Summary
Cannabis sativa의 선, capitate, 스토킹 및 고착성 trichomes의 편리하고 높은 처리량의 분리 및 농축을위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 액체 질소, 드라이 아이스 및 나일론 체만을 사용하는 트리초메의 건식, 비완충액 추출을 기반으로 하며 RNA 추출 및 전사체 분석에 적합합니다.
Abstract
이 논문은 Cannabis sativa에서 선, 항복, 스토킹 및 고착성 trichomes의 편리하고 처리량이 높은 분리 및 농축을 위한 프로토콜을 제시합니다. 칸나비노이드 및 휘발성 테르펜 대사를 위한 생합성 경로는 주로 대마 초 트리초메에 국한되어 있으며, 분리된 트리초메는 전사체 분석에 유용합니다. 전사체 특성화를 위해 선 모동을 분리하기 위한 기존 프로토콜은 불편하고 손상된 모합체 헤드와 상대적으로 적은 양의 분리된 모체를 제공합니다. 또한 RNA 분해를 방지하기 위해 단백질 억제제를 포함하는 고가의 장치 및 분리 배지에 의존합니다. 현재 프로토콜은 C. sativa 성숙한 암컷 꽃차례와 부채꼴 잎에서 각각 다량의 분리된 선상 항복 스토킹 및 고착성 트리초메를 얻기 위해 세 가지 개별 변형을 결합할 것을 제안합니다. 첫 번째 변형은 마이크로 체를 통한 트리코메의 통과를 용이하게 하기 위해 기존의 분리 매체를 액체 질소로 대체하는 것을 포함합니다. 두 번째 수정은 드라이 아이스를 사용하여 식물 공급원에서 trichomes를 분리하는 것입니다. 세 번째 변형은 기공 크기가 감소하는 5개의 미세 체를 통해 식물 재료를 연속적으로 통과시키는 것입니다. 현미경 이미징은 두 trichome 유형 모두에 대한 분리 기술의 효과를 입증했습니다. 또한, 분리된 트리초메로부터 추출된 RNA의 품질은 다운스트림 전사체 분석에 적합하였다.
Introduction
선모충(Glandular trichomes)은 식물에 존재하는 머리카락과 같은 구조로, 많은 2차 대사산물1을 함유하고 있으며, 새로운 생합성 유전자와 효소2의 귀중한 은행을대표한다. 대마초에서 중요한 2 차 대사 산물 인 칸 나비 노이드3 및 테르펜4의 생합성은 트리 코메에 국한되어 있습니다. 의약 및 레크리에이션 용도 모두에서 대마초의 품질을 결정하는 데 trichomes의 역할을 고려할 때, trichome 유전자 발현에 대한 연구가 중요합니다. trichome-specific 유전자의 발현을 특성화하기 위해, 관심있는 trichomes는 먼저 분리되어야한다. Trichome 격리 프로토콜은 1992 년 초에 처음 기술되었으며5, 최신 개발은 최근에 검토되었습니다2. 일반적으로, 전사체 특성화를 위해 선 모체를 추출하기 위한 프로토콜은 두 개의 별개의 순차적 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계는 식물 조직에서 trichomes를 완전히 물리적으로 분리하는 것입니다. 이 단계는 드라이 아이스 (5), 상업용 장치 (6, 7)를 갖는 유리 비드를 사용하거나, 메쉬 체 (8)에 대해 식물 재료를 분쇄하거나, 격리 완충액 (9)에서 식물 조직을 와동시킴으로써 수행 할 수있다. 두 번째 단계는 미세한 식물 잔류 물 및 / 또는 다른 trichome 유형에서 관심있는 trichomes를보다 정교하게 분리하는 것입니다. 이 단계는 밀도 구배 원심분리(8, 10) 또는 다양한 크기의 체(7, 9)를 사용하여 실행할 수 있다. 분해제에 대한 가공 조직의 RNA의 민감도가 매우 높기 때문에, 이 두 가지 순차적 단계는 일반적으로 단백질 억제제가 있는 상태에서 얼음처럼 차가운 격리 배지에서 수행된다4.
