Isolement, activation et expansion des lymphocytes T par flottation à partir d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique humain à l’aide de microbulles

Summary

L’objectif de cette étude est de démontrer la faisabilité de la séparation basée sur la flottation pour isoler, activer et développer les cellules T humaines primaires.

Abstract

Le processus d’isolement des lymphocytes T des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) pour établir des cultures ex vivo est crucial pour la recherche, les essais cliniques et les thérapies cellulaires. Dans cette étude, un protocole simple et novateur pour isoler, activer et étendre les cellules T des PBMC ex vivo est présenté. Cette étude utilise la technologie de tri cellulaire activé par flottabilité fonctionnalisée (BACS) pour isoler et activer les cellules T. En bref, le protocole implique la sélection positive de cellules CD3⁺ à partir de PBMC dérivés de leukopak, suivie d’une co-stimulation de 48 heures avec des microbulles de streptavidine (SAMB) pré-conjuguées anti-CD28 avant la transduction dans des plaques à 24 puits. Les microbulles fonctionnalisées offrent une occasion unique d’activer les cellules de manière dynamique, conduisant à des phénotypes prolifératifs qui permettent une expansion avec un minimum d’épuisement. Cette technique offre un épuisement réduit car les microbulles co-stimulatrices restent flottantes et retournent au sommet du milieu de culture, réduisant ainsi le temps pendant lequel les cellules en expansion sont en contact avec les facteurs co-stimulants. Les résultats indiquent que les lymphocytes T isolés et cultivés reçoivent suffisamment de stimulation pour s’activer et proliférer, mais pas au point de conduire à une suractivation, ce qui conduit ensuite à l’épuisement, comme le démontre la présence excessive de-1.

Introduction

Plus de 500 essais cliniques de thérapie cellulaire CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont actuellement menés dans le monde entier, et quatre produits de thérapie cellulaire CAR-T sont disponibles sur le marché¹. Cependant, il existe encore de nombreux besoins en matière de recherche et de fabrication de cellules CAR-T qui doivent être satisfaits pour améliorer l’efficacité, l’évolutivité et le succès à long terme de ces thérapies potentiellement curatives 2,3,4,5. La recherche clinique et la fabrication de cellules CAR-T adoptives commencent par l’isolement des cellules T à partir d’un échantillon de sang périphérique et la stimulation, la transduction et l’expansion ultérieures des cellules isolées. Des paramètres tels que la récupération des lymphocytes T, la pureté et les signaux d’activation/épuisement doivent être soigneusement pris en compte lors du choix des techniques d’isolement et de stimulation des cellules pour la recherche et la fabrication de cellules CAR-T ^3,4,6. Il est important de noter que l’amélioration de la persistance thérapeutique des thérapies cellulaires CAR-T en minimisant les obstacles biologiques résultant des procédés de fabrication actuels, tels que l’épuisement des lymphocytes T, est nécessaire pour améliorer l’efficacité thérapeutique ^6,7.

Comme alternative aux méthodes traditionnelles d’isolement cellulaire telles que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), ici, le tri cellulaire activé par flottabilité (BACS) avec des microbulles pour l’isolement des lymphocytes T est démontré. La séparation des microbulles utilise des microsphères creuses flottantes (microbulles) pour lier les cibles et les faire flotter à la surface des échantillons de fluide ^8,9. En fonctionnalisant les microbulles avec des anticorps (c.-à-d. anti-CD3), les populations de lymphocytes T souhaitées peuvent être sélectionnées positivement à partir d’échantillons de sang périphérique. Par la suite, l’utilisation d’une population différente de microbulles fonctionnalisées par anticorps (c.-à-d. anti-CD28) pour co-stimuler et activer positivement des cellules T sélectionnées positivement en suspension est démontrée dans ce travail. Les microbulles offrent un flux de travail d’isolation et d’activation simple et hautement réglable qui génère des cellules T prêtes pour la culture de cellules en suspension et les applications en aval telles que la modification génétique et l’expansion. De manière critique, l’activation cellulaire flottante avec des microbulles favorise la stimulation cellulaire restreinte pour prévenir l’épuisement excessif des lymphocytes T⁷.

