Summary
Hier presenteren we een protocol om kernen te isoleren uit de hersenen van het kortlevende gewervelde model Nothobranchius furzeri voor downstream toepassingen zoals single-nucleus RNA sequencing of single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-seq).
Abstract
Het bestuderen van hersenveroudering met eencellige resolutie in gewervelde systemen blijft een uitdaging vanwege kosten, tijd en technische beperkingen. Hier demonstreren we een protocol om single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) bibliotheken te genereren uit de hersenen van de van nature kortlevende gewervelde Afrikaanse turquoise killifish Nothobranchius furzeri. De Afrikaanse turquoise killifish heeft een levensduur van 4-6 maanden en kan op een kosteneffectieve manier worden gehuisvest, waardoor kosten- en tijdsbarrières worden verminderd om gewervelde hersenveroudering te bestuderen. Er zijn echter op maat gemaakte protocollen nodig om kernen van voldoende kwaliteit voor downstream eencellige experimenten te isoleren uit de hersenen van jonge en oude vissen. Hier demonstreren we een empirisch geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van hoogwaardige kernen uit de hersenen van volwassen Afrikaanse turquoise killifish, een cruciale stap in de generatie van hoogwaardige single nuclei omic bibliotheken. Verder laten we zien dat de stappen om vervuilend achtergrond-RNA te verminderen belangrijk zijn om celtypen duidelijk te onderscheiden. Samenvattend toont dit protocol de haalbaarheid aan van het bestuderen van hersenveroudering in niet-traditionele gewervelde modelorganismen.
Introduction
Het begrijpen van de mechanismen van gewervelde hersenveroudering is van cruciaal belang voor het aanpakken van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en dementie1. De Afrikaanse turquoise killifish (Nothobranchus furzeri) is het kortstlevende gewervelde dier dat in gevangenschap kan worden gefokt, en vanwege zijn korte levensduur en leeftijdsgebonden cognitieve stoornissen is het een uitstekend hersenverouderingsmodel 2,3,4,5. Onlangs heeft de komst van single-cell "omics" -technologieën, zoals single nuclei RNA-seq (snRNA-seq) en single nuclei assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (snATAC-seq), onderzoekers in staat gesteld om de ouder wordende hersenen te ondervragen met een ongekende resolutievan 6,7,8. Deze methoden zijn afhankelijk van kernisolatie, omdat het herstel van hersencellen zoals neuronen vaak te uitdagend is om 6,7,8,9,10 te isoleren. De meeste gepubliceerde kernisolatieprotocollen zijn echter geoptimaliseerd voor zoogdiermodelorganismen 11,12,13,14,15. Aangezien er momenteel dus een onvervulde behoefte is aan het isoleren van hersenkernen in de killifish als een opkomend nieuw modelorganisme op het gebied van verouderingsonderzoek2, is het doel van dit protocol om een methode vast te stellen voor het isoleren van hoogwaardige kernen uit bevroren hersendodendvisweefsel.
Hier wordt een gestroomlijnde en robuuste workflow opgezet die algemeen beschikbare materialen gebruikt om hoogwaardige kernen uit killifishhersenen te isoleren. Dit protocol is aangepast van een 10x Genomics-protocol voor muizenhersenen om tegemoet te komen aan de hersenen met een lager myelinegehalte van Afrikaanse turquoise killifish, de kwetsbaarheid van bevroren weefsel en de noodzaak om het omgevingsafvalgehalte te verminderen voor sequencing-gerelateerde toepassingen16. Inderdaad, eerder geoptimaliseerde protocollen voor hersenweefsel van zoogdieren 17,18 leiden tot een slechte kernkwaliteit (d.w.z. overlyse) en / of een hoog puingehalte bij gebruik op bevroren killifishhersenen, waardoor ze ongeschikt zijn voor gebruik met snRNA-seq volgens aanbevelingen voor enkele kernen RNA-seq met behulp van microfluïdica (aanvullende figuur 1).
Naast kernisolatie laten we zien hoe we de kwaliteit en opbrengst van kernen kunnen beoordelen door middel van microscopie en flowcytometrie. Dit artikel geeft voorbeelden van zowel optimale als suboptimale resultaten en bespreekt het oplossen van problemen. Dit protocol is ontworpen en geoptimaliseerd voor bevroren killifish-hersenen, maar kan ook zonder grote wijzigingen worden gebruikt op vers ontleedde killifish-monsters. Killifish hersenkernen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn geoptimaliseerd voor gebruik in single nucleus RNA-seq (snRNA-seq) als een downstream-toepassing, maar moeten ook geschikt zijn voor gebruik in snATAC-seq en bulk ATAC-seq.
Protocol
Dierverzorging en dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC van de University of Southern California onder goedgekeurde protocollen # 21215. Voor elk werk dat dit protocol gebruikt, is het noodzakelijk om goedkeuring te verkrijgen van het IACUC van de instelling voordat met onderzoekswerkzaamheden op gewervelde dieren wordt begonnen.
OPMERKING: Een volledige doorloop door het protocol vanaf flash-bevroren hersenweefsel (vanaf stap 3) duurt ~ 2,5 uur voor zes monsters (figuur 1).
