Summary
Es wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Das Protokoll basiert auf einer trockenen, nicht pufferartigen Extraktion von Trichomen, bei der nur flüssiger Stickstoff, Trockeneis und Nylonsiebe verwendet werden, und eignet sich für die RNA-Extraktion und transkriptomische Analyse.
Abstract
In diesem Artikel wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Die Biosynthesewege für den Cannabinoid- und flüchtigen Terpenstoffwechsel sind hauptsächlich in den Cannabis-Trichomen lokalisiert, und isolierte Trichome sind für die Transkriptomanalyse von Vorteil. Die bestehenden Protokolle zur Isolierung von Drüsentrichomen für die transkriptomische Charakterisierung sind unpraktisch und liefern kompromittierte Trichomköpfe und eine relativ geringe Menge an isolierten Trichomen. Darüber hinaus sind sie auf teure Apparaturen und Isolationsmedien angewiesen, die Proteininhibitoren enthalten, um den RNA-Abbau zu vermeiden. Das vorliegende Protokoll schlägt vor, drei einzelne Modifikationen zu kombinieren, um eine große Menge an isolierten Drüsen-, Kopf-, Stiel- und sitzenden Trichomen aus reifen weiblichen Blütenständen bzw. Fächerblättern von C. sativa zu erhalten. Die erste Modifikation besteht darin, das herkömmliche Isolationsmedium durch flüssigen Stickstoff zu ersetzen, um den Durchgang der Trichome durch die Mikrosiebe zu erleichtern. Die zweite Modifikation beinhaltet die Verwendung von Trockeneis, um die Trichome von der Pflanzenquelle zu lösen. Bei der dritten Modifikation wird das Pflanzenmaterial nacheinander durch fünf Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße geleitet. Die mikroskopische Bildgebung zeigte die Wirksamkeit der Isolationstechnik für beide Trichomtypen. Darüber hinaus war die Qualität der RNA, die aus den isolierten Trichomen extrahiert wurde, für die nachgelagerte transkriptomische Analyse geeignet.
Introduction
Drüsen-Trichome sind haarähnliche Strukturen, die in Pflanzen vorkommen und viele sekundäre Metabolitenenthalten 1 und eine wertvolle Bank neuer biosynthetischer Gene und Enzymedarstellen 2. Bei Cannabis ist die Biosynthese der wichtigen Sekundärmetaboliten, Cannabinoide3 und Terpene4, in den Trichomen lokalisiert. In Anbetracht der Rolle der Trichome bei der Bestimmung der Qualität von Cannabis sowohl für medizinische als auch für Freizeitzwecke ist die Untersuchung der Trichom-Genexpression von Interesse. Um die Expression von trichomspezifischen Genen zu charakterisieren, müssen zunächst die interessierenden Trichome isoliert werden. Trichom-Isolationsprotokolle wurden erstmals 1992 beschrieben5, und ihre neuesten Entwicklungen wurden kürzlich überprüft2. Im Allgemeinen können Protokolle zur Extraktion von Drüsentrichomen zur transkriptomischen Charakterisierung in zwei verschiedene aufeinanderfolgende Schritte unterteilt werden. Der erste Schritt beinhaltet eine gründliche physikalische Trennung der Trichome vom Pflanzengewebe. Dieser Schritt kann durch die Verwendung von Trockeneis5, Glasperlen mit einer handelsüblichen Vorrichtung6,7, das Mahlen des Pflanzenmaterials gegen ein Maschensieb8 oder das Vortexen des Pflanzengewebes in einem Isolationspuffer9 durchgeführt werden. Der zweite Schritt beinhaltet eine verfeinerte Trennung der interessierenden Trichome von den mikroskopisch kleinen Pflanzenresten und/oder anderen Trichomtypen. Dieser Schritt kann mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation 8,10 oder Sieben verschiedener Größen 7,9 durchgeführt werden. Aufgrund der extremen Empfindlichkeit der RNA in prozessierten Geweben gegenüber Abbaustoffen werden diese beiden aufeinanderfolgenden Schritte in der Regel im eiskalten Isolationsmedium durchgeführt, oft in Gegenwart von Proteininhibitoren4.
Herkömmliche Trichom-Isolationsprotokolle erfordern neben den eiskalten Temperaturen auch große Mengen an Isolationsmedium, um ein effizientes Extraktionsverfahren zu gewährleisten. Die Kombination dieser Komponenten führt zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Isolationsprozess, der einen hohen Durchsatz verhindert. Die Präsentation eines einfachen, benutzerfreundlichen alternativen Protokolls zur Isolierung von Trichomen ist daher wahrscheinlich für verschiedene Aspekte im Zusammenhang mit der Trichomcharakterisierung von Vorteil. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, ein alternatives Protokoll zur Isolierung von gestielten und sitzenden Drüsen-Kopftrichomen aus Cannabis sativa anzubieten, indem mehrere Elemente aus den konventionellen Protokollen kombiniert und integriert werden. Zu diesen Elementen gehören Trockeneis5, das Durchlaufen der Trichome durch mehrere Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße 7,9 und die Substitution des Isolationsmediums8 durch flüssigen Stickstoff (LN).
