Summary
提出了一种方案，用于方便和高通量地从 大麻中分离和富集腺头柄和无柄毛状体。该方案基于仅使用液氮、干冰和尼龙筛对毛状体进行干燥、非缓冲提取，适用于 RNA 提取和转录组学分析。
Abstract
本文提出了一种方便、高通量地从 大麻中分离和富集腺头柄和无柄毛状体的方案。大麻素和挥发性萜烯代谢的生物合成途径主要位于 大麻 毛状体中，分离的毛状体有利于转录组分析。用于分离腺毛以进行转录组学表征的现有方案不方便，并且提供受损的毛状体头和相对较少数量的分离毛状体。此外，它们依靠昂贵的设备和含有蛋白质抑制剂的分离培养基来避免RNA降解。本方案建议结合三种单独的修饰，分别从 苜蓿 成熟的雌性花序和扇形叶中获得大量分离的腺头柄和无柄毛状体。第一种修改涉及用液氮代替传统的隔离介质，以促进毛状体通过微筛。第二种修改涉及使用干冰将毛状体与植物源头分离。第三种修改涉及将植物材料连续通过五个孔径减小的微筛。显微成像证明了分离技术对两种毛状体类型的有效性。此外，从分离的毛状体中提取的RNA质量适合下游转录组分析。
Introduction
腺毛是存在于植物中的毛发状结构，含有许多次级代谢物1，代表了新型生物合成基因和酶的宝贵库2。在大麻中，重要的次生代谢物大麻素3和萜烯4的生物合成位于毛状体中。考虑到毛状体在确定药用和娱乐用途大麻质量方面的作用，毛状体基因表达的研究是有意义的。为了表征毛状体特异性基因的表达，必须首先分离感兴趣的毛状体。毛状体分离方案早在1992年就被首次描述5，其最新进展最近已得到回顾2。通常，提取腺毛状体以进行转录组学表征的方案可分为两个不同的顺序步骤。第一步涉及毛状体与植物组织的彻底物理分离。该步骤可以通过使用干冰5、玻璃珠与商业设备6、7、在网筛8上研磨植物材料、或在隔离缓冲液9中涡旋植物组织来执行。第二步涉及将感兴趣的毛状体与微观植物残留物和/或其他毛状体类型进行更精细的分离。该步骤可以使用密度梯度离心8，10或各种尺寸的筛子7，9执行。由于加工组织中的RNA对降解剂的敏感性极高，这两个连续步骤通常在冰冷的分离介质中进行，通常在蛋白质抑制剂4的存在下进行。
除了冰冷的温度外，传统的毛状体分离方案还需要大量的分离介质，以确保有效的提取过程。这些组件的组合导致一个艰巨、耗时的隔离过程，阻碍了高吞吐量。因此，提出一种简单、用户友好的替代毛状体分离方案可能对与毛状体表征相关的各个方面有益。本文旨在通过结合和整合传统方案中的几种元素，提供一种替代方案，从大麻中分离出柄状状体和无柄腺头状体。这些元素包括干冰5，毛状体通过几个孔径减小的微筛7，9，以及用液氮（LN）代替隔离介质8。
与传统方案相比，目前的毛状体分离方案的新颖性以多种方式呈现。该协议很方便，因为它不需要危险成分。该程序可以在实验室中进行，只需最少的预防措施，并促进高通量。用LN代替标准液体分离介质可确保毛状体在整个分离过程中的完整性，从而实现后续的转录组学分析。LN和干冰升华后，分离的毛状体没有有害残留物。此外，LN在室温下升华的倾向允许其在整个协议中大量使用。相反，使用大量常规隔离介质会在处理时产生实际困难。最后，该方案减少了椎间盘细胞与腺毛体剩余脆弱头部结构的分离，从而能够保留顶空内容物。
该协议以详细的分步方式呈现，旨在帮助分离 苜蓿衣原 体腺头状体的技术实践。该协议提供了一个可管理的工作流程，可分离出具有高浓度和纯度的毛状体，适用于下游分子分析。
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Protocol
注意：本研究中使用的植物材料由四种C . sativa ARO-Volcani菌株（CS-11，CS-12，CS-13和CS-14）组成，这些菌株生长在以色列火山中心，如其他地方所述11。从成熟的开花花序中分离出腺头柄柄毛状体，从成熟的非开花母株的大扇叶中分离出腺头状无柄毛状体。所有植物材料都是新鲜采摘的，并立即储存在-80°C。
