Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتوسيعها من عينات خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64573
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

Summary

الهدف من هذه الدراسة هو إثبات جدوى الفصل القائم على التعويم لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية البشرية الأولية.

Abstract

تعد عملية عزل الخلايا التائية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لإنشاء مزارع خارج الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية للبحث والاختبارات السريرية والعلاجات القائمة على الخلايا. في هذه الدراسة ، يتم تقديم بروتوكول بسيط وجديد لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية من PBMCs خارج الجسم الحي . تستخدم هذه الدراسة تقنية فرز الخلايا المنشطة بالطفو الوظيفي (BACS) لعزل الخلايا التائية وتنشيطها. باختصار ، يتضمن البروتوكول الاختيار الإيجابي لخلايا CD3 + من PBMCs المشتقة من leukopak ، يليها تحفيز مشترك لمدة 48 ساعة مع فقاعات streptavidin الدقيقة (SAMBs) المترافقة مسبقا المضادة ل CD28 قبل النقل في 24 لوحة بئر. توفر الفقاعات الدقيقة الوظيفية فرصة فريدة لتنشيط الخلايا بشكل مزدهر ، مما يؤدي إلى أنماط ظاهرية تكاثرية تسمح بالتوسع بأقل قدر من الإرهاق. توفر هذه التقنية استنفادا أقل لأن الفقاعات الدقيقة المحفزة المشتركة تظل طافية وتعود إلى الجزء العلوي من وسط الاستزراع ، مما يقلل من مقدار الوقت الذي تتلامس فيه الخلايا المتوسعة مع عوامل التحفيز المشترك. تشير النتائج إلى أن الخلايا التائية المعزولة والمستزرعة تتلقى تحفيزا كافيا للتنشيط والتكاثر ولكن ليس إلى الحد الذي يؤدي إلى فرط النشاط ، مما يؤدي بعد ذلك إلى الإرهاق ، كما يتضح من وجود PD-1 المفرط.

Introduction

يتم حاليا إجراء أكثر من 500 تجربة سريرية للعلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) في جميع أنحاء العالم ، وتتوفر أربعة منتجات للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR-T) في السوق1. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من احتياجات البحث والتصنيع في الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية والتي يجب معالجتها لتحسين الفعالية وقابلية التوسع والنجاح طويل الأجل لهذه العلاجات العلاجية المحتملة2،3،4،5. يبدأ البحث السريري والتصنيع بالتبني للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية بعزل الخلايا التائية من عينة دم محيطية والتحفيز اللاحق ونقل وتوسيع الخلايا المعزولة. تتطلب المعلمات مثل استعادة الخلايا التائية والنقاء وإشارات التنشيط / الاستنفاد دراسة متأنية عند اختيار تقنيات عزل الخلايا وتحفيزها لأبحاث الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهميةوتصنيعها 3،4،6. الأهم من ذلك ، هناك حاجة إلى تحسين الثبات العلاجي لعلاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عن طريق تقليل العوائق البيولوجية الناتجة عن عمليات التصنيع الحالية ، مثل استنفاد الخلايا التائية ، لتعزيز الفعالية العلاجية 6,7.

كبديل لطرق عزل الخلايا التقليدية مثل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) ، هنا ، يتم عرض فرز الخلايا المنشط بالطفو (BACS) باستخدام الفقاعات الدقيقة لعزل الخلايا التائية. يستخدم فصل الفقاعات الدقيقة كريات مجهرية مجوفة (فقاعات دقيقة) لربط الأهداف وتعويمها على سطح عينات السوائل 8,9. من خلال تشغيل الفقاعات الدقيقة مع الأجسام المضادة (أي مضادات CD3) ، يمكن اختيار مجموعات الخلايا التائية المرغوبة بشكل إيجابي من عينات الدم المحيطية. بعد ذلك ، تم توضيح استخدام مجموعة مختلفة من الفقاعات الدقيقة التي تعمل بالأجسام المضادة (أي anti-CD28) للمشاركة في تحفيز وتنشيط الخلايا التائية المختارة إيجابيا في هذا العمل. توفر الفقاعات الدقيقة سير عمل عزل وتنشيط بسيط وقابل للضبط للغاية يولد خلايا تائية جاهزة لزراعة الخلايا العالقة والتطبيقات النهائية مثل التعديل الوراثي والتوسع. بشكل حاسم ، يعزز تنشيط الخلايا الطافية مع الفقاعات الدقيقة تحفيز الخلايا المقيدة لمنع استنفاد الخلايا التائية المفرط7.