Die Neuartigkeit des vorliegenden Trichom-Isolationsprotokolls im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen zeigt sich in vielerlei Hinsicht. Dieses Protokoll ist praktisch, da es keine gefährlichen Komponenten benötigt. Das Verfahren kann mit minimalen Vorsichtsmaßnahmen im Labor durchgeführt werden und ermöglicht einen hohen Durchsatz. Durch den Ersatz des flüssigen Standard-Isolationsmediums durch LN wird die Integrität der Trichome während des gesamten Isolationsprozesses sichergestellt und eine anschließende transkriptomische Analyse ermöglicht. Nach der Sublimation des LN und des Trockeneises bleiben die isolierten Trichome frei von schädlichen Rückständen. Darüber hinaus ermöglicht die Neigung von LN, bei Raumtemperatur zu sublimieren, seine großzügige Verwendung im gesamten Protokoll. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung großer Mengen herkömmlicher Isolationsmedien zu praktischen Schwierigkeiten bei der Handhabung. Schließlich verringert das Protokoll die Trennung der Bandscheibenzelle von der verbleibenden zerbrechlichen Kopfstruktur des Drüsentrichoms und ermöglicht so die Beibehaltung des Kopfrauminhalts.
Dieses Protokoll wird in einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, um die technische Praxis der Isolierung von C. sativa-Drüsen-Kopftrichomen zu unterstützen . Das Protokoll bietet einen überschaubaren Arbeitsablauf, der zu isolierten Trichomen mit einer hohen Konzentration und Reinheit führt, die für die nachgelagerte molekulare Analyse geeignet sind.
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Protocol
HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Pflanzenmaterial bestand aus vier C. sativa-ARO-Volcani-Stämmen (CS-11, CS-12, CS-13 und CS-14 ), die im Volcani Center, Israel, angebaut wurden, wie an anderer Stelle beschrieben11. Drüsige Trichome mit Stielstielen wurden aus reifen Blütenständen isoliert, und drüsige sitzende Trichome wurden aus großen Fächerblättern von reifen, nicht blühenden Mutterpflanzen isoliert. Sämtliches Pflanzenmaterial wurde frisch gepflückt und sofort bei −80 °C gelagert.
ACHTUNG: Trockeneis und LN werden im gesamten Protokoll verwendet. Diese Stoffe sind äußerst gefährlich. Die isolierten Trichome können Trockeneispartikel enthalten, die gefährlichen Gasdruck erzeugen können, wenn sie in versiegelte Röhrchen eingeführt werden. Daher sollten alle Kappen mit Nadel punktiert werden. Die Verwendung einer Schutzbrille, geeigneter Laborkleidung und Handschuhen für die Handhabung bei extrem niedrigen Temperaturen wird dringend empfohlen.
1. Aufbau für die anfängliche Trennung der Trichome vom Pflanzenmaterial
- Zerkleinern Sie einen Trockeneisblock mit einem Hammer und einem harten, flachen Gegenstand in einem 5-Liter-Kunststoffbehälter in kleine feine Flocken.
- Die feinen Trockeneisflocken (kleiner als 5 mm) mit einem großen Sieb (über Poren kleiner als 5 mm) aus dem nicht zerkleinerten Trockeneis in einen weiteren 5-Liter-Kunststoffbehälter sieben. Gießen Sie ca. 200cm3 (200-ml-Markierung) der Trockeneisflocken in einen aufrechten 1-Liter-Glasbecher.
- Geben Sie bis zu 10 g gefrorene C. sativa-Blütenstände (im Folgenden als Pflanzenmaterial bezeichnet) auf die erste Schicht zerkleinertes Trockeneis und bedecken Sie sie mit einer zusätzlichen Schicht von 200cm3 fein zerkleinertem Trockeneis.
- Decken Sie die Öffnung des 1-Liter-Glasbechers mit zwei bis drei Schichten eines 1-mm-Moskitonetzes für die Fliegengittertür ab und befestigen Sie es mit Gummibändern an den Außenseiten des Glasbechers (Abbildung 1).
- Gießen Sie LN in einen großen Edelstahlbehälter mit rundem Boden (siehe Materialtabelle), in dem die isolierten Trichome gesammelt werden.
- Setzen Sie ein 350 μm großes Sieb in ein Mehlsieb ein, um das Mehlsiebgewebe von unten abzudecken (Abbildung 2). Wenn ein Mehlsieb mit abnehmbarem Kunststoffring vorhanden ist, setzen Sie das 350 μm große Sieb so ein, dass es unter dem Sieb des Mehlsiebs befestigt ist. Wenn nicht, befestigen Sie die 350 μm Maschenweite mit Gummibändern am Umfang des Mehlsiebs.
