Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מהמוחות של מודל בעלי החוליות קצרי הימים Nothobranchius furzeri עבור יישומים במורד הזרם כגון ריצוף RNA בעל גרעין יחיד או בדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq).
Abstract
חקר הזדקנות המוח ברזולוציה של תא בודד במערכות חולייתנים נותר מאתגר בשל עלות, זמן ואילוצים טכניים. כאן אנו מדגימים פרוטוקול ליצירת ספריות ריצוף RNA חד-גרעיניות (snRNA-seq) ממוחם של בעלי החוליות האפריקאים קצרי החיים באופן טבעי, Nothobranchius furzeri. לדגי הטורקיז האפריקאיים יש תוחלת חיים של 4-6 חודשים וניתן לשכן אותם בצורה חסכונית, ובכך להפחית את מחסומי העלות והזמן לחקר הזדקנות המוח של בעלי חוליות. עם זאת, יש צורך בפרוטוקולים מותאמים אישית כדי לבודד גרעינים באיכות מספקת לניסויים חד-תאיים במורד הזרם ממוחם של דגים צעירים ומבוגרים. כאן אנו מדגימים פרוטוקול מותאם אמפירית לבידוד גרעינים איכותיים ממוחם של דגי טורקיז אפריקאים בוגרים, שלב קריטי ביצירת ספריות גרעיניות בודדות באיכות גבוהה. יתר על כן, אנו מראים כי השלבים להפחתת RNA ברקע מזהם חשובים להבחנה ברורה בין סוגי תאים. לסיכום, פרוטוקול זה מדגים את ההיתכנות של חקר הזדקנות המוח באורגניזמים מודל לא מסורתיים של בעלי חוליות.
Introduction
הבנת המנגנונים של הזדקנות המוח של בעלי חוליות היא קריטית לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לגיל, כגון אלצהיימר ודמנציה1. דג הטורקיז האפריקאי (Nothobranchus furzeri) הוא בעל החוליות בעל החיים הקצרים ביותר שניתן לגדל בשבי, ובשל תוחלת החיים הקצרה שלו והפגיעה הקוגניטיבית הקשורה לגיל, זהו מודל מצוין להזדקנות המוח 2,3,4,5. לאחרונה, הופעתן של טכנולוגיות "אומיקה" חד-תאיות, כגון גרעין יחיד RNA-seq (snRNA-seq) ובדיקת גרעינים בודדים עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (snATAC-seq), אפשרו לחוקרים לחקור את המוח המזדקן ברזולוציה חסרת תקדים 6,7,8. שיטות אלה מסתמכות על בידוד גרעינים, שכן ההתאוששות של תאי מוח כגון נוירונים היא לעתים קרובות מאתגרת מכדי לבודד 6,7,8,9,10. עם זאת, רוב פרוטוקולי בידוד הגרעינים שפורסמו מותאמים לאורגניזמי מודל של יונקים 11,12,13,14,15. לפיכך, מכיוון שקיים כיום צורך בלתי מסופק בבידוד גרעיני המוח בדגי הקילי כאורגניזם מודל חדש בתחום מחקר ההזדקנות2, מטרת פרוטוקול זה היא לבסס שיטה לבידוד גרעינים איכותיים מרקמת דגי מוח קפואים.
כאן נוצרת זרימת עבודה יעילה וחזקה המשתמשת בחומרים זמינים בדרך כלל כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה ממוחות של דגי קילין. פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול 10x Genomics עבור מוחות עכברים כדי להתאים למוחות בעלי תכולת המיאלין הנמוכה יותר של דגי קילו טורקיז אפריקאים, לשבריריות של רקמות קפואות ולצורך להפחית את תכולת הפסולת הסביבתית עבור יישומים הקשורים לריצוף16. ואכן, פרוטוקולים שעברו אופטימיזציה בעבר עבור רקמת מוח של יונקים17,18 מובילים לאיכות גרעינים ירודה (כלומר, ל-overlysis) ו/או לתכולת פסולת גבוהה כאשר משתמשים בהם על מוחות קפואים של דגי קיילי, מה שהופך אותם ללא מתאימים לשימוש עם snRNA-seq בהתאם להמלצות לגרעין יחיד RNA-seq באמצעות מיקרופלואידיקה (איור משלים 1).
בנוסף לבידוד גרעינים, אנו מדגימים כיצד להעריך את איכות הגרעינים ותפוקתם על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה. מאמר זה מספק דוגמאות לתוצאות אופטימליות ולא אופטימליות ודן בפתרון בעיות. פרוטוקול זה תוכנן והותאם למוחות של דגי קילי קפואים, אך ניתן להשתמש בו גם ללא שינויים משמעותיים בדגימות של דגי קילי שזה עתה נותחו. גרעיני מוח של Killifish שבודדו בשיטה זו עברו אופטימיזציה לשימוש בגרעין יחיד RNA-seq (snRNA-seq) כיישום במורד הזרם, אך הם צריכים להיות מקובלים לשימוש גם ב-snATAC-seq וב-ATAC-SEQ בתפזורת.
Protocol
טיפול בבעלי חיים וניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם ל- IACUC של אוניברסיטת דרום קליפורניה תחת פרוטוקולים מאושרים #21215. עבור כל עבודה המשתמשת בפרוטוקול זה, יש צורך לקבל אישור מה- IACUC של המוסד לפני תחילת כל עבודת מחקר על בעלי חוליות.
הערה: ריצה מלאה בפרוטוקול שמתחילה מרקמת מוח קפואה בהבזק (החל משלב 3) צריכה להימשך ~2.5 שעות עבור שש דגימות (איור 1).