1. Ontleed killifish hersenen
- Humaniëer killifish met behulp van een oplossing van 1,5 g/l methanosulfonaat/tricaïne (MS-222) in het systeemwater.
- Gebruik een scherpe schaar om killifish snel te onthoofden nadat alle lichaams- en kieuwbewegingen zijn gestopt.
- Ontleed de onthoofde kop op een schone petrischaal zoals eerder beschreven19.
- Plaats de schaal onder een ontleedmicroscoop (met een vergrotingsbereik van 8x-35x). Draai het hoofd zodanig dat de branchiostegale stralen scherp zijn
- Knip met een schaar door het denarium zodat de branchiostegale stralen en de schedel worden onthuld.
- Houd met behulp van een tang de branchiostegale stralen aan weerszijden van de schedel vast. Gebruik een ander tangje om eventuele resterende weefselfragmenten uit de schedel te verwijderen. Het V-vormige optische chiasme dat de hersenen en de ogen verbindt, moet zichtbaar worden.
- Knip het optische chiasme met een schaar om beide ogen los te maken van de hersenen. Gebruik een tang om de schedel voorzichtig te bevrijden.
- Keer de schedel om en gebruik een tang om de spier van de dorsale kant van de schedel te schrapen.
- Gebruik een tang om de schedel op zijn plaats te houden en een ander paar tangen om voorzichtig de botten van de schedel te verwijderen en de hersenen te onthullen.
- De hersenen zien er wit en zacht uit. Eenmaal zichtbaar, is het niet nodig om alle schedelbotten te verwijderen. Verwijder de hersenen met een schone tang door voorzichtig op te tillen en te schrapen.
- Flash bevriest de hersenen door ze in een microcentrifugebuis te plaatsen die op droogijs is opgeslagen.
OPMERKING: Het bevroren hersenweefsel kan worden opgeslagen bij -80 °C totdat alle monsters die samen moeten worden verwerkt, zijn verzameld om batcheffecten bij verwerking voor het genereren van bibliotheken te beperken. Hoewel monsters die bij -80 °C zijn opgeslagen niet voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen, is dit protocol met succes uitgevoerd op killifishhersenen die tot 12 maanden zijn opgeslagen zonder noemenswaardige kwaliteitsverlies.
2. Bereid verse buffers voor
- Bereid kernenwasbuffer (2% runderserumalbumine [BSA] in 1x PBS, fosfaat-gebufferde zoutoplossing pH 7,4 en 0,2 U / μL RNase-remmer) en bewaar op ijs. Bereid 250 ml kernenwasbuffer voor maximaal acht monsters. Gebruik voor 250 ml 50 ml 10% BSA-stamoplossing, 25 ml van een 10x PBS-stamoplossing, 1,25 ml van de 40 U / μL RNase-remmervoorraad en breng vervolgens het volume op 250 ml met RNAse-vrije ddH2O.
- Bereid kernenlysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,01875% v/v NP-40 en 0,2 U/μL RNase-remmer) en bewaar op ijs. Bereid 10 ml kernlysisbuffer voor maximaal acht monsters. Gebruik voor 10 ml 100 μL 1 M Tris-HCl pH 7,4 stamoplossing, 20 μL 5 M NaCl-stamoplossing, 30 μL 1 M MgCl2 stamoplossing, 18,75 μL van een 10% NP-40 stamoplossing, 50 μL van de 40 U/μL RNase-remmervoorraad en breng het volume vervolgens op 10 ml met RNAse-vrije ddH2O.
3. Isoleer kernen
- Als u bevroren monsters gebruikt, ontdooit ze dan gedurende 10 minuten op ijs. Als u vers ontleedde hersenen gebruikt, gaat u direct verder met stap 3.2
OPMERKING: Hoewel dit protocol kan werken op enkele hersenen, zullen kleinere monsters van jonge vissen (5-6 weken oud) een slechtere opbrengst hebben. Voldoende opbrengsten kunnen altijd worden verkregen door twee hersenen als één monster te verwerken, ongeacht de leeftijd en het geslacht van de vis (tabel 1). Dit protocol heeft met succes hoogwaardige kernen geïsoleerd van vissen van 5-26 weken oud, inclusief dieren van zowel GRZ- als ZMZ1001-stammen. Er worden geen problemen verwacht bij het toepassen van dit protocol op andere stammen. - Verdubbel de hersenen in 1 ml ijskoude kernenlysisbuffer in een 2 ml Dounce homogenisator. Houd de homogenisator op ijs en vermijd het genereren van bubbels tijdens het lyseren van het monster. Verdubbeling met een geschatte snelheid van 0,5 s/downstroke en 0,5 s/upstroke met een twist van 180° per cyclus. Verdubbel met de losse stamper gedurende 15 slagen, of totdat het weefsel/lysis buffermengsel homogeen lijkt als er extra slagen nodig zijn.
