Summary
En protokoll presenteres for praktisk og høy gjennomstrømningsisolasjon og anrikning av kjertelkapitat, stilkede og sessile trikomer fra Cannabis sativa. Protokollen er basert på en tørr, ikke-bufferekstraksjon av trikomer ved bruk av bare flytende nitrogen, tørris og nylonsikt og er egnet for RNA-ekstraksjon og transkriptomisk analyse.
Abstract
Dette papiret presenterer en protokoll for praktisk og høy gjennomstrømningsisolasjon og anrikning av kjertelkapitat stilket og sessile trichomes fra Cannabis sativa. De biosyntetiske veiene for cannabinoid og flyktig terpenmetabolisme er lokalisert primært i cannabistrikomer , og isolerte trikomer er gunstige for transkriptomanalyse. De eksisterende protokollene for isolering av kjerteltrikomer for transkriptomisk karakterisering er ubeleilige og leverer kompromitterte trikomhoder og en relativt lav mengde isolerte trikomer. Videre er de avhengige av dyre apparater og isolasjonsmedier som inneholder proteinhemmere for å unngå RNA-nedbrytning. Den nåværende protokollen foreslår å kombinere tre individuelle modifikasjoner for å oppnå en stor mengde isolert glandular capitate stilket og sessile trichomes fra C. sativa modne kvinnelige blomsterstander og vifteblader, henholdsvis. Den første modifikasjonen innebærer å erstatte flytende nitrogen for det konvensjonelle isolasjonsmediet for å lette passasjen av trikomer gjennom mikrosiktene. Den andre modifikasjonen innebærer bruk av tørris for å løsne trikomene fra plantekilden. Den tredje modifikasjonen innebærer å føre plantematerialet fortløpende gjennom fem mikrosiler med avtagende porestørrelser. Mikroskopisk avbildning demonstrerte effektiviteten av isolasjonsteknikken for begge trichometyper. I tillegg var kvaliteten på RNA ekstrahert fra de isolerte trikomene passende for nedstrøms transkriptomisk analyse.
Introduction
Glandulære trikomer er hårlignende strukturer som finnes i planter som inneholder mange sekundære metabolitter1 og representerer en verdifull bank med nye biosyntetiske gener og enzymer2. I cannabis er biosyntesen av de viktige sekundære metabolittene, cannabinoider3 og terpener4, lokalisert i trikomene. Tatt i betraktning trikomenes rolle i å bestemme kvaliteten på cannabis både for medisinsk og rekreasjonsbruk, er studien av trichome-genuttrykk av interesse. For å karakterisere uttrykket av trichome-spesifikke gener, må trikomene av interesse først isoleres. Trichomes isolasjonsprotokoller ble først beskrevet så tidlig som i 19925, og deres siste utvikling har nylig blitt gjennomgått2. Generelt kan protokoller for ekstrahering av kjerteltrikomer for transkriptomisk karakterisering deles inn i to forskjellige sekvensielle trinn. Det første trinnet innebærer en grundig fysisk separasjon av trikomene fra plantevevet. Dette trinnet kan utføres ved å bruke tørris5, glassperler med et kommersielt apparat6,7, slipe plantematerialet mot en maskesikt8, eller vortexing av plantevevet i en isolasjonsbuffer9. Det andre trinnet innebærer en mer raffinert separasjon av trikomene av interesse fra de mikroskopiske planterester og / eller andre trichome-typer. Dette trinnet kan utføres ved hjelp av tetthetsgradientsentrifugering 8,10 eller sikter i forskjellige størrelser 7,9. På grunn av den ekstreme følsomheten av RNA i bearbeidet vev til nedbrytningsmidler, utføres disse to sekvensielle trinnene vanligvis i det iskalde isolasjonsmediet, ofte i nærvær av proteinhemmere4.
