Summary
Se presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. El protocolo se basa en una extracción seca y sin tampón de tricomas utilizando solo nitrógeno líquido, hielo seco y tamices de nylon y es adecuado para la extracción de ARN y el análisis transcriptómico.
Abstract
Este documento presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. Las vías biosintéticas para el metabolismo de los cannabinoides y los terpenos volátiles se localizan principalmente en los tricomas del cannabis , y los tricomas aislados son beneficiosos para el análisis del transcriptoma. Los protocolos existentes para aislar tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica son inconvenientes y proporcionan cabezas de tricomas comprometidas y una cantidad relativamente baja de tricomas aislados. Además, dependen de aparatos costosos y medios de aislamiento que contienen inhibidores de proteínas para evitar la degradación del ARN. El presente protocolo sugiere combinar tres modificaciones individuales para obtener una gran cantidad de tricomas glandulares capitados y sésiles aislados de inflorescencias femeninas maduras de C. sativa y hojas de abanico, respectivamente. La primera modificación consiste en sustituir el nitrógeno líquido por el medio de aislamiento convencional para facilitar el paso de tricomas a través de los microtamices. La segunda modificación consiste en usar hielo seco para separar los tricomas de la fuente vegetal. La tercera modificación consiste en pasar el material vegetal consecutivamente a través de cinco micro-tamices de tamaños de poro decrecientes. Las imágenes microscópicas demostraron la efectividad de la técnica de aislamiento para ambos tipos de tricomas. Además, la calidad del ARN extraído de los tricomas aislados fue apropiada para el análisis transcriptómico posterior.
Introduction
Los tricomas glandulares son estructuras similares a pelos presentes en las plantas que contienen muchos metabolitos secundarios1 y representan un valioso banco de nuevos genes biosintéticos y enzimas2. En el cannabis, la biosíntesis de los metabolitos secundarios importantes, los cannabinoides3 y los terpenos4, se localiza en los tricomas. Teniendo en cuenta el papel de los tricomas en la determinación de la calidad del cannabis tanto para usos medicinales como recreativos, el estudio de la expresión génica de tricomas es de interés. Para caracterizar la expresión de genes específicos de tricomas, primero se deben aislar los tricomas de interés. Los protocolos de aislamiento de tricomas se describieron por primera vez ya en 19925, y sus últimos desarrollos han sido revisados recientemente2. En general, los protocolos para extraer tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica se pueden dividir en dos pasos secuenciales distintos. El primer paso implica una separación física completa de los tricomas del tejido vegetal. Este paso se puede realizar utilizando hielo seco5, perlas de vidrio con un aparato comercial 6,7, moliendo el material vegetal contra un tamiz de malla8, o vórtice del tejido vegetal en un tampón de aislamiento9. El segundo paso implica una separación más refinada de los tricomas de interés del residuo microscópico de la planta y / u otros tipos de tricomas. Este paso se puede ejecutar utilizando centrifugación por gradiente de densidad 8,10 o tamices de varios tamaños 7,9. Debido a la extrema sensibilidad del ARN en los tejidos procesados a los agentes degradantes, estos dos pasos secuenciales generalmente se realizan en el medio de aislamiento helado, a menudo en presencia de inhibidores de proteínas4.
Los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas requieren, además de las temperaturas heladas, grandes cantidades de medio de aislamiento para garantizar un procedimiento de extracción eficiente. La combinación de estos componentes da como resultado un proceso de aislamiento arduo y lento que dificulta el alto rendimiento. Por lo tanto, es probable que la presentación de un protocolo alternativo de aislamiento de tricomas sencillo y fácil de usar sea beneficioso para varios aspectos asociados con la caracterización de tricomas. El presente trabajo tiene como objetivo ofrecer un protocolo alternativo para aislar tricomas capitados glandulares tallados y sésiles de Cannabis sativa mediante la combinación e integración de varios elementos de los protocolos convencionales. Estos elementos incluyen el hielo seco5, el paso de los tricomas a través de varios microtamices con tamaños de poro decrecientes7,9, y la sustitución del nitrógeno líquido (LN) por el medio de aislamiento8.