OPMERKING: Dounce-homogenisatoren moeten worden gewassen, gespoeld met gedestilleerd water en gesteriliseerd met standaard droge autoclaafsterilisatiecycli tussen gebruik.- Dounce met behulp van de strakke stamper voor 30 slagen met kleine pauzes, 30 s tot 1 min, elke 10 slagen. Verdubbeling met een geschatte snelheid van 0,5 s/downstroke en 0,5 s/upstroke met een twist van 180° per cyclus. Laat het monster 2 min op ijs rusten in de Dounce homogenisator.
OPMERKING: Deze incubatietijd zorgt voor voldoende lysis, maar moet worden verkort als nucleaire overlyse wordt waargenomen.
- Dounce met behulp van de strakke stamper voor 30 slagen met kleine pauzes, 30 s tot 1 min, elke 10 slagen. Verdubbeling met een geschatte snelheid van 0,5 s/downstroke en 0,5 s/upstroke met een twist van 180° per cyclus. Laat het monster 2 min op ijs rusten in de Dounce homogenisator.
- Zeef het monster door een celfilter van 70 μm in een conische buis van 15 ml, voorgecoat in 5% BSA.
- Voeg 4 ml kernenwasbuffer toe aan het monster door de wasbuffer over het celfilter van 70 μm uit stap 3.3 te pipetteren en meng vijf keer voorzichtig door inversie.
OPMERKING: Dit zorgt voor het herstel van kernen die mogelijk op het filter zijn opgesloten en verbetert de opbrengst. - Centrifugeer met behulp van een zwenkbakrotor bij 500 x g, 4 °C, gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig in een vloeibaar afvalrecipiënt te gieten. Breng het monster terug naar een rechtopstaande positie en verwijder de resterende wasbuffer met een P1000-pipet.
OPMERKING: De kernkorrel is waarschijnlijk zichtbaar wanneer u begint met twee hersenen in één monster. Bij het verwerken van enkelvoudige hersenen van jonge dieren (5-6 weken oud) wordt echter een lagere opbrengst verwacht en zijn pellets mogelijk niet altijd zichtbaar. In dit geval moet het supernatant voorzichtig worden verwijderd terwijl het de positie van de pellet aan de onderkant van de buis aanneemt. - Reuspendeer de kernen onmiddellijk in 1 ml kernenwasbuffer met een P1000-pipetpunt met brede boring.
- Breng het monster op 5 ml door 4 ml kernenwasbuffer toe te voegen en meng voorzichtig door inversie vijf keer. Centrifugeer met behulp van een zwenkbakrotor bij 500 x g, 4 °C, gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg.
- Resuspensie de kernen in 1 ml kernen spoelbuffer met een pipetpunt met brede boring en breng over naar een flowcytometrie (FACS) buis.
- Voeg 300 μL puinverwijderingsoplossing toe (materiaaltabel) en meng grondig door te pipetteren met een punt met brede boring totdat het mengsel homogeen is.
- Leg voorzichtig 1 ml kernwasbuffer op de kernoplossing die in stap 3.9 is bereid met behulp van een P1000-pipet en houd de buis onder een lichte hoek (aanvullende figuur 2). De oplossingsfractie voor het verwijderen van puin en de kernenwasbufferfractie moeten een duidelijke interface vormen als ze correct worden gelaagd.
- Centrifugeer in een zwenkbakrotor bij 3000 x g, 4 °C, gedurende 10 minuten. Gooi de bovenste twee fasen volledig weg met een P1000-pipet.
OPMERKING: De heldere FACS-buis maakt de visualisatie van de drie verschillende fasen na centrifugatie (boven, interfase, onder) mogelijk. Om maximale puinverwijdering te vergemakkelijken, wordt geadviseerd om agressiever dan conservatief te zijn bij het verwijderen van de bovenste twee fasen (d.w.z. het verwijderen van een kleine hoeveelheid van de onderste fase heeft de voorkeur boven het overdragen van een van de bovenste fasen; Aanvullende figuur 2). Bovendien kan de interfaselaag te dun zijn om te visualiseren. Verwijder in dit geval de bovenste (schijnbare) laag, die de interfaselaag bevat. De onderste laag die wordt behouden, moet ~1 ml totaal volume bevatten. - Breng de onderste laag over op een conische buis van 15 ml, voorgecoat met 5% BSA.
- Breng in de conische buis het volume op 15 ml met kernenwasbuffer en keer drie keer om om te mengen.
- Centrifugeer in een zwenkbakrotor bij 1000 x g, 4 °C, gedurende 10 min. Verwijder het supernatant voorzichtig.
- Onmiddellijk resuspenseren in 150 μL kernen wasbuffer met behulp van een pipetpunt met brede boring.
- Schakel over op een standaard pipetpunt met boring ingesteld op ~300 μL. Neem het hele monster op en bevestig vervolgens een 40 μm on-tip filter aan het einde van de pipetpunt, waarbij u ervoor zorgt dat het monster niet wordt verwijderd.