1. לנתח מוחות של דגי קילי
- יש להרדים באופן הומאני דגי קילי באמצעות תמיסה של 1.5 גרם/ליטר של מתנוסולפונט/טריקיין (MS-222) במי המערכת.
- השתמש במספריים חדים כדי לערוף במהירות דגי קילי לאחר שכל תנועת הגוף והזימים נפסקה.
- נתחו את הראש הערוף על צלחת פטרי נקייה כפי שתואר קודםלכן 19.
- מניחים את התבנית תחת מיקרוסקופ מנתח (באמצעות טווח הגדלה של 8x-35x). סובבו את הראש כך שהקרניים ההסתעפות יהיו בפוקוס
- באמצעות מספריים, לחתוך דרך dentary כך קרניים branchiostegal ואת הגולגולת מתגלים.
- באמצעות מלקחיים, החזיקו את קרני הענפים משני צדי הגולגולת. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי להסיר את כל שברי הרקמה שנותרו מהגולגולת. הכיאזמה האופטית בצורת V שמחברת בין המוח לעיניים אמורה להיות גלויה.
- חותכים את הכיאזמה האופטית באמצעות מספריים כדי לנתק את שתי העיניים מהמוח. השתמש מלקחיים כדי לשחרר בעדינות את הגולגולת.
- הפוך את הגולגולת והשתמש במלקחיים כדי לגרד את השריר מהצד הגבי של הגולגולת.
- השתמש זוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הגולגולת במקום ועוד זוג מלקחיים כדי להסיר בעדינות את עצמות הגולגולת, חושף את המוח.
- המוח נראה לבן ורך. לאחר גלוי, זה לא נדרש להסיר את כל עצמות הגולגולת. הסר את המוח עם מלקחיים נקיים על ידי הרמה בעדינות וגירוד.
- הבזק מקפיא את המוח על ידי הכנסתו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המאוחסן על קרח יבש.
הערה: ניתן לאחסן את רקמת המוח הקפואה בטמפרטורה של -80°C עד שכל הדגימות שיעובדו יחד ייאספו כדי להגביל את השפעות האצווה בעת עיבוד לצורך יצירת ספרייה. בעוד שדגימות המאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס אינן ניתנות לאחסון ללא הגבלת זמן, פרוטוקול זה בוצע בהצלחה על מוחות של דגי קילי המאוחסנים עד 12 חודשים ללא ירידה ניכרת באיכות.
2. הכינו מאגרים טריים
- הכינו את מאגר שטיפת הגרעינים (2% אלבומין בסרום בקר [BSA] ב-PBS אחד, pH 7.4 מלח עם מאגר פוספט ומעכב 0.2 U/μL RNase) ואחסנו על קרח. הכן 250 מ"ל של מאגר שטיפת גרעינים עבור עד שמונה דגימות. עבור 250 מ"ל, השתמש ב-50 מ"ל של תמיסת מלאי BSA של 10%, 25 מ"ל של תמיסת מלאי PBS של 10x, 1.25 מ"ל של 40 מלאי מעכבי U/μL RNase, ולאחר מכן הבא נפח ל-250 מ"ל עם ddH2O ללא RNAse.
- יש להכין חיץ ליזיס גרעיני (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0.01875% v/v NP-40 ומעכב0.2 U/μL RNase) ולאחסן על קרח. הכן 10 מ"ל של חיץ ליזה גרעינים עבור עד שמונה דגימות. עבור 10 מ"ל, השתמש ב- 100 μL של 1 M Tris-HCl pH 7.4 פתרון מלאי, 20 μL של תמיסת מלאי 5 M NaCl, 30 μL של 1 M MgCl 2פתרון מניות, 18.75 μL של תמיסת מלאי NP-40 10%, 50 μL של 40 U / μL מלאי מעכבי RNase, ולאחר מכן להביא את הנפח ל 10 מ"ל עם ddH2O ללא RNAse.
3. לבודד גרעינים
- אם אתם משתמשים בדגימות קפואות, הפשירו אותן על קרח למשך 10 דקות. אם אתם משתמשים במוחות שזה עתה נותחו, המשיכו ישירות לשלב 3.2
הערה: למרות שפרוטוקול זה יכול לעבוד על מוחות בודדים, לדגימות קטנות יותר מדגים צעירים (בני 5-6 שבועות) תהיה תפוקה נמוכה יותר. תמיד ניתן להשיג תשואות מספיקות על ידי עיבוד שני מוחות כדגימה אחת, ללא קשר לגיל ולמין של הדג (טבלה 1). פרוטוקול זה בודד בהצלחה גרעינים איכותיים מדגים בגילאי 5-26 שבועות, כולל בעלי חיים משני זני GRZ ו-ZMZ1001. לא צפויות בעיות בהחלת פרוטוקול זה על זנים אחרים. - להקפיץ את המוח ב-1 מ"ל של חיץ ליזיס גרעיני קרח קרים כקרח בהומוגנייזר של 2 מ"ל. השאירו את ההומוגנייזר על הקרח והימנעו מיצירת בועות בזמן שאתם מניחים את הדגימה. האטה בקצב משוער של 0.5 שניות/משיכות מטה ו-0.5 שניות/מכת מעלה עם פיתול של 180° לכל מחזור. יש לנטוש את השימוש במזיק הרופף במשך 15 משיכות, או עד שתערובת חיץ הרקמה/תזה נראית הומוגנית אם יש צורך במשיכות נוספות.