La novedad del actual protocolo de aislamiento de tricomas, en comparación con los protocolos convencionales, se presenta de varias maneras. Este protocolo es conveniente, ya que no requiere componentes peligrosos. El procedimiento se puede realizar en el laboratorio con precauciones mínimas y facilita un alto rendimiento. La sustitución del medio de aislamiento líquido estándar por LN garantiza la integridad de los tricomas durante todo el proceso de aislamiento, lo que permite un posterior análisis transcriptómico. Tras la sublimación del LN y el hielo seco, los tricomas aislados quedan libres de residuos dañinos. Además, la propensión de LN a sublimar a temperatura ambiente permite su uso generoso en todo el protocolo. Por el contrario, el uso de grandes volúmenes de medio de aislamiento convencional genera dificultades prácticas en su manejo. Finalmente, el protocolo disminuye la separación de la célula del disco de la frágil estructura de la cabeza restante del tricoma glandular, lo que permite la retención del contenido del espacio de cabeza.
Este protocolo se presenta de manera detallada paso a paso diseñado para ayudar a la práctica técnica de aislar tricomas capitales glandulares de C. sativa. El protocolo proporciona un flujo de trabajo manejable que da como resultado tricomas aislados con una alta concentración y pureza que son apropiados para el análisis molecular posterior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: El material vegetal utilizado en este estudio consistió en cuatro cepas de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 y CS-14) que se cultivaron en el Centro Volcani, Israel, como se describe en otra parte11. Los tricomas glandulares capitados tallados se aislaron de inflorescencias de floración maduras, y los tricomas sésiles capitados glandulares se aislaron de grandes hojas de abanico de plantas madre maduras sin flores. Todo el material vegetal fue recogido e inmediatamente almacenado a -80 °C.
PRECAUCIÓN: El hielo seco y LN se utilizan en todo el protocolo. Estas sustancias son extremadamente peligrosas. Los tricomas aislados pueden contener partículas de hielo seco que pueden crear una presión de gas peligrosa cuando se insertan en tubos sellados; Por lo tanto, todas las tapas deben perforarse con agujas. Se recomienda encarecidamente el uso de gafas protectoras, ropa de laboratorio adecuada y guantes para el manejo a temperaturas extremadamente bajas.
1. Configuración para la separación inicial de tricomas del material vegetal
- Aplaste un bloque de hielo seco en pequeñas escamas finas con un martillo y un objeto plano duro en un recipiente de plástico de 5 L.
- Tamizar los copos finos de hielo seco (menores de 5 mm) del hielo seco no triturado con un colador grande (a través de poros menores de 5 mm) en otro recipiente de plástico de 5 L. Vierta aproximadamente 200 cm3 (marca de 200 ml) de los copos de hielo seco en un vaso de precipitados de vidrio vertical de 1 L.
- Agregue hasta 10 g de inflorescencias congeladas de C. sativa (en adelante denominadas material vegetal) sobre la primera capa de hielo seco picado y cubra con una capa adicional de 200cm3 de hielo seco finamente triturado.
- Cubra la abertura del vaso de precipitados de vidrio de 1 L con dos o tres capas de mosquitero de puerta de 1 mm y asegúrelo a los lados exteriores de la taza de vidrio con bandas de goma (Figura 1).
- Vierta LN en un recipiente grande de acero inoxidable de fondo redondo (consulte la Tabla de materiales), donde se recogerán los tricomas aislados.
- Inserte una malla de 350 μm en un colador tamizador/tamiz de harina para cubrir la malla tamiz de harina desde abajo (Figura 2). Si hay disponible un tamiz de harina con un anillo de plástico desmontable, inserte la malla de 350 μm para que quede asegurada debajo de la malla del tamiz de harina. De lo contrario, asegure la malla de 350 μm a la circunferencia del tamiz de harina con bandas elásticas.
- Coloque el tamiz de harina sobre el recipiente grande de acero inoxidable de fondo redondo lleno de LN (Figura 3). Asegúrese de que el ancho del recipiente exceda el del tamiz de harina para minimizar la pérdida de la masa tamizada fuera del recipiente de acero inoxidable de fondo redondo.
