Summary
Este protocolo detalla la técnica para la extirpación del cerebro del cerdo en su totalidad y la disección de varias regiones cerebrales comúnmente estudiadas en neurociencia.
Abstract
El uso del cerdo como modelo animal preclínico y traducible ha sido bien documentado y aceptado por campos de investigación que investigan sistemas cardiovasculares, sistemas gastrointestinales y nutrición, y el cerdo está siendo utilizado cada vez más como un gran modelo animal en neurociencia. Además, el cerdo es un modelo aceptado para estudiar el neurodesarrollo, ya que muestra patrones de crecimiento y desarrollo cerebral similares a lo que ocurre en los seres humanos. Como un modelo animal menos común en neurociencia, los procedimientos quirúrgicos y de disección en cerdos pueden no ser tan familiares o bien practicados entre los investigadores. Por lo tanto, un protocolo visual estandarizado que detalla métodos consistentes de extracción y disección puede resultar valioso para los investigadores que trabajan con el cerdo. El siguiente video muestra una técnica para extirpar el cerebro del cerdo mientras mantiene intacta la corteza y el tronco encefálico y revisa los métodos para diseccionar varias regiones cerebrales comúnmente investigadas, incluyendo el tronco encefálico, cerebelo, midbrain, hipocampo, estriado, tálamo y corteza prefrontal medial. El propósito de este video es proporcionar a los investigadores las herramientas y conocimientos necesarios para realizar consistentemente una extracción y disección cerebral en el cerdo de cuatro semanas de edad.
Introduction
El cerdo ha sido bien documentado y aceptado como un modelo animal traducible para la investigación en sistemas cardiovasculares1,sistemas gastrointestinales2,nutrición3,4,diabetes5,toxicología6,y técnicas quirúrgicas7. El uso del cerdo en neurociencia está empezando a aumentar, ya que PubMed busca las palabras clave "modelo de animales cerebrales porcinos" resultan en cuatro veces más resultados de 1996-2005 que el período anterior de 10 años8,y aún más resultados en la actualidad. Una razón primaria por la que la popularidad del modelo porcino se está expandiendo se debe a sus similitudes en el crecimiento, la estructura y la función del cerebro en comparación con los seres humanos. En comparación con el cerebro humano, el cerebro del cerdo exhibe patrones girostrales similares, vascularización y distribución de materia gris y blanca9. Además, el cerebro del cerdo se ha utilizado en procedimientos de neuroimagen, evocado registro potencial, y en el establecimiento de técnicas de neurocirugía8,9. A diferencia de otros modelos animales, sin embargo, el cerdo y la experiencia humana perinatal crecimiento cerebral estimula, en lugar de pre- o post-natal crecimiento estimula. Al nacer, el cerebro humano y porcino pesa aproximadamente el 27 y el 25 por ciento de su peso cerebral adulto, respectivamente, en comparación con el cerebro de rata que pesa el 12 por ciento de su peso cerebral adulto y el cerebro del mono rhesus en el 76 por ciento del peso adulto10.
Una de las razones por las que el cerdo sólo ha sido adoptado lentamente como un modelo animal para la neurociencia es porque muchos investigadores no están familiarizados con el animal en este contexto. Los investigadores pueden no ser conscientes de sus usos potenciales en el campo o pueden no conocer las técnicas adecuadas necesarias para utilizar un modelo de este tipo. Como el uso del cerdo como modelo biomédico y preclínico gana atención y uso en neurociencia, es necesario establecer procedimientos estandarizados de eliminación de tejidos para garantizar una comparación precisa de los datos a través de estudios. Aunque las técnicas de disección y cirugía que involucran el cerebro del cerdo se han publicado en otros lugares11,12,13, hay una necesidad de protocolos simples y estandarizados para recoger tejido cerebral de cerdo, especialmente para su uso en ensayos bioquímicos. Como tal, el objetivo de este video es proporcionar el conocimiento necesario para permitir a los investigadores realizar una extracción y disección cerebral estandarizada. Este video ilustra una técnica adecuada para extirpar el cerebro del cerdo manteniendo intacta la corteza y el tronco encefálico, y posteriormente revisar los métodos para diseccionar varias regiones clave del cerebro.
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Protocol
Los procedimientos relacionados con temas animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign
NOTA: Antes de la eutanasia, el cerdo fue anestesiado a través de inyección intramuscular con una combinación de telazol:ketamina:xylazine (50.0 mg de tiletamina HCl más 50.0 mg de zolazepam HCl reconstituido con 2,50 ml de ketamina HCl (100 g/L) y 2,50 ml de xilazina (100 g/L) y se administra a 0,06 mg/kg BW). Una vez anestesiado, el cerdo fue eutanasiado mediante administración intracardiaca de pentobarbital sódico (390 mg/ml administrado a 1 ml/5 kg de BW). Para la disección cerebral, se recomienda que el método de eutanasia sea elegido en función del procedimiento analítico deseado del tejido. El método de eutanasia debe causar el menor daño posible al cerebro.
