Summary
Esrar sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, sadece sıvı azot, kuru buz ve naylon elekler kullanılarak trikomların kuru, tamponsuz ekstraksiyonuna dayanır ve RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için uygundur.
Abstract
Bu yazıda, Cannabis sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Kannabinoid ve uçucu terpen metabolizması için biyosentetik yollar öncelikle Esrar trikomlarında lokalize edilir ve izole trikomlar transkriptom analizi için faydalıdır. Transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların izole edilmesine yönelik mevcut protokoller sakıncalıdır ve tehlikeye atılmış trikom kafaları ve nispeten düşük miktarda izole trikom sağlar. Ayrıca, RNA yıkımını önlemek için pahalı cihazlara ve protein inhibitörleri içeren izolasyon ortamına güvenirler. Bu protokol, sırasıyla C. sativa olgun dişi salkımından ve fan yapraklarından büyük miktarda izole glandüler kapitat saplı ve sapsız trikom elde etmek için üç bireysel modifikasyonun birleştirilmesini önermektedir. İlk modifikasyon, trikomların mikro eleklerden geçişini kolaylaştırmak için geleneksel izolasyon ortamı yerine sıvı azotun ikame edilmesini içerir. İkinci modifikasyon, trikomları bitki kaynağından ayırmak için kuru buz kullanmayı içerir. Üçüncü modifikasyon, bitki materyalinin azalan gözenek boyutlarına sahip beş mikro elek içinden art arda geçirilmesini içerir. Mikroskobik görüntüleme, izolasyon tekniğinin her iki trikom tipi için etkinliğini göstermiştir. Ek olarak, izole trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi, aşağı akış transkriptomik analizi için uygundu.
Introduction
Glandüler trikomlar, birçok ikincil metabolit1 içeren bitkilerde bulunan ve yeni biyosentetik genlerin ve enzimlerin değerli bir bankasını temsil eden saç benzeri yapılardır2. Esrarda, önemli ikincil metabolitlerin, kanabinoidler3 ve terpenler4'ün biyosentezi, trikomlarda lokalizedir. Trikomların hem tıbbi hem de rekreasyonel kullanımlar için Esrar kalitesini belirlemedeki rolü göz önüne alındığında, trikom gen ekspresyonunun incelenmesi ilgi çekicidir. Trikoma özgü genlerin ekspresyonunu karakterize etmek için, önce ilgilenilen trikomlar izole edilmelidir. Trichome izolasyon protokolleri ilk olarak 1992 gibi erken bir tarihte tanımlanmıştır5 ve en son gelişmeleri yakın zamanda gözden geçirilmiştir2. Genel olarak, transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların ekstraksiyonu için protokoller iki ayrı sıralı adıma ayrılabilir. İlk adım, trikomların bitki dokusundan tamamen fiziksel olarak ayrılmasını içerir. Bu adım, kuru buz5, ticari aparat 6,7 ile cam boncuklar, bitki materyalinin bir ağ elek8'e karşı öğütülmesi veya bitki dokusunun bir izolasyon tamponu9'da vortekslenmesi ile gerçekleştirilebilir. İkinci adım, ilgilenilen trikomların mikroskobik bitki kalıntılarından ve / veya diğer trikom türlerinden daha rafine bir şekilde ayrılmasını içerir. Bu adım, yoğunluk gradyanı santrifüjleme8,10 veyaçeşitli boyutlarda elekler 7,9 kullanılarak gerçekleştirilebilir. İşlenmiş dokulardaki RNA'nın bozunma ajanlarına karşı aşırı duyarlılığı nedeniyle, bu iki ardışık adım genellikle buz gibi soğuk izolasyon ortamında, genellikle protein inhibitörlerinin varlığında gerçekleştirilir4.
Geleneksel trikom izolasyon protokolleri, buz gibi soğuk sıcaklıklara ek olarak, verimli bir ekstraksiyon prosedürü sağlamak için büyük miktarda izolasyon ortamı gerektirir. Bu bileşenlerin birleşimi, yüksek verimi engelleyen zorlu ve zaman alıcı bir yalıtım süreciyle sonuçlanır. Bu nedenle, basit, kullanıcı dostu bir alternatif trikom izolasyon protokolü sunmak, trikom karakterizasyonu ile ilişkili çeşitli yönler için faydalı olacaktır. Bu makale, geleneksel protokollerden çeşitli unsurları birleştirerek ve entegre ederek, saplı ve sapsız glandüler capitate trikomlarını Esrar sativasından izole etmek için alternatif bir protokol sunmayı amaçlamaktadır. Bu elementler arasında kuru buz5, trikomların gözenek boyutları 7,9 azalan birkaç mikro elek içinden geçirilmesi ve izolasyon ortamı8 için sıvı azotun (LN) ikame edilmesi yer almaktadır.