기존의 trichome 격리 프로토콜은 효율적인 추출 절차를 보장하기 위해 얼음처럼 차가운 온도 외에도 많은 양의 격리 매체가 필요합니다. 이러한 구성 요소의 조합은 높은 처리량을 방해하는 힘들고 시간이 많이 소요되는 격리 프로세스를 초래합니다. 따라서 간단하고 사용자 친화적인 대체 트리코메 분리 프로토콜을 제시하는 것은 트리코메 특성화와 관련된 다양한 측면에 도움이 될 수 있습니다. 본 논문은 기존 프로토콜의 여러 요소를 결합하고 통합하여 대마초 sativa에서 스토킹 및 고착성 선 capitate trichomes를 분리하기 위한 대체 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이러한 요소들은 드라이아이스(dry ice)5, 기공 크기가 감소하는 여러 개의 미세 체(micro-siev)를 통과하는 트리초메(trichomes)의 통과, 격리 매체(isolation medium)8를 액체 질소(LN)로 대체하는 것을 포함한다.
기존 프로토콜과 비교하여 현재 트리홈 격리 프로토콜의 참신함은 여러 가지 방식으로 나타납니다. 이 프로토콜은 위험한 구성 요소가 필요하지 않기 때문에 편리합니다. 이 절차는 최소한의 예방 조치로 실험실에서 수행 할 수 있으며 높은 처리량을 촉진합니다. 표준 액체 분리 배지를 LN으로 대체하면 분리 공정 전반에 걸쳐 트리코메의 무결성이 보장되어 후속 전사체 분석이 가능합니다. LN과 드라이 아이스가 승화되면 격리 된 트리 초메에는 유해한 잔류 물이 남지 않습니다. 또한, LN이 실온에서 승화하는 성향은 프로토콜 전반에 걸쳐 이의 관대한 사용을 가능하게 한다. 대조적으로, 대량의 종래의 격리 매체를 사용하는 것은 취급에 실질적인 어려움을 야기한다. 마지막으로, 프로토콜은 선 트리코메의 나머지 깨지기 쉬운 머리 구조에서 디스크 세포의 분리를 감소시켜 헤드스페이스 내용물의 유지를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 C. sativa glandular capitate trichomes를 분리하는 기술적 관행을 지원하도록 설계된 상세한 단계별 방식으로 제공됩니다. 이 프로토콜은 다운스트림 분자 분석에 적합한 고농도 및 순도의 분리된 트리코메를 생성하는 관리 가능한 워크플로우를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 이 연구에 사용된 식물 재료는 다른 곳에서 설명한 바와 같이 이스라엘 화산 센터에서 재배된 4개의 C. sativa ARO-Volcani 균주(CS-11, CS-12, CS-13 및 CS-14)로 구성되었습니다11. Glandular capitate 스토킹 trichomes는 성숙한 꽃이 만발한 꽃차례에서 분리되었고, glandular capitate sessile trichomes는 성숙한 꽃이 피지 않는 어머니 식물의 큰 부채꼴 잎에서 분리되었습니다. 모든 식물 재료를 신선하게 채취하여 즉시 -80°C에서 보관하였다.
주의: 드라이아이스와 LN은 프로토콜 전반에 걸쳐 사용됩니다. 이 물질들은 매우 위험합니다. 격리 된 trichomes에는 밀폐 된 튜브에 삽입 할 때 위험한 가스 압력을 생성 할 수있는 드라이 아이스 입자가 포함될 수 있습니다. 따라서 모든 캡은 바늘에 구멍을 뚫어야 합니다. 극도로 낮은 온도에서 취급하기 위해 보호용 고글, 적절한 실험실 착용 및 장갑을 사용하는 것이 좋습니다.
1. 식물 재료에서 trichomes의 초기 분리를위한 설정
- 5L 플라스틱 용기에 망치와 단단하고 평평한 물체를 사용하여 드라이아이스 블록을 작은 미세한 조각으로 부수십시오.
- 큰 여과기(5mm보다 작은 구멍을 통해)를 사용하여 분쇄되지 않은 드라이아이스에서 미세한 드라이아이스 플레이크(5mm 미만)를 다른 5L 플라스틱 용기에 체로 칩니다. 약 200cm3(200mL 표시)의 드라이아이스 플레이크를 직립형 1L 유리 비커에 붓습니다.
- 분쇄 된 드라이 아이스의 첫 번째 층에 최대 10g의 냉동 C. sativa 꽃차례 (지금부터 식물 재료라고 함)를 넣고 잘게 분쇄 된 드라이 아이스 200cm3 의 추가 층으로 덮습니다.
- 1L 유리 비커의 입구를 1mm 스크린 도어 모기장 2-3겹으로 덮고 고무 밴드로 유리 컵의 바깥쪽에 고정합니다(그림 1).
- LN을 큰 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기( 재료 표 참조)에 붓고 분리된 트리초메를 수집합니다.