2. Separación de tricomas del material vegetal
- Agite el vaso de 1 L con su abertura apuntando hacia abajo hacia el tamiz de harina como si usara un salero grande (Figura 4).
- Deje a un lado el vaso de precipitados de vidrio de 1 L cada 2-3 minutos para permitir el tamizado del hielo seco triturado y el material vegetal acumulado en el tamiz de harina.
- Tamizar el tamiz de harina horizontalmente para facilitar el paso del material vegetal al LN en el recipiente de acero inoxidable de fondo redondo que se encuentra debajo.
- Agregue LN al recipiente de acero inoxidable y hielo seco picado al vaso de precipitados de vidrio de 1 L cuando sus niveles sean bajos. Reponga el material vegetal usado en el vaso de precipitados de vidrio con 10 g adicionales de material vegetal fresco cuando el material vegetal en el tamiz de harina se agote. La reposición generalmente no tiene que repetirse más de dos veces.
- Repita los pasos 2.1-2.4 hasta que se haya recogido una cantidad suficiente de tricomas enriquecidos en el recipiente de acero inoxidable de fondo redondo. En general, 20 g de material vegetal fresco es suficiente para la extracción de ARN y el análisis del transcriptoma.
- Verifique que haya una sustancia blanca similar al polvo (que consiste en restos de plantas, tricomas glandulares y hielo seco triturado) en el fondo del recipiente de acero inoxidable sumergido en el LN. Una observación microscópica ayudará a determinar si se ha recolectado una cantidad suficiente de tricomas; Sin embargo, este paso podría obstruir el flujo del protocolo. Por lo general, 10-20 g de material vegetal inicial son suficientes para la mayoría de los aislamientos; Sin embargo, puede haber diferencias en la densidad de tricomas de las plantas.
NOTA: A partir de este punto, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde. Si se detiene por un corto tiempo, se deben agregar cantidades adecuadas de LN para que los tricomas permanezcan sumergidos. Alternativamente, los tricomas se pueden recolectar y almacenar a -80 ° C durante un máximo de 3 meses para su uso posterior, como se describe en el paso 5.
3. Separación de tricomas capitados glandulares (tallados y sésiles) de otros tipos de tricomas, como tricomas bulbosos y cistolíticos, y desechos
- Agregue una pequeña cantidad de LN a un recipiente limpio y pequeño de acero inoxidable de fondo redondo.
- Doblar dos veces un microtamiz de 40 cm x 40 cm con un tamaño de malla de 150 μm para obtener un pliegue de 20 cm x 20 cm y abrirlo. Asegúrese de que se asemeje a una forma de cono (Figura 5).
- Asegure el cono de malla al borde del contenedor de acero inoxidable de fondo redondo con una o dos pinzas para la ropa de modo que la parte abierta del cono quede en posición vertical y su parte puntiaguda esté parcialmente sumergida en el LN.
- Vierta suavemente el LN y la sustancia blanca en polvo del paso 2.6 en el cono del microtamiz.
- Aplique suavemente un cepillo ancho para recoger y transferir cualquier material vegetal restante del primer recipiente al cono de malla de 150 μm.
- Agregue más LN al primer recipiente y repita el movimiento de cepillado hasta que todo el material vegetal se transfiera al cono de microtamiz.
- Separe con cuidado la pinza de la tapa del recipiente y abra el cono de microtamiz para que los tricomas se ubiquen en el centro del microtamiz abierto. Mantenga las cuatro esquinas del microtamiz juntas para que la parte media que contiene los tricomas permanezca sumergida en el LN (Figura 6).
- Mientras sostiene las cuatro esquinas del microtamiz, sumerja y agite suavemente el microtamiz en el LN en el recipiente de acero como si estuviera infundiendo una bolsa de té. Continúe con este movimiento de inmersión/agitación (vertical y horizontal) durante 1 minuto. Hay una compensación entre la calidad y la cantidad de aislamiento. Los movimientos de inmersión más largos pueden resultar en mayores cantidades de tricomas, pero su grado de aislamiento puede ser más pobre. En general, se recomienda 1 minuto como adecuado tanto para la calidad como para la cantidad.