Mevcut trikom izolasyon protokolünün yeniliği, geleneksel protokollerle karşılaştırıldığında, çeşitli şekillerde ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, tehlikeli bileşenler gerektirmediğinden kullanışlıdır. Prosedür laboratuvarda minimum önlemle gerçekleştirilebilir ve yüksek verimi kolaylaştırır. Standart sıvı izolasyon ortamının yerine LN'nin ikame edilmesi, izolasyon prosesi boyunca trikomların bütünlüğünü sağlayarak sonraki transkriptomik analizlere olanak tanır. LN ve kuru buzun süblimasyonu üzerine, izole edilmiş trikomlar zararlı artıklardan arındırılmış olarak bırakılır. Ayrıca, LN'nin oda sıcaklığında süblimasyon eğilimi, protokol boyunca cömert kullanımına izin verir. Buna karşılık, büyük miktarlarda geleneksel izolasyon ortamının kullanılması, taşınmasında pratik zorluklar yaratır. Son olarak, protokol disk hücresinin glandüler trikomun kalan kırılgan kafa yapısından ayrılmasını azaltır ve kafa boşluğu içeriğinin tutulmasını sağlar.
Bu protokol, C. sativa glandüler capitate trikomlarının izole edilmesinin teknik uygulamasına yardımcı olmak için tasarlanmış ayrıntılı bir adım adım tarzda sunulmaktadır. Protokol, aşağı akış moleküler analizi için uygun olan yüksek konsantrasyon ve saflığa sahip izole trikomlarla sonuçlanan yönetilebilir bir iş akışı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu çalışmada kullanılan bitki materyali, başka bir yerde açıklandığı gibi İsrail'in Volcani Merkezi'nde yetiştirilen dört C. sativa ARO-Volcani suşundan (CS-11, CS-12, CS-13 ve CS-14) oluşmaktadır. Glandüler kapitat saplı trikomlar olgun çiçeklenme salkımından izole edildi ve glandüler kapitat sapsız trikomlar, olgun çiçekli olmayan ana bitkilerden büyük fan yapraklarından izole edildi. Tüm bitki materyali taze olarak toplandı ve hemen -80 ° C'de saklandı.
DİKKAT: Protokol boyunca kuru buz ve LN kullanılır. Bu maddeler son derece tehlikelidir. İzole trikomlar, kapalı tüplere yerleştirildiğinde tehlikeli gaz basıncı oluşturabilecek kuru buz parçacıkları içerebilir; Bu nedenle, tüm kapaklar iğneyle delinmelidir. Son derece düşük sıcaklıklarda kullanım için koruyucu gözlüklerin, uygun laboratuvar kıyafetlerinin ve eldivenlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
1. Trikomların bitki materyalinden ilk ayrılması için kurulum
- Kuru bir buz bloğunu 5 L'lik plastik bir kapta bir çekiç ve sert düz bir nesne kullanarak küçük ince pullar halinde ezin.
- İnce kuru buz pullarını (5 mm'den küçük) eleyerek eleyin Kırılmamış kuru buzdan büyük bir süzgeçle (5 mm'den küçük gözenekler aracılığıyla ) başka bir 5 L plastik kaba koyun. Kuru buz pullarının yaklaşık 200cm3'ünü (200 mL işareti) dik 1 L'lik cam bir beher içine dökün.
- Ezilmiş kuru buzun ilk tabakasına 10 g'a kadar dondurulmuş C. sativa salkımını (bundan böyle bitki materyali olarak adlandırılır) ekleyin ve 200cm3'lük ince ezilmiş kuru buz tabakası ile örtün.
- 1 L cam kabın açıklığını iki ila üç kat 1 mm ekran kapısı cibinliği ile örtün ve cam kabın dış taraflarına lastik bantlarla sabitleyin (Şekil 1).
- LN'yi, izole trikomların toplanacağı büyük bir yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kaba dökün (bakınız Malzeme Tablosu).
- Un elek ağını aşağıdan örtmek için un eleği/elek süzgecine 350 μm'lik bir ağ yerleştirin (Şekil 2). Çıkarılabilir plastik halkalı bir un eleği varsa, 350 μm ağı, un eleğinin ağının altına sabitlenecek şekilde yerleştirin. Değilse, 350 μm ağı un eleğinin çevresine lastik bantlarla sabitleyin.