注意：在整个协议中使用干冰和LN。这些物质非常危险。分离的毛状体可能含有干冰颗粒，当插入密封管中时会产生危险的气体压力;因此，所有瓶盖都应用针刺穿。强烈建议使用护目镜、适当的实验室服装和手套在极低温度下操作。
1. 毛状体与植物材料初始分离的设置
- 在 5 L 塑料容器中用锤子和坚硬的扁平物体将干冰块粉碎成细小的薄片。
- 用大过滤器（通过小于5毫米的孔）将未粉碎的干冰中的细干冰片（小于5毫米） 筛入另一个5升塑料容器中。将大约 200 cm3 （200 mL 标记） 的干冰片倒入直立的 1 L 玻璃烧杯中。
- 将多达10克冷冻的 C. sativa 花序（从现在开始称为植物材料）添加到第一层碎干冰上，并覆盖另外一层200厘米3 的细碎干冰。
- 用两到三层1毫米屏蔽门蚊帐盖住1 L玻璃烧杯的开口，并用橡皮筋将其固定在玻璃杯的外侧（图1）。
- 将LN倒入一个大的圆底不锈钢容器中（见 材料表），在那里将收集孤立的毛状体。
- 在面粉筛/筛过滤器中插入一个350μm的网眼，从下面覆盖面粉筛网（图2）。如果有带有可拆卸塑料环的面粉筛，请插入 350 μm 网，使其固定在面粉筛网下方。如果没有，请用橡皮筋将350μm网格固定在面粉筛的圆周上。
- 将面粉筛放在装满LN的大圆底不锈钢容器上方（图3）。确保容器的宽度超过面粉筛的宽度，以尽量减少圆底不锈钢容器外筛分质量的损失。
2. 毛状体与植物材料的分离
- 摇动1 L玻璃杯，其开口朝下指向面粉筛，就像使用大型盐瓶一样（图4）。
- 每2-3分钟放置一次1L玻璃烧杯，以筛选面粉筛上积聚的碎干冰和植物材料。
- 水平筛分面粉筛，以方便植物材料进入下面圆底不锈钢容器中的LN。
- 将 LN 加入不锈钢容器中，当干冰液位不足时，将碎干冰加入 1 L 玻璃烧杯中。当面粉筛上的植物材料耗尽时，用额外的10克新鲜植物材料补充玻璃烧杯中用过的植物材料。补货通常不必重复两次以上。
- 重复步骤2.1-2.4，直到在圆底不锈钢容器中收集了足够数量的富集毛状体。通常，20克新鲜植物材料足以进行RNA提取和转录组分析。
- 验证浸没在LN中的不锈钢容器底部是否有白色粉末状物质（由植物碎片，腺毛和碎干冰组成）。显微镜观察将有助于确定是否收集了足够数量的毛状体;但是，此步骤可能会阻碍协议的流。通常，10-20 g初始植物材料足以用于大多数分离;然而，植物的毛状体密度可能存在差异。
注意：从这一点开始，实验可以暂停并稍后重新启动。如果暂停一小段时间，应添加足量的LN，使毛状体保持浸没状态。或者，可以收集毛状体并在-80°C下储存长达3个月以供以后使用，如步骤5中所述。
3.腺头状体（柄状和无柄）与其他毛状体类型（如球状和囊状毛状体）和碎屑的分离
- 将少量LN添加到干净的小圆底不锈钢容器中。
- 将40厘米x 40厘米的微筛与150μm的筛目尺寸折叠两次，以获得20厘米x 20厘米的折叠，然后打开它。确保它类似于圆锥形（图5）。
- 用一个或两个衣夹将网锥固定在圆底不锈钢容器的边缘，使锥体的打开部分直立，其尖头部分部分浸没在LN中。
- 将步骤2.6中的LN和白色粉末状物质轻轻倒入微筛锥中。
- 轻轻地应用宽刷子收集并将任何剩余的植物材料从第一个容器转移到150μm网锥中。
- 向第一个容器中加入更多的LN，并重复刷洗动作，直到所有植物材料都转移到微筛锥中。
- 小心地将衣夹从容器盖上拆下，打开微筛锥，使毛状体位于打开的微筛中间。将微筛的所有四个角固定在一起，使包含毛状体的中间部分仍浸没在LN中（图6）。