Konvensjonelle trikomisolasjonsprotokoller krever, i tillegg til de iskalde temperaturene, store mengder isolasjonsmedium for å sikre en effektiv ekstraksjonsprosedyre. Kombinasjonen av disse komponentene resulterer i en vanskelig, tidkrevende isolasjonsprosess som hindrer høy gjennomstrømning. Å presentere en enkel, brukervennlig alternativ trichome-isolasjonsprotokoll vil derfor sannsynligvis være gunstig for ulike aspekter forbundet med trichome-karakterisering. Denne artikkelen tar sikte på å tilby en alternativ protokoll for isolering av stilkede og fastsittende kjertelkapitulatoriske trikomer fra Cannabis sativa ved å kombinere og integrere flere elementer fra de konvensjonelle protokollene. Disse elementene inkluderer tørris5, passering av trikomene gjennom flere mikrosikter med avtagende porestørrelser7,9, og erstatning av flytende nitrogen (LN) for isolasjonsmediet8.
Nyheten i den nåværende trichome-isolasjonsprotokollen, sammenlignet med konvensjonelle protokoller, presenterer på en rekke måter. Denne protokollen er praktisk, da den ikke krever farlige komponenter. Prosedyren kan utføres i laboratoriet med minimale forholdsregler og letter høy gjennomstrømning. Erstatning av LN for standard væskeisolasjonsmedium sikrer trikomenes integritet gjennom hele isolasjonsprosessen, noe som muliggjør påfølgende transkriptomisk analyse. Ved sublimering av LN og tørris blir de isolerte trikomene igjen fri for skadelige rester. Videre tillater LNs tilbøyelighet til å sublimere ved romtemperatur sin sjenerøse bruk gjennom hele protokollen. I motsetning til dette genererer bruk av store mengder konvensjonelt isolasjonsmedium praktiske vanskeligheter i håndteringen. Til slutt reduserer protokollen separasjonen av skivecellen fra den gjenværende skjøre hodestrukturen til kjerteltrikomen, noe som muliggjør oppbevaring av headspace-innholdet.
Denne protokollen presenteres på en detaljert trinnvis måte designet for å hjelpe den tekniske praksisen med å isolere C. sativa glandular capitate trichomes. Protokollen gir en håndterbar arbeidsflyt som resulterer i isolerte trikomer med høy konsentrasjon og renhet som passer for nedstrøms molekylær analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Plantematerialet som ble brukt i denne studien besto av fire C. sativa ARO-Volcani-stammer (CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14) som ble dyrket i Volcani Center, Israel, som beskrevet andre steder11. Glandular capitate stilket trichomes ble isolert fra modne blomstrende blomsterstander, og glandular capitate sessile trichomes ble isolert fra store vifteblader fra modne ikke-blomstrende moderplanter. Alt plantemateriale ble nyplukket og umiddelbart lagret ved -80 °C.
FORSIKTIG: Tørris og LN brukes gjennom hele protokollen. Disse stoffene er ekstremt farlige. De isolerte trikomene kan inneholde tørrispartikler som kan skape farlig gasstrykk når de settes inn i forseglede rør; Derfor bør alle caps være nålpunktert. Bruk av vernebriller, passende laboratorieslitasje og hansker for håndtering ved ekstremt lave temperaturer anbefales på det sterkeste.
1. Oppsett for den første separasjonen av trikomer fra plantematerialet
- Knus en tørrisblokk i små fine flak ved hjelp av en hammer og en hard flat gjenstand i en 5 L plastbeholder.
- Sikt de fine tørrisflakene (mindre enn 5 mm) fra den ikke-knuste tørrisen med en stor sil (via porer mindre enn 5 mm) i en annen 5 l plastbeholder. Hell ca. 200 cm3 (200 ml merke) av tørrisflakene i et oppreist 1 L glassbeger.
- Legg opptil 10 g frosne C. sativa blomsterstander (heretter referert til som plantemateriale) på det første laget av knust tørris, og dekk med et ekstra lag på 200 cm3 finknust tørris.
- Dekk åpningen til 1 L glassbegeret med to til tre lag med 1 mm skjermdørmyggnett, og fest det til ytre sider av glasskoppen med gummibånd (figur 1).
- Hell LN i en stor beholder i rustfritt stål med rund bunn (se materialfortegnelse), der de isolerte trikomene vil bli samlet.