Pour cette étude, la cytométrie en flux a été le principal outil utilisé pour analyser l’isolement, l’activation et le succès de la transduction des microbulles fonctionnalisées, ainsi que pour fournir des informations détaillées sur les sous-populations spécifiques présentes pendant les phases de croissance et d’expansion post-transduction. En plus de la cytométrie en flux, la microscopie à fond clair et la microscopie à fluorescence ont été utilisées pour confirmer la santé cellulaire, la morphologie et le succès de la transduction. Sur la base de ces résultats, la technologie et le protocole des microbulles offrent une alternative plus accordable et plus douce aux méthodes traditionnelles d’isolement et d’activation actuellement utilisées; en particulier, les cellules activées par microbulles montrent une expression nettement plus faible des marqueurs d’épuisement des lymphocytes T que celle généralement observée avec les outils et les kits standard de l’industrie.

Protocol

1. Isolement des lymphocytes T avec microbulles par sélection positive

REMARQUE : Ce protocole détaille une approche de sélection positive CD3⁺ à petite échelle utilisant des SAMB.

1. Incuber 3 x 10⁸ PBMC obtenus commercialement dans 2,5 mL de tampon de séparation avec un anticorps anti-CD3 biotinylé (OKT3) à une concentration de 25 ng d’anticorps pour 1 million de cellules (25 ng/M). Mélanger délicatement en pipetant de haut en bas, et incuber à température ambiante pendant 10 min.
2. Ajouter des microbulles de streptavidine (SAMB) dans un rapport de 0,5 (quantité de SAMB):1 (quantité de cellule) selon la concentration de SAMB déclarée par le fabricant.
3. Mélanger à l’aide d’un rotateur commercial de bout en bout (EOE) à 20 rpm pendant 10-15 min à température ambiante. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g à température ambiante.
4. Après centrifugation, les cellules sélectionnées positivement seront au sommet de la suspension avec les SAMB. Les autres cellules non sélectionnées seront dans la pastille de cellule au fond du tube. À l’aide d’une pipette en verre 9, insérez l’embout sous la couche de cellule à bulles au fond du tube, aspirez la pastille de cellule et le subnageant avec une pipette électronique et transférez-les dans un nouveau tube.

2. Co-stimulation (activation) des lymphocytes T sélectionnés positivement

1. Remettez en suspension la couche de cellules bulles restant dans le tube d’origine dans 1 mL de milieu cellulaire T complet (ou un autre milieu désiré).
2. Comptez les cellules du subnageant avec la microscopie à fond clair à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et soustrayez cette valeur du nombre de cellules de départ pour déterminer le nombre de cellules capturées dans la couche de cellule bulle.
3. Avant cette étape, mélanger l’anticorps anti-CD28 biotinylé avec des SAMB commerciaux pendant au moins 2 h pour créer les SAMB anti-CD28 conjugués. Contactez le fabricant des SAMB pour déterminer la quantité d’anticorps anti-CD28 nécessaire pour la conjugaison. Ajouter les SAMB conjugués anti-CD28 à la suspension de cellules à bulles résultant de l’étape 2.1 en utilisant un rapport de 1,5 (SAMB anti-CD28):1 (cellules).
4. Mélanger en utilisant la rotation EOE pendant 15 min, puis ajuster le volume total à 2 millions de cellules par mL avec un milieu de cellules T complet ou un autre milieu désiré en fonction du nombre de cellules obtenu à l’étape 2.2.