- 在握住微筛的所有四个角的同时，轻轻浸入并摇晃钢制容器中LN中的微筛，就像注入茶包一样。继续这种浸渍/摇晃（垂直和水平）运动1分钟。隔离质量和数量之间存在权衡。较长的浸渍运动可能导致更多的毛状体，但它们的隔离等级可能较差。总体而言，建议 1 分钟对于质量和数量都足够。
注意：此筛分运动是协议中最关键的部分，应相应地执行。 - 可选：将包裹在微筛中心的未过筛植物碎片和较大的毛状体（仍浸没在LN中）舀入13 mL或50 mL试管中，并储存在-80°C以备将来使用。
注意：为避免压力气体（来自干冰和LN残留物）积聚，请用无菌针头在试管盖上刺穿一个孔。一旦压力降低，就可以更换盖子，通常是在24小时后。
4. 毛状体通过孔径减小的微筛
- 将浸没在小圆底不锈钢容器底部LN中的过筛毛绒依次通过孔径减小的微筛（105μm，80μm，65μm和50μm），方法与步骤3中所示相同。
5. 收集所需的毛状体
- 取出浸没在LN中的所需毛状体，并使用预冷（LN）勺子包裹在50μm微筛中。将它们放在干净的盘子上。
注意：在最后的隔离阶段，从筛子中收集所需的毛状体。 - 通过预冷刮刀或插入试管中的勺 子，将 粉末状毛状毛状体快速转移到标记的预冷 1.5 mL 管中（图 7）。立即将试管储存在-80°C下以进行进一步研究。
注意：图 8 给出了描述整个隔离协议的示意图工作流程 图。
6. 净化毛状体的观察与分析
- 使用预冷（通过 LN）刮刀将少量（10mg）分离的毛状体放在显微镜载玻片上。加入一滴水，直接在光学显微镜上观察，不染色。使用低 （10x） 和高 （40x） 放大倍率评估整体隔离和污染程度。富集是通过毛状体相对于非毛状体组织的相对数量来目视估计的，如图 9所示。
- 从 50 mg 分离的 苜蓿腺 头柄柄和无柄毛状体中进行 RNA 提取和质量分析。
注意：使用采用基于poly-A的mRNA纯化策略的商业提取试剂盒（见 材料表）进行RNA提取。- 将50mg分离的毛状体重悬于裂解溶液中，涡旋30秒，在冰冷的超声清洁装置中以35kHz超声处理5分钟，并根据制造商的方案从样品中提取mRNA（参见 材料表）。
- 要估计从毛状体中提取的RNA的完整性，请使用芯片实验室系统确定RNA浓度，总量和RNA完整性数（RIN）值（参见 材料表）。
- 对毛状体部分进行RNAseq分析（可选）。测序读段的RNAseq分析和生物信息学分析可以通过标准外包服务进行
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Representative Results
与传统的毛状体隔离方案相比，该协议中包含的主要修改是用LN代替标准隔离介质。使用LN作为分离介质可以简化工作流程，因为只要样品浸没在LN中，就不太可能发生代谢降解。此外，由于该方案避免了传统毛状体分离介质中使用的有害成分（即金三羧酸和β-巯基乙醇），因此工作不仅限于化学罩。然而，在处理干冰和LN时采取必要的预防措施很重要。
为了评估本协议的优势，将本协议的毛状体分离结果与使用常规毛状体分离程序（使用水性缓冲液、玻璃珠和细筛进行毛状体分离）获得的结果进行比较12，最初使用光学显微镜。通过光学显微镜检测 对 不同分离阶段的组分进行比较，表明随着分离过程的进行，毛状体隔离程度也在增加。在分离过程的初始阶段（105-150μm微筛），叶组织碎片在分离部分占主导地位（图9A），而最终分离产物几乎完全由分离的毛状体组成（图9C）。应注意验证分离的样品是否无污染（图9B）。