NOTA: Este movimiento de tamizado es la parte más crítica del protocolo y debe ejecutarse en consecuencia. - Opcional: Recoger los restos vegetales no tamizados y los tricomas más grandes (aún sumergidos en el LN) que se envuelven en el centro del microtamiz en un tubo de ensayo de 13 ml o 50 ml, y almacenar a -80 °C para su uso futuro.
PRECAUCIÓN: Para evitar la acumulación de gas a presión (del hielo seco y residuos de LN), perfore un orificio en la tapa del tubo de ensayo con una aguja esterilizada. La tapa se puede reemplazar una vez que la presión se ha reducido, que generalmente es después de 24 h.
4. Pasar tricomas a través de micro-tamices de tamaño de poro decreciente
- Transfiera los tricomas tamizados sumergidos en el LN en el fondo del pequeño recipiente de acero inoxidable de fondo redondo secuencialmente a través de microtamices con tamaños de poro decrecientes (105 μm, 80 μm, 65 μm y 50 μm), de la misma manera que se presenta en el paso 3.
5. Recogida de los tricomas deseados
- Retire los tricomas deseados sumergidos en el LN y envueltos en el microtamiz de 50 μm con una cuchara preenfriada (en LN). Colócalos en un plato limpio.
NOTA: En esta etapa final de aislamiento, los tricomas deseados se recogen del tamiz. - Transfiera rápidamente los tricomas en polvo a un tubo de 1,5 ml preenfriado etiquetado a través de una espátula preenfriada o una cuchara insertada en el tubo (Figura 7). Conservar los tubos inmediatamente a -80 °C para estudios adicionales.
NOTA: En la figura 8 se proporciona un gráfico de flujo de trabajo esquemático que representa todo el protocolo de aislamiento.
6. Observación y análisis de los tricomas purificados
- Coloque una pequeña cantidad (10 mg) de tricomas aislados en un portaobjetos de microscopio utilizando una espátula preenfriada (a través de LN). Agregue una gota de agua y observe directamente en un microscopio óptico sin manchas. Evalúe el grado general de aislamiento y contaminación utilizando aumentos bajos (10x) y altos (40x). El enriquecimiento se estima visualmente por la cantidad relativa de tricomas con respecto al tejido no tricomático, como se muestra en la Figura 9.
- Realizar extracción de ARN y análisis de calidad a partir de 50 mg de tricomas aislados de tallo y sésil habitante glandular de C. sativa.
NOTA: Para la extracción de ARN se utilizó un kit de extracción comercial (ver Tabla de materiales) que empleaba una estrategia basada en poli-A de purificación de ARNm.- Resuspender 50 mg de los tricomas aislados en la solución de lisis, vórtice durante 30 s, sonicar en una unidad de limpieza ultrasónica helada a 35 kHz durante 5 min, y extraer el ARNm de las muestras de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales).
- Para estimar la integridad del ARN extraído de los tricomas, determine la concentración de ARN, la cantidad total y los valores del número de integridad del ARN (RIN) utilizando un sistema de laboratorio en un chip (consulte la Tabla de materiales).
- Realizar análisis RNAseq de las fracciones de tricomas (opcional). El análisis de RNAseq y los análisis bioinformáticos de lecturas secuenciadas pueden realizarse mediante servicios de externalización estándar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La principal modificación incluida en este protocolo en comparación con los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas es sustituir el medio de aislamiento estándar por LN. El uso de LN como medio de aislamiento permite un flujo de trabajo relajado, porque mientras las muestras estén sumergidas en LN, no es probable que ocurra degradación metabólica. Además, como el protocolo evita los componentes peligrosos (es decir, ácido aurintricarboxílico y β-mercaptoetanol) utilizados en el medio tradicional de aislamiento de tricomas, el trabajo no se limita a una campana química. Sin embargo, es importante tomar las precauciones necesarias al manipular hielo seco y LN.