הערה: יש לשטוף את ההומוגנייזרים, לשטוף אותם במים מזוקקים ולעקר אותם במחזורי עיקור סטנדרטיים של אוטוקלאב יבש בין שימושים.- יש לנטוש באמצעות המזיק ההדוק במשך 30 משיכות עם הפסקות קטנות, 30 שניות עד דקה, כל 10 משיכות. האטה בקצב משוער של 0.5 שניות/משיכות מטה ו-0.5 שניות/מכת מעלה עם פיתול של 180° לכל מחזור. תנו לדגימה לנוח על הקרח בהומוגנייזר של Dounce למשך 2 דקות.
הערה: זמן הדגירה הזה מבטיח תזה מספקת, אך יש לקצר אותו אם נצפית יתר על המידה הגרעינית.
- יש לנטוש באמצעות המזיק ההדוק במשך 30 משיכות עם הפסקות קטנות, 30 שניות עד דקה, כל 10 משיכות. האטה בקצב משוער של 0.5 שניות/משיכות מטה ו-0.5 שניות/מכת מעלה עם פיתול של 180° לכל מחזור. תנו לדגימה לנוח על הקרח בהומוגנייזר של Dounce למשך 2 דקות.
- מסננים את הדגימה דרך מסנן תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המצופה מראש ב-5% BSA.
- הוסף 4 מ"ל של מאגר שטיפת גרעינים לדגימה על ידי העברת חיץ הכביסה מעל מסנן התאים בגודל 70 מיקרומטר משלב 3.3 וערבב בעדינות על ידי היפוך חמש פעמים.
הערה: זה מאפשר התאוששות של גרעינים שעשויים להיות לכודים על המסנן ומשפר את התפוקה. - צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-נטנט על ידי מזיגה עדינה לתוך כלי קיבול לפסולת נוזלית. החזירו את הדגימה למצב זקוף והסירו את מאגר הכביסה שנותר באמצעות פיפטה P1000.
הערה: גלולת הגרעינים עשויה להיות גלויה כאשר מתחילים משני מוחות בדגימה אחת. עם זאת, בעת עיבוד מוחות בודדים מחיות צעירות (בני 5-6 שבועות), צפויה תפוקה נמוכה יותר, וייתכן שלא תמיד ניתן לראות כדוריות. במקרה זה, יש להסיר בזהירות את supernatant תוך הנחת המיקום של הכדור בתחתית הצינור. - החזירו מיד את הגרעינים ב-1 מ"ל של חיץ שטיפת גרעינים עם קצה פיפטה P1000 רחב משעמם.
- הביאו את הדגימה ל-5 מ"ל על ידי הוספת 4 מ"ל של מאגר שטיפת גרעינים וערבבו בעדינות על ידי היפוך חמש פעמים. צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות, ולהשליך את supernatant.
- יש להשעות את הגרעינים ב-1 מ"ל של חיץ שטיפת גרעינים עם קצה פיפטה רחב ולהעביר לצינור ציטומטריה של זרימה (FACS).
- מוסיפים 300 μL של תמיסה להסרת פסולת (Table of Materials) ומערבבים היטב על ידי פיפטינג עם קצה בור רחב עד שהתערובת הומוגנית.
- שכבו בעדינות 1 מ"ל של חיץ שטיפת גרעינים על גבי תמיסת הגרעינים שהוכנה בשלב 3.9 באמצעות פיפטה P1000 והחזקת הצינור בזווית קלה (איור משלים 2). שבר התמיסה להסרת פסולת ושבר מאגר שטיפת הגרעינים צריכים ליצור ממשק ברור אם הם מרובדים בצורה נכונה.
- צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב 3000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. בטל לחלוטין את שני השלבים העליונים באמצעות פיפטה P1000.
הערה: שפופרת FACS השקופה תאפשר הדמיה של שלושת השלבים הנפרדים לאחר צנטריפוגה (למעלה, אינטרפאזה, למטה). כדי להקל על הסרת פסולת מקסימלית, מומלץ להיות אגרסיביים יותר מאשר שמרניים בהסרת שני השלבים העליונים (כלומר, הסרת כמות קטנה של השלב התחתון עדיפה על פני נשיאת כל אחד מהשלבים העליונים; תרשים משלים 2). בנוסף, השכבה הבין-פאזית עשויה להיות דקה מכדי לדמיין אותה. במקרה זה, הסר את השכבה העליונה (לכאורה), המכילה את שכבת האינטרפאזה. השכבה התחתונה שנשמרת צריכה להכיל ~ 1 מ"ל נפח כולל. - העבירו את השכבה התחתונה לצינור חרוטי של 15 מ"ל המצופה מראש ב-5% BSA.
- בצינור החרוטי, הביאו את הנפח ל -15 מ"ל עם חיץ שטיפת גרעינים והפוך שלוש פעמים כדי לערבב.
- צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב 1000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. יש להסיר את הסופר-נטנט בזהירות.
- יש להקפיא באופן מיידי 150 μL של חיץ שטיפת גרעינים באמצעות קצה פיפטה רחב של נשא.
- עבור לקצה פיפטה רגיל שנקבע ל~300 μL. קח את כל הדגימה ולאחר מכן חבר מסנן של 40 מיקרומטר על הקצה לקצה קצה הפיפטה, תוך הקפדה שלא לגרש את הדגימה.