虽然本研究未量化毛状体密度，但图10中可以观察到最终分离步骤中分离的腺头柄柄和无柄毛状体的质量。纯度可以与使用常规方案12的毛状体分离获得的纯度进行比较（图10C）。在本协议中，保留了精致的柄毛状体头部结构，并且可以看到孤立的柄状体的整个头部（图10D），而使用常规协议时，缺少完整的毛状体头部结构，并且仅存在椎间盘细胞（图10E）。由于使用干冰和LN消除了可提取的植物材料的限制，因此产量也可以大大提高。我们的非水方案的另一个优点是它仅使用干冰和LN，因此，一旦分离介质蒸发，就不会留下任何残留成分。使用LN可防止粘性次级代谢物的释放，从而导致毛状体聚集13。在本协议中，在最后的分离步骤中分离的毛状体以干细粉的形式回收。
在整个方案中保持的极低温度可能足以满足常规缓冲培养基防止RNA降解的目标（只要样品保持浸没状态）并促进下游分子应用。为了验证这一假设，我们从分离的毛状体中提取RNA，并使用市售试剂盒估计RNA的完整性。获得的高RIN值（9.4至10）和独特的凝胶色谱（图11）清楚地表明RNA具有很高的完整性。通过RNAseq进一步分析RNA样品，并从所有文库中获得了>20 M高质量读数。
为了验证来自分离毛状体部分的mRNA确实富含毛状体表达基因，我们将花序和相应的分离柄毛状体的基因表达结果与Livingston等人先前提出的结果进行了比较14，该结果表征了大麻纯化毛状体的基因表达（改编自其补充表1).他们的方案包括在水性缓冲液中混合，通过筛子过滤，最后使用Percoll梯度纯化毛状体。毛状体表达基因被描述为与大麻二磷酸合酶（CBDAS）的基因表达高度相关（p > 0.95）的基因，CBDAS是一种毛状体特异性基因标记14。使用本协议获得的结果与Livingston等人14中提供的结果之间的基因表达比较表明，我们的毛状体部分中12个高度富集的基因在Livingston等人的研究14中也富集，包括毛状体标记基因CBDAS（表1）。值得注意的是，从本议定书中获得的富集率明显更高。这些结果证实了本方案用于研究富含毛状体的基因表达的有效性。
此外，我们比较了 大麻五个肌动蛋白基因的表达数据，因为肌动蛋白经常被用作转录组研究的参考基因（表2）。我们对孤立的柄状体和无柄毛状体的结果与Livingston等人研究14报告的结果相当。
最后，我们计算了叶绿素a-b结合蛋白家族基因的表达和毛状体富集数据，这些基因可能没有富集毛状体（表3）。事实上，该基因家族的12个成员显示出<1的毛状体富集因子，作为毛状体富集的阴性对照。这些综合结果表明了花序和孤立毛状体分数的独特表达模式，并支持分离毛状体部分的毛状完整性和质量。
图 1：装载 1 L 玻璃烧杯的设置。 1 mm 纱门网通过几根橡皮筋固定在玻璃烧杯的侧面（未显示）。1 L 玻璃烧杯应直立装载。请点击此处查看此图的大图。
图 2：面粉筛的设置。 面粉筛通过底部的橡皮筋 装有 350μm的微筛（未显示）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：毛状体隔离第一步的设置。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：玻璃烧杯的设置。 玻璃烧杯装有三层 1 毫米纱门（蚊子）网，通过开口处的橡皮筋 固定 。烧杯的开口朝下。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：用于毛状体隔离的微筛锥形结构的设置。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：包含孤立毛状体的微筛的浸渍和摇晃运动的设置。 水平/垂直运动应类似于茶包输液。对于所使用的每个网格尺寸，设置都是相同的。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：用于转移最终隔离毛状体的设置。 将最终分离的毛状体转移到标记的 1.5 mL 管中。所有器皿均应用LN预先冷却。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：概述协议的流程图。从C中分离出腺头状体。苜蓿涉及三个步骤：（1）毛状体与植物源头的初始分离并通过两个筛子（1毫米和350微米）通过，（2）通过五个孔径减小的微筛（150μm，105μm，80μm，65μm和50μm）使植物材料，以及（3）将分离的毛状体收集到预冷的1.5毫升管中。来自任何微筛阶段的保留组织可以类似地收集。请点击此处查看此图的大图。