Para evaluar las ventajas del presente protocolo, los resultados del aislamiento de tricomas del presente protocolo se compararon con los obtenidos mediante un procedimiento convencional de aislamiento de tricomas (que utilizó un tampón acuoso, perlas de vidrio y un tamiz fino para el aislamiento de tricomas)12, inicialmente utilizando un microscopio óptico. Una comparación de los componentes de diferentes fases de aislamiento a través de la inspección con microscopio óptico ilustra el aumento del grado de aislamiento de tricomas a medida que avanza el proceso de aislamiento. En la etapa inicial del proceso de aislamiento (microtamiz de 105-150 μm), predominaron trozos de tejido foliar en la porción aislada (Figura 9A), en contraste con el producto de aislamiento final, que estaba compuesto casi en su totalidad por tricomas aislados (Figura 9C). Se debe tener cuidado para validar que las muestras aisladas están libres de contaminación (Figura 9B).
Aunque la densidad de tricomas no fue cuantificada en este estudio, la calidad de los tricomas glandulares capitados aislados y sésiles en la etapa final de aislamiento se puede observar en la Figura 10. La pureza puede compararse con la obtenida con el aislamiento de tricomas utilizando un protocolo convencional12 (Figura 10C). En el presente protocolo, se conserva la delicada estructura de la cabeza del tricoma acechado, y todas las cabezas del tricoma acechado aislado son visibles (Figura 10D), mientras que utilizando el protocolo convencional, falta la estructura completa de la cabeza del tricoma y solo están presentes las células del disco (Figura 10E). El rendimiento también se puede aumentar considerablemente ya que el uso de hielo seco y LN obvia el límite de material vegetal que se puede extraer. Una ventaja adicional de nuestro protocolo no acuoso es que utiliza solo hielo seco y LN, y, por lo tanto, no quedan componentes residuales del medio de aislamiento una vez que se evaporan. El uso de LN previene la liberación de metabolitos secundarios pegajosos que pueden conducir a la agregación de los tricomas13. En el presente protocolo, los tricomas aislados en la etapa final de aislamiento se recuperaron como un polvo fino seco.
Es probable que las temperaturas extremadamente bajas mantenidas a lo largo del presente protocolo sean suficientes para cumplir los objetivos de los medios tampón convencionales que previenen la degradación del ARN (siempre que las muestras se mantengan sumergidas) y faciliten las aplicaciones moleculares posteriores. Para validar esta suposición, extrajimos ARN de los tricomas aislados y estimamos la integridad del ARN utilizando kits disponibles comercialmente. Los altos valores de RIN obtenidos (9,4 a 10) y la cromatografía en gel distinta (Figura 11) indican claramente una alta integridad de ARN. Las muestras de ARN se analizaron más a fondo mediante RNAseq, y se obtuvieron lecturas de alta calidad de >20 M de todas las bibliotecas.
Para validar que, efectivamente, el ARNm de la fracción de tricomas aislados está enriquecido en genes expresados por tricomas, comparamos nuestros resultados de expresión génica para la inflorescencia y los correspondientes tricomas aislados tallados con los resultados previos presentados por Livingston et al.14, que caracterizaron la expresión génica de tricomas purificados de Cannabis (adaptado de su Tabla Suplementaria 1 ). Su protocolo consistía en mezclar en tampón acuoso, filtrar a través de tamices y, finalmente, purificar tricomas utilizando un gradiente de Percoll. Los genes expresados en tricomas se caracterizaron como los más altamente correlacionados (p > 0,95) con la expresión génica de la ácido cannabidiólico sintasa (CBDAS), un marcador genético específico de tricomas14. La comparación de la expresión génica entre los resultados obtenidos con el presente protocolo y los presentados en Livingston et al.14 muestra que los 12 genes más enriquecidos en nuestra fracción de tricomas también fueron enriquecidos en el estudio de Livingston et al.14, incluyendo el gen marcador de tricomas CBDAS (Tabla 1). En particular, se obtuvo una relación de enriquecimiento significativamente mayor del presente protocolo. Estos resultados confirman la validez del presente protocolo para el estudio de la expresión génica enriquecida con tricomas.