- Stellen Sie das Mehlsieb über den großen, mit LN gefüllten Edelstahlbehälter mit rundem Boden (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die Breite des Behälters die des Mehlsiebs überschreitet, um den Verlust der gesiebten Masse außerhalb des Edelstahlbehälters mit rundem Boden zu minimieren.
2. Abtrennung der Trichome vom Pflanzenmaterial
- Schütteln Sie das 1-Liter-Glas mit der Öffnung nach unten zum Mehlsieb wie mit einem großen Salzstreuer (Abbildung 4).
- Stellen Sie den 1-Liter-Glasbecher alle 2-3 Minuten beiseite, damit das zerkleinerte Trockeneis und das Pflanzenmaterial, das sich auf dem Mehlsieb angesammelt hat, gesiebt werden können.
- Sieben Sie das Mehlsieb horizontal, um den Durchgang des Pflanzenmaterials in das LN im Edelstahlbehälter mit rundem Boden zu erleichtern.
- LN in den Edelstahlbehälter geben und zerkleinertes Trockeneis in den 1-Liter-Glasbecher geben, wenn der Füllstand zur Neige geht. Füllen Sie das verbrauchte Pflanzenmaterial im Glasbecher mit zusätzlichen 10 g frischem Pflanzenmaterial auf, wenn das Pflanzenmaterial auf dem Mehlsieb aufgebraucht ist. Der Nachschub muss in der Regel nicht mehr als zweimal wiederholt werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4, bis eine ausreichende Menge angereicherter Trichome im Edelstahlbehälter mit rundem Boden gesammelt wurde. In der Regel sind 20 g frisches Pflanzenmaterial für die RNA-Extraktion und Transkriptomanalyse ausreichend.
- Vergewissern Sie sich, dass sich am Boden des Edelstahlbehälters, der in das LN getaucht ist, eine weiße, pulverartige Substanz (bestehend aus Pflanzenresten, Drüsentrichomen und zerkleinertem Trockeneis) befindet. Eine mikroskopische Beobachtung hilft festzustellen, ob eine ausreichende Menge an Trichomen gesammelt wurde. Dieser Schritt kann jedoch den Ablauf des Protokolls behindern. In der Regel reichen 10-20 g anfängliches Pflanzenmaterial für die meisten Isolierungen aus; Es kann jedoch Unterschiede in der Trichomdichte der Pflanzen geben.
HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt kann das Experiment angehalten und später erneut gestartet werden. Bei einer kurzen Pause sollten ausreichende Mengen LN hinzugefügt werden, damit die Trichome unter Wasser bleiben. Alternativ können die Trichome gesammelt und bis zu 3 Monate bei −80 °C für die spätere Verwendung gelagert werden, wie in Schritt 5 beschrieben.
3. Trennung von drüsigen Kopftrichomen (gestielt und sitzend) von anderen Trichomtypen, wie z. B. bauchigen und zystolithischen Trichomen und Trümmern
- Geben Sie eine kleine Menge LN in einen sauberen kleinen Edelstahlbehälter mit rundem Boden.
- Falten Sie ein 40 cm x 40 cm großes Mikrosieb mit einer Maschenweite von 150 μm zweimal, um einen Falz von 20 cm x 20 cm zu erhalten, und öffnen Sie es. Stellen Sie sicher, dass es einer kegelförmigen Form ähnelt (Abbildung 5).
- Befestigen Sie den Maschenkegel mit einer oder zwei Wäscheklammern am Rand des Edelstahlbehälters mit rundem Boden, so dass der geöffnete Teil des Kegels aufrecht steht und sein spitzer Teil teilweise in das LN eingetaucht ist.
- Gießen Sie das LN und die weiße, pulverförmige Substanz aus Schritt 2.6 vorsichtig in den Mikrosiebkegel.
- Tragen Sie vorsichtig einen breiten Pinsel auf, um das restliche Pflanzenmaterial aus dem ersten Behälter zu sammeln und in den 150 μm großen Maschenkegel zu übertragen.
- Geben Sie mehr LN in den ersten Behälter und wiederholen Sie die Bürstbewegung, bis das gesamte Pflanzenmaterial in den Mikrosiebkegel übergegangen ist.
- Löse die Wäscheklammer vorsichtig vom Deckel des Behälters und öffne den Mikrosiebkegel, so dass sich die Trichome in der Mitte des geöffneten Mikrosiebs befinden. Halten Sie alle vier Ecken des Mikrosiebs zusammen, so dass der mittlere Teil, der die Trichome enthält, im LN eingetaucht bleibt (Abbildung 6).
- Während Sie alle vier Ecken des Mikrosiebs festhalten, tauchen und schütteln Sie das Mikrosieb vorsichtig in das LN im Stahlbehälter, als ob Sie einen Teebeutel aufgießen würden. Setzen Sie diese Tauch-/Schüttelbewegung (vertikal und horizontal) 1 Minute lang fort. Es gibt einen Kompromiss zwischen der Qualität und der Quantität der Isolierung. Längere Tauchbewegungen können zu größeren Mengen an Trichomen führen, aber ihr Isolationsgrad kann schlechter sein. Insgesamt wird 1 Minute sowohl für die Qualität als auch für die Quantität als ausreichend empfohlen.