- Un eleğini LN ile doldurulmuş büyük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3). Yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın dışındaki elenmiş kütlenin kaybını en aza indirmek için kabın genişliğinin un eleğininkini aştığından emin olun.
2. Trikomların bitki materyalinden ayrılması
- 1 L bardağı, açıklığı un eleğine doğru aşağı bakacak şekilde, büyük bir tuz çalkalayıcı kullanıyormuş gibi çalkalayın (Şekil 4).
- Un eleği üzerinde biriken ezilmiş kuru buzun ve bitki materyalinin elenmesini sağlamak için her 2-3 dakikada bir 1 L cam kabı bir kenara koyun.
- Aşağıdaki yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta bitki malzemesinin LN'ye geçişini kolaylaştırmak için un eleğini yatay olarak eleyin.
- Paslanmaz çelik kaba LN ekleyin ve seviyeleri düştüğünde 1 L cam beher için ezilmiş kuru buz ekleyin. Un eleği üzerindeki bitki materyali tükendiğinde, cam beherdeki kullanılmış bitki materyalini ilave 10 g taze bitki materyali ile doldurun. İkmal genellikle iki defadan fazla tekrarlanmak zorunda değildir.
- Yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta yeterli miktarda zenginleştirilmiş trikom toplanana kadar 2.1-2.4 arasındaki adımları tekrarlayın. Genel olarak, RNA ekstraksiyonu ve transkriptom analizi için 20 g taze bitki materyali yeterlidir.
- LN'ye batırılmış paslanmaz çelik kabın dibinde beyaz toz benzeri bir madde (bitki artıkları, glandüler trikomlar ve ezilmiş kuru buzdan oluşan) olduğunu doğrulayın. Mikroskobik bir gözlem, yeterli miktarda trikomun toplanıp toplanmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır; Ancak, bu adım protokolün akışını engelleyebilir. Genellikle, çoğu izolasyon için 10-20 g ilk bitki materyali yeterlidir; Bununla birlikte, bitkilerin trikom yoğunluğunda farklılıklar olabilir.
NOT: Bu noktadan itibaren, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Kısa bir süre duraklatılırsa, trikomların suya batırılmış kalması için yeterli miktarda LN eklenmelidir. Alternatif olarak, trikomlar, adım 5'te açıklandığı gibi, daha sonra kullanılmak üzere 3 aya kadar -80 ° C'de toplanabilir ve saklanabilir.
3. Glandüler capitate trikomların (saplı ve sapsız) soğanlı ve sistolikik trikomlar ve döküntüler gibi diğer trikom tiplerinden ayrılması
- Temiz küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik bir kaba az miktarda LN ekleyin.
- 20 cm x 20 cm'lik bir katlama elde etmek için 150 μm ağ boyutunda 40 cm x 40 cm mikro eleği iki kez katlayın ve açın. Koni benzeri bir şekle benzediğinden emin olun (Şekil 5).
- Ağ konisini yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın kenarına bir veya iki mandalla sabitleyin, böylece koninin açılan kısmı dik olur ve sivri kısmı kısmen LN'ye batırılır.
- LN'yi ve adım 2.6'daki beyaz toz benzeri maddeyi yavaşça mikro elek konisine dökün.
- Kalan bitki materyallerini toplamak ve ilk kaptan 150 μm ağ konisine aktarmak için yavaşça geniş bir fırça uygulayın.
- İlk kaba daha fazla LN ekleyin ve tüm bitki materyali mikro elek konisine aktarılana kadar fırçalama hareketini tekrarlayın.
- Mandalı kabın kapağından dikkatlice ayırın ve mikro elek konisini açın, böylece trikomlar açılan mikro eleğin ortasına yerleştirilecektir. Mikro eleğin dört köşesini de bir arada tutun, böylece trikomları içeren orta kısım LN'ye batırılmış halde kalır (Şekil 6).
- Mikro eleğin dört köşesini de tutarken, mikro eleği LN'ye bir çay poşeti demliyormuş gibi çelik kaba hafifçe daldırın ve sallayın. Bu daldırma/sallama (dikey ve yatay) hareketine 1 dakika devam edin. İzolasyon kalitesi ve miktarı arasında bir denge vardır. Daha uzun daldırma hareketleri daha fazla miktarda trikom ile sonuçlanabilir, ancak izolasyon dereceleri daha zayıf olabilir. Genel olarak, 1 dakika hem kalite hem de miktar için yeterli olarak önerilir.