הערה: מסננים על הקצה נחוצים כדי להשיג נפחים קטנים יותר, הדרושים לשמירה על ריכוז גרעינים מספיק עבור יישומים במורד הזרם. לדוגמה, עבור snRNA-seq המשתמש במיקרופלואידיקה, מומלץ ריכוז מינימלי של >300 גרעינים/μL, אם כי הטווח האופטימלי הוא 700-1200 גרעינים/μL18. ריכוזים גבוהים יותר של גרעינים יכולים גם להיות מדוללים בקלות במידת הצורך. - סנן את הדגימה על ידי הוצאה בכוח של הדגימה דרך המסנן לצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך של DNA הקושר 1.5 מ"ל. נפח ההעתקה הסופי צריך להיות 120-150 μL.
הערה: הקצפה מסוימת עלולה לנבוע מסינון. נראה שזה לא משפיע על איכות הגרעינים.
4. להעריך את איכות הגרעינים על ידי מיקרוסקופיה
- בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד, יש לערבב 10 μL של הדגימה המסוננת עם 10 μL של תמיסה כחולה טריפאן של 0.4% על ידי פיפטינג עדין. דגימות אינן דורשות זמן דגירה ממושך והן מוכנות להדמיה מיד לאחר הערבוב עם תמיסת טריפן כחולה.
- הפקידו 10 μL של הגרעינים המוכתמים לתוך תא של שקופית תא ספירה.
הערה: לחלופין, יש להפקיד 10 μL מדגימת הגרעינים המוכתמים על גבי מד המוציטומטר או מיקרוסקופיה ולכסות באמצעות תלוש כיסוי. - להעריך את איכות הגרעינים על ידי מיקרוסקופיית אור.
הערה: יש להשתמש בהגדלה נמוכה יותר רק כדי להגדיל את הגרעינים, מכיוון שפגמים בגרעינים יהיו גלויים לעין רק בהגדלות גבוהות יותר (כלומר, פי 60 ומעלה). שלב זה יכול להיעשות במהירות כדי להעריך את ההצלחה של הכנת גרעינים ואינו דורש ניתוח משני מעבר לבדיקה חזותית. גרעינים איכותיים ושלמים יהיו בעלי גבול20 מוגדר בחדות (איור 2A). גרעינים באיכות ירודה ישבשו את קרומי הגרעין, כתמים כחולים מסוג טריפאן ליד הממברנה הגרעינית המעידים על דליפה אפשרית של חומצת גרעין, ו/או עדות לפיצוץ20 (איור 2B). גרעינים בריאים צפויים להיות בקוטר של 10-15 מיקרומטר.
5. כימות גרעיני סינגלט, פסולת ופרופורציה מרובה על ידי ציטומטריה של זרימה
הערה: המינוח והממשק הספציפיים של תוכנת ציטומטר הזרימה עשויים להשתנות בהתאם למותג המכונה, אך יש להתאים שלבים אלה בקלות למערכות אחרות במידת הצורך.
- בצינור FACS, יש לתלות מחדש 10 μL של דגימת הגרעינים המסוננים ב-90 μL של המאגר המומלץ עבור ציטומטריה של זרימה לדילול של 1:10. לשם כך, 0.22 מיקרומטר מסונן PBS מעוקר, pH 7.2, עם 2 mM EDTA ו 0.5% BSA משמש במחקר זה.
הערה: למרות שדילול זה יעבוד עבור רוב הגרעינים המכינים, ייתכן שיהיה צורך בדילול נמוך יותר (למשל, 1:5) כדי לדגום מספיק גרעינים להערכת איכות במקרה של דגימה בעלת תפוקה נמוכה יותר (כלומר, <30 גרעינים/μL בדגימה המדוללת). - הכתימו את הדגימות בפרופידיום יודיד (PI) בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל. אין צורך בזמן הדגירה, וניתן לנתח גרעינים באופן מיידי.
הערה: לחלופין, יש לצבוע את הדגימות בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI. שים לב שיש לקרוא את DAPI בערוץ פלואורסצנטי שונה מזה של PI (ערוץ Vioblue-A V1-A; עירור ב-405 ננומטר, פליטה ב-450/50 ננומטר). - נתח את הדגימות על ציטומטר זרימה כדלקמן:
- הגדרת סביבת עבודה:
- יש את ציטומטר הזרימה במצב רכישה. לחץ על קובץ ולאחר מכן בחר סביבת עבודה חדשה מהתפריט הנפתח. תחת הכרטיסייה Experiment בחלונית השמאלית, הזן את שם הפרויקט ואת מזהה הדוגמה בשדות המתאימים.
- בסרגל הכלים השמאלי העליון, לחץ על כפתור חלון ניתוח חדש (סמל התוויית פיזור). לחץ על התיבה עם שלוש חלקות (Plot 4t) מהתפריט המוקפץ. על המסך יופיעו שלוש עלילות. לחץ על כפתור מצב ניתוח בסרגל הכלים השמאלי העליון (סמל) כך שהוא אפור ולא כתום.
- הגדרת חלקות ניתוח:
- שנה את הצירים של שלושת המגרשים באופן הבא, מסודרים כציר X וציר Y, בהתאמה:
תרשים 1: ציר X: FSC-A, ציר Y: SSC-A
מגרש 2: ציר X: HDR-T, ציר Y: SSC-A
תרשים 3: ציר X: PerCP-Vio700-A B3-A, ציר Y: SSC-A - שנה את הצירים על ידי לחיצה על תווית הציר ובחירת הערוץ הרצוי מהתפריט הנפתח.
- הגדר את המגרשים להיות מקודדים בצבע צפיפות על ידי לחיצה על סמל "i" האפור המרובע שמופיע ליד הפינה הימנית העליונה של כל חלקה. חלון מאפיינים נפתח עם לוח לחצנים משמאל. בחלון מאפיינים, לחץ על סמל Scatterplot (השני מלמעלה בצד שמאל של החלונית). לחץ על OK.