图9：使用当前协议的分离毛状体的显微镜图像。 （A，B，C）来自C. sativa扇叶的腺头无柄毛状体。（A） 中分离，从孔径范围为 105 μm 到 150 μm 的微筛。注意保留大量绿色、非毛状体材料。（B）分离结束，从孔径从50μm到65μm的微筛中分离，被植物源（红色箭头）污染，以及（C）无污染。比例尺 = （A） 100 μm， （B，C） 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图10：分离毛状体的显微镜图像。 （A，B）来自C. sativa的腺头状毛：（A）柄型，使用当前协议分离，和（B）无柄型，使用当前协议分离。（C）使用常规方案分离的柄状体。毛状体产量低，缺乏不折不扣的头部是显而易见的。（D，E）使用（D）本协议和（E）常规协议分离的柄腺头状体。（F）从65μm到105μm微筛分离的腺柄毛状体（特写）。请注意，柄毛状体的隔离度很高，头部和茎部分分离。红色箭头表示囊石毛状体，蓝色箭头表示腺头柄毛状体的几个茎部分，黄色箭头表示分离的椎间盘细胞。比例尺 = （A，C，D，E，F） 100 μm，（B） 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图11：分析从毛状体中提取的RNA的完整性。使用本协议分离的从腺头柄和无柄毛状体中提取的RNA样品的色谱仪和凝胶。本研究中使用的四个品种系的柄毛状体分别为CS-11，CS-12，CS-13和CS-14，以及（E-H）无柄毛状体CS-11，CS-12，CS-13和CS-14的RNA结果。请点击此处查看此图的大图。
表1：使用本协议使用RNAseq获得的富含毛状体的基因表达与Livingston等人获得的结果的比较14。选择Livingston等人14（来自他们的补充表数据S4，经Wiley出版商许可改编）显示与大麻二酸合酶（CBDAS）表达最高度相关的12个基因，被认为是毛状体特异性基因标记进行比较。请按此下载此表格。
表2：来自本协议的分离柄毛状体和无柄毛状体的五个大麻肌动蛋白基因的基因表达（FPKM）的比较（我们来自大麻品种CS-1111（Var CS-11）的基因表达数据）与先前发表的结果改编自Livingston等人14。Livingston等人14的结果基于Finola FN参考基因组呈现，他们的数据被翻译成CS10.2参考基因组。请按此下载此表格。
表3：来自本协议的全花序和分离柄毛状体的大麻叶绿素a-b结合基因的基因表达（FPKM）（我们来自Var CS-11的基因表达数据）。请按此下载此表格。
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Discussion
与目前可用的毛状体隔离方案相比，本协议描述了两种主要的修改。其中包括在初始步骤中使用干冰将毛状体从植物材料中分离出来，并用LN代替常用的液体缓冲介质。 C. sativa 毛状体净化的第一个修改是基于早期的方案，该协议引入了使用碎干冰将毛状体从天竺葵花梗分离5.虽然传统的毛状体分离方案通常使用小（50 mL）试管，但本研究使用1 L玻璃烧杯，其中包含大量碎干冰，可以处理更大体积的初始植物材料（最多10 g）。此外，在本协议中，在第一个隔离步骤中引入了两个通过微筛的毛状体的附加通道。第一步采用垂直上下剧烈的盐瓶运动，第二步采用水平筛分运动，通过面粉筛中的微筛。建议结合水平和垂直筛分运动，以促进基于毛状体大小和形状的增强分离。