- 밀가루 체/체 여과기에 350μm 메쉬를 삽입하여 아래에서 밀가루 체 메쉬를 덮습니다(그림 2). 분리 가능한 플라스틱 링이 있는 밀가루 체를 사용할 수 있는 경우 350μm 메쉬를 삽입하여 밀가루 체의 메쉬 아래에 고정합니다. 그렇지 않은 경우 고무 밴드로 350μm 메쉬를 밀가루 체 둘레에 고정합니다.
- LN으로 채워진 큰 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기 위에 밀가루 체를 놓습니다(그림 3). 용기의 너비가 밀가루 체의 너비를 초과하는지 확인하여 바닥이 둥근 스테인리스 스틸 용기 외부에서 체로 쳐진 덩어리의 손실을 최소화하십시오.
2. 식물 재료에서 trichomes 분리
- 큰 소금 통을 사용하는 것처럼 입구가 밀가루 체를 향해 아래쪽을 향하도록 1L 유리잔을 흔듭니다(그림 4).
- 밀가루 체에 쌓인 분쇄된 드라이아이스와 식물 재료를 체로 걸러낼 수 있도록 1-3분마다 2L 유리 비커를 따로 둡니다.
- 밀가루 체를 수평으로 체로 쳐서 아래의 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기에 있는 LN으로 식물 재료가 쉽게 통과할 수 있도록 합니다.
- 스테인리스 스틸 용기에 LN을 넣고 수위가 낮아지면 1L 유리 비커에 으깬 드라이아이스를 넣습니다. 밀가루 체의 식물 재료가 고갈되면 유리 비커에 사용한 식물 재료를 추가로 10g의 신선한 식물 재료로 보충하십시오. 보충은 일반적으로 두 번 이상 반복 할 필요가 없습니다.
- 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기에 충분한 양의 농축 트리초메를 수집할 때까지 2.1-2.4단계를 반복합니다. 일반적으로 20g의 신선한 식물 재료는 RNA 추출 및 전사체 분석에 충분합니다.
- LN에 잠긴 스테인리스 스틸 용기 바닥에 흰색 분말 유사 물질(식물 파편, 선 트리코메 및 분쇄된 드라이아이스로 구성)이 있는지 확인합니다. 현미경 관찰은 충분한 양의 trichomes가 수집되었는지 확인하는 데 도움이됩니다. 그러나 이 단계는 프로토콜의 흐름을 방해할 수 있습니다. 일반적으로 대부분의 격리에는 초기 식물 재료 10-20g이면 충분합니다. 그러나 식물의 trichome 밀도에는 차이가있을 수 있습니다.
참고: 이 시점부터 실험을 일시 중지했다가 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 짧은 시간 동안 일시 중지된 경우 트리초메가 잠긴 상태로 유지되도록 적절한 양의 LN을 추가해야 합니다. 대안적으로, trichomes는 5 단계에 설명 된대로 나중에 사용하기 위해 최대 3 개월 동안 -80 ° C에서 수집 및 저장 될 수 있습니다.
3. 구근 및 방광 성 trichomes 및 파편과 같은 다른 trichome 유형에서 선 capitate trichomes (스토킹 및 정착)의 분리
- 깨끗하고 작은 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기에 소량의 LN을 추가합니다.
- 150 μm 메쉬 사이즈의 40 cm x 40 cm 마이크로 체를 2번 접어 20 cm x 20 cm 폴드를 구하고, 그것을 열었다. 원뿔 모양과 비슷한지 확인합니다(그림 5).
- 하나 또는 두 개의 빨래집게로 메쉬 콘을 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기의 가장자리에 고정하여 원뿔의 열린 부분이 똑바로 세워지고 뾰족한 부분이 LN에 부분적으로 잠기도록 합니다.
- LN과 2.6단계의 백색 분말 유사 물질을 마이크로 체 콘에 부드럽게 붓습니다.
- 넓은 브러시를 부드럽게 적용하여 첫 번째 용기에 남아 있는 식물 재료를 모아 150μm 메쉬 콘으로 옮깁니다.
- 첫 번째 용기에 LN을 더 추가하고 모든 식물 재료가 마이크로 체 콘으로 옮겨질 때까지 칫솔질 동작을 반복합니다.
- 용기의 뚜껑에서 빨래 집게를 조심스럽게 떼어 내고 마이크로 체 콘을 열어 트리 초메가 열린 마이크로 체의 중간에 위치하도록합니다. 마이크로 체의 네 모서리를 모두 함께 잡아 trichomes가 포함 된 중간 부분이 LN에 잠긴 상태로 유지되도록합니다 (그림 6).