بالنسبة لهذه الدراسة ، كان قياس التدفق الخلوي هو الأداة الأساسية المستخدمة لتحليل العزلة والتنشيط ونجاح النقل للفقاعات الدقيقة الوظيفية ، بالإضافة إلى توفير معلومات مفصلة حول المجموعات السكانية الفرعية المحددة الموجودة خلال مراحل النمو والتوسع بعد النقل. بالإضافة إلى قياس التدفق الخلوي ، تم استخدام المجهر الساطع والفلوري لتأكيد صحة الخلية ، والتشكل ، ونجاح النقل. بناء على هذه النتائج ، توفر تقنية وبروتوكول الفقاعات الدقيقة بديلا أكثر قابلية للضبط والألطف لطرق العزل والتنشيط التقليدية المستخدمة حاليا اليوم. على وجه الخصوص ، تظهر الخلايا التي يتم تنشيطها بالفقاعات الدقيقة تعبيرا أقل بشكل ملحوظ عن علامات استنفاد الخلايا التائية مقارنة بتلك التي يتم ملاحظتها عادة باستخدام الأدوات والمجموعات المتوافقة مع معايير الصناعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل الخلايا التائية مع microbubbles باستخدام الاختيار الإيجابي

ملاحظة: يفصل هذا البروتوكول نهج الاختيار الإيجابي CD3 + على نطاق صغير باستخدام SAMBs.

  1. احتضان 3 × 108 PBMCs تم الحصول عليها تجاريا في 2.5 مل من عازلة الفصل مع الجسم المضاد المضاد ل CD3 (OKT3) بتركيز 25 نانوغرام من الجسم المضاد لكل 1 مليون خلية (25 نانوغرام / م). امزج بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. أضف فقاعات الستربتافيدين الدقيقة (SAMBs) بنسبة 0.5 (كمية SAMB):1 (كمية الخلية) وفقا لتركيز SAMB المبلغ عنه من قبل الشركة المصنعة.
  3. امزج باستخدام دوار تجاري من طرف إلى طرف (EOE) عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا المختارة إيجابيا في الجزء العلوي من التعليق مع SAMBs. ستكون الخلايا المتبقية غير المحددة في حبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. باستخدام ماصة زجاجية 9 ، أدخل الطرف أسفل طبقة خلية الفقاعة إلى أسفل الأنبوب ، واستنشاق حبيبات الخلية و subnatant باستخدام ماصة إلكترونية ونقلها إلى أنبوب جديد.

2. التحفيز المشترك (التنشيط) للخلايا التائية المختارة إيجابيا

  1. أعد تعليق طبقة الخلية الفقاعية المتبقية في الأنبوب الأصلي في 1 مل من وسط الخلية التائية الكامل (أو أي وسط آخر مرغوب).
  2. عد الخلايا في subnatant باستخدام الفحص المجهري brightfield باستخدام عداد الخلايا الآلي ، واطرح هذه القيمة من رقم خلية البداية لتحديد عدد الخلايا التي تم التقاطها في طبقة خلية الفقاعة.
  3. قبل هذه الخطوة ، امزج الجسم المضاد المضاد ل CD28 البيوتينيل مع SAMBs التجارية لمدة لا تقل عن 2 ساعة لإنشاء SAMBs المترافقة المضادة ل CD28. اتصل بالشركة المصنعة ل SAMBs لتحديد كمية الأجسام المضادة المضادة ل CD28 اللازمة للاقتران. أضف SAMBs المترافقة المضادة ل CD28 إلى تعليق خلية الفقاعة الناتج عن الخطوة 2.1 باستخدام نسبة 1.5 (SAMBs المضادة ل CD28):1 (الخلايا).
  4. امزج باستخدام دوران EOE لمدة 15 دقيقة ، ثم اضبط الحجم الإجمالي على 2 مليون خلية لكل مل مع وسيط خلية T كامل أو وسيط آخر مرغوب فيه وفقا لرقم الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2.2.

3. توسيع الخلايا المحفزة بشكل مشترك في وسط زراعة الخلايا

  1. قم بتوزيع 1 مل من الخلايا المنشطة من الخطوة 2.4 بتركيز 2 م / مل لكل بئر في لوحة من 24 بئرا. احتضان في حاضنة مرطبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  2. بعد 24 ساعة، أضف 50 وحدة / مل من IL-2 و 25 نانوغرام / م من مضاد CD3 القابل للذوبان (OKT3) لتشجيع التمدد بشكل أكبر، كما تم حسابه باستخدام العدد الأولي للخلايا المطلية في اليوم 0. ضع لوحة الخلية مرة أخرى في حاضنة CO2 المرطبة ، واتركها تحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

4. اختياري: نقل الخلايا التائية المنشطة مع lentivirus

ملاحظة: النهج المستخدم هنا مقتبس من Prommersberger et al. 10.