HINWEIS: Diese Siebbewegung ist der kritischste Teil des Protokolls und sollte entsprechend ausgeführt werden. - Optional: Schaufeln Sie die nicht gesiebten Pflanzenreste und größeren Trichome (die noch in das LN getaucht sind), die in der Mitte des Mikrosiebs eingewickelt sind, in ein 13-ml- oder 50-ml-Reagenzglas und lagern Sie sie bei −80 °C für die zukünftige Verwendung.
VORSICHT: Um die Ansammlung von Druckgas (aus Trockeneis und LN-Rückständen) zu vermeiden, stechen Sie mit einer sterilisierten Nadel ein Loch in die Kappe des Reagenzglases. Die Kappe kann ausgetauscht werden, sobald der Druck nachgelassen hat, was in der Regel nach 24 Stunden der Fall ist.
4. Passieren von Trichomen durch Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße
- Übertragen Sie die gesiebten Trichomen, die in das LN am Boden des kleinen Edelstahlbehälters mit rundem Boden getaucht sind, nacheinander durch Mikrosiebe mit abnehmenden Porengrößen (105 μm, 80 μm, 65 μm und 50 μm), auf die gleiche Weise wie in Schritt 3 dargestellt.
5. Entnahme der gewünschten Trichome
- Entfernen Sie die gewünschten Trichome, die in das LN getaucht und mit einem vorgekühlten (in LN) Löffel in das 50-μm-Mikrosieb eingewickelt sind. Legen Sie sie auf einen sauberen Teller.
Anmerkungen: In dieser letzten Isolationsphase werden die gewünschten Trichome aus dem Sieb entnommen. - Übertragen Sie die pulverförmigen Trichome schnell in ein markiertes, vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen über einen vorgekühlten Spatel oder eine in das Röhrchen eingeführte Scoopula (Abbildung 7). Lagern Sie die Röhrchen sofort bei −80 °C für weitere Untersuchungen.
HINWEIS: Ein schematisches Arbeitsablaufdiagramm, das das gesamte Isolationsprotokoll darstellt, ist in Abbildung 8 dargestellt.
6. Beobachtung und Analyse der gereinigten Trichome
- Geben Sie eine kleine Menge (10 mg) isolierter Trichome mit einem vorgekühlten (über LN) Spatel auf einen Objektträger. Fügen Sie einen Tropfen Wasser hinzu und beobachten Sie direkt auf einem Lichtmikroskop, ohne zu verfärben. Bewerten Sie den Gesamtisolations- und Kontaminationsgrad mit niedrigen (10x) und hohen (40x) Vergrößerungen. Die Anreicherung wird visuell anhand der relativen Menge an Trichomen in Bezug auf Nicht-Trichomgewebe geschätzt, wie in Abbildung 9 dargestellt.
- Führen Sie eine RNA-Extraktion und Qualitätsanalyse von 50 mg isolierten C. sativa-Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen durch.
HINWEIS: Für die RNA-Extraktion wurde ein kommerzielles Extraktionskit (siehe Materialtabelle) verwendet, das eine Poly-A-basierte Strategie der mRNA-Aufreinigung verwendet.- 50 mg der isolierten Trichome in der Lyselösung resuspendieren, 30 s lang wirbeln, 5 min lang in einem eiskalten Ultraschallreinigungsgerät bei 35 kHz beschallen und die mRNA gemäß dem Protokoll des Herstellers aus den Proben extrahieren (siehe Materialtabelle).
- Um die Integrität der aus den Trichomen extrahierten RNA abzuschätzen, bestimmen Sie die RNA-Konzentration, die Gesamtmenge und die RNA-Integritätszahl (RIN) mit einem Lab-on-a-Chip-System (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine RNAseq-Analyse der Trichomfraktionen durch (optional). RNAseq-Analysen und bioinformatische Analysen von sequenzierten Reads können mit Standard-Outsourcing-Diensten durchgeführt werden
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Representative Results
Die wichtigste Änderung, die in diesem Protokoll im Vergleich zu herkömmlichen Trichom-Isolationsprotokollen enthalten ist, besteht darin, das Standard-Isolationsmedium durch LN zu ersetzen. Die Verwendung von LN als Isolationsmedium ermöglicht einen entspannten Arbeitsablauf, denn solange die Proben in LN eingetaucht sind, ist kein metabolischer Abbau wahrscheinlich. Da das Protokoll außerdem die gefährlichen Komponenten (d. h. Aurintricarbonsäure und β-Mercaptoethanol) vermeidet, die in herkömmlichen Trichom-Isolationsmedien verwendet werden, ist die Arbeit nicht auf eine chemische Haube beschränkt. Dennoch ist es wichtig, beim Umgang mit Trockeneis und LN die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.