- 마이크로 체의 네 모서리를 모두 잡은 상태에서 티백을 주입하는 것처럼 강철 용기에 LN의 마이크로 체를 부드럽게 담그고 흔듭니다. 이 담그기/흔들기(수직 및 수평) 동작을 1분 동안 계속합니다. 격리 품질과 수량 사이에는 상충 관계가 있습니다. 더 긴 담그기 동작은 더 많은 양의 trichomes를 초래할 수 있지만 격리 등급은 더 나쁠 수 있습니다. 전반적으로 1분은 품질과 수량 모두에 적합한 것으로 권장됩니다.
참고: 이 체질 동작은 프로토콜의 가장 중요한 부분이며 그에 따라 실행되어야 합니다. - 선택 사항: 마이크로 체 중앙에 싸여 있는 체로 쳐지지 않은 식물 파편과 더 큰 트리초메(여전히 LN에 잠겨 있음)를 13mL 또는 50mL 시험관에 퍼내고 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관합니다.
주의 : 압력 가스(드라이아이스 및 LN 잔류물로부터)가 축적되는 것을 방지하려면 멸균된 바늘로 시험관 캡의 구멍을 뚫습니다. 캡은 압력이 감소하면 교체할 수 있으며, 이는 일반적으로 24시간 후입니다.
4. 기공 크기가 감소하는 미세 체를 통해 trichomes 통과
- 3단계에서 제시된 것과 동일한 방식으로 기공 크기가 감소하는 미세 체(105μm, 80μm, 65μm 및 50μm)를 통해 작은 둥근 바닥 스테인리스강 용기의 바닥에 있는 LN에 잠긴 체로 쳐진 트리초메를 순차적으로 옮깁니다.
5. 원하는 trichomes 수집
- 원하는 트리초메를 제거하고, LN에 잠기고, 미리 냉각된(in LN) 스푼을 사용하여 50 μm 마이크로체에 감쌌다. 깨끗한 접시에 담습니다.
알림: 이 최종 격리 단계에서 원하는 trichomes가 체에서 수집됩니다. - 튜브에 삽입된 미리 냉각된 주걱 또는 스쿠풀라를 통해 라벨이 부착된 사전 냉각 1.5mL 튜브에 분말 모양의 트리코메를 빠르게 옮깁니다(그림 7). 추가 연구를 위해 튜브를 즉시 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 전체 격리 프로토콜을 나타내는 개략적인 워크플로 차트는 그림 8에 나와 있습니다.
6. 정제된 트리초메의 관찰 및 분석
- 소량(10mg)의 분리된 트리초메를 미리 냉각된(LN을 통해 ) 주걱을 사용하여 현미경 슬라이드에 놓습니다. 물 한 방울을 넣고 얼룩없이 광학 현미경으로 직접 관찰하십시오. 낮은(10x) 및 높은(40x) 배율을 사용하여 전반적인 격리 및 오염 정도를 평가합니다. 농축은 그림 9에 표시된 바와 같이 비트리코메 조직에 대한 트리초메의 상대적인 양에 의해 시각적으로 추정됩니다.
- 분리된 C. sativa glandular capitate, 스토킹 및 고착성 trichomes 50mg에서 RNA 추출 및 품질 분석을 수행합니다.
참고: mRNA 정제의 poly-A 기반 전략을 사용하는 상업용 추출 키트( 재료 표 참조)를 RNA 추출에 사용했습니다.- 용해 용액에 분리 된 트리 초메 50mg을 재현 탁하고, 30 초 동안 소용돌이치고, 5 분 동안 35kHz의 얼음 차가운 초음파 세척 장치에서 초음파 처리하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 샘플에서 mRNA를 추출합니다 ( 재료 표 참조).
- 트리코메에서 추출한 RNA의 무결성을 추정하려면 랩온어칩 시스템을 사용하여 RNA 농도, 총량 및 RNA 무결성 수(RIN) 값을 결정합니다( 재료 표 참조).
- 트리코메 분획의 RNAseq 분석을 수행합니다(선택 사항). 시퀀싱 판독의 RNAseq 분석 및 생물정보학 분석은 표준 아웃소싱 서비스를 통해 수행할 수 있습니다
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
기존의 트리쿰 격리 프로토콜과 비교하여 이 프로토콜에 포함된 주요 수정 사항은 표준 격리 매체를 LN으로 대체하는 것입니다. LN을 분리 매질로 사용하면 시료가 LN에 잠겨 있는 한 대사 분해가 발생하지 않기 때문에 워크플로우가 완화됩니다. 또한, 프로토콜은 전통적인 trichome 격리 배지에 사용되는 유해 성분 (즉, aurintricarboxylic acid 및 β-mercaptoethanol)을 피하기 때문에 작업은 화학 후드로 제한되지 않습니다. 그럼에도 불구하고 드라이아이스와 LN을 취급할 때 필요한 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.
