Summary
कैनबिस सैटिवा से ग्रंथियों के फैलाव और सेसिल ट्राइकोम के सुविधाजनक और उच्च-थ्रूपुट अलगाव और संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल केवल तरल नाइट्रोजन, सूखी बर्फ और नायलॉन छलनी का उपयोग करके ट्राइकोम के सूखे, गैर-बफर निष्कर्षण पर आधारित है और आरएनए निष्कर्षण और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।
Abstract
यह पेपर कैनबिस सैटिवा से ग्रंथियों के प्रतिपादक पीछा और सेसिल ट्राइकोम के सुविधाजनक और उच्च-थ्रूपुट अलगाव और संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। कैनबिनोइड और वाष्पशील टेरपेन चयापचय के लिए बायोसिंथेटिक मार्ग मुख्य रूप से कैनबिस ट्राइकोम में स्थानीयकृत होते हैं, और पृथक ट्राइकोम ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण के लिए फायदेमंद होते हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक लक्षण वर्णन के लिए ग्रंथियों के ट्राइकोम को अलग करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल असुविधाजनक हैं और समझौता ट्राइकोम हेड और अपेक्षाकृत कम मात्रा में पृथक ट्राइकोम प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे आरएनए क्षरण से बचने के लिए प्रोटीन अवरोधकों वाले महंगे उपकरण और अलगाव मीडिया पर भरोसा करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में क्रमशः सी. सैटिवा परिपक्व महिला पुष्पक्रम और पंखे की पत्तियों से बड़ी मात्रा में पृथक ग्रंथियों के कैपिटा स्टॉक्ड और सेसिल ट्राइकोम प्राप्त करने के लिए तीन अलग-अलग संशोधनों को संयोजित करने का सुझाव दिया गया है। पहले संशोधन में सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से ट्राइकोम के पारित होने की सुविधा के लिए पारंपरिक अलगाव माध्यम के लिए तरल नाइट्रोजन को प्रतिस्थापित करना शामिल है। दूसरे संशोधन में पौधे के स्रोत से ट्राइकोम को अलग करने के लिए सूखी बर्फ का उपयोग करना शामिल है। तीसरे संशोधन में पौधे की सामग्री को लगातार घटते छिद्र आकार के पांच सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से पारित करना शामिल है। माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग ने दोनों ट्राइकोम प्रकारों के लिए अलगाव तकनीक की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, पृथक ट्राइकोम से निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त थी।
Introduction
ग्लैंडुलर ट्राइकोम पौधों में मौजूद बाल जैसी संरचनाएं हैं जिनमें कई माध्यमिक मेटाबोलाइट्सहोते हैं 1 और नए बायोसिंथेटिक जीन और एंजाइम2 के एक मूल्यवान बैंक का प्रतिनिधित्व करते हैं। कैनबिस में, महत्वपूर्ण माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, कैनबिनोइड्स3 और टेरपेन4 का जैवसंश्लेषण ट्राइकोम में स्थानीयकृत है। औषधीय और मनोरंजक उपयोगों के लिए कैनबिस की गुणवत्ता निर्धारित करने में ट्राइकोम की भूमिका को ध्यान में रखते हुए, ट्राइकोम जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन रुचि का है। ट्राइकोम-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को चिह्नित करने के लिए, रुचि के ट्राइकोम को पहले अलग किया जाना चाहिए। ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल को पहली बार 19925 की शुरुआत में वर्णित किया गया था, और उनके नवीनतमविकास की हाल ही में समीक्षा की गई है। सामान्य तौर पर, ट्रांसक्रिप्टोमिक लक्षण वर्णन के लिए ग्रंथियों के ट्राइकोम निकालने के प्रोटोकॉल को दो अलग-अलग अनुक्रमिक चरणों में विभाजित किया जा सकता है। पहले चरण में पौधे के ऊतकों से ट्राइकोम का पूरी तरह से भौतिक पृथक्करण शामिल है। यह चरण सूखी बर्फ5, वाणिज्यिक उपकरण 6,7 के साथ कांच के मोतियों का उपयोग करके, जाल छलनी8 के खिलाफ पौधे की सामग्री को पीसकर, या एक अलगाव बफर9 में पौधे के ऊतकों को भंवर करके किया जा सकता है। दूसरे चरण में सूक्ष्म पौधों के अवशेषों और / या अन्य ट्राइकोम प्रकारों से रुचि के ट्राइकोम का अधिक परिष्कृत पृथक्करण शामिल है। इस चरण को घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन8,10 या विभिन्न आकारों 7,9 की छलनी का उपयोग करके निष्पादित किया जा सकता है। डिग्रेडिंग एजेंटों के लिए संसाधित ऊतकों में आरएनए की अत्यधिक संवेदनशीलता के कारण, ये दो अनुक्रमिक चरण आमतौर पर बर्फ-ठंडे अलगाव माध्यम में आयोजित किए जाते हैं, अक्सर प्रोटीनअवरोधकों की उपस्थिति में 4।