הערה: ערוץ הפלואורסצנציה PerCP-Vio700-A B3-A מתאים לעירור ב-488 ננומטר, ולפליטה בטווח של 650-730 ננומטר.
- שנה את הצירים של שלושת המגרשים באופן הבא, מסודרים כציר X וציר Y, בהתאמה:
- הגדרת הגדרות מכשיר:
- לחץ על הכרטיסייה ערוצים בחלונית השמאלית. רשימה של כל הערוצים תופיע עם שלוש תיבות מימין. הגדר את B3, FSC-A ו- SSC-A ל - Hlog על-ידי לחיצה על החץ למטה בתיבות הראשונות שלהם בהתאמה מימין ובחירה ב - Hlog מהתפריט הנפתח. הגדר את המתח של SSC ל- 640 V, FSC ל- 300 V ו- B3 ל- 480 V על-ידי הקלדת מספרים אלה בתיבות האמצעיות המתאימות מימין והקשה על מקש Enter . שים לב שהתיבה השלישית מימין היא מתג שניתן להשתמש בו לסירוגין להקלדה.
- תחת הכותרת הדק, הגדר את ההדק FSC ל- 4 ואת ההדק SSC ו- B3 ל- 0 על-ידי לחיצה על החץ למטה, בחירתם מהתפריט הנפתח משמאל, הקלדת המספר בתיבה מימין ולאחר מכן הקשה על מקש Enter . שים לב שיש תיבה דו-מצבית בצד ימין שניתן להשתמש בה לחלופין להקלדה.
הערה: מתחי PMT צריכים להיות ממוטבים עבור כל מכונת ציטומטריה של זרימה מסוימת, אך ההדק עבור גרעינים חייב להיות נמוך יותר ממה שמשמש בדרך כלל עבור תאים. יתר על כן, יש להגדיר את סולם הציר ל- h-log.
- הקלד 100 μL בתיבת הטקסט אמצעי אחסון לדוגמה ו- 50 μL בתיבת הטקסט Uptake Volume בצד שמאל של חלון תוכנת הזרימה. ודא שהפרמטר Mix Sample מוגדר ל-Mix Gentle כדי למנוע שקיעה של גרעינים בשלב זה. לחץ על המשולש בתוך עיגול (סמל הפעלה ) בפינה הימנית התחתונה כדי להתחיל בזרימה.
- בדוק את איכות הזרימה:
- השתמש באזור פיזור צדדי (SSC-A) לעומת HDR-T כדי לבדוק אם יש בועות אוויר או גושים בדגימה. ודא כי העלילה היא רצף חלק של נקודות. בועות אוויר או גושים יגרמו לאזורים ריקים בתרשים SSC-A לעומת HDR-T.
- בדוק את תרשים הפיזור הצדדי (SSC-A) לעומת הפיזור הקדמי (FSC-A) כדי לוודא שהמתחים שבהם נעשה שימוש נכונים עבור הדגימה.
הערה: בניגוד לתאים, גרעינים לא ייפתרו באופן מלא מפסולת בפיזור צדדי לעומת חלקת פיזור קדימה. עם זאת, צריך להיות אשכול אירועים בצפיפות גבוהה לכיוון אמצע העלילה המתאים לגרעינים (בצבע חם יותר) עם צפיפות נמוכה יותר של אירועים (בצבע קריר יותר) ברקע המתאים לפסולת.
- ניתוח ספירת גרעינים ואיכותם:
- לחץ פעמיים על התרשים SSC-A לעומת PerCp-Vio-700A לקבלת תצוגה מוגדלת. לחץ על הלחצן בסרגל הכלים השמאלי העליון עם קווים מאונכים (Quadrant) כדי לבחור שער מרובע. לאחר מכן, לחץ במקום כלשהו בעלילה SSC-A לעומת PerCp-Vio-700A ורבעים יופיעו בתוך העלילה.
- לחץ במקום כלשהו על הקווים המפרידים בין הרבעים והחלק את הסמן כדי לשנות את מיקום הרבע. מקם את הרבעים כך שהרבע השמאלי העליון יכיל את אוכלוסיית השמאל הקיצוני (פסולת), והרביע הימני העליון יכיל מספר צבירים בצורת דמעה (גרעינים) (ראה איור 3 עבור הגדרת שערים ודוגמאות לתוצאות זרימה עבור תוצאות אופייניות עם הכנה הכוללת או לא כוללת שלב פינוי פסולת).
- ספירת פסולת לעומת גרעינים:
- לחץ על סמל "i" האפור המרובע בפינה השמאלית העליונה של העלילה כדי לפתוח את חלון המאפיינים . לחץ על הכרטיסייה פונקציות אזור ; רשימות של אזורי מגרש ופונקציות יופיעו.
- תחת הרשימה אזורים , ודא שסימן ביקורת ירוק לצד הפריט העליון, המציין את כל החלקה נבחרה. תחת הרשימה פונקציות , לחץ על Count/μL כדי להפיק סימן ביקורת ירוק. לחץ על OK, ומדד counts/μL יופיע בכל רבע.
- כדי להציג ספירות ואחוזים גולמיים, בחר Count ו - %-T מהכרטיסיה 'פונקציות אזור ', אם תרצה בכך. הספירות/μL ברביע השמאלי העליון והימני תואמות את תפוקת הפסולת והגרעינים, בהתאמה.