본 프로토콜의 장점을 평가하기 위해, 본 프로토콜의 트리코메 분리 결과를 처음에는 광학 현미경을 사용하여 기존의 트리코메 분리 절차(트리초메 분리를 위해 수성 완충액, 유리 구슬 및 미세 체를 사용함)12를 사용하여 얻은 결과와 비교했습니다. 광학 현미경 검사를 통해 서로 다른 분리 단계의 구성 요소를 비교하면 분리 공정이 진행됨에 따라 트리코메 분리 정도가 증가하는 것을 알 수 있습니다. 분리 공정의 초기 단계(105-150μm 마이크로 체)에서 잎 조직 조각이 분리된 부분(그림 9A)에서 우세했으며, 거의 전체가 분리된 트리코메로 구성된 최종 분리 제품과 대조적입니다(그림 9C). 분리된 샘플이 오염되지 않았는지 확인하기 위해 주의를 기울여야 합니다(그림 9B).
이 연구에서 trichome 밀도는 정량화되지 않았지만, 최종 분리 단계에서 분리 된 선 capitate 스토킹 및 고착 trichomes의 품질은 그림 10에서 관찰 할 수 있습니다. 순도는 종래의 프로토콜12를 사용하여 트리코메 분리로 얻은 것과 비교할 수 있다(도 10C). 본 프로토콜에서, 섬세한 스토킹 트리코메 헤드 구조가 유지되고, 분리된 스토킹 트리코메의 전체 헤드가 보이는 반면(도 10D), 종래의 프로토콜을 사용하는 경우, 완전한 트리코메 헤드 구조가 결여되어 있고, 디스크 세포만 존재한다(도 10E). 드라이아이스와 LN을 사용하면 추출할 수 있는 식물 재료의 한계를 없애기 때문에 수율도 크게 높일 수 있습니다. 당사의 비수성 프로토콜의 또 다른 장점은 드라이아이스와 LN만 사용하므로 분리 매체의 잔류 성분이 증발 후 남지 않는다는 것입니다. LN을 사용하면 trichomes13의 응집으로 이어질 수 있는 끈적끈적한 2차 대사산물의 방출을 방지할 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 최종 단리 단계에서 단리된 트리코메는 건조 미분말로서 회수되었다.
본 프로토콜 전반에 걸쳐 유지되는 극도로 낮은 온도는 기존의 완충 배지 RNA 분해를 방지하고(샘플이 물에 잠겨 있는 한) 다운스트림 분자 적용을 용이하게 하는 목표를 충족하기에 충분할 것입니다. 이 가정을 검증하기 위해 분리된 트리초메에서 RNA를 추출하고 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 RNA 무결성을 추정했습니다. 얻어진 높은 RIN 값(9.4 - 10)과 뚜렷한 겔 크로마토그래피(그림 11)는 높은 RNA 무결성을 명확하게 나타냅니다. RNA 샘플을 RNAseq에 의해 추가로 분석하고, 모든 라이브러리로부터 >20 M의 고품질 판독을 얻었다.
실제로, 분리 된 trichomes 분획으로부터의 mRNA가 trichome-발현 유전자에서 풍부하다는 것을 검증하기 위해, 우리는 꽃차례 및 상응하는 분리 된 스토킹 trichomes에 대한 유전자 발현 결과를 Livingston et al.14에 의해 제시된 이전 결과와 비교했다. ). 그들의 프로토콜은 수성 완충액에서 혼합하고, 체를 통해 여과하고, 마지막으로 Percoll 그래디언트를 사용한 트리코메 정제로 구성되었습니다. 트리초메 발현 유전자는 트리초메 특이적 유전자 마커인 칸나비디올산 합성효소(CBDAS)의 유전자 발현과 가장 높은 상관관계(p > 0.95)로 특성화되었다14. 본 프로토콜로 얻은 결과와 Livingston et al.14에 제시된 결과 사이의 유전자 발현 비교는 트리홈 마커 유전자 CBDAS를 포함하여 우리의 trichome 분획에서 가장 고도로 농축된12개의 유전자가 Livingston et al. 연구 14에서도 농축되었음을 보여줍니다(표 1). 특히, 상당히 높은 농축 비율이 본 프로토콜로부터 얻어졌다. 이러한 결과는 트리초메 풍부 유전자 발현 연구를 위한 본 프로토콜의 타당성을 확인시켜줍니다.