- Sett inn en 350 μm netting i en melsikt-/silsil for å dekke melsiktenettet nedenfra (figur 2). Hvis en melsikter med en avtakbar plastring er tilgjengelig, sett inn 350 μm nettingen slik at den er festet under melsikterens netting. Hvis ikke, fest 350 μm masken til omkretsen av melsikteren med gummibånd.
- Legg melsikteren over den store beholderen i rustfritt stål med rund bunn fylt med LN (figur 3). Sørg for at bredden på beholderen overskrider bredden på melsikteren for å minimere tapet av siktet masse utenfor beholderen i rustfritt stål med rund bunn.
2. Separasjon av trichomes fra plantematerialet
- Rist 1 L-glasset med åpningen pekende nedover mot melsikteren som om du bruker en stor saltshaker (figur 4).
- Sett til side 1 L glassbegeret hver 2-3 min for å tillate sikting av knust tørris og plantemateriale akkumulert på melsikten.
- Sikt melsikten horisontalt for å lette passasjen av plantematerialet inn i LN i den rundbunnede rustfrie stålbeholderen under.
- Legg LN til beholderen i rustfritt stål og knust tørris til 1 L glassbegeret når nivåene er lave. Fyll på det brukte plantematerialet i glassbegeret med ytterligere 10 g friskt plantemateriale når plantematerialet på melsikten er utarmet. Påfyllingen trenger vanligvis ikke å gjentas mer enn to ganger.
- Gjenta trinn 2.1-2.4 til en tilstrekkelig mengde berikede trikomer er samlet i beholderen i rustfritt stål med rund bunn. Vanligvis er 20 g ferskt plantemateriale tilstrekkelig for RNA-ekstraksjon og transkriptomanalyse.
- Kontroller at det er et hvitt pulverlignende stoff (bestående av planteavfall, kjerteltrikomer og knust tørris) i bunnen av beholderen i rustfritt stål nedsenket i LN. En mikroskopisk observasjon vil bidra til å avgjøre om en tilstrekkelig mengde trichomes er samlet; Dette trinnet kan imidlertid hindre protokollens flyt. Vanligvis er 10-20 g innledende plantemateriale tilstrekkelig for de fleste isolasjoner; Det kan imidlertid være forskjeller i trikomtettheten til plantene.
MERK: Fra dette tidspunktet kan eksperimentet settes på pause og startes på nytt senere. Hvis det settes på pause i kort tid, bør tilstrekkelige mengder LN tilsettes slik at trikomene forblir nedsenket. Alternativt kan trikomene samles opp og oppbevares ved −80 °C i opptil 3 måneder for senere bruk, som beskrevet i trinn 5.
3. Separasjon av glandular capitate trichomes (stilket og sessile) fra andre trichome typer, slik som bulbous og cystolithic trichomes, og rusk
- Tilsett en liten mengde LN i en ren liten beholder i rustfritt stål med rund bunn.
- Brett en 40 cm x 40 cm mikrosil med en 150 μm maskevidde to ganger for å få en 20 cm x 20 cm fold, og åpne den. Sørg for at den ligner en kjeglelignende form (figur 5).
- Fest nettingkjeglen til kanten av beholderen i rustfritt stål med en eller to klutnekker slik at den åpnede delen av kjeglen er oppreist og den spisse delen er delvis nedsenket i LN.
- Hell LN og det hvite pulverlignende stoffet forsiktig fra trinn 2.6 i mikrosilkjeglen.
- Påfør forsiktig en bred børste for å samle og overføre gjenværende plantemateriale fra den første beholderen til 150 μm maskekjegle.
- Tilsett mer LN i den første beholderen, og gjenta børstebevegelsen til alt plantematerialet er overført til mikrosilkjeglen.
- Løsne klutnekken forsiktig fra lokket på beholderen, og åpne mikrosiktkeglen slik at trikomene er plassert midt i den åpnede mikrosikten. Hold alle fire hjørnene av mikrosilen sammen slik at den midtre delen som inneholder trikomene forblir nedsenket i LN (figur 6).
- Mens du holder alle fire hjørnene av mikrosilen, dypp og rist forsiktig mikrosilen i LN i stålbeholderen som om du fyller en tepose. Fortsett denne dypping / risting (vertikal og horisontal) bevegelse i 1 min. Det er en avveining mellom isolasjonskvalitet og kvantitet. Lengre dyppebevegelser kan resultere i større mengder trikomer, men isolasjonsgraden kan være dårligere. Totalt anbefales 1 min som tilstrekkelig for både kvalitet og kvantitet.