NOT: Bu eleme hareketi protokolün en kritik kısmıdır ve buna göre yürütülmelidir. - İsteğe bağlı: Mikro eleğin ortasına sarılmış elenmemiş bitki artıklarını ve daha büyük trikomları (hala LN'ye batırılmış) 13 mL veya 50 mL'lik bir test tüpüne alın ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
DİKKAT: Basınçlı gazın birikmesini önlemek için (kuru buz ve LN kalıntılarından), test tüpünün kapağındaki bir deliği sterilize edilmiş bir iğne ile delin. Kapak, basınç düştüğünde, genellikle 24 saat sonra değiştirilebilir.
4. Trikomların gözenek boyutu küçülen mikro eleklerden geçirilmesi
- Küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın altındaki LN'ye batırılmış elenmiş trikomları, 3. adımda sunulduğu gibi, gözenek boyutları azalan (105 μm, 80 μm, 65 μm ve 50 μm) mikro eleklerden sırayla aktarın.
5. İstenilen trikomların toplanması
- LN'ye batırılmış ve önceden soğutulmuş (LN'de) bir kaşık kullanarak 50 μm mikro eleğe sarılmış istenen trikomları çıkarın. Onları temiz bir tabağa yerleştirin.
NOT: Bu son izolasyon aşamasında, istenilen trikomlar elekten toplanır. - Toz benzeri trikomları, önceden soğutulmuş bir spatula veya tüpe yerleştirilen bir scoopula aracılığıyla etiketli önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın (Şekil 7). Daha ileri çalışmalar için tüpleri hemen -80 ° C'de saklayın.
NOT: Tüm yalıtım protokolünü gösteren şematik bir iş akışı şeması Şekil 8'de verilmiştir.
6. Saflaştırılmış trikomların gözlem ve analizi
- Önceden soğutulmuş (LN yoluyla ) bir spatula kullanarak mikroskop slaydına az miktarda (10 mg) izole trikom yerleştirin. Bir damla su ekleyin ve lekelenmeden doğrudan hafif bir mikroskopta gözlemleyin. Genel izolasyon ve kontaminasyon derecesini düşük (10x) ve yüksek (40x) büyütmeler kullanarak değerlendirin. Zenginleştirme, Şekil 9'da gösterildiği gibi, trikom dışı dokuya göre trikomların göreceli miktarı ile görsel olarak tahmin edilir.
- 50 mg izole C. sativa glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomlardan RNA ekstraksiyonu ve kalite analizi yapın.
NOT: RNA ekstraksiyonu için poli-A tabanlı bir mRNA saflaştırma stratejisi kullanan ticari bir ekstraksiyon kiti (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.- Lizis çözeltisinde 50 mg izole trikomu yeniden askıya alın, 30 s boyunca vorteks, 5 dakika boyunca 35 kHz'de buz gibi soğuk bir ultrasonik temizleme ünitesinde sonikleştirin ve mRNA'yı üreticinin protokolüne göre numunelerden çıkarın (bkz.
- Trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın bütünlüğünü tahmin etmek için, RNA konsantrasyonunu, toplam miktarı ve RNA bütünlük sayısı (RIN) değerlerini bir çip üzerinde laboratuvar sistemi kullanarak belirleyin (bkz.
- Trikom fraksiyonlarının RNAseq analizini yapın (isteğe bağlı). RNAseq analizi ve sıralı okumaların biyoinformatik analizleri standart dış kaynak kullanımı hizmetleri ile gerçekleştirilebilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geleneksel trikom izolasyon protokollerine kıyasla bu protokolde yer alan ana modifikasyon, standart izolasyon ortamının LN ile değiştirilmesidir. LN'yi bir izolasyon ortamı olarak kullanmak, rahat bir iş akışı sağlar, çünkü numuneler LN'ye batırıldığı sürece, metabolik bozulmanın meydana gelmesi muhtemel değildir. Ayrıca, protokol geleneksel trikom izolasyon ortamında kullanılan tehlikeli bileşenlerden (yani, aurintrikarboksilik asit ve β-merkaptoetanol) kaçındığından, iş kimyasal bir başlık ile sınırlı değildir. Bununla birlikte, kuru buz ve LN ile çalışırken gerekli önlemleri almak önemlidir.