Además, se compararon los datos de expresión de cinco genes de actina de Cannabis, ya que la actina se utiliza con frecuencia como gen de referencia para estudios de transcriptoma (Tabla 2). Nuestros resultados tanto para los tricomas aislados de tallo como para los sésiles fueron comparables a los reportados por el estudio de Livingston et al.14.
Finalmente, calculamos los datos de expresión y enriquecimiento de tricomas para los genes de la familia de proteínas de unión a clorofila a-b, que presumiblemente no están enriquecidos con tricomas (Tabla 3). De hecho, los 12 miembros de esta familia de genes mostraron un factor de enriquecimiento de tricomas de <1, que sirve como un control negativo para el enriquecimiento de tricomas. Estos resultados combinados indican los patrones de expresión únicos de la inflorescencia y las fracciones aisladas de tricomas y apoyan la integridad y calidad de los tricomas aislados.
Figura 1: Configuración para cargar el vaso de precipitados de vidrio de 1 L. La malla de la puerta de 1 mm se asegura a los lados del vaso de precipitados de vidrio a través de unas pocas bandas de goma (no se muestran). El vaso de precipitados de vidrio de 1 L debe cargarse en posición vertical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración del tamiz de harina. El tamiz de harina está equipado con un microtamiz de 350 μm a través de bandas de goma en la parte inferior (no se muestra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración del primer paso del aislamiento de tricomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Configuración del vaso de precipitados de vidrio. El vaso de precipitados de vidrio equipado con tres capas de malla de puerta mosquitera (mosquito) de 1 mm asegurada mediante bandas de goma en la abertura. La apertura del vaso apunta hacia abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Configuración de la estructura del cono de microtamiz utilizada para el aislamiento de tricomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Configuración para el movimiento de inmersión y agitación del microtamiz que contiene tricomas aislados. El movimiento horizontal/vertical debe parecerse a una infusión de bolsita de té. La configuración es idéntica para cada tamaño de malla utilizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Configuración para la transferencia de los tricomas aislados finales. Los tricomas aislados finales se transfieren a un tubo etiquetado de 1,5 ml. Todos los utensilios deben ser pre-enfriados con LN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Diagrama de flujo que describe el protocolo. El aislamiento de tricomas capitados glandulares de C. Sativa implica tres pasos: (1) el desprendimiento inicial de los tricomas de la fuente de la planta y el paso a través de dos tamices (1 mm y 350 μm), (2) pasar el material vegetal a través de cinco micro-tamices de tamaños de poro decrecientes (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm y 50 μm), y (3) la recolección de los tricomas aislados en un tubo preenfriado de 1,5 ml. De manera similar, se puede recolectar tejido retenido de cualquiera de las etapas del microtamiz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Imágenes microscópicas de los tricomas aislados utilizando el protocolo actual. (A,B,C) Tricomas sésiles glandulares capitados de hojas de abanico de C. sativa. (A) Aislamiento medio, a partir de microtamices con tamaños de poro que van de 105 μm a 150 μm. Tenga en cuenta la retención de grandes cantidades de material verde, sin tricomas. (B) Fin del aislamiento, de microtamices con tamaños de poro que van de 50 μm a 65 μm, contaminados con fuente vegetal (flecha roja), y (C) libre de contaminación. Barras de escala = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Imágenes microscópicas de los tricomas aislados. (A,B) Tricomas glandulares capitados de C. sativa: (A) tipo tallado, aislado usando el protocolo actual, y (B) tipo sésil, aislado usando el protocolo actual. (C) Tricomas acechados aislados mediante un protocolo convencional. El bajo rendimiento y la falta de cabezas no comprometidas de los tricomas son evidentes. (D,E) Tricomas capitados glandulares acechados aislados usando (D) el protocolo actual y (E) el protocolo convencional. (F) Tricomas glandulares acechados aislados de microtamices de 65 μm a 105 μm (primer plano). Tenga en cuenta el alto aislamiento de los tricomas acechados, con cabezas separadas y partes del tallo. Las flechas rojas indican tricomas cistolíticos, las flechas