3. Expansion des cellules co-stimulées dans le milieu de culture cellulaire

1. Répartir 1 mL de cellules activées à partir de l’étape 2.4 à une concentration de 2 M/mL par puits dans une plaque de 24 puits. Incuber dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ à 37 °C.
2. Après 24 h, ajouter 50 U/mL d’IL-2 et 25 ng/M d’anti-CD3 soluble (OKT3) pour encourager davantage l’expansion, calculé en utilisant le nombre initial de cellules plaquées au jour 0. Replacez la plaque cellulaire dans l’incubateur de CO₂ humidifié et laissez-la incuber toute la nuit à 37 °C.

4. Facultatif : Transduction des lymphocytes T activés avec lentivirus

NOTE: L’approche utilisée ici est adaptée de Prommersberger et al. ¹⁰.

1. Décongeler le lentivirus à température ambiante et mélanger brièvement par pipetage.
2. Retirez délicatement le milieu de l’eau, 600 μL, de chaque puits, sans toucher les cellules filles qui se trouvent maintenant au fond du puits ou la couche de bulles qui est restée à la surface de la solution.
3. Ajouter 5 μg/mL de bromure d’hexadiméthrine par puits pour améliorer la transduction virale. Ajouter les particules lentivirales à une multiplicité d’infection (MOI) de 3 (particules lentivirales par cellule).
4. Centrifuger la plaque pendant 45 min à 800 x g et 32 °C en accélérant lentement et sans interruption de décélération. Incuber les cellules pendant 4 h dans un incubateur de CO₂ humidifié à 37 °C.
5. Après 4 h, ajouter 600 μL de milieu de lymphocytes T complets frais disponibles dans le commerce et 50 U/mL d’IL-2 à chaque puits, et remettre la plaque cellulaire dans l’incubateur de CO₂ humidifié à 37 °C pour la dilatation des lymphocytes T.

5. Expansion des lymphocytes T (avec ou sans transduction préalable)

1. Tous les 2 jours, retirer la moitié du milieu du milieu médian, le remplacer par un milieu de lymphocytes T frais et complet et ajouter de l’IL-2 à une concentration de 50 U/mL.
2. Comptez les lymphocytes T deux fois par semaine pour évaluer la densité cellulaire. Lorsque la densité cellulaire dépasse 2 x 10 6-2,5 x 10⁶ cellules/mL, transférer les cellules dans un récipient plus grand, en les diluant à 5 x 10⁵ cellules/mL.

6. Récolte des lymphocytes T et cytométrie en flux

1. Mélangez délicatement le contenu de chaque puits en tuyautant de haut en bas. Retirez tout le contenu du puits, y compris les microbulles, et transférez-les dans un tube de 1,5 mL.
2. Lavez bien chaque puits avec 400 μL de DPBS sans calcium et sans magnésium (−/−) et transférez la solution dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 50 μL de tampon de séparation.
4. Tacher avec un cocktail d’anticorps d’activation et d’épuisement / coloration, et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Préparez les cocktails colorants comme suit - cocktail d’activation: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; cocktail d’épuisement : AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE--1.
5. Ajouter 1 mL de tampon de séparation et mélanger délicatement. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à température ambiante pour éliminer l’excès d’anticorps. Aspirer complètement le surnageant.
6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de séparation et la transférer dans un récipient approprié (p. ex. un tube FACS, une plaque de 96 puits, etc.) pour l’analyse par cytométrie en flux. Le schéma de contrôle recommandé pour l’analyse de cytométrie en flux est détaillé à la figure 1.