- סינגלט נחשב:
- האשכול השמאלי ביותר בצורת דמעה בחלק התחתון של הרביע הימני העליון מייצג סינגלטים. צייר שער מצולע סביב אוכלוסייה זו על-ידי לחיצה על לחצן המצולע (מצולע) בסרגל הכלים השמאלי העליון.
- לחץ פעם אחת, החלק את העכבר כדי להתחיל לצייר ולחץ שוב כדי לסיים קטע ליניארי של השער ולהתחיל את הקטע הבא. לחץ פעמיים כדי לסיים את השער. לחץ על גבול השער והחלק את העכבר כדי למקם מחדש את השער.
- לחץ על הקודקודים של השער כדי לשנות את הצורה. ספירות/μL של האוכלוסייה המגודרת (סינגלטים) יופיעו. זהו הריכוז של הכנת הגרעינים עם הדילול הראשוני.
הערה: אזור הפיזור קדימה לעומת יחס ליניארי של גובה 1:1, המשמש בדרך כלל לקביעת קצב סינגלט בעת זרימת תאים, אינו חל על גרעינים וניתן להתעלם ממנו.
- באמצעות ריכוז הגרעין המדולל ומקדם הדילול, חישוב לאחור של ריכוז ההכנה הראשונית (למשל, עבור דילול 1:10, הכפל את הריכוז הנצפה ב-10). ריכוזים של >300 גרעינים/μL מתאימים ל-snRNA-seq.
- הגדרת סביבת עבודה:
Representative Results
פרוטוקול הבידוד של גרעיני המוח של דגי הקילי שמתואר כאן מותאם במיוחד לדגי הקילי ומסוכם באיור 1. בנוסף למיצוי גרעינים, הפרוטוקול מפרט שיטות שונות להערכת האיכות והכמות של גרעינים מבודדים. איור 2 מראה דוגמאות של גרעינים בריאים (איור 2A) ולא בריאים (איור 2B) כפי שהם מוערכים על-ידי מיקרוסקופיית אור. גרעינים בריאים המתאימים לניתוח במורד הזרם (איור 2A) קיימים כגרעיני סינגלט עם ממברנות שלמות. כפי שניתן לראות באיור 2B, מצב הכשל הנפוץ ביותר של פרוטוקול זה (ופרוטוקולים אחרים לבידוד גרעינים) הוא יצירת גרעינים מוגזמים, המאופיינים בממברנות גרעיניות פגומות. לעתים קרובות זה מוביל להיווצרות גושים של גרעינים ויכול לתרום לאותות רקע ביישומים במורד הזרם עקב דליפה של חומצות גרעין מהגרעינים הקרועים. אם נצפתה התגבשות מוגזמת, אנו ממליצים להיות עדינים יותר במהלך שלבי ההפחתה ו/או להפחית את זמני הדגירה במאגר התזה.
פרוטוקול זה משתמש בציטומטריה של זרימה כדי לכמת את מספר הגרעינים המבודדים ולקבוע את החלק היחסי של גרעינים מרובים בדגימה. בנוסף, ניתן להשתמש בציטומטריה של זרימה כדי להעריך את התוכן היחסי של פסולת מזהמת, לעתים קרובות שברי גרעינים קרועים ופסולת תאית אחרת שיכולה להשפיע לרעה על בדיקות במורד הזרם בדגימת הגרעינים. נתוני זרימה מייצגים ניתן לראות באיור 3. הליך בידוד גרעינים איכותי ייצור: 1) שבר פסולת קטן, ו-2) שבר גבוה של סינגלט לעומת גרעינים מרובים (> 80% מחלק הגרעינים). השימוש בצביעת PI, המכתימה חומצות גרעין, מאפשר להפריד גרעיני סינגלט מפסולת ומגרעינים מרובים. איור 3A הוא דוגמה להכנה שזוהמה על-ידי פסולת, ואילו איור 3B הוא דוגמה לניסוי באיכות גבוהה.
איור 1: זרימת עבודה של בידוד גרעיני מוח של Killifish. תהליך עבודה ניסיוני לבידוד גרעינים ממוחות של דגי קילין קפואים או טריים. לאחר בידוד והערכה, גרעינים יכולים לשמש לניתוחי "אומיקה" שונים במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הערכת איכות גרעינים באמצעות מיקרוסקופיה. גרעינים היו מעורבים ביחס של 1:1 בתמיסה של 0.4% Trypan Blue והודגמו במיקרוסקופ Echo Revolve על ידי הדמיית שדה בהיר ברזולוציה של 60x. (A) דוגמה לגרעין איכותי. הגרעין קיים כסינגלט וממברנת הגרעין שלמה. (B) דוגמה לגרעינים באיכות ירודה. קרומי הגרעין נפגעים, וגרעינים מתגבשים לכפיל, ככל הנראה בגלל דליפה של דנ"א דביק, שניתן לראותו דולף מראש הגרעין העליון ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כימות גרעינים והערכת טוהר על ידי ציטומטריה של זרימה. דגימות גרעינים הוכתמו בדילול של 1:100 של PI והופעלו על ציטומטר זרימה. גרעינים נמצאים בצורות סינגלט ומרובות ברביע הימני העליון של (A,B) עם סינגלטים כענן האירועים הנמוך ביותר ואחריו כפילים, שלישיות וכו 'בסדר עולה. פסולת מסומנת על ידי האירועים בשני הרבעים השמאליים ביותר. (A) דוגמה להכנת גרעינים באיכות נמוכה, שבה שלב פינוי הפסולת הושמט ופסולת מהווה >40% מהאירועים. (B) דוגמה לדגימת גרעינים באיכות גבוהה, עם שלב פינוי הפסולת הכלול. בדוגמה זו, פסולת מהווה <10% מכלל האירועים הרשומים על ידי ציטומטר הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| סוג הדגימה (2 מוחות) | תשואה ממוצעת (4 הכנות עצמאיות) |
| מוחות גבריים במשך 5 שבועות | 3.59 ± 1.76 x 105 |
| מוחות גבריים במשך 10 שבועות | 6.41 ± 1.33 x 105 |
| מוחות גבריים במשך 15 שבועות | 14.59 ± 2.05 x 105 |
| מוח נשי בן 5 שבועות | 2.54 ± 0.75 x 105 |
| מוחות נשיים בני 10 שבועות | 4.66 ± 1.29 x 105 |
| מוחות נשיים במשך 15 שבועות | 7.95 ± 3.51 x 105 |
טבלה 1: התשואות הממוצעות הצפויות משני מוחות של דגי קילי טורקיז אפריקאים על פני מין וגיל. התשואות הממוצעות מבוטא כ-10 5 גרעינים± שגיאת תקן של הממוצע על פני ארבעה תכשירי גרעינים עצמאיים בכל קטגוריה.