MERK: Denne siktbevegelsen er den mest kritiske delen av protokollen og bør utføres deretter. - Valgfritt: Øs de ikke-siktede planterestene og større trikomer (fortsatt nedsenket i LN) som er pakket inn i midten av mikrosikten i et 13 ml eller 50 ml reagensrør, og oppbevar ved -80 ° C for fremtidig bruk.
FORSIKTIG: For å unngå opphopning av trykkgass (fra tørris og LN-rester), punkter et hull i lokket på reagensrøret med en sterilisert nål. Hetten kan byttes ut når trykket har gått ned, som vanligvis er etter 24 timer.
4. Passerer trikomer gjennom mikrosiler med avtagende porestørrelse
- Overfør siktede trikomer nedsenket i LN i bunnen av den lille beholderen i rustfritt stål med rund bunn sekvensielt gjennom mikrosiler med avtagende porestørrelser (105 μm, 80 μm, 65 μm og 50 μm), på samme måte som presentert i trinn 3.
5. Innsamling av ønskede trikomer
- Fjern de ønskede trikomene nedsenket i LN og pakket inn i 50 μm mikrosilen ved hjelp av en forkjølt (i LN) skje. Legg dem på en ren tallerken.
MERK: I dette siste isolasjonsstadiet samles de ønskede trikomene fra silen. - Overfør raskt de pulverlignende trikomene til et merket forkjølt 1,5 ml rør via en forkjølt slikkepott eller en scoopula satt inn i røret (figur 7). Oppbevar tubene umiddelbart ved -80 °C for videre studier.
MERK: Et skjematisk arbeidsflytdiagram som viser hele isolasjonsprotokollen er gitt i figur 8.
6. Observasjon og analyse av de rensede trikomene
- Plasser en liten mengde (10 mg) isolerte trikomer på et mikroskopglass ved hjelp av en forkjølt (via LN) slikkepott. Tilsett en dråpe vann, og observer direkte på et lysmikroskop uten flekker. Evaluer den totale isolasjons- og forurensningsgraden ved bruk av lave (10x) og høye (40x) forstørrelser. Anrikning er visuelt estimert av den relative mengden trikomer med hensyn til ikke-trikomvev, som vist i figur 9.
- Utfør RNA-ekstraksjon og kvalitetsanalyse fra 50 mg isolert C. sativa glandular capitate stilket og sessile trichomes.
MERK: Et kommersielt ekstraksjonssett (se materialtabell) som bruker en poly-A-basert strategi for mRNA-rensing ble brukt til RNA-ekstraksjon.- Resuspend 50 mg av de isolerte trikomene i lysisoppløsningen, hvirvel i 30 s, sonicate i en iskald ultralydrengjøringsenhet ved 35 kHz i 5 minutter, og ekstrahere mRNA fra prøvene i henhold til produsentens protokoll (se materialtabell).
- For å estimere integriteten til RNA ekstrahert fra trikomene, bestem RNA-konsentrasjonen, totalmengden og RNA-integritetsnummeret (RIN) verdier ved hjelp av et lab-on-a-chip-system (se materialtabell).
- Utfør RNAseq-analyse av trikomfraksjonene (valgfritt). RNAseq analyse og bioinformatikk analyser av sekvenserte leser kan utføres av standard outsourcing tjenester
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hovedmodifikasjonen som er inkludert i denne protokollen sammenlignet med konvensjonelle trikomisolasjonsprotokoller, er å erstatte standard isolasjonsmedium med LN. Bruk av LN som isolasjonsmedium tillater en avslappet arbeidsflyt, fordi så lenge prøvene er nedsenket i LN, er det ikke sannsynlig at metabolsk nedbrytning vil forekomme. Videre, da protokollen unngår de farlige komponentene (dvs. aurintrikarboksylsyre og β-merkaptoetanol) som brukes i tradisjonelt trikomisolasjonsmedium, er arbeidet ikke begrenset til en kjemisk hette. Likevel er det viktig å ta nødvendige forholdsregler ved håndtering av tørris og LN.