पारंपरिक ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल को बर्फ-ठंडे तापमान के अलावा, एक कुशल निष्कर्षण प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए बड़ी मात्रा में अलगाव माध्यम की आवश्यकता होती है। इन घटकों के संयोजन के परिणामस्वरूप एक कठिन, समय लेने वाली अलगाव प्रक्रिया होती है जो उच्च थ्रूपुट में बाधा डालती है। इसलिए, एक सीधा, उपयोगकर्ता के अनुकूल वैकल्पिक ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करना ट्राइकोम लक्षण वर्णन से जुड़े विभिन्न पहलुओं के लिए फायदेमंद होने की संभावना है। वर्तमान पेपर का उद्देश्य पारंपरिक प्रोटोकॉल से कई तत्वों को जोड़कर और एकीकृत करके कैनबिस सैटिवा से स्टॉक्ड और सेसिले ग्लैंडुलर कैपिटेट ट्राइकोम को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। इन तत्वों में शुष्क बर्फ5, घटते छिद्र आकार 7,9 के साथ कई सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से ट्राइकोमका गुजरना और अलगाव माध्यम8 के लिए तरल नाइट्रोजन (एलएन) को प्रतिस्थापित करना शामिल है।
पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में वर्तमान ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल की नवीनता, कई तरीकों से प्रस्तुत होती है। यह प्रोटोकॉल सुविधाजनक है, क्योंकि इसके लिए खतरनाक घटकों की आवश्यकता नहीं है। प्रक्रिया को प्रयोगशाला में न्यूनतम सावधानी के साथ आयोजित किया जा सकता है और उच्च थ्रूपुट की सुविधा प्रदान करता है। मानक तरल अलगाव माध्यम के लिए एलएन को प्रतिस्थापित करना अलगाव प्रक्रिया के दौरान ट्राइकोम की अखंडता सुनिश्चित करता है, जिससे बाद में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण सक्षम होता है। एलएन और सूखी बर्फ के उच्चीकरण पर, पृथक ट्राइकोम को हानिकारक अवशिष्ट से मुक्त छोड़ दिया जाता है। इसके अलावा, कमरे के तापमान पर एलएन की प्रवृत्ति पूरे प्रोटोकॉल में इसके उदार उपयोग की अनुमति देती है। इसके विपरीत, पारंपरिक अलगाव माध्यम की बड़ी मात्रा का उपयोग करने से इसकी हैंडलिंग में व्यावहारिक कठिनाइयां उत्पन्न होती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल ग्रंथियों के ट्राइकोम की शेष नाजुक सिर संरचना से डिस्क सेल के पृथक्करण को कम करता है, जिससे हेडस्पेस सामग्री का प्रतिधारण सक्षम होता है।
इस प्रोटोकॉल को एक विस्तृत चरण-दर-चरण फैशन में प्रस्तुत किया गया है जो सी सैटिवा ग्लैंडुलर कैपिटेट ट्राइकोम्स को अलग करने के तकनीकी अभ्यास की सहायता के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटोकॉल एक प्रबंधनीय वर्कफ़्लो प्रदान करता है जिसके परिणामस्वरूप उच्च एकाग्रता और शुद्धता के साथ पृथक ट्राइकोम होते हैं जो डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण के लिए उपयुक्त होते हैं।
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Protocol
नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पौधे सामग्री में चार सी सैटिवा एआरओ-वोल्कानी उपभेद (सीएस -11, सीएस -12, सीएस -13, और सीएस -14) शामिल थे, जो वोल्कानी सेंटर, इज़राइल में उगाए गए थे, जैसाकि कहीं और वर्णित है। ग्लैंडुलर कैपिटेट डंठल वाले ट्राइकोम को परिपक्व फूलों के पुष्पक्रम से अलग किया गया था, और ग्रंथियों के कैपिट सेसिल ट्राइकोम को परिपक्व गैर-फूल वाले मां पौधों से बड़े पंखे की पत्तियों से अलग किया गया था। सभी पौधों की सामग्री को ताजा उठाया गया और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।
चेतावनी: पूरे प्रोटोकॉल में सूखी बर्फ और एलएन का उपयोग किया जाता है। ये पदार्थ बेहद खतरनाक हैं। पृथक ट्राइकोम में शुष्क बर्फ के कण हो सकते हैं जो सील ट्यूबों में डालने पर खतरनाक गैस दबाव पैदा कर सकते हैं; इसलिए, सभी कैप्स को सुई-पंचर किया जाना चाहिए। बेहद कम तापमान पर हैंडलिंग के लिए सुरक्षात्मक चश्मे, उपयुक्त लैब पहनने और दस्ताने के उपयोग की अत्यधिक सलाह दी जाती है।
1. पौधे सामग्री से ट्राइकोम के प्रारंभिक पृथक्करण के लिए सेटअप
- एक 5 एल प्लास्टिक कंटेनर में हथौड़ा और एक कठोर सपाट वस्तु का उपयोग करके एक सूखे बर्फ ब्लॉक को छोटे महीन गुच्छे में कुचल दें।
- गैर-कुचल सूखी बर्फ से महीन सूखे बर्फ के गुच्छे (5 मिमी से छोटे) को एक बड़े छन्नी (5 मिमी से छोटे छिद्रों के माध्यम से) के साथ एक और 5 एल प्लास्टिक कंटेनर में छान लें। सूखे बर्फ के गुच्छे के लगभग 200 सेमी3 (200 एमएल निशान) को एक सीधा 1 एल ग्लास बीकर में डालें।
- कुचल सूखी बर्फ की पहली परत पर जमे हुए सी सैटिवा पुष्पक्रम (अब से पौधे सामग्री के रूप में संदर्भित) जोड़ें, और बारीक कुचल सूखी बर्फ की 200 सेमी3 की अतिरिक्त परत के साथ कवर करें।
- 1 लीटर स्क्रीन डोर मच्छरदानी की दो से तीन परतों के साथ 1 एल ग्लास बीकर के उद्घाटन को कवर करें, और इसे रबर बैंड (चित्रा 1) के साथ ग्लास कप के बाहरी किनारों पर सुरक्षित करें।
- एलएन को एक बड़े गोल-नीचे स्टेनलेस स्टील कंटेनर में डालें ( सामग्री की तालिका देखें), जहां पृथक ट्राइकोम एकत्र किए जाएंगे।