OPMERKING: On-tip filters zijn nodig om kleinere volumes te verkrijgen, die nodig zijn om voldoende kernconcentratie voor downstream-toepassingen te behouden. Voor snRNA-seq met behulp van microfluïdica wordt bijvoorbeeld een minimale concentratie van >300 kernen/μL aanbevolen, hoewel het optimale bereik 700-1200 kernen/μL18 is. Hogere concentraties kernen kunnen indien nodig ook gemakkelijk worden verdund. - Filtreer het monster door het monster met kracht door het filter in een laag DNA-bindende microcentrifugebuis van 1,5 ml te drijven. Het uiteindelijke elutievolume moet 120-150 μL zijn.
OPMERKING: Sommige schuimvorming kan het gevolg zijn van filtratie. Dit lijkt geen invloed te hebben op de kernkwaliteit.
4. Beoordeel de kwaliteit van kernen door microscopie
- Meng in een aparte microcentrifugebuis 10 μL van het gefilterde monster met 10 μL 0,4% trypanblauwe oplossing door voorzichtig pipetteren. Monsters vereisen geen verlengde incubatietijd en zijn klaar voor visualisatie onmiddellijk na het mengen met trypan blue-oplossing.
- Deponeer 10 μL van de gekleurde kernen in een kamer van een telkamerschuif.
OPMERKING: Als alternatief, deponeer 10 μL van het gekleurde kernmonster op een hemocytometer of microscopieschuif en dek af met een afdekslip. - Beoordeel de kwaliteit van de kernen door middel van lichtmicroscopie.
OPMERKING: Lagere vergrotingen mogen alleen worden gebruikt om in te zoomen op kernen, omdat kerndefecten alleen visueel zichtbaar zijn bij hogere vergrotingen (d.w.z. 60x of hoger). Deze stap kan snel worden uitgevoerd om het succes van kernpreparaat te beoordelen en vereist geen secundaire analyse buiten visuele inspectie. Intacte kernen van hoge kwaliteit hebben een scherp gedefinieerde rand20 (figuur 2A). Kernen van slechte kwaliteit hebben verstoorde kernmembranen, fragmentarische trypanblauwe kleuring in de buurt van het kernmembraan die wijst op mogelijke nucleïnezuurlekkage en / of bewijs van blaten20 (figuur 2B). Gezonde kernen zullen naar verwachting 10-15 μm in diameter zijn.
5. Kwantificeer singletkernen, puin en multipletverhouding door flowcytometrie
OPMERKING: De specifieke terminologie en interface van de flowcytometersoftware kan verschillen op basis van het merk van de machine, maar deze stappen moeten indien nodig eenvoudig kunnen worden aangepast aan andere systemen.
- Resuspendeer in een FACS-buis 10 μL van het gefilterde kernmonster in 90 μL van de buffer die wordt aanbevolen voor flowcytometrie voor een verdunning van 1:10. Hiervoor wordt in deze studie 0,22 μm gefilterd gesteriliseerd PBS, pH 7,2, met 2 mM EDTA en 0,5% BSA gebruikt.
OPMERKING: Hoewel deze verdunning voor de meeste kernvoorbereiding zal werken, kan een lagere verdunning (bijv. 1:5) nodig zijn om voldoende kernen te bemonsteren voor kwaliteitsbeoordeling in het geval van een monster met een lagere opbrengst (d.w.z. <30 kernen / μL in het verdunde monster). - Kleur de monsters met propidiumjodide (PI) in een eindconcentratie van 1 μg/ml. Er is geen incubatietijd nodig en kernen kunnen onmiddellijk worden geanalyseerd.
OPMERKING: U kunt de monsters ook kleuren met een eindconcentratie van 0,1 μg/ml DAPI. Merk op dat DAPI moet worden afgelezen op een ander fluorescentiekanaal dan PI (Vioblue-A V1-A-kanaal; excitatie bij 405 nm, emissie bij 450/50 nm). - Analyseer de monsters op een flowcytometer als volgt:
- Een werkruimte instellen:
- Zorg ervoor dat de flowcytometer in de acquisitiemodus staat. Klik op Bestand en selecteer vervolgens Nieuwe werkruimte in het vervolgkeuzemenu. Voer op het tabblad Experiment in het linkerdeelvenster de naam van project en voorbeeld-id in hun respectievelijke velden in.
- Klik in de linkerbovenhoek op de knop Nieuw analysevenster (scatter plot-pictogram). Klik op het vak met drie plots (Plot 4t) in het pop-upmenu. Er verschijnen drie plots op het scherm. Klik op de knop Analysemodus in de werkbalk linksboven (A-pictogram) zodat deze grijs is en niet oranje.
- Analyseplots instellen:
- Verander de assen van de drie percelen als volgt, geordend als respectievelijk X-as en Y-as:
Perceel 1: X-as: FSC-A, Y-as: SSC-A
Plot 2: X-as: HDR-T, Y-as: SSC-A
Perceel 3: X-as: PerCP-Vio700-A B3-A, Y-as: SSC-A - Wijzig de assen door op het aslabel te klikken en het gewenste kanaal te selecteren in het vervolgkeuzemenu.
- Stel de dichtheidskleurcode in door op het vierkantgrijze pictogram "i" te klikken dat naast de rechterbovenhoek van elke plot verschijnt. Er wordt een venster Eigenschappen geopend met een deelvenster met knoppen aan de linkerkant. Klik in het venster Eigenschappen op het Scatterplot-pictogram (tweede bovenaan aan de linkerkant van het paneel). Klik op OK.