For å vurdere fordelene ved denne protokollen ble trikomisoleringsresultatene fra denne protokollen sammenlignet med de som ble oppnådd ved bruk av en konvensjonell trichome-isolasjonsprosedyre (som brukte en vandig buffer, glassperler og en fin sil for trichome-isolasjon)12, opprinnelig ved bruk av et lysmikroskop. En sammenligning av komponentene fra forskjellige isolasjonsfaser via lysmikroskopinspeksjon illustrerer den økende trikomisolasjonsgraden etter hvert som isolasjonsprosessen skrider frem. I den første fasen av isolasjonsprosessen (105-150 μm mikrosil) var biter av bladvev dominerende i den isolerte delen (figur 9A), i motsetning til det endelige isolasjonsproduktet, som nesten utelukkende besto av isolerte trikomer (figur 9C). Det må utvises forsiktighet for å validere at de isolerte prøvene er forurensningsfrie (figur 9B).
Selv om trikomtettheten ikke ble kvantifisert i denne studien, kan kvaliteten på de isolerte kjertelkapitatstilkede og fastsittende trikomene i det siste isolasjonstrinnet observeres i figur 10. Renheten kan sammenlignes med den som oppnås ved trichome-isolasjon ved bruk av en konvensjonell protokoll12 (figur 10C). I denne protokollen beholdes den delikate stilkede trikomhodestrukturen, og hele hodene til den isolerte stilkede trikomen er synlige (figur 10D), mens ved bruk av konvensjonell protokoll mangler hele trikomhodestrukturen, og bare skivecellene er til stede (figur 10E). Utbyttet kan også økes kraftig siden bruk av tørris og LN unngår grensen for plantemateriale som kan utvinnes. En ekstra fordel med vår ikke-vandige protokoll er at den bare bruker tørris og LN, og derfor blir ingen gjenværende komponenter i isolasjonsmediet igjen når de fordamper. Bruk av LN forhindrer frigjøring av klebrige sekundære metabolitter som kan føre til aggregering av trikomene13. I denne protokollen ble de isolerte trikomene i det siste isolasjonstrinnet gjenfunnet som et tørt fint pulver.
De ekstremt lave temperaturene som opprettholdes gjennom hele denne protokollen, vil sannsynligvis være tilstrekkelig til å oppfylle målene for konvensjonell buffermedieforhindring av RNA-nedbrytning (så lenge prøvene holdes nedsenket) og legge til rette for nedstrøms molekylære applikasjoner. For å validere denne antagelsen ekstraherte vi RNA fra de isolerte trikomene og estimerte RNA-integriteten ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett. De oppnådde høye RIN-verdiene (9, 4 til 10) og distinkt gelkromatografi (figur 11) indikerer tydelig en høy RNA-integritet. RNA-prøvene ble videre analysert av RNAseq, og >20 M høykvalitetsavlesninger ble oppnådd fra alle biblioteker.
For å validere at mRNA fra den isolerte trikomfraksjonen faktisk er beriket i trikom-uttrykte gener, sammenlignet vi våre genuttrykksresultater for blomsterstanden og tilsvarende isolerte stilkede trikomer til tidligere resultater presentert av Livingston et al.14, som karakteriserte genuttrykket av rensede trikomer av cannabis (tilpasset fra deres tilleggstabell 1 ). Protokollen deres besto av blanding i vandig buffer, filtrering gjennom sikter og til slutt trichome-rensing ved hjelp av en Percoll-gradient. Trikom-uttrykte gener ble karakterisert som de mest korrelerte (p > 0,95) med genuttrykket av cannabidiolsyresyntase (CBDAS), en trikomspesifikk genmarkør14. Sammenligningen av genuttrykk mellom resultatene oppnådd med denne protokollen og de som presenteres i Livingston et al.14, viser at de 12 mest berikede genene i vår trichomefraksjon også ble beriket i Livingston et al. studie 14, inkludert trichome-markørgenet CBDAS (tabell 1). Spesielt ble det oppnådd en betydelig høyere anrikningsgrad fra den nåværende protokollen. Disse resultatene bekrefter gyldigheten av den nåværende protokollen for studiet av trikomberiket genuttrykk.