Representative Results

Les lymphocytes T ont été isolés à partir de PBMC achetés et plaqués pour l’activation comme décrit dans le protocole. Les échantillons témoins négatifs (PBMC achetés) n’ont pas été activés. Ces échantillons témoins ont été inclus pour démontrer l’effet du processus d’activation des microbulles sur les échantillons expérimentaux par rapport aux témoins de lymphocytes T intacts et non stimulés, en veillant à ce que les marqueurs d’activation observés soient le résultat des facteurs d’activation ajoutés et ne soient pas inhérents aux lymphocytes T eux-mêmes. Selon le schéma expérimental de la figure 2, les cellules ont été ensemencées à 2 x 10⁶ cellules/mL dans un milieu de lymphocytes T et ont été soit intactes/non stimulées, soit co-stimulées avec des SAMB anti-CD3 (clone OKT3) et anti-CD28 (clone 28.2). Après 48 h de stimulation en culture, les cellules ont été transduites avec la particule lentivirale codant pour zsGreen. 4 jours et 6 jours après la transduction, les cellules ont été imagées, récoltées et colorées en surface à l’aide d’AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE--1 (ou PE-CD69 selon que les panneaux d’épuisement ou d’activation ont été utilisés, respectivement) et 7-AAD. Le transgène zsGreen était détectable dans le canal FITC. L’approche de contrôle de la cytométrie en flux est détaillée à la figure 1. Des augmentations du nombre de lymphocytes T viables et de lymphocytes T transgéniques positifs ont été observées entre l’échantillon témoin et les cellules ayant reçu une costimulation par microbulles (Figure 3). Une augmentation des populations de cellules effectrices a également été observée dans les échantillons de microbulles (figure 4). Des lymphocytes T exprimant des marqueurs d’activation et d’épuisement accrus ont été observés parmi les échantillons de cellules ayant reçu une costimulation par microbulles (Figure 5 et Figure 6). L’expansion cellulaire a été observée entre les points temporels du jour 4 et du jour 6 des échantillons co-stimulés, indiquant que les cellules étaient actives, prolifératives et transmettaient le transgène à mesure qu’elles se développaient.