Mevcut protokolün avantajlarını değerlendirmek için, mevcut protokolden elde edilen trikom izolasyon sonuçları, başlangıçta bir ışık mikroskobu kullanarak, geleneksel bir trikom izolasyon prosedürü (sulu bir tampon, cam boncuklar ve trikom izolasyonu için ince bir elek kullanan) 12 kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırılmıştır. Işık mikroskobu muayenesi ile farklı izolasyon fazlarından bileşenlerin karşılaştırılması, izolasyon işlemi ilerledikçe artan trikom izolasyon derecesini göstermektedir. İzolasyon işleminin ilk aşamasında (105-150 μm mikro elek), neredeyse tamamen izole trikomlardan oluşan nihai izolasyon ürününün aksine, izole kısımda yaprak dokusu parçaları baskındı (Şekil 9A). İzole edilen numunelerin kontaminasyonsuz olduğunu doğrulamak için dikkatli olunmalıdır (Şekil 9B).
Bu çalışmada trikom yoğunluğu ölçülmemiş olsa da, son izolasyon basamağında izole glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların kalitesi Şekil 10'da gözlenebilir. Saflık, geleneksel bir protokol12 kullanılarak trikom izolasyonu ile elde edilenle karşılaştırılabilir (Şekil 10C). Mevcut protokolde, hassas saplı trikom kafa yapısı korunmuştur ve izole saplı trikomun tüm kafaları görünür durumdadır (Şekil 10D), oysa konvansiyonel protokolü kullanarak, tüm trikom kafa yapısı eksiktir ve sadece disk hücreleri mevcuttur (Şekil 10E). Kuru buz ve LN kullanımı, ekstrakte edilebilecek bitki materyalinin sınırını ortadan kaldırdığı için verim de büyük ölçüde arttırılabilir. Susuz protokolümüzün ek bir avantajı, sadece kuru buz ve LN kullanmasıdır ve bu nedenle, buharlaştıktan sonra izolasyon ortamının artık bileşenleri kalmaz. LN kullanımı, trikomların toplanmasına yol açabilecek yapışkan ikincil metabolitlerin salınmasını önler13. Mevcut protokolde, son izolasyon adımında izole edilmiş trikomlar kuru ince bir toz olarak geri kazanılmıştır.
Mevcut protokol boyunca muhafaza edilen son derece düşük sıcaklıkların, RNA bozulmasını önleyen (numuneler suya batırılmış halde tutulduğu sürece) geleneksel tampon ortamın hedeflerini karşılamada ve aşağı akış moleküler uygulamalarını kolaylaştırmada yeterli olması muhtemeldir. Bu varsayımı doğrulamak için, RNA'yı izole trikomlardan çıkardık ve ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak RNA bütünlüğünü tahmin ettik. Elde edilen yüksek RIN değerleri (9.4 ila 10) ve farklı jel kromatografisi (Şekil 11) açıkça yüksek bir RNA bütünlüğünü göstermektedir. RNA örnekleri RNAseq tarafından daha fazla analiz edildi ve tüm kütüphanelerden >20 M yüksek kaliteli okumalar elde edildi.
Gerçekten de, izole trikom fraksiyonundan gelen mRNA'nın trikom eksprese edilen genlerde zenginleştirildiğini doğrulamak için, çiçeklenme ve buna karşılık gelen izole saplı trikomlar için gen ekspresyon sonuçlarımızı, Esrarın saflaştırılmış trikomlarının gen ekspresyonunu karakterize eden Livingston ve ark.14 tarafından sunulan önceki sonuçlarla karşılaştırdık (Ek Tablo 1'den uyarlanmıştır) ). Protokolleri, sulu tamponda karıştırma, eleklerden filtreleme ve son olarak bir Percoll gradyanı kullanarak trikom saflaştırmadan oluşuyordu. Trikom eksprese edilen genler, trikom spesifik bir gen belirteciolan kanabidiolik asit sentazın (CBDAS) gen ekspresyonu ile en yüksek oranda ilişkili olanlar (p > 0.95) olarak karakterize edildi. Mevcut protokolle elde edilen sonuçlar ile Livingston ve ark.14'te sunulanlar arasındaki gen ekspresyonunun karşılaştırılması, trikom fraksiyonumuzdaki en zengin 12 genin, trikom belirteç geni CBDAS da dahil olmak üzere Livingston ve ark. çalışma14'te de zenginleştirildiğini göstermektedir (Tablo 1). Özellikle, mevcut protokolden önemli ölçüde daha yüksek bir zenginleştirme oranı elde edilmiştir. Bu sonuçlar, trikomla zenginleştirilmiş gen ekspresyonunun incelenmesi için mevcut protokolün geçerliliğini doğrulamaktadır.
Ek olarak, Esrarın beş aktin geninin ekspresyon verilerini karşılaştırdık, çünkü aktin, transkriptom çalışmaları için sıklıkla bir referans gen olarak kullanılmaktadır (Tablo 2). Hem izole saplı hem de sapsız trikomlar için sonuçlarımız, Livingston ve ark. çalışma14 tarafından bildirilenlerle karşılaştırılabilirdi.