איור משלים 1: השוואה של איכות בידוד גרעינים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים והפרוטוקול הממוטב שלנו על מוחות של דגי קילי קפואים. (A) הערכת איכות גרעינים על ידי מיקרוסקופיה. גרעינים היו מעורבבים ביחס של 1:1 בתמיסה של 0.4% Trypan Blue והודמיו על גבי מיקרוסקופ על ידי הדמיית שדה בהיר ב-60x. (B) כימות גרעינים ועומס פסולת על ידי ציטומטריית זרימה. דגימות גרעינים הוכתמו בדילול של 1:100 של PI והופעלו על ציטומטר זרימה. (C) סיכום מדדי הערכת האיכות על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה עם הפרוטוקולים השונים של אמות המידה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: ייצוג סכמטי של שלבי פינוי הפסולת. (A) סכימה של הסרת פסולת שכבות טרום צנטריפוגה. (B) סכימה של הסרת סופר-נאטנט לאחר צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן יכול לשמש לשחזור גרעינים באיכות גבוהה ממוחות של דגי קילין. פרוטוקול זה היה צריך להיות מתוכנן במיוחד עבור מוח הקילפיש, שכן פרוטוקולי בידוד גרעיני מוח טיפוסיים המבוססים על יונקים המיושמים על מוחות של דגי קילי הביאו באופן עקבי לאיכות גרעינים ירודה בידינו. אנו חושדים שהסיבה לכך היא תכולת המיאלין היחסית הנמוכה יותר במוחם של דגי הקילין בהשוואה לעמיתיהם היונקים, אשר יתכנסו ויתגבשו בתגובה לתנאים הקשים הנדרשים לתזה של תאי מוח של יונקים. פרוטוקול זה הוא התקדמות בתחום ההזדקנות ודגי הקילין מכיוון שהוא מאפשר לחקור את הזדקנות המוח ברמת התא הבודד במודל חסכוני וחסכוני בזמן של הזדקנות המוח של בעלי חוליות.
פרוטוקול זה עמיד בפני דגימות טריות או קפואות, אם כי יש לקחת בחשבון את היישומים במורד הזרם בעת שימוש ברקמה טרייה או קפואה. רקמה קפואה היא לעתים קרובות נוחה מכיוון שניתן לאסוף ולאחסן אותה במשך חודשים בזמן איסוף הדגימות. דגימות כאלה יכולות לשמש בבטחה עבור יישומים כגון snRNA-seq. עם זאת, הקפאת דגימות עלולה לשבש את מבנה הגרעין ובכך את היכולת למדוד במדויק את נוף הכרומטין על ידי ATAC-seq21. לכן, עבור יישומים במורד הזרם כגון ATAC-seq בתפזורת או snATAC-seq, מומלץ להשתמש במוחות שנותחו זה עתה במקום במוחות קפואים. בנוסף, מכיוון שכל השלבים לאחר הומוגניזציה של המוח יכולים להתבצע במקביל, פרוטוקול זה מקובל להפעלת דגימות מרובות במסגרת זמן סבירה, ובכך מגביל את השפלת ה- RNA הנגרמת על ידי דגירה ממושכת על קרח.
יתר על כן, חובה להכין מאגרים טריים (תוך שעות) מביצוע מיצוי גרעינים. מצאנו כי יש להוסיף חומרי ניקוי כמו גם BSA למאגרים מיד לפני תחילת הפרוטוקול. מאגרים המכילים מלחים בלבד (PBS, NaCl וכו') עשויים להיות מיוצרים כתרכיזים, מסננים מעוקרים (0.22 מיקרומטר) ומאוחסנים ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. ניתן להכין, לעקר ולאחסן תמיסות BSA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ימים ספורים ממיצוי הגרעינים (אם הוכנו מאבקה), אך יש להוסיף אותן תמיד למאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מיד לפני ביצוע הפרוטוקול. עם זאת, אנו ממליצים להכין פתרונות BSA ביום הפרוטוקול. אם אתם משתמשים בפתרונות BSA מוכנים מראש של צד שלישי, מומלץ להשתמש בבקבוקים טריים שלא נפתחו. שימוש ב-BSA טרי מוביל בדרך כלל לתכולת פסולת נמוכה יותר במכיני גרעינים.