1. Extracción del cerebro del cerdo
- Después de la eutanasia humana, decapitar al cerdo cortando por encima de la nuca, entre la primera y la segunda vértebra (atlas y eje, respectivamente).
- Asegure la cabeza en un banco inmovilizado vise modificado para incluir picos. Asegúrese de que la cabeza esté completamente inmovilizada antes de proceder.
- Usando un bisturí, haz un corte sagital a lo largo de la línea media del cráneo que continúa hacia la parte posterior de la cabeza.
- Haga un segundo corte (transversal) en la parte posterior de la cabeza.
- Haga un tercer corte (transversal) en el extremo posterior del hocico y en línea con los ojos. Corta la piel lo más lejos posible del cráneo para asegurar un fácil acceso al cráneo.
- Usando una sierra ósea, hacer dos cortes anteriores a posteriores laterales a la línea media, extendiéndose desde los ojos hasta el ápice de la curvatura del cráneo. Envuelve la sierra hacia la línea media y corta lo suficientemente profundo como para penetrar en el cráneo.
- Repita el proceso anterior en los lados perpendiculares, creando una "ventana" rectangular en el cráneo.
- Usando un gancho de carne, saque la sección rectangular del cráneo. Comience colocando el gancho en una de las esquinas de la sección y aplique presión hacia arriba para aflojar la pieza del cráneo. Tener cuidado de colocar el anzuelo de carne sólo a nivel del cráneo para evitar penetrar inadvertidamente el tejido cerebral.
- Si alguna capa meningeal permanece en el cerebro, utilice fórceps y tijeras contundentes (o alternativamente, un bisturí) para eliminar suavemente las capas sin cortar en el cerebro.
- Use un bisturí para cortar músculo y grasa en la parte posterior de la cabeza, exponiendo la parte posterior del cráneo.
- Haz dos cortes transversales a lo largo de la parte posterior del cráneo. Asegúrese de no cortar en el tejido cerebral.
- Asegure la cabeza colocando una mano firme en el hocico y aplique una presión hacia atrás para extraer la parte posterior del cráneo, exponiendo el cerebelo.
- Retire la cabeza del vicio del banco y colóquela en una alfombra quirúrgica.
- Usa una herramienta larga y delgada, como el extremo contundente de un bisturí, para extirpar el cerebro. Invierta la cabeza y use un movimiento suave para sacar al cerebro de la cavidad del cráneo sin dañar la superficie del cerebro.
NOTA: Será necesario cortar los nervios craneales para extirpar el cerebro. Hazlo suavemente y no intentes sacar el cerebro con fuerza. El cerebro se caerá por sí solo cuando esté correctamente y completamente separado del cráneo y la columna vertebral.
2. Disección del cerebro del cerdo
NOTA: Puede ser útil utilizar un atlas cerebral o una guía de disección de fibra14 como representación visual durante los procedimientos de disección. Asegúrese de que las muestras de tejido diseccionado se almacenen correctamente de acuerdo con las necesidades específicas del proyecto al retirar cada muestra (descrita con más detalle a continuación). Además, tenga en cuenta que para los propósitos de este video, todas las regiones cerebrales mostradas fueron diseccionadas del hemisferio derecho, pero esto puede diferir según el laboratorio basado en objetivos experimentales.
- Para extirpar el tronco encefálico (predominantemente la médula), hacer un corte coronal caudal al cerebelo.
- Para extirpar el cerebelo, haga un corte coronal posterior a la corteza. Aísle las regiones deseadas (por ejemplo, vermis, flocculus, etc.) del cerebelo de esta muestra. Asegúrese de no incluir ninguna porción del tallo cerebral en esta muestra.
- Separa los dos hemisferios del cerebro haciendo un corte sagital medio a lo largo de la fisura longitudinal. Haga este corte como un movimiento continuo para evitar causar daños en la corteza.
- Para extraer el cerebro medio, disecciona una cantidad deseada de tejido sólo ventral al colliculi superior e inferior.
- Para eliminar el hipocampo, coloque el extremo contundente de un bisturí en la parte posterior del cuerpo calloso y enrolle suavemente el hipocampo hacia fuera, usando un movimiento "J" a partir de la parte posterior del cuerpo calloso; un cuerno de hipocampo entero tiene "forma de frijol".
- El estriado (se muestra principalmente el núcleo de caudato) es una región de rayas grises y blancas justo debajo del cuerpo calloso y anterior al hipocampo. Biselar el bisturí y eliminar esta región, revelando tejido estriado al retirarse.