- आटे के सिफ्टर जाल को नीचे से ढकने के लिए आटे के सिफ्टर/छलनी छन्नी में 350 μm जाल डालें (चित्र 2)। यदि एक डिटैचेबल प्लास्टिक रिंग के साथ एक आटा सिफ़्टर उपलब्ध है, तो 350 μm जाल डालें ताकि यह आटे के सिफ्टर के जाल के नीचे सुरक्षित हो। यदि नहीं, तो रबर बैंड के साथ आटा सिफ्टर की परिधि में 350 μm जाल को सुरक्षित करें।
- एलएन से भरे बड़े गोल-नीचे स्टेनलेस स्टील कंटेनर के ऊपर आटा सिफ्टर रखें (चित्रा 3)। सुनिश्चित करें कि कंटेनर की चौड़ाई आटा सिफ्टर से अधिक है ताकि गोल-तल स्टेनलेस स्टील कंटेनर के बाहर सिफ्टेड द्रव्यमान के नुकसान को कम किया जा सके।
2. पौधे की सामग्री से ट्राइकोम का पृथक्करण
- 1 लीटर गिलास को इसके उद्घाटन के साथ आटा सिफ्टर की ओर नीचे की ओर इंगित करते हुए हिलाएं जैसे कि एक बड़े नमक शेकर का उपयोग करके (चित्रा 4)।
- आटे की छलनी पर जमा सूखी बर्फ और पौधे की सामग्री को छानने की अनुमति देने के लिए हर 2-3 मिनट में 1 एल ग्लास बीकर को अलग रखें।
- नीचे गोल-तल स्टेनलेस स्टील कंटेनर में एलएन में संयंत्र सामग्री के पारित होने की सुविधा के लिए आटे को क्षैतिज रूप से छान लें।
- स्टेनलेस स्टील कंटेनर में एलएन जोड़ें और 1 एल ग्लास बीकर में कुचल सूखी बर्फ जोड़ें जब उनका स्तर कम हो जाता है। ग्लास बीकर में इस्तेमाल की गई पौधे की सामग्री को अतिरिक्त 10 ग्राम ताजा पौधे सामग्री के साथ फिर से भरें जब आटा छलनी पर पौधे की सामग्री समाप्त हो जाती है। पुनःपूर्ति को आमतौर पर दो बार से अधिक दोहराने की आवश्यकता नहीं होती है।
- चरण 2.1-2.4 को दोहराएं जब तक कि गोल-तल स्टेनलेस स्टील कंटेनर में समृद्ध ट्राइकोम की पर्याप्त मात्रा एकत्र न हो जाए। आम तौर पर, आरएनए निष्कर्षण और प्रतिलेख विश्लेषण के लिए 20 ग्राम ताजा पौधे सामग्री पर्याप्त है।
- सत्यापित करें कि एलएन में डूबे स्टेनलेस स्टील कंटेनर के तल पर एक सफेद पाउडर जैसा पदार्थ (पौधे के मलबे, ग्रंथियों के ट्राइकोम और कुचल सूखी बर्फ से मिलकर) है। एक सूक्ष्म अवलोकन यह निर्धारित करने में मदद करेगा कि ट्राइकोम की पर्याप्त मात्रा एकत्र की गई है या नहीं; हालाँकि, यह कदम प्रोटोकॉल के प्रवाह को बाधित कर सकता है। आमतौर पर, प्रारंभिक पौधे सामग्री का 10-20 ग्राम अधिकांश अलगाव के लिए पर्याप्त है; हालांकि, पौधों के ट्राइकोम घनत्व में अंतर हो सकता है।
नोट: इस बिंदु से, प्रयोग को बाद में रोका और पुनरारंभ किया जा सकता है। यदि थोड़े समय के लिए रोक दिया जाता है, तो पर्याप्त मात्रा में एलएन जोड़ा जाना चाहिए ताकि ट्राइकोम जलमग्न रहें। वैकल्पिक रूप से, ट्राइकोम को बाद में उपयोग के लिए 3 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र और संग्रहीत किया जा सकता है, जैसा कि चरण 5 में वर्णित है।
3. अन्य ट्राइकोम प्रकारों से ग्रंथियों के कैपिट ट्राइकोम (डंठल और सेसिल) का पृथक्करण, जैसे बल्बऔर सिस्टोलिथिक ट्राइकोम, और मलबे
- एक साफ छोटे गोल-नीचे स्टेनलेस स्टील कंटेनर में एलएन की एक छोटी मात्रा जोड़ें।
- 20 सेमी x 20 सेमी फोल्ड प्राप्त करने के लिए 150 μm जाल आकार के साथ 40 सेमी x 40 सेमी माइक्रो-छलनी को दो बार मोड़ें, और इसे खोलें। सुनिश्चित करें कि यह शंकु जैसी आकृति जैसा दिखता है (चित्रा 5)।
- जाल शंकु को गोल-तल स्टेनलेस स्टील कंटेनर के किनारे पर एक या दो कपड़े के साथ सुरक्षित करें ताकि शंकु का खुला हिस्सा सीधा हो और इसका नुकीला हिस्सा आंशिक रूप से एलएन में डूब जाए।
- धीरे से चरण 2.6 से एलएन और सफेद पाउडर जैसे पदार्थ को सूक्ष्म-छलनी शंकु में डालें।
- पहले कंटेनर से किसी भी शेष पौधे की सामग्री को 150 μm जाल शंकु में इकट्ठा करने और स्थानांतरित करने के लिए धीरे से एक विस्तृत ब्रश लागू करें।
- पहले कंटेनर में अधिक एलएन जोड़ें, और ब्रशिंग गति को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी पौधे सामग्री सूक्ष्म-छलनी शंकु में स्थानांतरित न हो जाए।
- कंटेनर के ढक्कन से कपड़े के पिन को सावधानीपूर्वक अलग करें, और माइक्रो-छलनी शंकु खोलें ताकि ट्राइकोम खोले गए माइक्रो-छलनी के बीच में स्थित हों। सूक्ष्म छलनी के सभी चार कोनों को एक साथ पकड़ें ताकि ट्राइकोम युक्त मध्य भाग एलएन में डूबा रहे (चित्र 6)।
- माइक्रो-छलनी के सभी चार कोनों को पकड़ते हुए, धीरे से स्टील के कंटेनर में एलएन में माइक्रो-छलनी को डुबोएं और हिलाएं जैसे कि एक चाय बैग डालें। इस डिपिंग/शेकिंग (ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज) गति को 1 मिनट के लिए जारी रखें। अलगाव की गुणवत्ता और मात्रा के बीच एक व्यापार है। लंबे समय तक डिपिंग गति के परिणामस्वरूप ट्राइकोम की बड़ी मात्रा हो सकती है, लेकिन उनका अलगाव ग्रेड खराब हो सकता है। कुल मिलाकर, गुणवत्ता और मात्रा दोनों के लिए 1 मिनट को पर्याप्त माना जाता है।