I tillegg sammenlignet vi ekspresjonsdataene for fem aktingener av cannabis, siden aktin ofte brukes som referansegen for transkriptomstudier (tabell 2). Våre resultater for både isolerte stilkede og fastsittende trikomer var sammenlignbare med de som ble rapportert av Livingston et al. studie14.
Til slutt beregnet vi ekspresjons- og trikomanrikningsdata for klorofyll a-b-bindende proteinfamiliegener, som antagelig ikke er trikomberiket (tab 3). Faktisk viste de 12 medlemmene av denne genfamilien en trichome-anrikningsfaktor på <1, som tjente som en negativ kontroll for trichome-berikelse. Disse kombinerte resultatene indikerer de unike uttrykksmønstrene til blomsterstanden og isolerte trikomfraksjoner og støtter trikomintegriteten og kvaliteten til den isolerte trikomfraksjonen.
Figur 1: Oppsett for lasting av 1 L glassbeger. 1 mm skjermdørnett festes til sidene av glassbegeret via noen gummistrikker (vises ikke). 1 L glassbegeret skal lastes i oppreist stilling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av melsikteren. Melsikteren er utstyrt med en 350 μm mikrosil via gummistrikker nederst (ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett av første trinn i trikomisolering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oppsett av glassbegeret. Glassbegeret er utstyrt med tre lag med 1 mm skjermdør (mygg) netting sikret via gummistrikker ved åpningen. Åpningen av begeret peker nedover. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Oppsett av mikrosilkjeglestrukturen som brukes til trichome-isolasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Oppsett for dyppe- og ristebevegelse av mikrosilen som inneholder isolerte trikomer. Den horisontale/vertikale bevegelsen skal ligne en teposeinfusjon. Oppsettet er identisk for hver maskenettstørrelse som brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Oppsett for overføring av de endelige isolerte trikomene. De endelige isolerte trikomene overføres til et merket 1,5 ml rør. Alle redskapene skal være forkjølt med LN. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Flytskjema som beskriver protokollen. Isoleringen av kjertelkapitulær trichomes fra C. Sativa innebærer tre trinn: (1) den første løsningen av trikomene fra plantekilden og passasjen via to sikter (1 mm og 350 μm), (2) passerer plantematerialet via fem mikrosikter med avtagende porestørrelser (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm og 50 μm), og (3) samlingen av de isolerte trikomene i et forkjølt 1,5 ml rør. Beholdt vev fra noen av mikrosiltrinnene kan på samme måte samles inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Mikroskopibilder av de isolerte trikomene med gjeldende protokoll. (A,B,C) Glandular capitate sessile trichomes fra C. sativa fan blader. (A) Midtisolering, fra mikrosiler med porestørrelser fra 105 μm til 150 μm. Legg merke til oppbevaring av store mengder grønt, ikke-trikomisk materiale. (B) Slutt på isolasjon, fra mikrosiler med porestørrelser fra 50 μm til 65 μm, forurenset med plantekilde (rød pil), og (C) fri for forurensning. Skalastenger = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Mikroskopibilder av de isolerte trikomene. (A,B) Glandular capitate trichomes fra C. sativa: (A) stilket type, isolert ved hjelp av gjeldende protokoll, og (B) sessil type, isolert ved hjelp av gjeldende protokoll. (C) Forfulgte trikomer isolert ved hjelp av en konvensjonell protokoll. Det lave utbyttet og mangelen på kompromissløse hoder av trichomes er tydelig. (D,E) Stilket kjertelkapitulær trikomer isolert ved hjelp av (D) den nåværende protokollen og (E) den konvensjonelle protokollen. (F) Kjertelstilkede trikomer isolert fra 65 μm til 105 μm mikrosikt (nærbilde). Legg merke til den høye isolasjonen av stilkede trikomer, med frittliggende hoder og stengeldeler. De røde pilene indikerer cystolitiske trikomer, de blå pilene indikerer noen få stengeldeler fra kjertelkapitatet stilkede trikomer, og de gule pilene indikerer