Um die Vorteile des vorliegenden Protokolls zu bewerten, wurden die Ergebnisse der Trichomisolierung aus dem vorliegenden Protokoll mit denen verglichen, die mit einem konventionellen Trichomisolationsverfahren (bei dem ein wässriger Puffer, Glasperlen und ein feines Sieb zur Trichomisolierung verwendet wurden)12 verglichen, wobei zunächst ein Lichtmikroskop verwendet wurde. Ein Vergleich der Komponenten aus verschiedenen Isolationsphasen mittels lichtmikroskopischer Inspektion verdeutlicht den zunehmenden Trichom-Isolationsgrad im Laufe des Isolationsprozesses. In der Anfangsphase des Isolationsprozesses (105-150 μm Mikrosieb) waren im isolierten Teil überwiegend Blattgewebestücke (Abbildung 9A), im Gegensatz zum endgültigen Isolationsprodukt, das fast ausschließlich aus isolierten Trichomen bestand (Abbildung 9C). Es sollte darauf geachtet werden, dass die isolierten Proben kontaminationsfrei sind (Abbildung 9B).
Obwohl die Trichomdichte in dieser Studie nicht quantifiziert wurde, kann die Qualität der isolierten drüsigen Kopfstiele und der sitzenden Trichome im letzten Isolationsschritt in Abbildung 10 beobachtet werden. Die Reinheit kann mit der Reinheit verglichen werden, die mit der Trichomisolierung unter Verwendung eines herkömmlichen Protokolls12 erzielt wird (Abbildung 10C). Im vorliegenden Protokoll wird die empfindliche Struktur des gestielten Trichomkopfes beibehalten und die gesamten Köpfe des isolierten gestielten Trichoms sind sichtbar (Abbildung 10D), während bei Verwendung des herkömmlichen Protokolls die vollständige Struktur des Trichomkopfes fehlt und nur die Bandscheibenzellen vorhanden sind (Abbildung 10E). Auch die Ausbeute kann stark gesteigert werden, da durch den Einsatz von Trockeneis und LN die Begrenzung des zu gewinnenden Pflanzenmaterials vermieden wird. Ein weiterer Vorteil unseres nicht-wässrigen Protokolls besteht darin, dass nur Trockeneis und LN verwendet werden und daher nach dem Verdampfen keine Restbestandteile des Isolationsmediums zurückbleiben. Die Verwendung von LN verhindert die Freisetzung von klebrigen Sekundärmetaboliten, die zur Aggregation der Trichomeführen können 13. Im vorliegenden Protokoll wurden die isolierten Trichome im letzten Isolationsschritt als trockenes, feines Pulver zurückgewonnen.
Die extrem niedrigen Temperaturen, die während des gesamten vorliegenden Protokolls aufrechterhalten werden, werden wahrscheinlich ausreichen, um die Ziele herkömmlicher Puffermedien zu erreichen, die den RNA-Abbau verhindern (solange die Proben unter Wasser bleiben) und nachgeschaltete molekulare Anwendungen zu erleichtern. Um diese Annahme zu validieren, extrahierten wir RNA aus den isolierten Trichomen und schätzten die RNA-Integrität mit Hilfe kommerziell erhältlicher Kits. Die erhaltenen hohen RIN-Werte (9,4 bis 10) und die ausgeprägte Gelchromatographie (Abbildung 11) weisen eindeutig auf eine hohe RNA-Integrität hin. Die RNA-Proben wurden mit RNAseq weiter analysiert und aus allen Bibliotheken wurden >20 M High-Quality-Reads erhalten.
Um zu bestätigen, dass die mRNA aus der Fraktion der isolierten Trichome tatsächlich mit Trichom-exprimierten Genen angereichert ist, verglichen wir unsere Genexpressionsergebnisse für den Blütenstand und die entsprechenden isolierten gestielten Trichome mit früheren Ergebnissen von Livingston et al.14, die die Genexpression von gereinigten Trichomen von Cannabis charakterisierten (adaptiert aus ihrer ergänzenden Tabelle 1 ). Ihr Protokoll bestand aus dem Mischen in wässrigem Puffer, dem Filtern durch Siebe und schließlich der Trichomreinigung mit einem Percoll-Gradienten. Trichom-exprimierte Gene wurden als diejenigen charakterisiert, die am stärksten mit der Genexpression der Cannabidiolsäuresynthase (CBDAS), einem trichomspezifischen Genmarker14, korrelierten (p > 0,95). Der Vergleich der Genexpression zwischen den Ergebnissen, die mit dem vorliegenden Protokoll erzielt wurden, und denen, die in Livingston et al.14 vorgestellt wurden, zeigt, dass die 12 am höchsten angereicherten Gene in unserer Trichomfraktion auch in der Studievon Livingston et al. 14 angereichert waren, einschließlich des Trichom-Markergens CBDAS (Tabelle 1). Bemerkenswert ist, dass mit dem vorliegenden Protokoll ein signifikant höheres Anreicherungsverhältnis erzielt wurde. Diese Ergebnisse bestätigen die Validität des vorliegenden Protokolls zur Untersuchung der mit Trichomen angereicherten Genexpression.