नोट: यह चोरी की गति प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है और तदनुसार निष्पादित किया जाना चाहिए। - वैकल्पिक: गैर-छिद्रित पौधे के मलबे और बड़े ट्राइकोम (अभी भी एलएन में डूबे हुए) को स्कूप करें जो माइक्रो-छलनी के केंद्र में 13 एमएल या 50 एमएल टेस्ट ट्यूब में लिपटे हुए हैं, और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करते हैं।
सावधानी: दबाव वाली गैस (सूखी बर्फ और एलएन अवशेषों से) के निर्माण से बचने के लिए, एक निष्फल सुई के साथ टेस्ट ट्यूब की टोपी में एक छेद पंचर करें। दबाव कम होने के बाद कैप को बदला जा सकता है, जो आमतौर पर 24 घंटे के बाद होता है।
4. घटते छिद्र आकार के सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से ट्राइकोम पास करना
- छोटे गोल-नीचे स्टेनलेस स्टील कंटेनर के तल पर एलएन में डूबे हुए ट्राइकोम को क्रमिक रूप से घटते छिद्र आकार (105 μm, 80 μm, 65 μm, और 50 μm) के साथ सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से स्थानांतरित करें, जैसा कि चरण 3 में प्रस्तुत किया गया है।
5. वांछित ट्राइकोम का संग्रह
- एलएन में डूबे हुए वांछित ट्राइकोम को हटा दें और प्री-चिल्ड (एलएन में) चम्मच का उपयोग करके 50 μm माइक्रो-चलनी में लपेटें। उन्हें एक साफ प्लेट पर रखें।
नोट: इस अंतिम अलगाव चरण में, छलनी से वांछित ट्राइकोम एकत्र किए जाते हैं। - पाउडर जैसे ट्राइकोम को जल्दी से एक लेबल प्री-चिल्ड 1.5 एमएल ट्यूब में पूर्व-ठंडा स्पैटुला या ट्यूब में डाले गए स्कूपुला के माध्यम से स्थानांतरित करें (चित्रा 7)। आगे के अध्ययन के लिए ट्यूबों को तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: पूरे अलगाव प्रोटोकॉल को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध वर्कफ़्लो चार्ट चित्रा 8 में दिया गया है।
6. शुद्ध ट्राइकोम का अवलोकन और विश्लेषण
- प्री-कूल्ड (एलएन के माध्यम से ) स्पैटुला का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पृथक ट्राइकोम की एक छोटी मात्रा (10 मिलीग्राम) रखें। पानी की एक बूंद जोड़ें, और धुंधला किए बिना सीधे प्रकाश माइक्रोस्कोप पर निरीक्षण करें। कम (10x) और उच्च (40x) आवर्धन का उपयोग करके समग्र अलगाव और संदूषण की डिग्री का मूल्यांकन करें। गैर-ट्राइकोम ऊतक के संबंध में ट्राइकोम की सापेक्ष मात्रा से संवर्धन का अनुमान लगाया जाता है, जैसा कि चित्र 9 में दिखाया गया है।
- 50 मिलीग्राम पृथक सी. सैटिवा ग्लैंडुलर कैपिटेट स्टॉक्ड और सेसिल ट्राइकोम से आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता विश्लेषण करें।
नोट: आरएनए निष्कर्षण के लिए एमआरएनए शुद्धिकरण की पॉली-ए-आधारित रणनीति को नियोजित करने वाली एक वाणिज्यिक निष्कर्षण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था।- लाइसिस समाधान में पृथक ट्राइकोम के 50 मिलीग्राम, 30 सेकंड के लिए भंवर, 5 मिनट के लिए 35 kHz पर बर्फ-ठंडा अल्ट्रासोनिक सफाई इकाई में सोनिकेट, और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार नमूनों से एमआरएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- ट्राइकोम से निकाले गए आरएनए की अखंडता का अनुमान लगाने के लिए, लैब-ऑन-ए-चिप सिस्टम का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता, कुल मात्रा और आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) मान निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- ट्राइकोम अंशों (वैकल्पिक) का आरएनएसेक विश्लेषण करें। आरएनएसेक विश्लेषण और अनुक्रमित पठन के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण मानक आउटसोर्सिंग सेवाओं द्वारा किया जा सकता है
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Representative Results
पारंपरिक ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में इस प्रोटोकॉल में शामिल मुख्य संशोधन एलएन के साथ मानक अलगाव माध्यम को प्रतिस्थापित कर रहा है। एक अलगाव माध्यम के रूप में एलएन का उपयोग करने से एक आराम से वर्कफ़्लो की अनुमति मिलती है, क्योंकि जब तक नमूने एलएन में डूबे रहते हैं, तब तक चयापचय क्षरण होने की संभावना नहीं होती है। इसके अलावा, जैसा कि प्रोटोकॉल पारंपरिक ट्राइकोम अलगाव माध्यम में उपयोग किए जाने वाले खतरनाक घटकों (यानी, ऑरिन्ट्रिकारबॉक्सिलिक एसिड और β-मर्काप्टोएथेनॉल) से बचता है, काम रासायनिक हुड तक सीमित नहीं है। फिर भी, सूखी बर्फ और एलएन को संभालते समय आवश्यक सावधानी बरतना महत्वपूर्ण है।