OPMERKING: Het PerCP-Vio700-A B3-A fluorescentiekanaal komt overeen met een excitatie bij 488 nm en emissie in het bereik van 650-730 nm.
- Verander de assen van de drie percelen als volgt, geordend als respectievelijk X-as en Y-as:
- Instrumentinstellingen instellen:
- Klik op het tabblad Kanalen in het linkerdeelvenster. Er verschijnt een lijst met alle kanalen met drie vakjes aan de rechterkant. Stel B3, FSC-A en SSC-A in op Hlog door op de pijl-omlaag te klikken op hun respectievelijke eerste vakken aan de rechterkant en Hlog te selecteren in het vervolgkeuzemenu. Stel de spanning van SSC in op 640 V, FSC op 300 V en B3 op 480 V door deze nummers in hun respectievelijke middelste vakken aan de rechterkant in te typen en op enter te drukken. Merk op dat het derde vak aan de rechterkant een schakelaar is die afwisselend kan worden gebruikt om te typen.
- Stel onder de triggerkop de FSC-trigger in op 4 en de SSC- en B3-trigger op 0 door op de pijl-omlaag te klikken, deze te selecteren in het vervolgkeuzemenu aan de linkerkant, het nummer in het vak aan de rechterkant in te typen en vervolgens op enter te drukken. Merk op dat er een schakelvak aan de rechterkant is dat als alternatief kan worden gebruikt om te typen.
OPMERKING: PMT-spanningen moeten worden geoptimaliseerd voor elke specifieke flowcytometriemachine, maar de trigger voor kernen moet lager zijn dan wat doorgaans voor cellen wordt gebruikt. Bovendien moet de asschaal worden ingesteld op h-log.
- Typ 100 μL in het tekstvak Monstervolume en 50 μL in het tekstvak Opnamevolume aan de linkerkant van het stroomsoftwarevenster. Controleer of de parameter Mix Sample is ingesteld op Mix Gentle om te voorkomen dat kernen in deze stap worden gelyseerd. Druk op het driehoekje in een cirkel (pictogram Afspelen ) in de rechterbenedenhoek om de stroom te starten.
- Controleer de stroomkwaliteit:
- Gebruik het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) versus HDR-T om te controleren op luchtbellen of klonten in het monster. Zorg ervoor dat dit plot een soepel continuüm van punten is. Luchtbellen of klonten resulteren in lege gebieden in de SSC-A versus HDR-T-plot.
- Controleer de side scatter (SSC-A) versus forward scatter (FSC-A) plot om te controleren of de gebruikte spanningen correct zijn voor het monster.
OPMERKING: In tegenstelling tot cellen zullen kernen niet volledig oplossen van puin in een zijverstrooiing versus voorwaartse spreidingsplot. Er moet echter een cluster van gebeurtenissen met hoge dichtheid zijn in het midden van het perceel dat overeenkomt met kernen (warmer gekleurd) met een lagere dichtheid van gebeurtenissen (koeler gekleurd) op de achtergrond die overeenkomt met puin.
- Analyseer het aantal kernen en de kwaliteit:
- Dubbelklik op het perceel SSC-A vs. PerCp-Vio-700A voor een vergrote weergave. Klik op de knop op de werkbalk linksboven met loodrechte lijnen (Kwadrant) om een kwadrantpoort te selecteren. Klik vervolgens ergens in de SSC-A vs. PerCp-Vio-700A plot en kwadranten verschijnen in het plot.
- Klik ergens op de kwadrantscheidingslijnen en schuif met de cursor om de plaatsing van het kwadrant te wijzigen. Plaats de kwadranten zodanig dat het kwadrant linksboven de uiterst linkse populatie (puin) bevat en het kwadrant rechtsboven verschillende druppelvormige clusters (kernen) (zie figuur 3 voor poortopstelling en voorbeelden van stroomresultaten voor typische resultaten met preps, inclusief al dan niet inclusief een stap voor het verwijderen van puin).
- Puin versus kernen telt:
- Klik op het vierkantsgrijze "i" -pictogram in de rechterbovenhoek van het plot om het venster Eigenschappen te openen. Klik op het tabblad Regiofuncties ; lijsten met plotgebieden en functies worden weergegeven.
- Zorg in de lijst Regio's voor een groen vinkje naast het bovenste item, dat aangeeft dat het hele perceel is geselecteerd. Klik in de lijst Functies op Count/μL om een groen vinkje te maken. Klik op OK en in elk kwadrant verschijnt een telling/μL-statistiek.
- Als u onbewerkte tellingen en percentages wilt weergeven, selecteert u desgewenst Aantal en %-T op het tabblad Regiofuncties . De tellingen/μL in het kwadrant linksboven en rechts komen overeen met respectievelijk de puin- en kernopbrengst.
- Singlet telt:
- De meest linkse druppelvormige cluster in het onderste deel van het kwadrant rechtsboven vertegenwoordigt singlets. Teken een veelhoekige poort rond deze populatie door op de veelhoekknop (Polygoon) op de werkbalk linksboven te klikken.