  1. قم بإذابة الفيروس العدسي في درجة حرارة الغرفة ، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات.
  2. قم بإزالة منتصف ناتانت برفق ، 600 ميكرولتر من كل بئر ، دون لمس الخلايا الابنة الموجودة الآن في قاع البئر أو طبقة الفقاعة التي بقيت على سطح المحلول.
  3. أضف 5 ميكروغرام / مل من بروميد سداسي ديميثرين لكل بئر لتعزيز النقل الفيروسي. أضف جزيئات lentiviral عند تعدد العدوى (MOI) من 3 (جزيئات lentiviral لكل خلية).
  4. قم بالطرد المركزي للوحة لمدة 45 دقيقة عند 800 × جم و 32 درجة مئوية باستخدام تسارع بطيء وعدم انقطاع للتباطؤ. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في حاضنة CO2 مرطبة عند 37 درجة مئوية.
  5. بعد 4 ساعات ، أضف 600 ميكرولتر من وسط الخلايا التائية الكاملة الطازجة المتاحة تجاريا و 50 وحدة / مل من IL-2 إلى كل بئر ، وضع لوحة الخلية مرة أخرى في حاضنة CO2 المرطبة عند 37 درجة مئوية لتوسيع الخلايا التائية.

5. توسيع الخلايا التائية (مع أو بدون نقل مسبق)

  1. كل يومين ، قم بإزالة نصف الوسط من منتصف ناتانت ، واستبدله بوسط خلية تائية جديد وكامل ، وأضف IL-2 بتركيز 50 وحدة / مل.
  2. عد الخلايا التائية مرتين في الأسبوع لتقييم كثافة الخلية. عندما تتجاوز كثافة الخلية 2 × 10 6-2.5 × 106 خلايا / مل ، انقل الخلايا إلى وعاء أكبر ، وقم بتخفيفها إلى 5 × 105 خلايا / مل.

6. حصاد الخلايا التائية وقياس التدفق الخلوي

  1. امزج محتويات كل بئر برفق عن طريق سحب لأعلى ولأسفل. قم بإزالة محتويات البئر بالكامل ، بما في ذلك الفقاعات الدقيقة ، وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  2. اغسل كل بئر ب 400 ميكرولتر من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (-/-) ، وانقل المحلول إلى أنبوب سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح الطاف, وإعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من عازلة الفصل.
  4. تلطيخ بكوكتيل تنشيط واستنفاد الأجسام المضادة / تلطيخ ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تحضير كوكتيلات تلطيخ على النحو التالي- كوكتيل التنشيط: AF700-CD3 ، PE / Dazzle-CD4 ، PE / Cy7-CD8 ، BV510-CD25 ، PE-CD69 ؛ كوكتيل الإرهاق: AF700-CD3 ، PE / Dazzle-CD4 ، PE / Cy7-CD8 ، PE-PD-1.
  5. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للفصل ، واخلطه برفق. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لغسل الأجسام المضادة الزائدة. نضح الطافية تماما.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للفصل ، وانقلها إلى وعاء مناسب (على سبيل المثال ، أنبوب FACS ، لوحة 96 بئر ، إلخ) لتحليل قياس التدفق الخلوي. تم تفصيل مخطط بوابة تحليل التدفق الخلوي الموصى به في الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم عزل الخلايا التائية من PBMCs المشتراة ومطلية للتنشيط كما هو موضح في البروتوكول. لم يتم تنشيط عينات التحكم السلبية (PBMCs المشتراة). تم تضمين عينات التحكم هذه لإثبات تأثير عملية تنشيط الفقاعات الدقيقة على العينات التجريبية مقارنة بضوابط الخلايا التائية التي لم تمسها ولم يتم تحفيزها ، مما يضمن أن علامات التنشيط التي لوحظت كانت نتيجة لعوامل التنشيط المضافة ولم تكن متأصلة في الخلايا التائية نفسها. وفقا للمخطط التجريبي في الشكل 2 ، تم زرع الخلايا عند 2 × 106 خلايا / مل في وسط الخلية التائية وكانت إما لم تمسها / لم يتم تحفيزها أو تحفيزها بشكل مشترك مع مضادات CD3 (استنساخ OKT3) ومضادة CD28 (استنساخ 28.2) SAMBs. بعد 48 ساعة من التحفيز في الثقافة ، تم تحويل الخلايا باستخدام ترميز الجسيمات الفيروسية العدسية ل zsGreen. في 4 أيام و 6 أيام بعد النقل ، تم تصوير الخلايا وحصادها وتلطيخها بالسطح باستخدام AF700-CD3 و PE / Dazzle-CD4 و PE / Cy7-CD8 و BV510-CD25 و PE-PD-1 (أو PE-CD69 اعتمادا على ما إذا تم استخدام لوحات الاستنفاد أو التنشيط ، على التوالي) ، و 7-AAD. كان جين التحوير zsGreen قابلا للكشف في قناة FITC. تم تفصيل نهج بوابة قياس التدفق الخلوي في الشكل 1. لوحظت زيادات في أعداد الخلايا التائية القابلة للحياة والخلايا التائية الإيجابية لجين التحوير بين العينة الضابطة والخلايا التي تلقت التحفيز المشترك للفقاعات الدقيقة (الشكل 3). كما لوحظت زيادة في أعداد الخلايا المستجيبة في عينات الفقاعات الدقيقة (الشكل 4). لوحظت الخلايا التائية التي تعبر عن علامات التنشيط والاستنفاد المتزايدة بين عينات الخلايا التي تلقت التحفيز المشترك للفقاعات الدقيقة (الشكل 5 والشكل 6). لوحظ توسع الخلايا بين اليوم 4 واليوم 6 نقاط زمنية للعينات المحفزة بشكل مشترك ، مما يشير إلى أن الخلايا كانت نشطة وتكاثرية وتمرر جين التحوير أثناء توسعها.