वर्तमान प्रोटोकॉल के फायदों का आकलन करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल से ट्राइकोम अलगाव परिणामों की तुलना पारंपरिक ट्राइकोम अलगाव प्रक्रिया (जिसमें एक जलीय बफर, ग्लास बीड्स और ट्राइकोम अलगाव के लिए एक अच्छी छलनी का उपयोग किया गया था) का उपयोग करके प्राप्त किए गए परिणामों के साथ की गई थी, शुरू में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके। प्रकाश माइक्रोस्कोप निरीक्षण के माध्यम से विभिन्न अलगाव चरणों के घटकों की तुलना अलगाव प्रक्रिया की प्रगति के रूप में बढ़ते ट्राइकोम अलगाव डिग्री को दर्शाती है। अलगाव प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण (105-150 μm माइक्रो-चलनी) में, पत्ती के ऊतकों के टुकड़े पृथक भाग (चित्रा 9 ए) में प्रमुख थे, अंतिम अलगाव उत्पाद के विपरीत, जो लगभग पूरी तरह से पृथक ट्राइकोम (चित्रा 9 सी) से बना था। यह सत्यापित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि पृथक नमूने संदूषण मुक्त हैं (चित्रा 9 बी)।
यद्यपि इस अध्ययन में ट्राइकोम घनत्व की मात्रा निर्धारित नहीं की गई थी, लेकिन अंतिम अलगाव चरण में पृथक ग्रंथियों के कैपिटा और सेसिल ट्राइकोम की गुणवत्ता को चित्रा 10 में देखा जा सकता है। शुद्धता की तुलना पारंपरिक प्रोटोकॉल12 (चित्रा 10 सी) का उपयोग करके ट्राइकोम अलगाव के साथ प्राप्त की जा सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, नाजुक डंठल वाले ट्राइकोम सिर संरचना को बरकरार रखा जाता है, और पृथक डंठल वाले ट्राइकोम के पूरे सिर दिखाई देते हैं (चित्रा 10 डी), जबकि पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके, पूर्ण ट्राइकोम सिर संरचना गायब है, और केवल डिस्क कोशिकाएं मौजूद हैं (चित्रा 10 ई)। उपज को भी बहुत बढ़ाया जा सकता है क्योंकि सूखी बर्फ और एलएन का उपयोग पौधे की सामग्री की सीमा को कम करता है जिसे निकाला जा सकता है। हमारे गैर-जलीय प्रोटोकॉल का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह केवल सूखी बर्फ और एलएन का उपयोग करता है, और इसलिए, वाष्पित होने के बाद अलगाव माध्यम के कोई अवशिष्ट घटक नहीं बचे हैं। एलएन का उपयोग चिपचिपे माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की रिहाई को रोकता है जो ट्राइकोम्स13 के एकत्रीकरण का कारण बन सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, अंतिम अलगाव चरण में पृथक ट्राइकोम को सूखे महीन पाउडर के रूप में बरामद किया गया था।
वर्तमान प्रोटोकॉल के दौरान बनाए गए बेहद कम तापमान पारंपरिक बफर मीडिया-रोकथाम आरएनए गिरावट (जब तक नमूने जलमग्न रखे जाते हैं) के उद्देश्यों को पूरा करने और डाउनस्ट्रीम आणविक अनुप्रयोगों को सुविधाजनक बनाने में पर्याप्त होने की संभावना है। इस धारणा को मान्य करने के लिए, हमने पृथक ट्राइकोम से आरएनए निकाला और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरएनए अखंडता का अनुमान लगाया। प्राप्त उच्च आरआईएन मान (9.4 से 10) और अलग जेल क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 11) स्पष्ट रूप से एक उच्च आरएनए अखंडता का संकेत देते हैं। आरएनए नमूनों का आरएनएसेक द्वारा आगे विश्लेषण किया गया था, और सभी पुस्तकालयों से >20 एम उच्च गुणवत्ता वाले रीड प्राप्त किए गए थे।
यह सत्यापित करने के लिए कि, वास्तव में, पृथक ट्राइकोम अंश से एमआरएनए ट्राइकोम-व्यक्त जीन में समृद्ध है, हमने फ्लोरेसेंस और संबंधित पृथक डंठल वाले ट्राइकोम के लिए हमारे जीन अभिव्यक्ति परिणामों की तुलना लिविंगस्टन एट अल.14 द्वारा प्रस्तुत पिछले परिणामों से की, जिसमें कैनबिस के शुद्ध ट्राइकोम की जीन अभिव्यक्ति की विशेषता थी (उनके पूरक तालिका 1 से अनुकूलित)। ). उनके प्रोटोकॉल में जलीय बफर में सम्मिश्रण, छलनी के माध्यम से फ़िल्टरिंग और अंत में, परकोल ढाल का उपयोग करके ट्राइकोम शुद्धिकरण शामिल था। ट्राइकोम-व्यक्त जीन को कैनाबिडियोलिक एसिड सिंथेज़ (सीबीडीएएस), एक ट्राइकोम-विशिष्ट जीन मार्कर14 की जीन अभिव्यक्ति के साथ सबसे अधिक सहसंबद्ध (पी > 0.95) के रूप में वर्णित किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों और लिविंगस्टन एट अल.14 में प्रस्तुत परिणामों के बीच जीन अभिव्यक्ति की तुलना से पता चलता है कि हमारे ट्राइकोम अंश में 12 सबसे अधिक समृद्ध जीन भी लिविंगस्टन एट अल अध्ययन14 में समृद्ध थे, जिसमें ट्राइकोम मार्कर जीन सीबीडीएएस (तालिका 1) भी शामिल था। विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल से काफी अधिक संवर्धन अनुपात प्राप्त किया गया था। ये परिणाम ट्राइकोम-समृद्ध जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की वैधता की पुष्टि करते हैं।
इसके अलावा, हमने कैनबिस के पांच एक्टिन जीनों के अभिव्यक्ति डेटा की तुलना की, क्योंकि एक्टिन का उपयोग अक्सर ट्रांसस्क्रिप्टम अध्ययनों के लिए संदर्भ जीन के रूप में किया जाता है (तालिका 2)। पृथक स्टॉक्ड और सेसिल ट्राइकोम दोनों के लिए हमारे परिणाम लिविंगस्टन एट अल अध्ययन14 द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों के बराबर थे।