separerte skiveceller. Skalastenger = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Analyse av integriteten til RNA ekstrahert fra trikomene. Kromatografer og geler av ekstraherte RNA-prøver fra kjertelkapitat stilket og sessile trikomer isolert ved hjelp av denne protokollen. Resultater for RNA fra (A-D) de stilkede trikomene til de fire kultivarlinjene som ble brukt i denne studien, henholdsvis CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14, og (E-H) de fastsittende trikomene, CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammenligning av det trikomberikede genuttrykket oppnådd med RNAseq ved bruk av denne protokollen med resultatene oppnådd av Livingston et al.14. De 12 genene som viser den høyeste korrelasjonen til cannabidiolsyresyntase (CBDAS) -uttrykk av Livingston et al.14 (fra deres tilleggstabelldata S4, tilpasset med tillatelse fra Wiley-utgivere), betraktet som en trikomspesifikk genmarkør, ble valgt for sammenligning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Sammenligning av genuttrykk (FPKM) av fem cannabisaktingener av isolerte stilkede og fastsittende trikomer fra denne protokollen (våre genuttrykksdata fra Cannabis-sorten CS-1111 (Var CS-11)) med tidligere publiserte resultater tilpasset fra Livingston et al.14. Resultatene av Livingston et al.14 ble presentert basert på Finola FN-referansegenomet, og deres data ble oversatt til CS10.2-referansegenomet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Genuttrykk (FPKM) av cannabisklorofyll a-b bindende gener av hele blomsterstander og isolerte stilkede trikomer fra denne protokollen (våre genuttrykksdata fra Var CS-11). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med de nåværende tilgjengelige trichome-isolasjonsprotokollene, er to hovedmodifikasjoner beskrevet i denne protokollen. Disse inkluderer løsrivelse av trikomene fra plantematerialet ved bruk av tørris i det første trinnet og erstatning av LN for det vanlige flytende buffermediet. Den første modifikasjonen for C. sativa trichome-rensing er basert på en tidligere protokoll som introduserte bruk av knust tørris for å løsne trikomene fra geraniumpedikler5. Mens tradisjonelle trichome-isolasjonsprotokoller vanligvis bruker et lite (50 ml) reagensrør, ble et 1 L glassbeger brukt i denne studien med en sjenerøs mengde knust tørris, slik at et større volum av innledende plantemateriale (opptil 10 g) kan behandles. Videre ble det i denne protokollen innført ytterligere to passasjer av trikomene gjennom mikrosiler i det første isolasjonstrinnet. Det første trinnet benytter en vertikal opp-og-ned kraftig saltshaker-lignende bevegelse, og det andre benytter en horisontal siktebevegelse gjennom mikrosikten i melsikteren. De kombinerte horisontale og vertikale siktebevegelsene foreslås for å fremme en forbedret separasjon basert på trikomens størrelse og form.
Den andre, mest signifikante modifikasjonen adresserer isolasjonsmediet der passasjen gjennom mikrosiktene utføres. I denne protokollen er det konvensjonelle vandige isolasjonsmediet fullstendig erstattet av LN. En tidligere protokoll8 brukte også LN i det første trinnet for trichome-isolering, separerte trikomer fra plantematerialet (ved å rive blomstermaterialet mot en maskesikt), men fortsatte med en væskebufferekstraksjon og Percoll-tetthetsseparasjon. Erstatning av LN i stedet for det konvensjonelle isolasjonsmediet eliminerer behovet for spesielle prosedyrer knyttet til de giftige komponentene i det konvensjonelle isolasjonsmediet, noe som muliggjør en avslappet arbeidsflyt og høy gjennomstrømning.
Et sentralt trekk ved denne protokollen er avhengig av tilbøyeligheten til tørris og LN til å sublimere raskt ved romtemperatur. Denne funksjonen muliggjør deres sjenerøse anvendelse gjennom hele isolasjonsprosessen. I motsetning til dette vil bruk av en stor mengde av den konvensjonelle isolasjonsbufferen føre til tekniske komplikasjoner med hensyn til håndtering av de store volumene.