azules indican algunas partes del tallo de los tricomas glandulares capitados tallados, y las flechas amarillas indican células de disco separadas. Barras de escala = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Análisis de la integridad del ARN extraído de los tricomas. Cromatógrafos y geles de muestras de ARN extraídas de tricomas glandulares capitados y sésiles aislados utilizando el presente protocolo. Resultados para el ARN de (A-D) los tricomas acechados de las cuatro líneas de cultivares utilizadas en este estudio, CS-11, CS-12, CS-13 y CS-14, respectivamente, y (E-H) los tricomas sésiles, CS-11, CS-12, CS-13 y CS-14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Comparación de la expresión génica enriquecida con tricomas obtenida con RNAseq utilizando el presente protocolo con los resultados obtenidos por Livingston et al.14. Los 12 genes que muestran la mayor correlación con la expresión de ácido cannabidiólico sintasa (CBDAS) por Livingston et al.14 (de su Supplemental Table Data S4, adaptado con permiso de los editores de Wiley), considerados un marcador genético específico de tricomas, fueron elegidos para la comparación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Comparación de la expresión génica (FPKM) de cinco genes de actina de cannabis de tricomas aislados de tallo y sésil del presente protocolo (nuestros datos de expresión génica de la variedad de cannabis CS-1111 (Var CS-11)) con resultados previamente publicados adaptados de Livingston et al.14. Los resultados de Livingston et al.14 se presentaron a partir del genoma de referencia de Finola FN, y sus datos se tradujeron al genoma de referencia CS10.2. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Expresión génica (FPKM) de genes de unión a clorofila a-b de cannabis de inflorescencias enteras y tricomas acechados aislados del presente protocolo (nuestros datos de expresión génica de Var CS-11). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En comparación con los protocolos de aislamiento de tricomas actualmente disponibles, en el presente protocolo se describen dos modificaciones principales. Estos incluyen el desprendimiento de los tricomas del material vegetal utilizando hielo seco en el paso inicial y la sustitución de LN por el medio tampón líquido comúnmente utilizado. La primera modificación para la purificación de tricomas de C. sativa se basa en un protocolo anterior que introdujo el uso de hielo seco picado para separar los tricomas de los pedicelos de geranio5. Mientras que los protocolos tradicionales de aislamiento de tricomas generalmente usan un tubo de ensayo pequeño (50 ml), en este estudio se utilizó un vaso de precipitados de vidrio de 1 L con una cantidad generosa de hielo seco triturado, lo que permite procesar un mayor volumen de material vegetal inicial (hasta 10 g). Además, en el presente protocolo, se introdujeron dos pasajes adicionales de los tricomas a través de microtamices en el primer paso de aislamiento. El primer paso emplea un movimiento vertical de arriba y abajo vigoroso similar a un salero, y el segundo emplea un movimiento de tamizado horizontal a través del micro tamiz en el tamiz de harina. Se sugieren los movimientos combinados de tamizado horizontal y vertical para promover una separación mejorada basada en el tamaño y la forma del tricoma.
La segunda modificación, la más significativa, aborda el medio de aislamiento en el que se realiza el paso a través de los microtamices. En el presente protocolo, el medio de aislamiento acuoso convencional se sustituye completamente por LN. Un protocolo anterior8 también utilizó LN en el primer paso para el aislamiento de tricomas, separando los tricomas del material vegetal (rallando el material de la flor contra un tamiz de malla), pero continuó con una extracción de tampón líquido y separación de densidad Percoll. La sustitución de LN en lugar del medio de aislamiento convencional elimina la necesidad de procedimientos especiales asociados con los componentes tóxicos del medio de aislamiento convencional, lo que permite un flujo de trabajo relajado y un alto rendimiento.
Una característica clave del presente protocolo se basa en la propensión del hielo seco y el LN a sublimarse rápidamente a temperatura ambiente. Esta característica permite su aplicación generosa durante todo el proceso de aislamiento. Por el contrario, el uso de una gran cantidad del tampón de aislamiento convencional daría lugar a complicaciones técnicas relacionadas con el manejo de sus grandes volúmenes.