또한, 대 마초의 5개 액틴 유전자의 발현 데이터를 비교했는데, 이는 액틴이 전사체 연구의 기준 유전자로 자주 사용되기 때문입니다(표 2). 고립 된 스토킹 및 고착성 trichomes에 대한 우리의 결과는 Livingston et al. 연구14.
마지막으로, 우리는 아마도 트리코메 농축되지 않은 엽록소 a-b 결합 단백질 패밀리 유전자에 대한 발현 및 트리코메 농축 데이터를 계산했습니다(표 3). 실제로, 이 유전자 패밀리의 12개 구성원은 <1의 트리홈 농축 인자를 보였으며, 이는 트리홈 농축에 대한 음성 대조군 역할을 했습니다. 이러한 결합된 결과는 꽃차례 및 분리된 트리코메 분획의 고유한 발현 패턴을 나타내며 분리된 트리코메 분획의 트리코메 무결성 및 품질을 지원합니다.
그림 1: 1L 유리 비커를 넣기 위한 설정. 1mm 스크린 도어 메쉬는 몇 개의 고무 밴드(표시되지 않음)를 통해 유리 비커의 측면에 고정됩니다. 1L 유리 비커는 똑바로 세워야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 밀가루 체 설정. 밀가루 체에는 바닥에 고무 밴드를 통해 350μm 마이크로 체가 장착되어 있습니다(표시되지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 트리코메 격리의 첫 번째 단계 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유리 비커 설정. 유리 비커에는 개구부에 고무 밴드 를 통해 고정된 1mm 스크린 도어(모기) 메쉬의 3겹이 장착되어 있습니다. 비커의 입구가 아래쪽을 향하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 트리코메 분리에 사용되는 마이크로 체 원뿔 구조의 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 분리된 트리코메를 포함하는 마이크로 체의 침지 및 흔들림 동작에 대한 설정. 수평/수직 이동은 티백 주입과 유사해야 합니다. 설정은 사용된 각 메쉬 크기에 대해 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 최종 분리된 트리코메를 옮기기 위한 설정. 최종 분리된 트리코메는 표지된 1.5mL 튜브로 옮겨집니다. 모든 기구는 LN으로 미리 냉각해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 프로토콜을 간략하게 설명하는 순서도. C에서 선 capitate trichomes의 분리. Sativa 는 세 단계를 포함합니다 : (1) 식물 공급원에서 trichomes의 초기 분리 및 2 개의 체 (1mm 및 350 μm)를 통한 통과, (2) 기공 크기가 감소하는 5 개의 마이크로 체를 통해 식물 재료 통과 (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm 및 50 μm), (3) 분리 된 trichomes를 미리 냉각 된 1.5 mL 튜브에 수집합니다. 임의의 마이크로체 단계로부터 보유된 조직은 유사하게 수집될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 현재 프로토콜을 사용한 분리된 trichomes의 현미경 이미지. (A, B, C) Glandular capitate sessile trichomes from C. sativa fan leaves. (A) 105 μm에서 150 μm 범위의 공극 크기를 가진 마이크로 체에서 중간 분리. 많은 양의 녹색, 비 trichome 재료의 보유에 유의하십시오. (B) 50 μm에서 65 μm 범위의 공극 크기를 가진 미세 체에서 식물 공급원(빨간색 화살표)으로 오염되고 (C) 오염되지 않은 분리의 끝. 스케일 바 = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 분리된 트리코메의 현미경 이미지. (A,B) C. sativa의 선 capitate trichomes: (A) 현재 프로토콜을 사용하여 분리된 스토킹 유형 및 (B) 현재 프로토콜을 사용하여 분리된 고착 유형. (C) 기존 프로토콜을 사용하여 분리된 스토킹 트리초메. trichomes의 낮은 수확량과 타협하지 않는 머리의 부족은 명백합니다. (D,E) 스토킹된 선 capitate trichomes는 (D) 본 프로토콜 및 (E) 기존 프로토콜을 사용하여 분리되었습니다. (F) 65 μm에서 105 μm 마이크로 체로 분리 된 선 스토킹 trichomes (클로즈업). 