Darüber hinaus verglichen wir die Expressionsdaten von fünf Aktin-Genen von Cannabis, da Aktin häufig als Referenzgen für Transkriptomstudien verwendet wird (Tabelle 2). Unsere Ergebnisse sowohl für die isolierten gestielten als auch für die sitzenden Trichome waren vergleichbar mit denen, die in der Studie von Livingston et al.14 berichtet wurden.
Schließlich berechneten wir die Expressions- und Trichomanreicherungsdaten für die Gene der Chlorophyll a-b-bindenden Proteinfamilie, die vermutlich nicht mit Trichomen angereichert sind (Tabelle 3). Tatsächlich zeigten die 12 Mitglieder dieser Genfamilie einen Trichomanreicherungsfaktor von <1, der als Negativkontrolle für die Trichomanreicherung diente. Diese kombinierten Ergebnisse deuten auf die einzigartigen Expressionsmuster des Blütenstandes und der isolierten Trichomfraktionen hin und unterstützen die Trichomintegrität und -qualität der isolierten Trichomfraktion.
Abbildung 1: Aufbau für die Beschickung des 1-Liter-Glasbechers. Das 1 mm starke Gitter der Fliegengittertür wird mit einigen Gummibändern (nicht abgebildet) an den Seiten des Glasbechers befestigt. Der 1-Liter-Glasbecher sollte in aufrechter Position eingelegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Aufbau des Mehlsichters. Das Mehlsieb ist mit einem 350 μm Mikrosieb über Gummibänder an der Unterseite (nicht abgebildet) ausgestattet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Aufbau des ersten Schritts der Trichomisolierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Aufbau des Glasbechers. Der Glasbecher ist mit drei Schichten 1 mm starkem Fliegengitter (Moskito) ausgestattet, das an der Öffnung mit Gummibändern gesichert ist. Die Öffnung des Bechers zeigt nach unten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Aufbau der Mikrosiebkegelstruktur, die für die Trichomisolierung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Aufbau für die Tauch- und Schüttelbewegung des Mikrosiebs mit isolierten Trichomen. Die horizontale/vertikale Bewegung sollte einem Teebeutelaufguss ähneln. Der Aufbau ist für jede verwendete Maschenweite identisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Aufbau für die Übertragung der endgültigen isolierten Trichomen. Die schließlich isolierten Trichome werden in ein markiertes 1,5-ml-Röhrchen überführt. Alle Utensilien sollten mit LN vorgekühlt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Flussdiagramm, das das Protokoll skizziert. Die Isolierung von Drüsen-Kopf-Trichomen von C. Sativa umfasst drei Schritte: (1) die anfängliche Ablösung der Trichome von der Pflanzenquelle und die Passage über zwei Siebe (1 mm und 350 μm), (2) das Passieren des Pflanzenmaterials über fünf Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm und 50 μm) und (3) das Sammeln der isolierten Trichome in ein vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen. Zurückgehaltenes Gewebe aus jeder der Mikrosiebstufen kann in ähnlicher Weise entnommen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Mikroskopische Aufnahmen der isolierten Trichome unter Verwendung des aktuellen Protokolls. (A,B,C) Drüsige kopfförmige, sitzende Trichome aus C. sativa-Fächerblättern. (A) Mittlere Isolation aus Mikrosieben mit Porengrößen von 105 μm bis 150 μm. Beachten Sie die Retention großer Mengen an grünem, nicht-trichomigem Material. (B) Ende der Isolierung von Mikrosieben mit Porengrößen von 50 μm bis 65 μm, die mit pflanzlicher Quelle (roter Pfeil) kontaminiert und (C) frei von Verunreinigungen sind. Maßstabsbalken = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Mikroskopische Aufnahmen der isolierten Trichomen. (A,B) Drüsige Kopftrichome von C. sativa: (A) gestielter Typ, isoliert mit dem aktuellen Protokoll, und (B) sessiler Typ, isoliert mit dem aktuellen Protokoll. (C) Gestielte Trichomen, die mit einem konventionellen Protokoll isoliert wurden. Der geringe Ertrag und das Fehlen von kompromisslosen Köpfen der Trichome sind offensichtlich. (D,E) Gestielte Drüsen-Kopftrichome, isoliert unter Verwendung von (D) dem vorliegenden Protokoll und (E) dem konventionellen Protokoll. (F) Drüsige gestielte Trichomen, isoliert von 65 μm bis 105 μm Mikrosieben (Nahaufnahme). Beachten Sie die hohe Isolation der gestielten Trichome mit abgetrennten Köpfen und Stielteilen. Die roten Pfeile zeigen zystolithische Trichome an, die blauen Pfeile zeigen einige Stielteile der gestielten Trichome des Drüsenkopfes und die