- Klik één keer, schuif met de muis om te beginnen met tekenen en klik nogmaals om een lineair segment van de poort te voltooien en het volgende te beginnen. Dubbelklik om de poort te voltooien. Klik op de rand van de poort en schuif met de muis om de poort te verplaatsen.
- Klik op de hoekpunten van de poort om de vorm te wijzigen. Tellingen/μL van de gated populatie (singlets) verschijnen. Dit is de concentratie van de kernenvoorbereiding met de initiële verdunning.
OPMERKING: De voorwaartse spreidingszone versus hoogte 1:1 lineaire relatie, die vaak wordt gebruikt om de singletsnelheid te bepalen bij stromende cellen, is niet van toepassing op kernen en kan worden genegeerd.
- Bereken met behulp van de concentratie van de verdunde kernenvoorbereiding en de verdunningsfactor de concentratie van de initiële prep (bijv. voor een verdunning van 1:10 de waargenomen concentratie vermenigvuldigen met 10). Concentraties van >300 kernen/μL zijn geschikt voor snRNA-seq.
- Een werkruimte instellen:
Representative Results
Het hier beschreven killifish hersenkern isolatieprotocol is specifiek geoptimaliseerd voor de killifish en is samengevat in figuur 1. Naast kernextractie beschrijft het protocol verschillende methoden voor het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerde kernen. Figuur 2 toont voorbeelden van zowel gezonde (figuur 2A) als ongezonde (figuur 2B) kernen zoals beoordeeld met lichtmicroscopie. Gezonde kernen die geschikt zijn voor downstream-analyse (figuur 2A) presenteren zich als singletkernen met intacte membranen. Zoals te zien is in figuur 2B, is de meest voorkomende faalmodus van dit protocol (en andere kernisolatieprotocollen) het genereren van overdreven kernen, die worden gekenmerkt door beschadigde kernmembranen. Dit leidt vaak tot klonteren van kernen en kan bijdragen aan achtergrondsignalen in downstream-toepassingen als gevolg van het lekken van nucleïnezuren uit de gescheurde kernen. Als overmatige klontering wordt waargenomen, raden we aan om voorzichtiger te zijn tijdens de verdubbelingsstappen en / of de incubatietijden in lysisbuffer te verkorten.
Dit protocol maakt gebruik van flowcytometrie om het aantal geïsoleerde kernen te kwantificeren en het relatieve aandeel van multipletkernen in een monster te bepalen. Bovendien kan flowcytometrie worden gebruikt om het relatieve gehalte aan verontreinigend puin, vaak gescheurde kernfragmenten en ander cellulair puin te beoordelen dat de stroomafwaartse testen in het kernmonster nadelig kan beïnvloeden. Representatieve stroomgegevens zijn te zien in figuur 3. Een hoogwaardige kernisolatieprocedure zal produceren: 1) een kleine puinfractie en 2) een hoge fractie singlet versus multipletkernen (> 80% van de kernfractie). Het gebruik van PI-kleuring, die nucleïnezuren kleurt, maakt het mogelijk om singletkernen te scheiden van puin en multipletkernen. Figuur 3A is een voorbeeld van een preparaat dat besmet is met puin, terwijl figuur 3B een voorbeeld is van een experiment van hoge kwaliteit.
Figuur 1: Killifish hersenkernen isolatie workflow. Experimentele workflow voor kernisolatie van bevroren of verse killifishhersenen. Eenmaal geïsoleerd en beoordeeld, kunnen kernen worden gebruikt voor verschillende downstream "omics" -analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beoordeling van de kwaliteit van kernen door microscopie. Kernen werden 1:1 gemengd in een oplossing van 0,4% Trypan Blue en gevisualiseerd op een Echo Revolve microscoop door brightfield imaging op 60x. (A) Een voorbeeld van een hoogwaardige kern. De kern is aanwezig als een singlet en het kernmembraan is intact. (B) Een voorbeeld van kernen van slechte kwaliteit. De nucleaire membranen zijn beschadigd en kernen klonteren in een doublet, waarschijnlijk als gevolg van lekkage van kleverig DNA, dat kan worden gezien lekkend vanaf de bovenkant van de bovenste kern. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kernkwantificering en zuiverheidsbeoordeling door flowcytometrie. Kernmonsters werden gekleurd met een 1:100 verdunning van PI en uitgevoerd op een flowcytometer. Kernen zijn aanwezig in singlet- en multipletvormen in het kwadrant rechtsboven (A,B) met singlets als de laagste wolk van gebeurtenissen gevolgd door doubletten, drielingen, enz. in oplopende volgorde. Puin wordt gekenmerkt door de gebeurtenissen in de meest linkse twee kwadranten. (A) Een voorbeeld van een kernvoorbereiding van lage kwaliteit, waarbij de stap voor het verwijderen van puin werd weggelaten en puin > 40% van de gebeurtenissen uitmaakt. (B) Een voorbeeld van een hoogwaardig kernmonster, met de meegeleverde stap voor het verwijderen van puin. In dit voorbeeld vormt puin < 10% van alle gebeurtenissen die door de flowcytometer worden geregistreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Type monster (2 hersenen) | Gemiddelde opbrengst (4 onafhankelijke preps) |
| 5-weekse mannelijke hersenen | 3,59 ± 1,76 x 105 |
| 10-weekse mannelijke hersenen | 6,41 ± 1,33 x 105 |
| 15-weekse mannelijke hersenen | 14,59 ± 2,05 x 105 |
| 5-weekse vrouwelijke hersenen | 2,54 ± 0,75 x 105 |
| 10-weekse vrouwelijke hersenen | 4,66 ± 1,29 x 105 |
| 15-weekse vrouwelijke hersenen | 7,95 ± 3,51 x 105 |
Tabel 1: Gemiddelde verwachte opbrengsten van twee hersenen van Afrikaanse turquoise killifish over geslacht en leeftijd. Gemiddelde opbrengsten uitgedrukt als 105 kernen ± standaardfout van het gemiddelde over vier onafhankelijke kernpreparaten in elke categorie.
Aanvullende figuur 1: Vergelijking van de isolatiekwaliteit van kernen met behulp van standaardprotocollen en ons geoptimaliseerde protocol voor bevroren killifishhersenen. (A) Beoordeling van de kwaliteit van kernen door middel van microscopie. Kernen werden 1:1 gemengd in een oplossing van 0,4% Trypan Blue en gevisualiseerd op een microscoop door brightfield imaging bij 60x. (B) Kernen en debris load kwantificering door flowcytometrie. Kernmonsters werden gekleurd met een 1:100 verdunning van PI en uitgevoerd op een flowcytometer. (C) Samenvatting van kwaliteitsbeoordelingsmaatstaven door middel van microscopie en flowcytometrie met de verschillende gebenchmarkte protocollen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Schematische weergave van de stappen voor het verwijderen van puin. (A) Schema van puinverwijdering gelaagdheid vóór centrifugatie. (B) Schema voor de verwijdering van supernatanten na centrifugatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om reproductief hoogwaardige kernen te genereren uit killifishhersenen. Dit protocol moest specifiek worden ontworpen voor de killifish-hersenen, omdat typische op zoogdieren gebaseerde hersenkernisolatieprotocollen toegepast op killifish-hersenen consequent resulteerden in een slechte kernkwaliteit in onze handen. We vermoeden dat dit te wijten is aan het lagere relatieve myelinegehalte van de killifish-hersenen in vergelijking met hun zoogdierachtige tegenhangers, die zouden lyseren en klonteren als reactie op de barre omstandigheden die nodig zijn voor hersencellysis van zoogdieren. Dit protocol is een vooruitgang in de verouderings- en killifish-velden omdat het de verkenning van hersenveroudering op eencellig niveau vergemakkelijkt in een kosten- en tijdeffectief model van gewervelde hersenveroudering.
Dit protocol is robuust voor verse of bevroren monsters, hoewel men rekening moet houden met de downstream-toepassingen bij het gebruik van vers of bevroren weefsel. Bevroren weefsel is vaak handig omdat het maandenlang kan worden verzameld en bewaard terwijl monsters worden verzameld. Dergelijke monsters kunnen veilig worden gebruikt voor toepassingen zoals snRNA-seq. Het bevriezen van monsters kan echter de nucleaire structuur verstoren en dus het vermogen om het chromatinelandschap nauwkeurig te meten door ATAC-seq21. Voor downstream-toepassingen zoals bulk ATAC-seq of snATAC-seq wordt het dus aanbevolen om vers ontleedde hersenen te gebruiken in plaats van bevroren hersenen. Bovendien, omdat alle stappen na hersenhomogenisatie parallel kunnen worden uitgevoerd, is dit protocol vatbaar voor het uitvoeren van meerdere monsters in een redelijk tijdsbestek, waardoor RNA-afbraak veroorzaakt door langdurige incubatie op ijs wordt beperkt.
Bovendien is het noodzakelijk om buffers vers (binnen enkele uren) na het uitvoeren van kernextractie te bereiden. We ontdekten dat detergentia en BSA onmiddellijk voorafgaand aan het begin van het protocol aan buffers moeten worden toegevoegd. Buffers die alleen zouten bevatten (PBS, NaCl, enz.) mogen als concentraten worden gemaakt, filter gesteriliseerd (0,22 μm) en voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard. BSA-stamoplossingen kunnen binnen enkele dagen na de kernextractie (indien bereid uit een poeder) worden bereid, gesteriliseerd en bij 4 °C worden bewaard, maar moeten altijd onmiddellijk aan de in dit protocol gebruikte buffers worden toegevoegd voordat het protocol wordt uitgevoerd. We raden echter aan om BSA-oplossingen voor te bereiden op de dag van het protocol. Als u vooraf gemaakte BSA-oplossingen van een derde partij gebruikt, wordt geadviseerd om verse, ongeopende flessen te gebruiken. Het gebruik van verse BSA leidt over het algemeen tot een lager puingehalte in kernvoorbereiding.