अंत में, हमने क्लोरोफिल ए-बी बाइंडिंग प्रोटीन परिवार जीन के लिए अभिव्यक्ति और ट्राइकोम संवर्धन डेटा की गणना की, जो संभवतः ट्राइकोम समृद्ध नहीं हैं (तालिका 3)। दरअसल, इस जीन परिवार के 12 सदस्यों ने <1 का ट्राइकोम संवर्धन कारक दिखाया, जो ट्राइकोम संवर्धन के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। ये संयुक्त परिणाम पुष्पक्रम और पृथक ट्राइकोम अंशों के अद्वितीय अभिव्यक्ति पैटर्न को इंगित करते हैं और पृथक ट्राइकोम अंश की ट्राइकोम अखंडता और गुणवत्ता का समर्थन करते हैं।
चित्रा 1: 1 एल ग्लास बीकर लोड करने के लिए सेटअप। 1 मिमी स्क्रीन दरवाजा जाल कुछ रबर बैंड (नहीं दिखाया गया) के माध्यम से ग्लास बीकर के किनारों पर सुरक्षित है। 1 एल ग्लास बीकर को एक सीधी स्थिति में लोड किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: आटा सिफ्टर का सेटअप। आटा सिफ्टर को नीचे रबर बैंड के माध्यम से 350 μm माइक्रो-छलनी के साथ फिट किया जाता है (दिखाया नहीं गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: ट्राइकोम अलगाव के पहले चरण का सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: ग्लास बीकर का सेटअप। ग्लास बीकर में 1 मिमी स्क्रीन-डोर (मच्छर) जाल की तीन परतें लगी हैं, जिन्हें उद्घाटन में रबर बैंड के माध्यम से सुरक्षित किया गया है। बीकर का उद्घाटन नीचे की ओर इशारा कर रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: ट्राइकोम अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली सूक्ष्म-छलनी शंकु संरचना का सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: पृथक ट्राइकोम युक्त सूक्ष्म-छलनी की डिपिंग और हिलने की गति के लिए सेटअप। ऊर्ध्वाधर आंदोलन एक चाय बैग जलसेक के समान होना चाहिए। सेटअप उपयोग किए गए प्रत्येक जाल आकार के लिए समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: अंतिम पृथक ट्राइकोम को स्थानांतरित करने के लिए सेटअप। अंतिम पृथक ट्राइकोम को लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। सभी बर्तनों को एलएन के साथ पहले से ठंडा किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 8: फ़्लोचार्ट प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। सी से ग्रंथियों के कैपिट ट्राइकोम्स का अलगाव। सैटिवा में तीन चरण शामिल हैं: (1) पौधे के स्रोत से ट्राइकोम की प्रारंभिक टुकड़ी और दो छलनी (1 मिमी और 350 μm) के माध्यम से मार्ग, (2) पौधे की सामग्री को घटते छिद्र आकार (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm, और 50 μm), और (3) अलग-अलग ट्राइकोम का संग्रह पूर्व-ठंडा 1.5 mL ट्यूब में बदलना। सूक्ष्म-छलनी चरणों में से किसी से भी बरकरार ऊतक को इसी तरह एकत्र किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 9: वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके पृथक ट्राइकोम की माइक्रोस्कोपी छवियां। (ए, बी, सी) सी. सैटिवा फैन पत्तियों से ग्लैंडुलर कैपिटे सेसिल ट्राइकोम। (ए) मध्य-अलगाव, 105 μm से 150 μm तक के छिद्र आकार के साथ सूक्ष्म-छलनी से। हरी, गैर-ट्राइकोम सामग्री की बड़ी मात्रा के प्रतिधारण पर ध्यान दें। (बी) अलगाव का अंत, 50 μm से 65 μm तक छिद्र आकार वाले सूक्ष्म-छलनी से, पौधे के स्रोत (लाल तीर) से दूषित, और (C) संदूषण से मुक्त। स्केल पट्टियाँ = (A) 100 μm, (B, C) 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 10: पृथक ट्राइकोम की माइक्रोस्कोपी छवियां। (ए, बी) सी. सैटिवा से ग्लैंडुलर कैपिटेट ट्राइकोम्स: (ए) वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किया गया प्रकार, और (बी) सेसिल प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके पृथक। (सी) एक पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए ट्राइकोम का पीछा किया गया। ट्राइकोम की कम उपज और समझौता न किए गए सिरों की कमी स्पष्ट है। (D, E) (डी) वर्तमान प्रोटोकॉल और (ई) पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए स्कलैंडुलर कैपिटेट ट्राइकोम। (च) 65 μm से 105 μm माइक्रो-छलनी (क्लोज-अप) से अलग किए गए ग्लैंडुलर स्टॉक्ड ट्राइकोम। अलग-अलग सिर और डंठल भागों के साथ, डंठल तिरछे ट्राइकोम के उच्च अलगाव पर ध्यान दें। लाल तीर सिस्टोलिथिक ट्राइकोम का संकेत देते हैं, नीले तीर ग्रंथियों के कैपिटे का पीछा करने वाले ट्राइकोम से कुछ डंठल भागों को इंगित करते हैं, और पीले तीर अलग डिस्क कोशिकाओं का संकेत देते हैं। स्केल बार = (A, C, D, E, F) 100 μm, (B) 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 11: ट्राइकोम से निकाले गए आरएनए की अखंडता का विश्लेषण। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके ग्रंथियों के कैपिटे से निकाले गए आरएनए नमूनों के क्रोमेटोग्राफ और जैल को अलग किया गया और सेसिल ट्राइकोम को अलग किया गया। (ए-डी) से आरएनए के परिणाम इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली चार कल्टीवेटर लाइनों, सीएस -11, सीएस -12, सीएस -13, और सीएस -14, और (ई-एच) सेसिले ट्राइकोम, सीएस -11, सीएस -12, सीएस -13 और सीएस -14। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: लिविंगस्टन एट अल.14 द्वारा प्राप्त परिणामों के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरएनएसेक के साथ प्राप्त ट्राइकोम-समृद्ध जीन अभिव्यक्ति की तुलना। लिविंगस्टन एट अल.14 द्वारा कैनाबिडिओलिक एसिड सिंथेज़ (सीबीडीएएस) अभिव्यक्ति के लिए उच्चतम सहसंबंध प्रदर्शित करने वाले 12 जीन ( विली प्रकाशकों की अनुमति से अनुकूलित उनके पूरक तालिका डेटा एस 4 से), जिसे ट्राइकोम-विशिष्ट जीन मार्कर माना जाता है, को तुलना के लिए चुना गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 2: वर्तमान प्रोटोकॉल (कैनाबिस किस्म सीएस -11 11 (वर सीएस -11) से हमारे जीन अभिव्यक्ति डेटा) से पृथक स्टॉक्ड और सेसिल ट्राइकोम के पांच कैनबिस एक्टिनजीनों की जीन अभिव्यक्ति (एफपीकेएम) की तुलना लिविंगस्टन एट अल .14 से अनुकूलित पहले प्रकाशित परिणामों के साथ। लिविंगस्टन एट अल .14 के परिणाम फिनोला एफएन संदर्भ जीनोम के आधार पर प्रस्तुत किए गए थे, और उनके डेटा को सीएस 10.2 संदर्भ जीनोम में अनुवादित किया गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 3: कैनबिस क्लोरोफिल ए-बी बाइंडिंग जीन की जीन अभिव्यक्ति (एफपीकेएम) पूरे पुष्पक्रम के जीन और वर्तमान प्रोटोकॉल से अलग किए गए ट्राइकोम (वार सीएस -11 से हमारे जीन अभिव्यक्ति डेटा)। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वर्तमान में उपलब्ध ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल में दो मुख्य संशोधनों का वर्णन किया गया है। इनमें प्रारंभिक चरण में सूखी बर्फ का उपयोग करके पौधे की सामग्री से ट्राइकोम की टुकड़ी और आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरल बफर माध्यम के लिए एलएन को प्रतिस्थापित करना शामिल है। सैटिवा ट्राइकोम शुद्धिकरण के लिए पहला संशोधन एक पुराने प्रोटोकॉल पर आधारित है जिसने ट्राइकोम को जेरेनियम पेडीसेल5 से अलग करने के लिए कुचल सूखी बर्फ का उपयोग शुरू किया था। जबकि पारंपरिक ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल आम तौर पर एक छोटी (50 एमएल) टेस्ट ट्यूब का उपयोग करते हैं, इस अध्ययन में एक 1 एल ग्लास बीकर का उपयोग कुचल सूखी बर्फ की उदार मात्रा के साथ किया गया था, जिससे प्रारंभिक पौधे सामग्री (10 ग्राम तक) की एक बड़ी मात्रा को संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में, पहले अलगाव चरण में सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से ट्राइकोम के दो अतिरिक्त मार्ग पेश किए गए थे। पहला चरण एक ऊर्ध्वाधर ऊपर-नीचे जोरदार नमकशेकर जैसी गति को नियोजित करता है, और दूसरा आटा सिफ्टर में सूक्ष्म छलनी के माध्यम से क्षैतिज छानने की गति को नियोजित करता है। संयुक्त क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर चोरी गतियों को ट्राइकोम आकार और आकार के आधार पर एक बढ़े हुए पृथक्करण को बढ़ावा देने का सुझाव दिया जाता है।
दूसरा, सबसे महत्वपूर्ण संशोधन अलगाव माध्यम को संबोधित करता है जिसमें सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से मार्ग आयोजित किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, पारंपरिक जलीय अलगाव माध्यम को पूरी तरह से एलएन द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है। एक पिछले प्रोटोकॉल8 ने ट्राइकोम अलगाव के लिए पहले चरण में एलएन का भी उपयोग किया, पौधे की सामग्री से ट्राइकोम को अलग किया (एक जाल छलनी के खिलाफ फूल सामग्री को झंझरी करके), लेकिन तरल बफर निष्कर्षण और परकोल घनत्व पृथक्करण के साथ जारी रहा। पारंपरिक अलगाव माध्यम के स्थान पर एलएन को प्रतिस्थापित करने से पारंपरिक अलगाव माध्यम के विषाक्त घटकों से जुड़ी विशेष प्रक्रियाओं की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जिससे आराम से वर्कफ़्लो और उच्च थ्रूपुट की अनुमति मिलती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता कमरे के तापमान पर जल्दी से जलमग्न होने के लिए सूखी बर्फ और एलएन की प्रवृत्ति पर निर्भर करती है। यह सुविधा अलगाव प्रक्रिया के दौरान उनके उदार आवेदन को सक्षम बनाती है। इसके विपरीत, पारंपरिक अलगाव बफर की एक बड़ी मात्रा का उपयोग करने से इसकी बड़ी मात्रा को संभालने से संबंधित तकनीकी जटिलताएं होंगी।
जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल में अलगाव प्रक्रिया ग्रंथियों के कैपिटे स्टार्केड ट्राइकोम की नाजुक सिर संरचना के प्रतिधारण को बढ़ावा देती है, पारंपरिक प्रोटोकॉल शेष ग्रंथि सामग्री से डिस्क कोशिकाओं के पृथक्करण को बढ़ावा देते हैं, जो आसानी से धोया जाता है, केवल डिस्क कोशिकाओं को छोड़ देता है। इस घटना को हमारे नए प्रोटोकॉल (चित्रा 10 डी, ई) के लिए एक पारंपरिक अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में हमारे परिणामों में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। सूक्ष्म अवलोकन के अलावा, ट्राइकोम (इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पृथक) से निकाले गए आरएनए का गुणवत्ता विश्लेषण स्पष्ट रूप से इंगित करता है कि अलगाव प्रक्रिया के दौरान आरएनए अखंडता को बनाए रखा जाता है और यह ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।
इसके अलावा, हमारे पृथक ट्राइकोम अंश से जीन अभिव्यक्ति के परिणाम इंगित करते हैं कि अंश स्थापित ट्राइकोम-व्यक्त जीन (तालिका 1) में अत्यधिक समृद्ध है और, पारस्परिक रूप से, गैर-ट्राइकोम-व्यक्त जीन का प्रतिनिधित्व नहीं किया जाता है (तालिका 3)।
वर्तमान प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा सूक्ष्म-छलनी से गुजरने की प्रवृत्ति के अनुसार ट्राइकोम को अलग करने के लिए इसकी विशेष उपयुक्तता है। जबकि प्रोटोकॉल को घनत्व ढाल का उपयोग करके ट्राइकोम अलगाव पर सीधे लागू नहीं किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो घनत्व ढाल चरण से पहले ट्राइकोम को अलग करने के लिए उपयुक्त है। इस अध्ययन में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पृथक ट्राइकोम एक प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन से नहीं गुजरे, और इस तरह के आवेदन के लिए उनकी उपयुक्तता को सत्यापित करने की आवश्यकता है। हालांकि, चूंकि स्टॉक्ड और सेसिल ट्राइकोम दोनों से निकाले गए आरएनए नमूनों ने कोई गिरावट नहीं दिखाई, जैसा कि कोमैटोग्राफ और उच्च आरआईएन मूल्यों द्वारा इंगित किया गया है, यह माना जा सकता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ पृथक ट्राइकोम प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए आवश्यक आवश्यकताओं को पूरा करने की संभावना है।
पंखे की पत्तियों से ग्रंथियों के कैपिट सेसिल ट्राइकोम की अलगाव डिग्री (प्रारंभिक पौधे स्रोत और अन्य प्रकार के ट्राइकोम से) बहुत अधिक है, क्योंकि पंखे की पत्तियों में ग्रंथियों के कैपिटे का पीछा करने वाले ट्राइकोम प्रकार15,16 की कमी होती है, और सिस्टोलिथिक और बल्बस ट्राइकोम आसानी से उनके संरचनात्मक और आकार के अंतर के कारण सेसिल ट्राइकोम से अलग हो जाते हैं। हालांकि, ग्रंथियों के फैलाव के संबंध में, संवर्धन के रूप में उनकी अलगाव डिग्री को संबोधित करना सबसे अच्छा है, क्योंकि पौधे के स्रोत, परिपक्व महिला पुष्पक्रम में प्री-डंठल प्रकार14 के अलावा सभी चार ट्राइकोम प्रकार होते हैं। यह कारण है कि अधिकांश पृथक ग्रंथियों के कैपिटेट ट्राइकोम डंठल प्रकार के होते हैं, क्योंकि उनकी ऊंची स्थिति (एपिडर्मल-बाउंड सेसिल ट्राइकोम के संबंध में) उनके सूखे बर्फ के कण से टकराने और पौधे से अलग होने की संभावना को बढ़ाती है। इसके अलावा, डंठल वाले ट्राइकोम के सिर और डंठल के हिस्सों को जोड़ने वाले मोड़ को ग्रंथि सिर17 के विघटन से जुड़ी कमजोरी का बिंदु माना जाता है। इस प्रकार, पीछा किए गए ट्राइकोम भाग को एक अत्यधिक समृद्ध अंश के रूप में संदर्भित करना सटीक होगा जिसमें सेसिल प्रकार के संभावित कम संदूषण होते हैं। हालांकि, इस धारणा को मान्य करने के लिए आगे का विश्लेषण नहीं किया गया था।
अन्य पौधों की प्रजातियों से ग्रंथियों के ट्राइकोम निकालने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की उपयुक्तता अभी तक निर्धारित नहीं की गई है। सैटिवा में उच्च ट्राइकोम घनत्व संभवतः वर्तमान प्रोटोकॉल की सफलता में योगदान देता है। हालांकि, यह संभावना नहीं है कि यह एकमात्र कारण है, क्योंकि अपेक्षाकृत बड़े पौधे सामग्री स्रोत (प्रति अलगाव चक्र 10 ग्राम तक) को प्रभावी ढंग से संसाधित किया जा सकता है। अन्य अध्ययनों ने अन्य पौधों से विभिन्न ट्राइकोम प्रकारों को अलग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए हैं, उदाहरण के लिए, एराबिडोप्सिस थैलियाना18,19 से रोसेट पत्ती ट्राइकोम। जबकि इस काम में अन्य ट्राइकोम प्रकारों को अलग करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का अध्ययन नहीं किया गया था, इस काम में प्रस्तुत तत्व, विशेष रूप से अलगाव बफर के लिए एलएन का प्रतिस्थापन, ट्राइकोम अलगाव प्रक्रिया में सुधार करने की संभावना है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक कैनबीवर लिमिटेड से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। सभी पौधों की सामग्री उदारतापूर्वक वोल्कानी सेंटर, इज़राइल से प्रोफेसर हिनानिट कोलताई द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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