gelben Pfeile zeigen getrennte Bandscheibenzellen an. Maßstabsbalken = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Analyse der Integrität der aus den Trichomen extrahierten RNA. Chromatographien und Gele von extrahierten RNA-Proben aus gestielten und sitzenden Trichomen des Drüsenkopfes, die unter Verwendung des vorliegenden Protokolls isoliert wurden. Ergebnisse für die RNA von (A-D) den gestielten Trichomen der vier in dieser Studie verwendeten Sortenlinien CS-11, CS-12, CS-13 und CS-14 bzw. (E-H) der sitzenden Trichome CS-11, CS-12, CS-13 und CS-14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Vergleich der mit Trichomen angereicherten Genexpression, die mit RNAseq unter Verwendung des vorliegenden Protokolls erhalten wurde, mit den Ergebnissen von Livingston et al.14. Die 12 Gene, die die höchste Korrelation mit der Expression der Cannabidiolsäuresynthase (CBDAS) von Livingston et al.14 aufweisen (aus ihren Supplemental Table Data S4, angepasst mit Genehmigung des Wiley-Verlags), die als trichomspezifische Genmarker gelten, wurden zum Vergleich ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Vergleich der Genexpression (FPKM) von fünf Cannabis-Aktin-Genen von isolierten gestielten und sitzenden Trichomen aus dem vorliegenden Protokoll (unsere Genexpressionsdaten der Cannabissorte CS-11 11 (Var CS-11)) mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen, die von Livingston et al.14 adaptiert wurden. Die Ergebnisse von Livingston et al.14 wurden auf der Grundlage des Finola FN-Referenzgenoms vorgestellt und ihre Daten in das CS10.2-Referenzgenom übersetzt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Genexpression (FPKM) von Cannabis Chlorophyll a-b bindenden Genen ganzer Blütenstände und isolierter gestielter Trichome aus dem vorliegenden Protokoll (unsere Genexpressionsdaten von Var CS-11). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Trichom-Isolationsprotokollen werden im vorliegenden Protokoll zwei wesentliche Modifikationen beschrieben. Dazu gehört das Ablösen der Trichome vom Pflanzenmaterial mit Hilfe von Trockeneis im ersten Schritt und das Ersetzen des üblicherweise verwendeten flüssigen Puffermediums durch LN. Die erste Modifikation für die Reinigung von C. sativa-Trichomen basiert auf einem früheren Protokoll, das die Verwendung von zerkleinertem Trockeneis zur Ablösung der Trichome von Geranienstielen einführte5. Während herkömmliche Protokolle zur Isolierung von Trichomen in der Regel ein kleines (50 ml) Reagenzglas verwenden, wurde in dieser Studie ein 1-Liter-Glasbecherglas mit einer großzügigen Menge zerkleinertem Trockeneis verwendet, wodurch ein größeres Volumen des ursprünglichen Pflanzenmaterials (bis zu 10 g) verarbeitet werden konnte. Darüber hinaus wurden im vorliegenden Protokoll im ersten Isolationsschritt zwei zusätzliche Passagen der Trichome durch Mikrosiebe eingeführt. Im ersten Schritt wird eine vertikale, kräftige Salzstreuer-ähnliche Bewegung auf und ab bewegt, und im zweiten Schritt wird eine horizontale Siebbewegung durch das Mikrosieb im Mehlsieb durchgeführt. Die kombinierten horizontalen und vertikalen Siebbewegungen werden vorgeschlagen, um eine verbesserte Trennung basierend auf der Größe und Form der Trichome zu fördern.
Die zweite, bedeutendste Modifikation betrifft das Isolationsmedium, in dem die Passage durch die Mikrosiebe erfolgt. Im vorliegenden Protokoll wird das herkömmliche wässrige Isolationsmedium vollständig durch LN ersetzt. Ein früheres Protokoll8 verwendete LN ebenfalls im ersten Schritt für die Trichomisolierung, indem Trichome vom Pflanzenmaterial getrennt wurden (indem das Blütenmaterial gegen ein Maschensieb gerieben wurde), fuhr aber mit einer Flüssigpufferextraktion und einer Percoll-Dichtetrennung fort. Durch den Ersatz von LN anstelle des herkömmlichen Isolationsmediums entfallen spezielle Verfahren, die mit den toxischen Komponenten des herkömmlichen Isolationsmediums verbunden sind, was einen entspannten Arbeitsablauf und einen hohen Durchsatz ermöglicht.
Ein wesentliches Merkmal des vorliegenden Protokolls beruht auf der Neigung von Trockeneis und LN, bei Raumtemperatur schnell zu sublimieren. Diese Eigenschaft ermöglicht eine großzügige Anwendung während des gesamten Isolationsprozesses. Im Gegensatz dazu würde die Verwendung einer großen Menge des herkömmlichen Isolationspuffers zu technischen Komplikationen bei der Handhabung seiner großen Volumina führen.