Son olarak, muhtemelen trikomla zenginleştirilmemiş klorofil a-b bağlayıcı protein ailesi genleri için ekspresyon ve trikom zenginleştirme verilerini hesapladık (Tablo 3). Gerçekten de, bu gen ailesinin 12 üyesi, trikom zenginleştirmesi için negatif bir kontrol görevi gören <1'lik bir trikom zenginleştirme faktörü gösterdi. Bu kombine sonuçlar, çiçeklenme ve izole trikom fraksiyonlarının benzersiz ekspresyon kalıplarını gösterir ve izole trikom fraksiyonunun trikom bütünlüğünü ve kalitesini destekler.
Şekil 1: 1 L cam kabın yüklenmesi için kurulum. 1 mm'lik ekran kapı ağı, cam kabın kenarlarına birkaç lastik bantla sabitlenir (gösterilmemiştir). 1 L cam beher dik konumda yüklenmelidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Un eleğinin kurulumu. Un eleği, alttaki lastik bantlar aracılığıyla 350 μm'lik bir mikro elek ile donatılmıştır (resimde gösterilmemiştir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Trikom izolasyonunun ilk adımının kurulumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Cam kabın kurulumu. Cam beher, açıklıkta lastik bantlarla sabitlenmiş üç kat 1 mm'lik ekran kapısı (sivrisinek) ağı ile donatılmıştır. Beherin açıklığı aşağı doğru işaret ediyor. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Trikom izolasyonu için kullanılan mikro elek koni yapısının kurulumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İzole trikomlar içeren mikro eleğin daldırma ve sallama hareketi için kurulum. Yatay/dikey hareket bir çay poşeti infüzyonuna benzemelidir. Kurulum, kullanılan her ağ boyutu için aynıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Son izole trikomların aktarılması için kurulum. Son izole trikomlar etiketli 1.5 mL tüpe aktarılır. Tüm mutfak eşyaları LN ile önceden soğutulmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Protokolü özetleyen akış şeması. Glandüler capitate trikomların C'den izolasyonu. sativa üç adımdan oluşur: (1) trikomların bitki kaynağından ilk ayrılması ve iki elek ( 1 mm ve 350 μm) yoluyla geçişi, (2) bitki materyalinin azalan gözenek boyutlarına (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm ve 50 μm) sahip beş mikro elek yoluyla geçirilmesi ve (3) izole edilmiş trikomların önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik bir tüpe toplanması. Mikro elek aşamalarının herhangi birinden tutulan doku da benzer şekilde toplanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Mevcut protokolü kullanarak izole edilmiş trikomların mikroskopi görüntüleri. (A,B,C) C. sativa fan yapraklarından glandüler kapitat sapsız trikomlar. (A) Gözenek boyutları 105 μm ile 150 μm arasında değişen mikro eleklerden orta izolasyon. Büyük miktarlarda yeşil, trikom olmayan malzemenin tutulmasına dikkat edin. (B) Gözenek boyutları 50 μm ile 65 μm arasında değişen, bitki kaynağı (kırmızı ok) ile kontamine olmuş mikro eleklerden izolasyon sonu ve (C) kontaminasyon içermeyen. Ölçek çubukları = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: İzole trikomların mikroskopi görüntüleri. (A,B) C. sativa'dan glandüler kapitat trikomları: (A) mevcut protokol kullanılarak izole edilmiş saplı tip ve (B) mevcut protokol kullanılarak izole edilmiş sapsız tip. (C) Geleneksel bir protokol kullanılarak izole edilmiş saplı trikomlar. Trikomların düşük verimi ve tavizsiz kafalarının eksikliği belirgindir. (D,E) Saplı glandüler capitate trikomları (D) mevcut protokol ve (E) konvansiyonel protokol kullanılarak izole edilmiştir. (F) 65 μm ila 105 μm mikro elekler (yakın çekim) arasında izole edilmiş glandüler saplı trikomlar. Saplı trikomların, ayrılmış kafaları ve sap parçaları ile yüksek izolasyonuna dikkat edin. Kırmızı oklar sistolitik trikomları, mavi oklar glandüler kapitat saplı trikomlardan birkaç sap parçasını ve sarı oklar ayrılmış disk hücrelerini gösterir. Ölçek çubukları = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın bütünlüğünün analizi. Mevcut protokol kullanılarak izole edilen glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomlardan ekstrakte edilen RNA örneklerinin kromatografları ve jelleri. Bu çalışmada kullanılan dört çeşit hattının saplı trikomlarından (A-D) RNA için sonuçlar, sırasıyla CS-11, CS-12, CS-13 ve CS-14 ve (E-H) sapsız trikomlar, CS-11, CS-12, CS-13 ve CS-14. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Mevcut protokol kullanılarak RNAseq ile elde edilen trikomla zenginleştirilmiş gen ekspresyonunun Livingston ve ark.14 tarafından elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması. Livingston ve ark.14 tarafından kanabidiolik asit sentaz (CBDAS) ekspresyonu ile en yüksek korelasyonu gösteren 12 gen (Wiley yayıncılarının izniyle uyarlanmış Ek Tablo Verileri S4'ten), trikoma özgü bir gen belirteci olarak kabul edildi, karşılaştırma için seçildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Mevcut protokolden izole edilmiş saplı ve sapsız trikomların beş Esrar aktin geninin gen ekspresyonunun (FPKM) karşılaştırılması (Esrar çeşidi CS-11 11'den (Var CS-11) gen ekspresyon verilerimiz) Livingston ve ark.14'ten uyarlanmış daha önce yayınlanmış sonuçlarla karşılaştırılması. Livingston ve ark.14'ün sonuçları Finola FN referans genomuna dayanarak sunulmuş ve verileri CS10.2 referans genomuna çevrilmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: Tüm salkımların Esrar klorofil a-b bağlanma genlerinin gen ekspresyonu (FPKM) ve mevcut protokolden izole edilmiş saplı trikomlar (Var CS-11'den gen ekspresyon verilerimiz). Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut trikom izolasyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, mevcut protokolde iki ana değişiklik açıklanmaktadır. Bunlar, trikomların ilk adımda kuru buz kullanılarak bitki malzemesinden ayrılmasını ve yaygın olarak kullanılan sıvı tampon ortamının yerine LN'nin kullanılmasını içerir. C. sativa trikom saflaştırması için ilk modifikasyon, trikomları sardunya pedicellerinden ayırmak için ezilmiş kuru buz kullanımını tanıtan daha önceki bir protokole dayanmaktadır5. Geleneksel trikom izolasyon protokolleri genellikle küçük (50 mL) bir test tüpü kullanırken, bu çalışmada cömert miktarda ezilmiş kuru buz ile 1 L'lik bir cam beher kullanılmış ve daha büyük miktarda ilk bitki materyalinin (10 g'a kadar) işlenmesine izin verilmiştir. Ayrıca, bu protokolde, ilk izolasyon adımında trikomların mikro eleklerden iki ek geçişi daha tanıtılmıştır. İlk adım, dikey yukarı ve aşağı kuvvetli tuzluklayıcı benzeri bir hareket kullanır ve ikincisi, un eleyicisindeki mikro elek boyunca yatay bir eleme hareketi kullanır. Kombine yatay ve dikey eleme hareketlerinin, trikom boyutuna ve şekline bağlı olarak gelişmiş bir ayırmayı teşvik etmesi önerilir.
İkincisi, en önemli değişiklik, mikro eleklerden geçişin yapıldığı izolasyon ortamını ele alır. Mevcut protokolde, geleneksel sulu izolasyon ortamı tamamen LN ile değiştirilmiştir. Önceki bir protokol8 , trikom izolasyonu için ilk adımda LN'yi kullandı, trikomları bitki materyalinden ayırdı (çiçek malzemesini bir ağ eleğine karşı rendeleyerek), ancak bir sıvı tampon ekstraksiyonu ve Percoll yoğunluğu ayrımı ile devam etti. Geleneksel izolasyon ortamının yerine LN'nin ikame edilmesi, geleneksel izolasyon ortamının toksik bileşenleriyle ilişkili özel prosedürlere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak rahat bir iş akışı ve yüksek verim sağlar.
Mevcut protokolün önemli bir özelliği, kuru buz ve LN'nin oda sıcaklığında hızlı bir şekilde süblimleşme eğilimine dayanmaktadır. Bu özellik, yalıtım süreci boyunca cömert uygulamalarını sağlar. Buna karşılık, büyük miktarda geleneksel izolasyon tamponunun kullanılması, büyük hacimlerinin taşınmasıyla ilgili teknik komplikasyonlara yol açacaktır.