第二个，也是最重要的修改涉及通过微筛的隔离介质。在本协议中，传统的水分离介质完全被LN取代。先前的方案8 在第一步中也使用LN进行毛状体分离，将毛状体与植物材料分离（通过在网筛上磨碎花材料），但继续进行液体缓冲液提取和Percoll密度分离。用LN代替传统隔离介质，无需对传统隔离介质的有毒成分进行特殊操作，从而实现轻松的工作流程和高通量。
本协议的一个关键特征依赖于干冰和LN在室温下快速升华的倾向。此功能使其能够在整个隔离过程中得到大量应用。相反，使用大量常规隔离缓冲液会导致处理其大体积的技术复杂性。
虽然本协议中的分离过程促进了腺头柄毛状体脆弱的头部结构的保留，但常规方案促进了椎间盘细胞与剩余腺体材料的分离，这些物质很容易被冲走，只留下椎间盘细胞。在我们的结果中可以清楚地看到这种现象，将传统隔离方案与我们的新方案进行比较（图10D，E）。除了显微镜观察外，从毛状体中提取的RNA的质量分析（使用此协议分离）清楚地表明，在分离过程中保留了RNA的完整性，并且适用于转录组学分析。
此外，我们分离的毛状体部分的基因表达结果表明，该部分在已建立的毛状体表达基因中高度富集（表1），并且反过来，非毛状体表达的基因没有代表性（表3）。
本协议的主要限制是其专用性，可根据毛状体通过微筛的倾向来隔离毛状体。虽然该协议不能直接应用于使用密度梯度的毛状体分离，但如有必要，它适用于在密度梯度步骤之前分离毛状体。在这项研究中，使用该协议分离的毛状体没有进行蛋白质组学表征，需要验证它们对此类应用的适用性。然而，由于从柄毛状体和无柄毛状体中提取的RNA样品没有表现出降解，如胆量图和高RIN值所示，可以假设用本协议分离的毛状体可能满足蛋白质组学分析所需的要求。
由于扇叶缺乏15，16型腺头柄柄毛状体，囊石和球状毛状体由于结构和大小的差异，与无柄毛状体的分离程度（来自初始植物来源和其他类型的毛状体）非常高。然而，关于腺头柄型毛状体的分离，最好将它们的分离度作为富集，因为植物来源，成熟的雌性花序，除了前茎型14外，还包含所有四种毛状体类型。按理说，大多数孤立的腺头状毛都是柄型的，因为它们的升高位置（相对于表皮结合的无柄毛状体）增加了它们与干冰颗粒碰撞并与植物分离的可能性。此外，连接柄毛状体的头部和柄部分的接合处被认为是与腺体头部脱落相关的弱点17。因此，将柄毛状体部分称为具有潜在低无柄型污染的高度富集部分是准确的。然而，没有进行进一步的分析来验证这一假设。
本议定书是否适合从其他植物物种中提取腺毛，尚待确定。 C. sativa 的高毛状体密度可能有助于本协议的成功。然而，这似乎不太可能是唯一的原因，因为可以有效地处理相对较大的植物材料来源（每个分离周期高达10 g）。其他研究提出了从其他植物中分离不同毛状体类型的详细方案，例如，拟 南芥18，19的莲座叶毛。虽然本协议在这项工作中没有研究分离其他毛状体类型的适用性，但这项工作中提出的元素，特别是用LN代替隔离缓冲液，可能会改善毛状体分离过程。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢CannabiVar Ltd.的财政支持。所有植物材料均由以色列火山中心的Hinanit Koltai教授慷慨提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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