- Para extraer la corteza prefrontal medial, diseccione el tejido del giro frontal al cuerpo calloso, eliminando la porción más medial de esa sección. La corteza derecha debe permanecer después de la eliminación de la corteza prefrontal medial.
- Para eliminar el tálamo, retire la estructura similar a una bombilla en el centro de la superficie midsagittal del cerebro y rostral al cerebro medio. El tálamo tiene una forma esférica y se verá ligeramente más oscuro que el tejido circundante.
3. Post-disección
- Una vez finalizada la disección, conservar las muestras de tejido correctamente para análisis posteriores. La omisión de este paso dará lugar a una autolisis y degradación significativas en tan solo 20 minutos.
- Deje intacta cada región cerebral en el momento de la disección si se realizarán análisis estructurales, o picar los tejidos para crear una muestra de tejido homogéneo antes de la preservación. Los métodos comunes de conservación de muestras para los tejidos cerebrales incluyen la criopreservación y la fijación química utilizando agentes de enlace cruzado15.
- Para ensayos de laboratorio estándar (por ejemplo, expresión génica o proteica), sumérjase en nitrógeno líquido o soluciones que estabilicen el material genético antes del almacenamiento a largo plazo a -80 °C para proporcionar métodos de conservación convenientes y rentables.
- Si mantener la estructura tisular es una prioridad, preservar los tejidos cerebrales a través de métodos tradicionales de fijación (por ejemplo, el uso de fijadores a base de aldehído para reenlazar proteínas), ya sea sin o con perfusión del animal u órgano de interés antes de la disección del tejido.
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Representative Results
Esta sección describe ejemplos de resultados obtenidos después de la extracción correcta y la disección de un cerebro de cerdo de 4 semanas de edad. La Figura 1 describe la forma de cada región cerebral para su uso como guía durante la disección. Parte del tronco encefálico puede permanecer en el cráneo después de la extirpación del cerebelo (Figura 1B). Esto se puede eliminar mientras se aísla la región deseada del cerebelo. La Tabla 1 muestra el peso promedio (± error estándar de la media) para cada una de las regiones cerebrales diseccionadas (n=5).
Figura 1: Cerebro de cerdo extraído. Contornos de regiones cerebrales para su uso como guía durante la disección. Las regiones mostradas son del hemisferio derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| región | Peso (g) | Sem |
| Cerdo entero* | 8.006 | 0.545 |
| Tronco encefálico | 0.829 | 0.132 |
| cerebelo | 5.929 | 0.137 |
| mesencéfalo | 0.376 | 0.047 |
| hipocampo | 0.500 | 0.051 |
| Estriado | 0.410 | 0.115 |
| tálamo | 0.476 | 0.120 |
| Medial Cortex Prefrontal | 0.459 | 0.122 |
| *Peso presentado como kg |
Tabla 1: Ponderaciones de las regiones cerebrales. Peso promedio del cerebro de cerdo de 4 semanas y cada región cerebral diseccionada (n=5).
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Discussion
Las técnicas descritas en este documento fueron diseñadas para cerdos de aproximadamente 4 semanas de edad. Es fundamental realizar estos pasos inmediatamente después de que el cerdo ha sido eutanasiado humanamente para asegurar que se mantenga la integridad de la estructura del tejido cerebral, especialmente cuando se consideran ensayos bioquímicos posteriores. Es útil utilizar un atlas o guías de disección de fibra16 al aprender por primera vez las técnicas. Se recomienda que el experimentador practique varias extracciones cerebrales y disecciones antes de obtener muestras para la recopilación de datos. El paso más difícil es la extirpación del cráneo. Este paso será más fácil con la experiencia, ya que en gran medida requiere práctica de primera mano para saber dónde en el cráneo para ver y cuándo el cráneo ha sido cortado a través. Este procedimiento es similar al descrito por Bassi et al.12, aunque no requiere la necesidad de crear una ventana craneal hexagonal y proporciona un tutorial visual de cómo realizar la técnica.
Una limitación de esta técnica es que cuando se trabaja con cerdos mayores, puede tomar más tiempo para eliminar el cráneo a medida que se vuelve significativamente más grueso con la edad. Si el uso de una sierra es demasiado laborioso o ineficaz para cráneos más gruesos, puede ser necesario utilizar un martillo y cincel, como el mostrado por Bjarkam et al.13, o equipo quirúrgico alimentado (por ejemplo, sierra ósea). Además, esta técnica no siempre garantiza la captura de las bombillas olfativas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
A los autores les gustaría reconocer a Jim Knoblauch y Martin-Booth Hodges, del Colegio de Servicios de Comunicación y Tecnología de la Información de Ciencias Agrícolas, del Consumidor y Ambientales, por su experiencia en el rodaje, grabación y edición de audio y vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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