Figure 1 : Exemple d’échantillon de contrôle non touché/négatif du schéma de contrôle. À partir des singlets, les cellules de population ont ensuite été fermées à l’aide de SSC-A/FSC-A. Le nombre total de cellules CD3+ a été éliminé, suivi d’un contrôle viable du CD3⁺ à l’aide du 7-AAD pour déterminer la viabilité de la population. Toutes les populations et tous les calculs subséquents ont été déterminés à partir de la population viable de 7-AAD(−)/CD3⁺(+), comme le montrent les flèches indiquant les portes de sous-population. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Aperçu de la chronologie expérimentale. Les jours du protocole sont indiqués ci-dessus, et les jours correspondants après la transduction (D0-D6) sont utilisés dans les figures ci-dessous. Les cellules ont été plaquées immédiatement après la sélection et l’activation. Les puits de contrôle ont été générés à l’aide d’un protocole de sélection négative à microbulles. Les lymphocytes T témoins n’ont pas reçu d’agents de costimulation et n’ont pas subi de transduction, bien qu’ils aient reçu de l’IL-2 pour s’assurer que les cellules étaient maintenues en assez bonne santé pour maintenir une viabilité raisonnable tout au long de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation des cellules viables et transduites avec succès après la transduction. (A) Cellules CD3⁺ viables 4 jours et 6 jours après la transduction. La viabilité a été déterminée par cytométrie de flux, dans laquelle la population a été quantifiée par gating sur des cellules 7-AAD(−)/CD3⁺(+). (B) Le nombre de cellules transduites avec succès avec rLV.EF1.zsGreen a été déterminé par cytométrie en flux, dans laquelle la population viable 7-AAD(−)/CD3⁺(+) a ensuite été fermée dans des cellules zsGreen(+). Toutes les conditions ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3). Les données représentent la moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Lymphocytes T CD4+ et CD8⁺ viables. Les sous-populations de lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont été quantifiées en évaluant la population viable de CD3+ (CD3+ [+]/7-AAD[−]) et en mesurant l’expression de (A) CD4+ et (B) CD8⁺. Toutes les conditions ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3). Les données représentent la moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Lymphocytes T activés viables. La population viable de CD3⁺ a également été analysée pour déterminer des marqueurs d’activation spécifiques, comme l’indiquent les figures ci-dessus. (A) CD69 est un marqueur précoce de l’activation; (B) CD25 est un marqueur d’activation moyen à tardif. Les pourcentages au-dessus des barres d’erreur représentent le pourcentage de cellules CD3⁺ viables exprimant le marqueur respectif. Toutes les conditions ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3). Les données représentent la moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Lymphocytes T épuisés. La population viable de CD3⁺ a également été analysée pour déterminer les marqueurs de l’épuisement (-1). (A) Le nombre total de cellules 7-AAD(−)/CD3+(+)/-1⁺(+) au jour 4 et au jour 6 après la transduction. (B) Le pourcentage de cellules-1⁺. Au jour 4 et au jour 6, la population de l’échantillon activé/transduit avait ~25 % de cellules CD3+/-1+ viables, tandis que la population de l’échantillon témoin avait ~2 % de cellules CD3+/-1⁺ viables. Il convient de noter que le matériau de départ ou isolé contenait < ~ 15 % de cellules CD3+/-1⁺ viables (données post-isolement et pré-culture non présentées). Toutes les conditions ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3). Les données représentent la moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit permet l’isolement des cellules T à partir d’échantillons de PBMC et l’activation des cellules T en suspension dans des milieux de culture avec des microbulles. Cette méthode repose sur des microbulles fonctionnalisées dont la flottabilité inhérente offre une occasion unique d’introduire des signaux co-stimulateurs aux cellules et de les activer lorsqu’elles sont suspendues dans un milieu de culture, réduisant ainsi l’exposition des cellules en expansion à une stimulation prolongée; une telle surstimulation peut entraîner une augmentation de l’expression des marqueurs d’épuisement des lymphocytes T et une réduction de l’efficacité thérapeutique¹¹. Les lymphocytes T stimulés qui sont fixés de manière dynamique à des microbulles fonctionnalisées produisent des cellules filles intactes qui tombent au fond de la plaque de culture cellulaire pour l’expansion, permettant une période de croissance loin des facteurs de stimulation flottants. Il a été détaillé dans la littérature comment l’exposition prolongée de lymphocytes T isolés à des facteurs de stimulation - tels que les protocoles à base de billes magnétiques¹² - peut avoir un impact négatif sur l’expansion et l’efficacité thérapeutique ^6,7,11.

Comme ce protocole rapporté repose sur la sélection positive des cellules CD3⁺ , il est essentiel d’éliminer le subnageant sous la couche de cellules bulles avec précaution mais profondeur pendant la phase d’isolement de ce protocole. Cela garantit que seule la population de lymphocytes T positivement sélectionnée est stimulée et plaquée. Il s’agit également d’une étape importante pour déterminer le nombre de cellules sélectionnées dans l’échantillon PBMC de départ, ce qui est nécessaire pour des calculs précis de costimulation et de placage.

Ces activités de développement de protocoles de microbulles pour l’activation et l’expansion des lymphocytes T ont tiré parti d’un large éventail de marqueurs lors de l’analyse par cytométrie en flux, ce qui a permis de caractériser en profondeur la population de lymphocytes T isolés et stimulés afin d’évaluer les paramètres critiques des lymphocytes T, y compris l’activation, l’épuisement et l’expansion clonale. Comparé aux technologies d’isolation et de stimulation des lymphocytes T couramment utilisées, telles que les protocoles à base de billes magnétiques, ce protocole de microbulles vise à minimiser la surstimulation des cellules sans sacrifier l’expansion et les capacités de fonction effectrice correspondantes des cellules T isolées. Les applications futures de cette technique de microbulles comprendront divers protocoles pour la sélection positive des lymphocytes T, la co-stimulation et les cultures subséquentes de cellules à microbulles afin de répondre à une variété de besoins de flux de travail pour les communautés de recherche et de fabrication de thérapie cellulaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000