Mens isolasjonsprosessen i denne protokollen fremmer oppbevaring av den skjøre hodestrukturen til kjertelkapitatet stilket trikom, fremmer de konvensjonelle protokollene separasjonen av skivecellene fra det gjenværende kjertelmaterialet, som lett vaskes bort, og etterlater bare skivecellene. Dette fenomenet kan tydelig sees i våre resultater som sammenligner en konvensjonell isolasjonsprotokoll med vår nye protokoll (figur 10D, E). Foruten den mikroskopiske observasjonen, indikerer kvalitetsanalysen av RNA ekstrahert fra trikomene (isolert ved hjelp av denne protokollen) tydelig at RNA-integriteten beholdes under isolasjonsprosessen og at den er egnet for transkriptomisk analyse.
Videre indikerer genuttrykket fra vår isolerte trikomfraksjon at fraksjonen er sterkt anriket i etablerte trikomuttrykte gener (tab 1) og gjensidig at ikke-trikomuttrykte gener ikke er representert (tab 3).
Hovedbegrensningen i denne protokollen er dens eksklusive egnethet til å isolere trikomer i henhold til deres tilbøyelighet til å passere gjennom mikrosiler. Selv om protokollen ikke kan brukes direkte på trichome-isolasjon ved hjelp av en tetthetsgradient, er den egnet for å isolere trikomene før tetthetsgradienttrinnet, om nødvendig. I denne studien gjennomgikk trikomene isolert ved hjelp av denne protokollen ikke en proteomisk karakterisering, og deres egnethet for en slik applikasjon må verifiseres. Men da RNA-prøvene ekstrahert fra både stilkede og sessile trikomer ikke viste noen nedbrytning, som indikert av koratografene og høye RIN-verdier, kan det antas at trikomene isolert med den nåværende protokollen sannsynligvis vil oppfylle kravene som trengs for proteomisk analyse.
Isolasjonsgraden (fra den opprinnelige plantekilden og andre typer trikomer) av kjertelkapitaten sessile trikomer fra viftebladene er svært høy, da viftebladene mangler kjertelkapitatet stilket trichome type15,16, og de cystolitiske og pæreformede trikomene er lett isolert fra de sessile trikomene på grunn av deres strukturelle og størrelsesforskjeller. Imidlertid, med hensyn til isolering av kjertelkapitat stilket type trichomes, er det best å adressere deres isolasjonsgrad som anrikning, da plantekilden, den modne kvinnelige blomsterstanden, inneholder alle fire trichome-typer, i tillegg til pre-stilk type14. Det står til grunn at de fleste av de isolerte kjertelkapitattrikomene er av stilket type, da deres forhøyede posisjon (i forhold til de epidermalbundne sessile trikomene) øker sannsynligheten for at de kolliderer med en tørrispartikkel og blir løsrevet fra planten. Videre anses krysset som forbinder hode- og stengeldeler av stilket trichome som et svakhetspunkt forbundet med abscission av kjertelhodet17. Dermed ville det være nøyaktig å referere til den stilkede trichome-delen som en svært beriket fraksjon med potensielt lav forurensning av den sessile typen. Det ble imidlertid ikke utført ytterligere analyser for å validere denne antakelsen.
Egnetheten av den nåværende protokollen til å trekke ut kjerteltrikomer fra andre plantearter er ennå ikke bestemt. Den høye trikomtettheten i C. sativa bidrar antagelig til suksessen til den nåværende protokollen. Det virker imidlertid usannsynlig at dette er den eneste årsaken, da en relativt stor plantematerialkilde (opptil 10 g per isolasjonssyklus) kan behandles effektivt. Andre studier har presentert detaljerte protokoller for å isolere forskjellige trikomtyper fra andre planter, for eksempel rosettbladtrikomer fra Arabidopsis thaliana18,19. Selv om anvendeligheten av den nåværende protokollen for isolering av andre trikomtyper ikke ble studert i dette arbeidet, vil elementer som presenteres i dette arbeidet, spesielt substitusjonen av LN for isolasjonsbufferen, sannsynligvis forbedre trikomisolasjonsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra CannabiVar Ltd. Alt plantemateriale ble sjenerøst levert av professor Hinanit Koltai fra Volcani Center, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