Während der Isolationsprozess im vorliegenden Protokoll die Beibehaltung der zerbrechlichen Kopfstruktur des Drüsen-Kopfstiel-Trichoms fördert, fördern die konventionellen Protokolle die Trennung der Bandscheibenzellen vom verbleibenden Drüsenmaterial, das leicht weggespült werden kann, so dass nur die Bandscheibenzellen übrig bleiben. Dieses Phänomen zeigt sich deutlich in unseren Ergebnissen, die ein herkömmliches Isolationsprotokoll mit unserem neuen Protokoll vergleichen (Abbildung 10D,E). Neben der mikroskopischen Betrachtung zeigt die Qualitätsanalyse der aus den Trichomen extrahierten RNA (isoliert mit diesem Protokoll) deutlich, dass die RNA-Integrität während des Isolationsprozesses erhalten bleibt und dass sie für die transkriptomische Analyse geeignet ist.
Darüber hinaus deuten die Genexpressionsergebnisse unserer isolierten Trichomfraktion darauf hin, dass die Fraktion stark mit etablierten Trichom-exprimierten Genen angereichert ist (Tabelle 1) und umgekehrt, dass nicht-trichom-exprimierte Gene nicht repräsentiert sind (Tabelle 3).
Die Haupteinschränkung des vorliegenden Protokolls ist seine ausschließliche Eignung zur Isolierung von Trichomen entsprechend ihrer Neigung, durch Mikrosiebe zu gehen. Obwohl das Protokoll nicht direkt auf die Trichomisolierung mit einem Dichtegradienten angewendet werden kann, eignet es sich bei Bedarf zur Isolierung der Trichome vor dem Dichtegradientenschritt. In dieser Studie wurden die mit diesem Protokoll isolierten Trichome keiner proteomischen Charakterisierung unterzogen, und ihre Eignung für eine solche Anwendung muss überprüft werden. Da die RNA-Proben, die sowohl aus gestielten als auch aus sessilen Trichomen extrahiert wurden, jedoch keinen Abbau aufwiesen, wie die Chomatographen und die hohen RIN-Werte zeigen, kann davon ausgegangen werden, dass die mit dem vorliegenden Protokoll isolierten Trichome wahrscheinlich die für die proteomische Analyse erforderlichen Anforderungen erfüllen.
Der Isolationsgrad (von der ursprünglichen Pflanzenquelle und anderen Arten von Trichomen) der sessilen Trichome des Drüsen aus den Fächerblättern ist sehr hoch, da den Fächerblättern die gestielten Trichome des Drüsen fehlen15,16, und die zystolithischen und bauchigen Trichome aufgrund ihrer Struktur- und Größenunterschiede leicht von den sitzenden Trichomen isoliert werden können. Im Hinblick auf die Isolierung von drüsigen Trichomen mit gestieltem Kopfstiel ist es jedoch am besten, ihren Isolationsgrad als Anreicherung zu betrachten, da die Pflanzenquelle, der reife weibliche Blütenstand, neben dem Vorstieltyp14 alle vier Trichomtypen enthält. Es liegt auf der Hand, dass die meisten der isolierten Drüsen-Trichome vom gestielten Typ sind, da ihre erhöhte Position (in Bezug auf die epidermal gebundenen sessilen Trichomen) die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sie mit einem Trockeneispartikel kollidieren und sich von der Pflanze lösen. Darüber hinaus wird die Verbindungsstelle, die die Kopf- und Stielteile des gestielten Trichoms verbindet, als ein Schwachpunkt angesehen, der mit der Abszision des Drüsenkopfesverbunden ist 17. Daher wäre es korrekt, den gestielten Trichomanteil als eine hochangereicherte Fraktion mit potenziell geringer Kontamination des sitzenden Typs zu bezeichnen. Es wurden jedoch keine weiteren Analysen durchgeführt, um diese Annahme zu bestätigen.
Die Eignung des vorliegenden Protokolls zur Extraktion von Drüsentrichomen aus anderen Pflanzenarten muss noch geklärt werden. Die hohe Trichomdichte in C. sativa trägt vermutlich zum Erfolg des vorliegenden Protokolls bei. Es erscheint jedoch unwahrscheinlich, dass dies der alleinige Grund ist, da eine relativ große Pflanzenmaterialquelle (bis zu 10 g pro Isolationszyklus) effektiv verarbeitet werden kann. Andere Studien haben detaillierte Protokolle für die Isolierung verschiedener Trichomtypen aus anderen Pflanzen vorgestellt, z. B. Rosettenblatt-Trichome aus Arabidopsis thaliana18,19. Während die Anwendbarkeit des vorliegenden Protokolls zur Isolierung anderer Trichomtypen in dieser Arbeit nicht untersucht wurde, sind die in dieser Arbeit vorgestellten Elemente, insbesondere die Substitution des Isolationspuffers durch LN, wahrscheinlich, dass sie den Prozess der Trichomisolierung verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung von CannabiVar Ltd. Das gesamte Pflanzenmaterial wurde großzügigerweise von Professor Hinanit Koltai vom Volcani Center, Israel, zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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