Mientras que el proceso de aislamiento en el presente protocolo promueve la retención de la frágil estructura de la cabeza del tricoma glandular capitado, los protocolos convencionales promueven la separación de las células del disco del material glandular restante, que se lava fácilmente, dejando solo las células del disco. Este fenómeno se puede ver claramente en nuestros resultados que comparan un protocolo de aislamiento convencional con nuestro nuevo protocolo (Figura 10D, E). Además de la observación microscópica, el análisis de calidad del ARN extraído de los tricomas (aislado mediante este protocolo) indica claramente que la integridad del ARN se conserva durante el proceso de aislamiento y que es adecuado para el análisis transcriptómico.
Además, los resultados de expresión génica de nuestra fracción aislada de tricomas indican que la fracción está altamente enriquecida en genes establecidos expresados en tricomas (Tabla 1) y, recíprocamente, que los genes no expresados en tricomas no están representados (Tabla 3).
La principal limitación del presente protocolo es su idoneidad exclusiva para aislar tricomas según su propensión a pasar a través de microtamices. Si bien el protocolo no se puede aplicar directamente al aislamiento de tricomas utilizando un gradiente de densidad, es adecuado para aislar los tricomas antes del paso de gradiente de densidad, si es necesario. En este estudio, los tricomas aislados utilizando este protocolo no se sometieron a una caracterización proteómica, y su idoneidad para tal aplicación debe ser verificada. Sin embargo, como las muestras de ARN extraídas de tricomas tallados y sésiles no mostraron degradación, como lo indican los comatógrafos y los altos valores de RIN, se puede suponer que los tricomas aislados con el presente protocolo probablemente cumplan con los requisitos necesarios para el análisis proteómico.
El grado de aislamiento (de la fuente inicial de la planta y otros tipos de tricomas) de los tricomas sésiles capitados glandulares de las hojas de abanico es muy alto, ya que las hojas de abanico carecen del tricoma glandular capitado tipo15,16, y los tricomas cistolíticos y bulbosos se aíslan fácilmente de los tricomas sésiles debido a sus diferencias estructurales y de tamaño. Sin embargo, con respecto al aislamiento de tricomas glandulares de tipo tallo capitado, es mejor abordar su grado de aislamiento como enriquecimiento, ya que la fuente de la planta, la inflorescencia femenina madura, contiene los cuatro tipos de tricomas, además del tipo pre-tallo14. Es lógico pensar que la mayoría de los tricomas capitados glandulares aislados son del tipo tallado, ya que su posición elevada (en relación con los tricomas sésiles unidos a la epiderma) aumenta la probabilidad de que colisionen con una partícula de hielo seco y se desprendan de la planta. Además, la coyuntura que conecta las partes de la cabeza y el tallo del tricoma acechado se considera un punto de debilidad asociado con la abscisión de la cabeza de la glándula17. Por lo tanto, sería exacto referirse a la porción de tricoma acechada como una fracción altamente enriquecida con una contaminación potencialmente baja del tipo sésil. Sin embargo, no se realizaron análisis adicionales para validar esta suposición.
La idoneidad del presente protocolo para extraer tricomas glandulares de otras especies vegetales aún no se ha determinado. La alta densidad de tricomas en C. sativa presumiblemente contribuye al éxito del presente protocolo. Sin embargo, parece poco probable que esta sea la única razón, ya que una fuente de material vegetal relativamente grande (hasta 10 g por ciclo de aislamiento) puede procesarse de manera efectiva. Otros estudios han presentado protocolos detallados para aislar diferentes tipos de tricomas de otras plantas, por ejemplo, tricomas de hojas de roseta de Arabidopsis thaliana18,19. Si bien la aplicabilidad del presente protocolo para aislar otros tipos de tricomas no se estudió en este trabajo, es probable que los elementos presentados en este trabajo, especialmente la sustitución del tampón de aislamiento por LN, mejoren el proceso de aislamiento de tricomas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo financiero de CannabiVar Ltd. Todo el material vegetal fue generosamente proporcionado por el profesor Hinanit Koltai del Centro Volcani, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