Mevcut protokoldeki izolasyon süreci, glandüler kapitat saplı trikomun kırılgan kafa yapısının tutulmasını teşvik ederken, geleneksel protokoller disk hücrelerinin kalan bez malzemesinden ayrılmasını teşvik eder, bu da kolayca yıkanır ve sadece disk hücrelerini bırakır. Bu fenomen, geleneksel bir izolasyon protokolünü yeni protokolümüzle karşılaştıran sonuçlarımızda açıkça görülebilir (Şekil 10D, E). Mikroskobik gözlemin yanı sıra, trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın kalite analizi (bu protokol kullanılarak izole edilmiştir), izolasyon işlemi sırasında RNA bütünlüğünün korunduğunu ve transkriptomik analiz için uygun olduğunu açıkça göstermektedir.
Ayrıca, izole trikom fraksiyonumuzdan elde edilen gen ekspresyonu sonuçları, fraksiyonun yerleşik trikom eksprese edilen genlerde (Tablo 1) yüksek oranda zenginleştirildiğini ve karşılıklı olarak, trikom eksprese edilmeyen genlerin temsil edilmediğini göstermektedir (Tablo 3).
Mevcut protokolün ana sınırlaması, mikro eleklerden geçme eğilimlerine göre trikomları izole etmek için münhasır uygunluğudur. Protokol, bir yoğunluk gradyanı kullanılarak trikom izolasyonuna doğrudan uygulanamasa da, gerekirse yoğunluk gradyanı adımından önce trikomların izole edilmesi için uygundur. Bu çalışmada, bu protokol kullanılarak izole edilen trikomlar proteomik bir karakterizasyona tabi tutulmamıştır ve böyle bir uygulama için uygunluklarının doğrulanması gerekmektedir. Bununla birlikte, hem saplı hem de sapsız trikomlardan ekstrakte edilen RNA örnekleri, chomatographs ve yüksek RIN değerleri ile belirtildiği gibi, herhangi bir bozulma göstermediğinden, mevcut protokolle izole edilen trikomların proteomik analiz için gerekli gereksinimleri karşılaması muhtemel olduğu varsayılabilir.
Glandüler kapitat sapsız trikomların fan yapraklarından izolasyon derecesi (ilk bitki kaynağından ve diğer trikom türlerinden) çok yüksektir, çünkü fan yaprakları glandüler kapitat saplı trikom tip15,16'dan yoksundur ve sistolitik ve soğanlı trikomlar, yapısal ve boyut farklılıkları nedeniyle sapsız trikomlardan kolayca izole edilir. Bununla birlikte, glandüler kapitat saplı tip trikomların izolasyonu ile ilgili olarak, bitki kaynağı, olgun dişi salkım, sap öncesi tip14'e ek olarak dört trikom tipinin tümünü içerdiğinden, izolasyon derecelerini zenginleştirme olarak ele almak en iyisidir. İzole edilmiş glandüler kapitat trikomlarının çoğunun saplı tipte olması mantıklıdır, çünkü yüksek konumları (epidermal bağlı sapsız trikomlarla ilgili olarak), kuru bir buz parçacığı ile çarpışma ve bitkiden ayrılma olasılığını arttırır. Ayrıca, saplı trikomun baş ve sap kısımlarını birbirine bağlayan kavşak, bez başı17'nin iptali ile ilişkili bir zayıflık noktası olarak kabul edilir. Bu nedenle, saplı trikom kısmına, sapsız tipte potansiyel olarak düşük kontaminasyona sahip oldukça zenginleştirilmiş bir fraksiyon olarak atıfta bulunmak doğru olacaktır. Bununla birlikte, bu varsayımı doğrulamak için daha fazla analiz yapılmamıştır.
Mevcut protokolün diğer bitki türlerinden glandüler trikomları çıkarmak için uygunluğu henüz belirlenmemiştir. C. sativa'daki yüksek trikom yoğunluğu muhtemelen mevcut protokolün başarısına katkıda bulunur. Bununla birlikte, nispeten büyük bir bitki materyal kaynağı (izolasyon döngüsü başına 10 g'a kadar) etkili bir şekilde işlenebildiğinden, bunun tek neden olması muhtemel görünmemektedir. Diğer çalışmalar, farklı trikom tiplerini diğer bitkilerden izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmuştur, örneğin, Arabidopsis thaliana18,19'dan rozet yaprağı trikomları. Diğer trikom tiplerini izole etmek için mevcut protokolün uygulanabilirliği bu çalışmada çalışılmamış olsa da, bu çalışmada sunulan unsurların, özellikle de izolasyon tamponu için LN'nin ikame edilmesinin, trikom izolasyon sürecini iyileştirmesi muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar CannabiVar Ltd.'den finansal destek aldıklarını kabul etmektedir. Tüm bitki materyali, İsrail'deki Volcani Merkezi'nden Profesör Hinanit Koltai tarafından cömertçe sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