בין אם דגימות טריות או קפואות משמשות כקלט, חשוב להעריך את איכות הגרעינים לאחר בידוד הגרעינים. למרות שפרוטוקול זה תוכנן במיוחד כדי למנוע התמזגות יתר, זוהי הסיבה השכיחה ביותר לאובדן איכות גרעינים. יתר עלול לנבוע מזמן רב מדי במאגר התזה, מטיפול גס מדי בגרעינים כגון פיפטינג מוגזם עם קצה פיפטה נשא סטנדרטי, או מכמות זמן מופרזת בין בידוד גרעינים ליישומים במורד הזרם (>1 שעות). גרעינים מוגזמים לעיתים קרובות פוגעים בפריפריות גרעיניות, שדולפות דנ"א וגורמות לגושים (איור 2B). זה יוביל למספר מוגבר של הכפלות ויתרום חומצות גרעין ברקע שיפריעו ליישומים במורד הזרם, במיוחד snRNA-seq. ניתן להעריך את שתי התכונות על ידי מיקרוסקופיה לאחר בידוד גרעינים. אם נצפתה התגבשות גרעינית מוגזמת, אנו ממליצים לנסות לקצר את שלב הדגירה של הליזיס כדי להפחית את הסיכוי להתנשאות יתר. כשיטה חלופית להגדלת גרעינים סינגלטים, ניתן להשתמש במיון תאים בסיוע פלואורסצנציה (FACS) כדי להעשיר עבור סינגלטים במורד הזרם של פרוטוקול זה. עם זאת, נציין כי כאשר עובדים עם גרעינים שכבר שבירים מרקמה קפואה, לחץ הגזירה המתרחש במהלך המיון עלול להוביל לקרע גרעיני מוגבר ובכך לעלייה ב-RNA/DNA הסביבתי. בנוסף, נציין כי הזמן הנדרש להפעלת מיון תפוקה של FACS עבור גרעינים בעת עיבוד דגימות מרובות ידרוש מכל דגימות הגרעינים להישאר על הקרח במשך שעות, בעוד דגימות אחרות ממוינות. לפיכך, זמני המתנה ארוכים יותר בעת עיבוד דגימות מרובות במקביל לגישת FACS עשויים גם הם להוביל לירידה כללית באיכות הגרעינים ולהגביר את הסיכון להתפרקות RNA. לפיכך, אם FACS מעוניין בקצב כפול מופחת, אנו ממליצים לבדוק שוב את תכולת הפסולת לאחר מיון התפוקה, ולשקול ירידה אפשרית באיכות ה-RNA עבור יישומי RNA-seq של תא בודד כאזהרה פוטנציאלית.
הערכה מדויקת של ספירת גרעינים ושיעור סינגלט חיונית כמעט לכל יישומי ה"אומיקה" במורד הזרם, והיא בעלת חשיבות עליונה. בשל היכולת לשער ולספור גרעינים בקלות לפי גודל, ציטומטריה של זרימה היא השיטה המדויקת ביותר לספירת גרעינים שהערכנו. לחלופין, ניתן לכמת גרעינים באמצעות מוני תאים כגון מונה התאים האוטומטי Countess 2 FL של Invitrogen או מונה התאים האוטומטי של DeNovix CellDrop. יש לציין כי מונה התאים האוטומטיים Countess 2 FL של Invitrogen, ובמידה פחותה בהרבה ה-DeNovix, נוטים להעריך יתר על המידה את ספירת הגרעינים על ידי ספירת פסולת כגרעינים, מה שאומר שייתכן שיהיה צורך בגודל ידני. יתר על כן, ציטומטר הזרימה מאפשר להעריך בקלות את טוהר הגרעינים. ניתן להבחין ביחס היחסי של גרעינים סינגלט לעומת גרעינים מרובים באופן כמותי שקשה על ידי מיקרוסקופיה. זה חיוני עבור snRNA-seq ו- snATAC-seq, שכן פרוטוקולים אלה יסבלו מעודף של דגימות מרובות, אשר יש להוציא מניתוחים במורד הזרם. בנוסף למכפלות, ניתן לכמת את החלק היחסי של "פסולת" (גרעינים מקוטעים, פסולת תאית) על ידי ציטומטריה של זרימה וחייב להיות נמוך יחסית, שכן חומר זה מכיל לעתים קרובות חומצות גרעין מזהמות שיכולות לתרום אות רקע ולהשחית נתוני "אומיקה" של גרעין יחיד.
בדומה לפרוטוקולי בידוד גרעינים שתוארו קודם לכן, לא ניתן לשחזר את הפרופורציות של סוגי התאים ברקמה המקורית בנאמנות בהכנה לגרעינים19, ולכן יש לפרש אותם בזהירות. כדי לציין, כמו כל הטלאוסטים, לדגי הטורקיז האפריקאים יש אריתרוציטים בעלי גרעינים, שגם הם צפויים להיות מיוצגים בהכנת הגרעינים. ניתן לזהות גרעינים אלה בערכות נתונים של snRNA-seq ו-snATAC-seq על ידי ביטוי/נגישות גבוהה יותר של גנים של המוגלובין, וניתן לשלול אותם באופן חישובי אם רוצים.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
כמה לוחות נוצרו עם BioRender.com. עבודה זו במעבדה שלנו נתמכה על ידי מענק ההכשרה לפוסט-דוקטורט של NIA T32 AG052374 ל-B.T., מענק מקרן סימונס כחלק משיתוף הפעולה של סימונס למען פלסטיות במוח המזדקן, מענק פיילוט מקרן Navigage ופרס משפחת הנסון-ת'ורל ל-B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
- Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P.
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757 (2018).
- McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
- Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
- Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22 (2021).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
- Grindberg, R. V., et al.
- Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542 (2020).
- Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
- Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
- Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
- Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
- Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).