분리 된 머리와 줄기 부분이있는 스토킹 trichomes의 높은 격리에 주목하십시오. 빨간색 화살표는 방광성 모낭을 나타내고, 파란색 화살표는 선 항복 스토킹 모모메의 몇 줄기 부분을 나타내며, 노란색 화살표는 분리된 디스크 세포를 나타냅니다. 축척 막대 = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 트리코메에서 추출한 RNA의 무결성 분석. 본 프로토콜을 사용하여 분리된 선상복 스토킹 및 고착성 트리코메에서 추출된 RNA 샘플의 크로마토그래프 및 겔. 본 연구에 사용된 4개의 품종 계통인 CS-11, CS-12, CS-13, 및 CS-14의 스토킹 트리초메(A-D)로부터의 RNA에 대한 결과, 및 (E-H) 고착성 트리코메, CS-11, CS-12, CS-13, 및 CS-14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 본 프로토콜을 사용하여 RNAseq로 얻은 트리초메 농축 유전자 발현을 Livingston et al.14에 의해 얻은 결과와 비교. 리빙스턴 (Livingston) 등14 (보충 표 데이터 S4, Wiley 출판사의 허가를 받아 채택 됨)에 의한 칸 나비 디올 산 합성 효소 (CBDAS) 발현과 가장 높은 상관 관계를 나타내는 12 개의 유전자가 비교를 위해 선택되었다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 현재 프로토콜에서 분리된 스토킹 및 고착성 트리초메의 5개 대마초 액틴 유전자의 유전자 발현(FPKM)의 비교(대마초 품종 CS-11 11(Var CS-11))와 이전에 발표된 결과와 Livingston et al.14. Livingston et al.14의 결과는 Finola FN 참조 게놈을 기반으로 제시되었으며 해당 데이터는 CS10.2 참조 게놈으로 변환되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 전체 꽃차례의 대마초 엽록소 a-b 결합 유전자의 유전자 발현(FPKM) 및 본 프로토콜에서 분리된 스토킹 트리초메(Var CS-11의 유전자 발현 데이터). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 이용가능한 트리코메 격리 프로토콜과 비교하여, 두 가지 주요 변형이 본 프로토콜에 기술되어 있다. 여기에는 초기 단계에서 드라이 아이스를 사용하여 식물 재료에서 trichomes를 분리하고 일반적으로 사용되는 액체 버퍼 매체를 LN으로 대체하는 것이 포함됩니다. C. sativa trichome 정제를 위한 첫 번째 변형은 제라늄 페디셀에서 트리초메를 분리하기 위해 으깬 드라이아이스를 사용하는 초기 프로토콜을 기반으로 한다5. 기존의 트리코메 분리 프로토콜은 일반적으로 소형(50mL) 시험관을 사용하지만, 이 연구에서는 1L 유리 비커를 넉넉한 양의 분쇄된 드라이아이스와 함께 사용하여 더 많은 양의 초기 식물 재료(최대 10g)를 처리할 수 있었습니다. 또한, 본 프로토콜에서, 마이크로 체를 통한 트리코메의 두 개의 추가 통로가 첫 번째 분리 단계에서 도입되었습니다. 첫 번째 단계는 수직으로 위아래로 격렬한 소금 통과 같은 동작을 사용하고 두 번째 단계는 밀가루 체의 미세 체를 통해 수평 체로 체질하는 동작을 사용합니다. 결합 된 수평 및 수직 체질 동작은 trichome 크기와 모양에 따라 향상된 분리를 촉진하기 위해 제안됩니다.
두 번째, 가장 중요한 수정은 마이크로 체를 통과하는 통로가 수행되는 분리 매체를 다룹니다. 본 프로토콜에서, 종래의 수성 격리 매질은 LN에 의해 완전히 대체된다. 이전 프로토콜8 은 또한 트리초메 분리를 위한 첫 번째 단계에서 LN을 사용하여 식물 재료에서 트리초메를 분리했지만(메쉬 체에 대해 꽃 재료를 격자로 격자 넣음) 액체 버퍼 추출 및 Percoll 밀도 분리를 계속했습니다. 기존 분리 매체 대신 LN을 대체하면 기존 격리 매체의 독성 성분과 관련된 특수 절차가 필요하지 않아 워크플로가 완화되고 처리량이 높아집니다.
본 프로토콜의 주요 특징은 드라이아이스와 LN이 실온에서 빠르게 승화되는 경향에 의존합니다. 이 기능은 격리 프로세스 전반에 걸쳐 넉넉하게 적용할 수 있습니다. 대조적으로, 많은 양의 종래의 격리 완충액을 사용하는 것은 그의 대량의 취급과 관련된 기술적 복잡성을 야기할 것이다.