Figure 1
الشكل 1: مثال على مخطط البوابة - لم يمسها / عينة التحكم السلبية. بدءا من المفردات ، تم إغلاق الخلايا السكانية بعد ذلك باستخدام SSC-A / FSC-A. تم إغلاق إجمالي خلايا CD3 + ، تليها بوابات CD3 + قابلة للحياة باستخدام 7-AAD لتحديد صلاحية السكان. تم تحديد جميع المجموعات السكانية والحسابات اللاحقة من السكان 7-AAD (-) / CD3 + (+) ، كما هو موضح باستخدام الأسهم التي تشير إلى بوابات السكان الفرعية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على الجدول الزمني التجريبي. تمت الإشارة إلى أيام البروتوكول أعلاه ، ويتم استخدام الأيام المقابلة بعد النقل (D0-D6) في الأشكال أدناه. تم طلاء الخلايا مباشرة بعد الاختيار والتنشيط. تم إنشاء آبار التحكم باستخدام بروتوكول الاختيار السلبي للفقاعات الدقيقة. لم تتلق الخلايا التائية الضابطة عوامل تحفيز مشتركة ولم تخضع للنقل ، على الرغم من أنها تلقت IL-2 لضمان الحفاظ على صحة الخلايا بما يكفي للحفاظ على قابلية معقولة طوال التجربة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تقييم الخلايا القابلة للحياة والمتحولة بنجاح بعد النقل. (أ) خلايا CD3+ القابلة للحياة بعد 4 أيام و6 أيام بعد النقل. تم تحديد الجدوى من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي ، حيث تم تحديد عدد السكان عن طريق البوابات على خلايا 7-AAD (-) / CD3 + (+). (ب) تم تحديد عدد الخلايا التي تم تحويلها بنجاح باستخدام rLV.EF1.zsGreen من خلال قياس التدفق الخلوي ، حيث تم عزل مجموعة 7-AAD (-) / CD3 + (+) القابلة للحياة إلى خلايا zsGreen (+). تم تنفيذ جميع الشروط في ثلاث نسخ (ن = 3). تمثل البيانات متوسط ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خلايا CD4+ وCD8+ T قابلة للحياة. تم تحديد المجموعات الفرعية للخلايا التائية CD4 + و CD8 + عن طريق البوابات على مجموعة CD3 + القابلة للحياة (CD3 + [+] / 7-AAD [-]) وقياس التعبير عن (A) CD4 + و (B) CD8 +. تم تنفيذ جميع الشروط في ثلاث نسخ (ن = 3). تمثل البيانات متوسط ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الخلايا التائية المنشطة القابلة للحياة. كما تم تحليل مجتمع CD3 + القابل للحياة بحثا عن علامات تنشيط محددة كما هو موضح في الأشكال أعلاه. (أ) CD69 هو علامة مبكرة للتنشيط ؛ (ب) CD25 هي علامة تنشيط متوسطة إلى متأخرة. تمثل النسب المئوية أعلى أشرطة الخطأ النسبة المئوية لخلايا CD3 + القابلة للحياة التي تعبر عن العلامة المعنية. تم تنفيذ جميع الشروط في ثلاث نسخ (ن = 3). تمثل البيانات متوسط ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: الخلايا التائية المستنفدة. كما تم تحليل مجتمع CD3 + القابل للحياة بحثا عن علامات الإرهاق (PD-1). (أ) العدد الإجمالي لخلايا 7-AAD (-) / CD3 + (+) / PD-1 + (+) في اليوم 4 واليوم 6 بعد النقل. ب: النسبة المئوية لخلايا PD-1+ . في اليوم 4 واليوم 6 ، كان لدى مجتمع العينة المنشط / المحول ~ 25٪ خلايا CD3 + / PD-1 + قابلة للحياة ، في حين أن مجتمع العينة الضابطة كان لديه ~ 2٪ خلايا CD3 + / PD-1 + قابلة للحياة. وتجدر الإشارة إلى أن المادة البادئة / المعزولة تحتوي على خلايا CD3 + / PD-1 + قابلة للحياة < ~ 15٪ (بيانات ما بعد العزلة / ما قبل الاستزراع غير معروضة). تم تنفيذ جميع الشروط في ثلاث نسخ (ن = 3). تمثل البيانات متوسط ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح البروتوكول الموصوف بعزل الخلايا التائية من عينات PBMC وتنشيط الخلايا التائية العالقة في وسائط المزرعة ذات الفقاعات الدقيقة. تعتمد هذه الطريقة على الفقاعات الدقيقة الوظيفية التي يوفر طفوها المتأصل فرصة فريدة لإدخال إشارات التحفيز المشترك إلى الخلايا وتنشيطها أثناء تعليقها في وسط استزراع ، وبالتالي تقليل تعرض الخلايا المتوسعة للتحفيز لفترات طويلة ؛ يمكن أن يؤدي هذا التحفيز المفرط إلى زيادة التعبير عن علامات استنفاد الخلايا التائية وتقليل الفعالية العلاجية11. تنتج الخلايا التائية المحفزة المرتبطة بشكل طفوي بالفقاعات الدقيقة الوظيفية خلايا بنوية لم تمسها تسقط إلى أسفل صفيحة زراعة الخلايا للتوسع ، مما يسمح بفترة من النمو بعيدا عن عوامل التحفيز الطفو. لقد تم تفصيله في الأدبيات كيف يمكن أن يؤثر التعرض المطول للخلايا التائية المعزولة لعوامل التحفيز - مثل البروتوكولات القائمة على الخرزة المغناطيسية12 - سلبا على التوسع والفعالية العلاجية 6،7،11.