Of verse of bevroren monsters nu als input worden gebruikt, het is belangrijk om de kwaliteit van kernen na kernisolatie te beoordelen. Hoewel dit protocol specifiek is ontworpen om overlyse te voorkomen, is dit de meest voorkomende oorzaak van kwaliteitsverlies in kernen. Overlyse kan het gevolg zijn van te veel tijd doorgebracht in de lysisbuffer, te ruwe behandeling van de kernen zoals overmatig pipetteren met een standaard boringpipetpunt, of een overmatige hoeveelheid tijd doorgebracht tussen kernisolatie en downstream-toepassingen (>1 uur). Overdreven kernen hebben vaak beschadigde nucleaire periferie, die DNA lekken en klontering veroorzaken (figuur 2B). Dit zal leiden tot een verhoogd aantal multipletten en bijdragen achtergrondnucleïnezuren die zullen interfereren met downstream-toepassingen, met name snRNA-seq. Beide kwaliteiten kunnen worden beoordeeld door microscopie na kernisolatie. Als overmatige nucleaire klontering wordt waargenomen, raden we aan om te proberen de lysisstap incubatie te verkorten om de kans op overlyse te verminderen. Als alternatieve methode voor het verhogen van singlets van kernen, kan fluorescentie-assisted cell sorting (FACS) worden gebruikt om te verrijken voor singlets stroomafwaarts van dit protocol. We merken echter op dat, bij het werken met reeds fragiele kernen uit bevroren weefsel, de schuifspanning die optreedt tijdens het sorteren kan leiden tot verhoogde nucleaire breuk en dus verhoogd omgevings-RNA / DNA. Bovendien merken we op dat de tijd die nodig is om een FACS-opbrengstsortering voor kernen uit te voeren bij het verwerken van meerdere monsters, vereist dat alle kernmonsters urenlang op ijs blijven, terwijl andere monsters worden gesorteerd. Verhoogde wachttijden bij het verwerken van meerdere monsters parallel met de FACS-aanpak kunnen dus waarschijnlijk ook leiden tot een algehele verminderde kernkwaliteit en het risico op RNA-afbraak verhogen. Dus als FACS gewenst is voor een verlaagde doubletsnelheid, raden we aan dat het puingehalte opnieuw wordt gecontroleerd na de opbrengstsortering en dat mogelijk verminderde RNA-kwaliteit in aanmerking wordt genomen voor single cell RNA-seq-toepassingen als een potentieel voorbehoud.
Een nauwkeurige schatting van het aantal kernen en de singletverhouding is essentieel voor bijna alle downstream "omics" -toepassingen en is van het grootste belang. Vanwege het vermogen om kernen gemakkelijk op grootte te sluiten en te tellen, is flowcytometrie de meest nauwkeurige methode voor het tellen van kernen die we hebben beoordeeld. Als alternatief kan men kernen kwantificeren met behulp van celtellers zoals Invitrogen's Countess 2 FL Automated Cell Counter of de DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. Om op te merken, heeft invitrogen's Countess 2 FL Automated Cell Counter, en in veel mindere mate de DeNovix, de neiging om kerntellingen te overschatten door puin als kernen te tellen, wat betekent dat handmatige gating van de grootte nodig kan zijn. Bovendien kan men met de flowcytometer eenvoudig de zuiverheid van de kernen beoordelen. Men kan de relatieve verhouding van singlet versus multipletkernen onderscheiden op een kwantitatieve manier die moeilijk is door microscopie. Dit is van vitaal belang voor snRNA-seq en snATAC-seq, omdat die protocollen zullen lijden onder een overschot aan multipletmonsters, die moeten worden uitgesloten van downstream-analyses. Naast multipletten kan het relatieve aandeel "puin" (gefragmenteerde kernen, cellulair puin) worden gekwantificeerd door flowcytometrie en moet relatief laag zijn, omdat dit materiaal vaak verontreinigende nucleïnezuren bevat die een achtergrondsignaal kunnen bijdragen en "omics" -gegevens met één kern kunnen beschadigen.
Net als bij eerder beschreven kernisolatieprotocollen, mogen de verhoudingen van celtypen in het oorspronkelijke weefsel niet getrouw worden samengevat in de kernvoorbereiding19 en moeten daarom met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Om op te merken, zoals alle teleosts, hebben Afrikaanse turquoise killifish kernvormige erytrocyten, die naar verwachting ook vertegenwoordigd zullen zijn in de kernvoorbereiding. Deze kernen kunnen worden geïdentificeerd in snRNA-seq en snATAC-seq datasets door de hogere expressie / toegankelijkheid van hemoglobinegenen en kunnen indien gewenst computationeel worden uitgesloten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Sommige panelen werden gegenereerd met BioRender.com. Dit werk in ons laboratorium werd ondersteund door de NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant to B.T., een subsidie van de Simons Foundation als onderdeel van de Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, een pilotbeurs van de Navigage Foundation en een Hanson-Thorell Family award aan B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
- Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P.
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757 (2018).
- McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
- Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
- Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22 (2021).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
- Grindberg, R. V., et al.
- Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542 (2020).
- Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
- Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
- Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
- Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
- Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).