본 프로토콜의 분리 과정은 선 capitate 스토킹 trichome의 깨지기 쉬운 머리 구조의 유지를 촉진하는 반면, 기존 프로토콜은 디스크 세포만 남기고 쉽게 씻겨 나가는 나머지 샘 물질로부터 디스크 세포의 분리를 촉진합니다. 이 현상은 기존 격리 프로토콜과 새로운 프로토콜을 비교한 결과에서 명확하게 볼 수 있습니다(그림 10D,E). 현미경 관찰 외에도 trichomes에서 추출한 RNA의 품질 분석(이 프로토콜을 사용하여 분리)은 RNA 무결성이 분리 과정에서 유지되고 전사체 분석에 적합하다는 것을 명확하게 나타냅니다.
또한, 분리된 트리초메 분획의 유전자 발현 결과는 분획이 확립된 트리초메 발현 유전자에서 고도로 풍부하고(표 1) 역수적으로 비트리초메 발현 유전자가 대표되지 않음을 나타냅니다(표 3).
본 프로토콜의 주요 한계는 마이크로 체를 통과하는 경향에 따라 trichomes를 분리하는 데 독점적 인 적합성입니다. 이 프로토콜은 밀도 구배를 사용하여 trichome 분리에 직접 적용 할 수는 없지만 필요한 경우 밀도 구배 단계 전에 trichomes를 분리하는 데 적합합니다. 이 연구에서 이 프로토콜을 사용하여 분리된 트리홈은 단백질체 특성화를 거치지 않았으며 이러한 적용에 대한 적합성을 검증해야 합니다. 그러나, 스토킹 및 고착성 트리초메 둘 다로부터 추출된 RNA 샘플이 분해를 나타내지 않았기 때문에, 코마토그래프 및 높은 RIN 값에 의해 나타난 바와 같이, 본 프로토콜로 분리된 트리코메는 단백질체 분석에 필요한 요건을 충족할 가능성이 있다고 가정할 수 있다.
팬 잎에는 선 모양의 줄기 스토킹 트리 홈 유형15,16이 없기 때문에 팬 잎에서 선 모양의 capitate sessile trichomes의 분리 정도 (초기 식물 공급원 및 다른 유형의 trichomes로부터)가 매우 높으며, 방광 및 구근 trichomes는 구조적 및 크기 차이로 인해 고착성 trichomes에서 쉽게 분리됩니다. 그러나 선 capitate 스토킹 유형 trichomes의 분리와 관련하여, 식물 공급원 인 성숙한 암컷 꽃차례가 줄기 전 유형14 외에도 4 가지 trichome 유형을 모두 포함하기 때문에 농축으로 격리 정도를 해결하는 것이 가장 좋습니다. 격리 된 선 capitate trichomes의 대부분은 스토킹 유형이며, 높은 위치 (표피 결합 고착 trichomes와 관련하여)가 드라이 아이스 입자와 충돌하여 식물에서 분리 될 가능성을 높이기 때문입니다. 또한, 스토킹 트리코메의 머리와 줄기 부분을 연결하는 접합부는 샘 머리(17)의 이탈과 관련된 약점으로 간주된다. 따라서, 스토킹 된 trichome 부분을 고착 유형의 잠재적으로 낮은 오염을 갖는 고도로 농축 된 분획으로 언급하는 것이 정확할 것이다. 그러나 이 가정을 검증하기 위한 추가 분석은 수행되지 않았습니다.
다른 식물 종에서 선 trichomes를 추출하는 현재 프로토콜의 적합성은 아직 결정되지 않았습니다. C. sativa의 높은 trichome 밀도는 아마도 현재 프로토콜의 성공에 기여할 것입니다. 그러나 상대적으로 큰 식물 재료 공급원(분리 주기당 최대 10g)을 효과적으로 처리할 수 있기 때문에 이것이 유일한 이유는 아닌 것 같습니다. 다른 연구에서는 Arabidopsis thaliana18,19의 로제트 잎 trichomes와 같은 다른 trichome 유형을 다른 식물에서 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시했습니다. 다른 트리홈 유형을 분리하기 위한 본 프로토콜의 적용 가능성은 이 연구에서 연구되지 않았지만, 이 연구에서 제시된 요소, 특히 분리 완충액에 대한 LN의 대체는 트리코메 분리 프로세스를 개선할 가능성이 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 CannabiVar Ltd.의 재정 지원을 인정합니다. 모든 식물 재료는 이스라엘 화산 센터의 Hinanit Koltai 교수가 아낌없이 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