نظرا لأن هذا البروتوكول المبلغ عنه يعتمد على الاختيار الإيجابي لخلايا CD3 + ، فمن الأهمية بمكان إزالة المادة الفرعية أسفل طبقة خلية الفقاعة بعناية ولكن بدقة أثناء مرحلة العزل من هذا البروتوكول. وهذا يضمن تحفيز عدد الخلايا التائية المختارة إيجابيا فقط وتصفيتها. هذه أيضا خطوة مهمة لتحديد عدد الخلايا المختارة من عينة PBMC الأولية ، وهو أمر ضروري لإجراء حسابات دقيقة للتحفيز المشترك والطلاء.

استفادت أنشطة تطوير بروتوكول الفقاعات الدقيقة هذه لتنشيط الخلايا التائية وتوسيعها من مجموعة واسعة من العلامات أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بالتوصيف الشامل لمجموعة الخلايا التائية المعزولة والمحفزة لتقييم معلمات الخلايا التائية الحرجة ، بما في ذلك التنشيط والاستنفاد والتوسع النسيلي. عند مقارنته بتقنيات عزل وتحفيز الخلايا التائية شائعة الاستخدام ، مثل البروتوكولات القائمة على الخرزة المغناطيسية ، يهدف بروتوكول الفقاعات الدقيقة هذا إلى تقليل التحفيز المفرط للخلايا دون التضحية بقدرات التوسع ووظيفة المستجيب المقابلة للخلايا التائية المعزولة. ستشمل التطبيقات المستقبلية لتقنية الفقاعات الدقيقة هذه بروتوكولات مختلفة للاختيار الإيجابي للخلايا التائية ، والتحفيز المشترك ، ومزارع خلايا الفقاعات الدقيقة اللاحقة لتلبية مجموعة متنوعة من احتياجات سير العمل لأبحاث العلاج بالخلايا ومجتمعات التصنيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين ، في وقت التقديم ، هم موظفون في Akadeum Life Sciences ، التي تصنع وتبيع منتجات فصل الفقاعات الدقيقة.

Acknowledgments

اي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 190 ،
عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتوسيعها من عينات خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C.,… More

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter