型的使用在神经科学中得到重视和使用，有必要建立标准化的组织去除程序，以确保在研究中准确比较数据。虽然涉及猪脑的解剖和手术技术已经发表在其他地方11，12，13，但需要简单和标准化的协议来收集猪脑组织，特别是用于生化检测。因此，本视频的目的是提供必要的知识，使研究人员能够进行标准化的大脑提取和解剖。这段视频展示了一种适当的技术，在保持皮层和脑部完好无损的同时去除猪脑，然后审查解剖几个关键大脑区域的方法。
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Protocol
涉及动物学科的程序已获得伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准
注：在安乐死之前，猪通过肌肉注射麻醉，结合了特拉佐尔：氯胺酮：西拉津（50.0毫克瓷砖胺HCl加上50.0毫克佐拉泽帕姆HCl） 重组时含有2.50毫升氯胺酮HCl（100克/升）和2.50毫升西拉津（100克/升），施用于0.06毫克/千克BW）。麻醉后，猪通过五巴比妥钠（390毫克/mL在1mL/5公斤BW）的内皮管理被安乐死。对于大脑解剖，建议根据组织所需的分析程序选择安乐死的方法。安乐死的方法应该对大脑造成尽可能少的伤害。
1. 提取猪脑
- 在人道安乐死之后，通过在颈部的尿布上方切割，在第一个和第二个椎骨（分别在图集和轴之间）斩首猪。
- 将头部固定在固定的长凳上，以包括尖刺。确保头部在继续前完全固定。
- 使用手术刀，沿着头骨的中线进行下垂切口，继续到头部后部。
- 在头部后部进行第二次（横向）切割。
- 在鼻子的后端剪第三个（横向），并与眼睛对联。尽可能远离头骨切开皮肤，确保轻松进入头骨。
- 使用骨锯，使两个前后切横向到中线，从眼睛延伸到头骨曲率的顶点。将锯子斜向中线，切得足够深，可以穿透头骨。
- 在垂直的两侧重复上述过程，在头骨中创建一个矩形"窗口"。
- 用肉钩撬开头骨的矩形部分。首先将钩子放入该部分的一个角落，并施加向上压力以松开头骨碎片。小心将肉钩只放在头骨的水平，以防止无意中穿透脑组织。
- 如果脑膜层停留在大脑中，使用钳子和钝剪刀（或者手术刀）在不切入大脑的情况下轻轻移除层。
- 使用手术刀切除头部后部的肌肉和脂肪，露出头骨的后部。
- 沿着头骨后部做两个横切。一定不要切成脑组织。
- 将一只坚定的手放在鼻子上，然后施加向后压力，将头骨的后部拉下来，露出小脑，从而固定头部。
- 将头部从长凳上取下，放在手术垫上。
- 使用细长的工具，如手术刀的钝端，去除大脑。倒置头部，使用柔和的铲取动作将大脑从头骨腔中哄出，而不会损坏大脑表面。
注意：有必要切断颅骨神经以去除大脑。轻轻地这样做，不要试图强行拉出大脑。当大脑与头骨和脊椎完全分离时，大脑会自行脱落。
2. 解剖猪脑
注意：在解剖过程中使用脑图集或纤维解剖指南14 作为视觉表现可能有帮助。在移除每个样本时，确保根据项目特定需求正确存储解剖的组织样本（详情请如下）。此外，请注意，为了此视频的目的，显示的所有大脑区域都是从右半球解剖的，但根据实验目标，每个实验室可能有所不同。
- 要去除脑系统（主要是美杜拉），使冠状切口到小脑。
- 要去除小脑，在皮层后部进行冠状切割。从这个样本中分离出小脑所需的区域（如紫杉、絮怪等）。请务必在此样本中包括脑干的任何部分。
- 通过沿着纵向裂痕进行中下垂切割来分离大脑的两个半球。将此切口作为连续运动，以防止对皮层造成损害。
- 要去除中脑，解剖所需的组织量，只需向上级和劣等科利库利腹腔。
- 要去除海马体，请将手术刀的钝端放在体料库的后部，然后用从体库卡洛苏姆后部开始的"J"运动轻轻地将海马卷出：整个海马角是"豆形的"。
- 纹状体（主要显示为细胞核）是一个灰色和白色的物质条纹区域，就在海马体的正下方和海马体前部。剥开手术刀并移除此区域，在切除后露出条纹组织。
- 要去除前额叶皮质内皮质，从前额陀螺解剖组织到肉体卡洛苏姆，去除该部分的最中位部分。切除前额皮质中位后，右皮层应保留。
- 要去除沙拉穆斯，取出大脑中腹表面中心的球状结构，并旋转到脑中。沙拉穆斯有一个球形形状，看起来比周围的组织稍暗。
3. 解剖后
- 解剖完成后，正确保存组织样本，供后续分析。如果遗漏此步骤，将在 20 分钟内导致显著的自动分析和退化。
- 如果进行结构分析，或在保存前将组织切碎以创建同质组织样本，则在解剖时保持每个大脑区域完好无损。脑组织的常见样品保存方法包括使用交联剂15进行冷冻保存和化学固定。
- 对于标准实验室检测（如基因或蛋白质表达），浸入液氮或溶液中，在长期储存在 -80 °C 之前稳定遗传物质，以提供方便且经济高效的保存方法。
- 如果维护组织结构是重中之重，则通过传统的固定方法（例如，使用基于醛的固定剂来交叉链接蛋白质）来保存脑组织，在组织解剖之前，无需或与动物或感兴趣的器官进行灌注。
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Representative Results
本节描述了正确提取和解剖4周大猪脑后获得的结果示例。 图1 勾勒出每个大脑区域的形状，供解剖期间用作指南。切除小脑（图1B）后，部分脑部可能留在头骨中。这可以在隔离小脑所需的区域时删除。 表1 显示每个被解剖的大脑区域（n=5）的平均重量（平均±平均标准误差）。
图1：提取猪脑。 在解剖过程中用作指南的大脑区域轮廓。显示的区域来自右半球。 请单击此处查看此图的更大版本。
| 地区 | 重量 （g） | 塞姆 |
| 全猪* | 8.006 | 0.545 |
| 脑干 | 0.829 | 0.132 |
| 小脑 | 5.929 | 0.137 |
| 中脑 | 0.376 | 0.047 |
| 海马体 | 0.500 | 0.051 |
| 纹 状 体 | 0.410 | 0.115 |
| 丘脑 | 0.476 | 0.120 |
| 中前额皮质 | 0.459 | 0.122 |
| *重量表示为公斤 |
表1：大脑区域重量。 4周大的猪脑和每个解剖的大脑区域（n=5）的平均体重。
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Discussion
此处描述的技术是为大约 4 周大的猪设计的。在猪被人道地安乐死后立即执行这些步骤，以确保脑组织结构的完整性得到维护，尤其是在考虑随后的生化检测时。在第一次学习技术时，使用地图集或纤维16 解剖指南是有帮助的。建议实验者在获取数据收集样本之前进行几次大脑提取和解剖。最困难的步骤是切除头骨。这一步将变得更加容易的经验，因为它在很大程度上需要第一手的实践，知道在哪里的头骨看到，当头骨已被切断。此程序与 Bassi 等人描述的程序类似，尽管它不需要创建六边形颅窗口，并且提供了如何执行该技术的视觉教程。
这种技术的限制是，在与老猪一起工作时，可能需要更多的时间来取出头骨，因为它会随着年龄的增长而变得明显变厚。如果使用锯子对于较厚的头骨来说过于费力或无效，则可能需要使用锤子和凿子，如 Bjarkam 等人13所展示的锤子和凿子，或者使用电动手术设备（例如骨锯）。此外，这种技术并不总是确保嗅球的捕获。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢农业、消费者和环境科学信息技术与传播服务学院的吉姆·克诺布劳赫和马丁·布斯·霍奇斯在拍摄、录制和编辑音频和视频方面的专业知识。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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